在本发明的构架中,对葡糖杆菌属的微生物进行了比较周密的研究,结果发现从所说的微生物中可以得到催化L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的新ADH。而且发现本发明提供的ADH是在诸如2,6-二氯苯酚靛酚(下称DCIP)、吩嗪甲氧基硫酸盐(下称PMS)、铁氰化物或细胞色素C之类的电子受体存在下将L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的,而NAD、NADP和氧不适合作电子受体。因此该ADH明显不同于已知L-山梨糖醛酮脱氢酶。
本发明的目的之一是提供作用于L-山梨糖醛酮以生产2-KGA的新ADH,它有下列的物理化学性质:
a)分子量:91,000±5,000
(由两个均一的亚单位组成,每一亚单位的分子量为44,000±2,000)
b)底物特异性:对醛类化合物有活性
c)抑制作用:被Cu2+、Zn2+、Ni2+和乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制
d)最佳pH:6.0-8.5
e)最佳温度:20-40℃
f)刺激剂:Ca2+和吡咯并喹啉苯醌(下称PQQ)
本发明的另一目的是提供生产上所限定的新ADH的方法,该方法是在有氧条件下于含水营养基中培养能够产生有上述性质的ADH的葡糖杆菌属微生物,破裂该微生物细胞,并从微生物破裂细胞的无细胞提取物中分离和纯化ADH。本发明的又一目的是提供利用ADH从L-山梨糖醛酮生产2-KGA的方法,该方法包括(i)在电子受体存在下用上文所限定的ADH与L-山梨糖醛酮接触,或(ii)用在有氧条件下于含水营养基中能产生上文所限定的ADH的葡糖杆菌属微生物与L-山梨糖醛酮接触,或(iii)用所说微行物的无细胞提取物与L-山梨糖醛酮接触,然后对(i)、(ii)和(iii)的每种情形,从反应混合物中分离2-KGA。
按下述实施例制备的纯化的ADH样品的物理化学性质如下:
1)酶的活性
本发明的新ADH在电子受体存在下催化L-山梨糖醛酮至2-KGA的氧化作用是按以下的反应式进行的:L-山梨糖醛酮+电子受体→2-KGA+还原的电子受体
该酶不能以氧作为电子受体,这已被确证,即用氧作为可能的电子受体去进行L-山梨糖醛酮至2-KGA的转变时,该酶没有催化活性;而且用熔解氧探测器检测,在反应混合物中检测不到氧的消耗。但是能作为电子受体的任何常规化合物都能与本发明的酶一起使用。DCIP、PMS、铁氰化物或细胞色素C作为电子受体是优选的。
酶的分析按下述方法进行:
分析ADH活性的基础反应混合物由0.1mM DCIP、1.0mMPMS、50mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)、2.0mM L-山梨糖醛酮、酶溶液和水组成,终体积为0.5ml,在临测定前准备。反应于25℃以L-山梨糖醛酮开始,酶活性以在600纳米处DCIP初始还原速率测定。1单位酶活性定义为每分钟催化1μM DCIP还原的酶量。pH7.0时DCIP的消光系数为14.5mM-1。参比池中含所有上述组成,但不含L-山梨糖醛酮。
蛋白质浓度的测定用BCA蛋白质分析试剂(Pierce,Rockford,IL)
2)底物特异性
酶的底物特异性测定是用1)中所述的酶分析方法,但以各种不同的底物溶液代替L-山梨糖醛酮。已研究了纯化酶对各种底物的底物特异性(参见表1)。
表1
ADH的底物特异性
底 物 |
相对活性(%) |
L-山梨糖醛酮L-山梨糖D-山梨醇正丙醇异丙醇D-核糖D,L-甘油醛D-葡萄糖醛酮D-甘露糖D-果糖D-葡萄糖 |
100000033.3788.977.862.20188.9 |
得自氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的ADH对于D,L-甘油醛和D-葡萄糖的相对活性比对于L-山梨糖醛酮的分别高约8倍和2倍。
3)最佳pH
ADH反应速率与反应混合物的pH之间的相关性测定是用1)中所述的酶分析方法,但使用各种不同的pH和缓冲溶液(参见表2)
表2
ADH活性的最佳pH
pH值 |
相对活性(%)a) |
缓冲液 |
0.1M McIlvain |
0.1M磷酸钾 |
0.2M Tris-HCl |
4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0 |
---69.772.6-79.0-63.9-- |
----70.093.587.190.3--- |
------93.5-10088.778.4 |
a)表中数据以pH8.0Tris-HCl缓冲液中活性的百分数表示。
4)pH稳定性
将酶于0℃下在各种pH的缓冲液中保持6天,然后用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。测定结果示于表3。在pH7.5左右纯化酶是相对稳定的。
