CN1314799C - 醛脱氢酶ii - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的醛脱氢酶，它具有下述的物理化学性质：分子量100,000±10,000Da且由2个同源亚基组成，或分子量150,000±15,000Da且由3个同源亚基组成，每一个亚基的分子量为55,000±2,000Da；对L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、和D-木糖有脱氢酶活性；以吡咯并喹啉醌为辅因子；从L-山梨糖醛酮生产维生素C时最适pH约6.5至约8.0，从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸时最适pH约9.0；被Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和一碘乙酸盐抑制；及来自葡糖杆菌属微生物。

Description

醛脱氢酶II
技术领域
本发明涉及一种新酶，即醛脱氢酶(下文称作SNDH II  ，它负责完成两个