表3
ADH活性的pH稳定性
pH值 |
相对稳定性(%)a) |
缓冲液 |
0.1M McIlvain |
0.1M磷酸钾 |
0.2M Tris-HCl |
5.56.06.57.07.58.08.59.0 |
0.462.748.4524.060.597.0-- |
-3.9015.852.5100--- |
---77.294.370.847.935.5 |
a)表中数据以pH7.5的0.1M磷酸钾缓冲液中活性的百分数表示。
5)热稳定性
酶的热稳定性试验是将其置于50mM的磷酸钾缓冲溶液(pH7.5)中于各种不同的温度下保温5分钟,然后将处理后的酶立刻在冰水中冷却。用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。酶的稳定性可达35℃,在40℃和45℃下保温后活性分别损失约50%和60%(参见表4,A栏)。
表4
温度对ADH稳定性和活性的影响
温度(℃) |
相对活性(%) |
(A) |
(B) |
0202530354045505560 |
100-10010010054.138.810.44.02.4 |
-*96.410080.073.915.216.4--- |
*未试验
(A)酶稳定性试验
(B)最佳温度评定试验
数据以25℃时活性的百分数表示
6)最佳温度
测定了20℃至45℃温度范围内的酶活性。酶的最佳温度为25℃(参见表4,B栏)
7)金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响
用1)中所述的分析方法测定活性,检验了金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响。将各化合物溶液搅拌入基础反应混合物中,在加入酶时反应开始(参见表5和6)。
表5
各种金属对ADH活性的影响
金属 |
浓度(mM) |
相对活性(%) |
无Ca(NO3)2·4H2OCaCl2CuCl2·6H2OCuSO4·7H2OFe2(SO4)3·nH2OMgSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OTiCl4ZnCl2ZnSO4·7H2ONiSO4·6H2O |
-0.03870.190.03870.03870.190.3740.190.3740.550.03870.228-0.3740.410.190.3740.190.3740.190.3740.190.3740.3740.375 |
10029445033710050010061.917.610064.044.930.479.339.969.742.11008036.121.132.617.6 |
如表5中所示,在0.04-0.2mM Ca2+存在下,酶反应被强烈刺激约3-4.5倍,而Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mo6+、Ti4+、Zn2+和Ni2+抑制酶活性。
表6
酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响
化合物 |
浓度(mM) |
相对活性(%) |
无EDTA奎宁N-乙基马来酰亚胺叠氮化钠一碘乙酸盐Na2HAsO4·7H2O氟代乙酸钠氟化钠KCNPQQ |
-0.1940.4800.9800.9501.8700.9501.8700.9501.8700.9501.8700.9501.8700.9501.8700.9501.8701.9003.7400.01 |
1003.82.61.6117.6111.894.176.5104.895.293.787.3100107.1118.2127.3100105.8112.5104.8147.6 |
如表6所示,EDTA强烈抑制酶活性,1.87mM的N-乙基马来酰亚胺和一碘乙酸盐分别部分抑制活性24%和13%;在氟化钠(1.87mM)、奎宁(0.95-1.87mM)、氟代乙酸钠(0.95-1.87mM)和Na2HAsO4·7H2O(1.87mM)存在下,对酶反应有5-27%的微小刺激;加入0.01mM PQQ刺激活性50%左右。
8)底物浓度对反应速率的影响
测定了0.15-7.54mM的不同浓度的L-山梨糖醛酮的氧化反应速度以确定L-山梨糖醛酮的Km值。根据以DCIP作为电子受体时的反应速度从Lineweaver-Bruk曲线计算出表观米氏(Michaelis)常数为0.85mM。
9)分子量
用凝胶过滤柱(Sephacryl S-400HR)测定了酶的分子量。与分子量标示蛋白质比较计算的酶表观分子量为91,000±5,000。SDS-聚丙烯酰胺电泳给出了分子量44,000±2,000的单带。
以上提示该酶是由两个均一的亚单位组成。
10)纯化步骤
原则上ADH的纯化可用任何已知纯化方法的组合来进行,诸如用沉淀剂(例如硫酸铵、聚乙二醇等)分级分离、离子交换色谱法、吸附色谱法、凝胶过滤色谱法、凝胶电泳法、以及盐析和渗析法。
如上所述,本发明提供的ADH可通过在有氧条件下于含水的营养基中培养适合的微生物、破裂微生物细胞、并从破裂的微生物细胞的无细胞提取物中分离并纯化ADH来制备。
本发明所用的微生物是能产生如上所限定的ADH的葡糖杆菌属微生物。所说微生物的功能等同物、次培养物、突变体和变种也能用于本发明。
优选的菌株是氧化葡糖杆菌。在本发明中使用的最优选的菌株是氧化葡糖杆菌DSM 4025,它保存于德国哥廷根德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Gottingen),保藏号DSM No.4025,保藏日1987年3月17日。保藏人是中国北京三里河52号中国科学院微生物研究所东方科学仪器进出口公司。
另外,根据布达佩斯条约的规定,该菌株的次培养物还保藏在日本工业科学和技术协会发酵研究所(现为全国生物科学和人类-技术研究所),保藏号为氧化葡糖杆菌DSM No.4025 FERM BP-3812,保藏日1992年3月30日,保藏人是日本罗氏研究中心(Nip-pon Roche Research Center),日本神奈川县(247)镰仓市KajiwaraAza Sotokochi 200。
另外,欧洲专利公开No.0 278 447公开了此菌株的特性。
该微生物可在有氧条件下辅以适合的营养物在含水介质中培养。进行培养的pH为4.0-9.0,优选6.0-8.0。培养周期依pH、温度和所用的营养基而不同,但最好是约1-5天。进行培养的优选温度范围为13℃左右-36℃左右,更优选18℃-33℃。
通常要求培养基含营养物作为可同化的碳源,诸如甘油、D-甘露糖醇、D-山梨醇、季戊四醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、卫矛醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖,优选D-山梨醇、D-甘露糖醇和甘油;以及诸如有机物质的可消化氮源,例如胨、酵母提取物、面包酵母、肉提取物、酪蛋白、尿素、氨基酸、玉米浸渍液等。各种无机物也可作为氮源,诸如硝酸盐、铵盐等。另外,培养基通常含无机盐,诸如硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等。
现将从培养后的微生物中分离和纯化ADH的具体实施方案简要叙述于下:
(1)用离心或过滤法从液体培养物中收集细胞,
(2)用水、生理食盐水或有适合pH的缓冲溶液洗涤收集的细胞,
(3)将洗后的细胞悬浮于缓冲溶液中并用均化器、声裂器、法兰西压机或用溶菌酶处理等方法裂解细胞以产生裂解细胞的溶液,
(4)从裂解细胞的无细胞提取物、最好是从微生物的胞液部分分离并纯化ADH。
本发明提供的ADH可用作自醛生产羧酸的催化剂,特别是自L-山梨糖经L-山梨糖醛酮生产2-KGA。
反应应在pH约6.0-约9.0下在电子受体(例如DCIP、PMS、沃尔斯特氏兰、铁氰化物、辅酶Q、细胞色素C等)存在下于溶剂(诸如Tris-HCl缓冲溶液、磷酸缓冲溶液等)中进行。
进行反应的优选温度范围是约10℃-约50℃。当pH和温度设定在7.0-8.0和20-40℃时,反应通常会产生最好的结果。
溶剂中L-山梨糖醛酮的浓度可根据其它反应条件而变化,但通常是约0.5-50g/l,最优选约1-约30g/l。
在反应中,ADH也可以与适合的载体以固定化态使用。任何在本技术领域中通常已知的固定酶的方法都可以使用。例如,将酶直接结合在有一个或多个官能基的树脂膜、颗粒或类似物上,或可通过有一个或多个官能基的桥连化合物(例如戊二醛)将其结合在树脂上。
除上所述外,培养后的细胞也可用于从醛制备羧酸的生产,特别是从L-山梨糖醛酮制备2-KGA的生产。
下面以实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
ADH的制备
所有操作均在8℃下进行,缓冲溶液为0.05M磷酸钾(pH7.0),除非另外指明。
(1)氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的培养
将氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)在含5.0%D-甘露糖醇、0.25%MgSO4·7H2O、1.75%玉米浸渍液、5.0%面包酵母、0.5%尿素、0.5%碳酸钙和2%琼脂的琼脂斜面上27℃下生长4天。在一500ml三角烧瓶中将一环的细胞接种于含8%L-山梨糖、0.05%甘油、0.5%尿素、0.25%MgSO4·7H2O、1.75%玉米浸渍液、5.0%面包酵母和1.5%CaCO3的50ml种子培养基中,在旋转振摇器上(180rpm)于30℃下培养一天。将各10ml的培养液转移到含100ml相同种子培养基的两个500ml三角烧瓶中并按上述方法进行培养。将如此制备的种子培养液用于接种2升的培养基,该培养基含10%L-山梨糖、0.05%甘油、0.25%MgSO4·7H2O、30%玉米浸渍液、6.25%面包酵母和0.15%防泡剂,置于一3升的发酵罐中。其发酵参数为搅拌速度800rpm,通气速率0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟),温度为30℃。培养过程中用氢氧化钠保持pH7.0。经培养40小时后,从4个发酵罐中收集8升含氧化葡糖杆菌DSM4025(FERM BP-3812)细胞的培养液。以800rpm(10,000xg)离心使微红色的细胞在已存在于培养基中的面包酵母顶上成层,然后用刮刀小心取下上层并将细胞用0.85%的NaCl溶液洗涤一次。最后,从8升的培养液中得到湿重46g的氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)细胞。
(2)胞液部分的制备
将细胞浆(46g)悬浮于138ml缓冲溶液中,然后通过法兰西细胞压机。经离心除去未破裂的细胞后,上清液被称为无细胞提取物,然后无细胞提取物以100,000xg速度离心60分钟。所得到的上清液(150ml)称为氧化葡糖杆菌DSM(FERM BP-3812)的可溶部分。将此部分对缓冲溶液进行透析后,将100ml比活性为1.42单位/毫克蛋白质的部分用于下一纯化步骤。
(3)二乙基氨基乙基(下称DEAE)-纤维素柱色谱法
将透析液(100ml)加到用缓冲液平衡的DEAE-纤维素色谱柱(Whatman DE-52,3×50cm)上,并用缓冲液洗涤至流出小量蛋白质。然后,在缓冲溶液中以线性梯度加入0.0-0.8M NaCl。主要的酶活性在0.45-0.55M浓度范围的NaCl溶液下被洗脱。然后将合并的活性部分对缓冲溶液进行透析。
(4)DEAE-琼脂糖柱色谱法
将上一步骤得到的透析活性部分(58ml)加入用缓冲溶液平衡的DEAE-琼脂糖(Pharmacia,1.5×50cm)柱上。经用含0.2M Na-Cl的缓冲液洗涤后,在缓冲液中以线性梯度加入0.2-0.8M的Na-Cl。酶活性于0.38-0.42M NaCl溶液浓度范围被洗脱。收集相应于ADH活性的部分。
(5)Q-琼脂糖柱色谱法
将上一步骤得到的合并的活性部分(15.8ml)对缓冲液进行透析,然后加到用缓冲液平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia,1.0×20cm)色谱柱上。用缓冲液洗涤色谱柱,然后在缓冲液中以0.0-0.6M的线性梯度加入NaCl。相应于ADH的活性部分在0.34-0.37M NaCl浓度下被洗脱。
现将酶的纯化步骤小结于表7中。
表7
得自氧化葡糖杆菌DSM 4025
的染料连接的ADH的纯化
步骤 |
总活性(单位) |
总蛋白质(毫克) |
比活性(单位/毫克蛋白质) |
回收率(%) |
可溶部分DEAE-纤维素DEAE-琼脂糖Q-琼脂糖 |
1.320427.5148.081.0 |
93044.512.30.825 |
1.429.66112.398.2 |
10032.411.26.14 |
(6)所分离酶的纯度
将比活性为每毫克蛋白质98.2单位的纯化酶(0.2mg/ml)用于下面的分析:
天然ADH分子量的测定是用高效液相色谱法,使用尺寸排阻凝胶柱(TSK凝胶G 3000 SWXL柱,7.8×300mm),以含0.3M Na-Cl的0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)平衡,流速为每分钟1.0ml,在254nm处检测。用氰钻胺素(1.35K)、肌红蛋白(17K)、卵清蛋白(44K)、g-球蛋白(158K)和甲状腺球蛋白(670K)作为分子量标准物质。纯化的酶显示一单峰,测定的分子量为91,000±5,000左右。
在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下,该酶显示了分子量约为44,000±2,000的单带。由这些结果发现,纯化的ADH是由两个均一的亚单位组成的。
(7)反应产物的鉴定
将纯化酶(0.02mg)、L-山梨糖醛酮(2mg)和PMS(0.1mg)于0.5ml缓冲液中的反应混合物在30℃保温1.5小时。结果,产物与标准样品比较,鉴定为2-KGA。
实施例2
用纯化的ADH生产2-KGA
将含纯化ADH(0.04mg蛋白质,按实施例1的方法制备)、L-山梨糖醛酮(4mg)和PMS(0.2mg)于1.0ml 0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物于25℃保温1.0小时,同时轻轻振摇。结果,以约2.3mg/小时的速率形成了2-KGA。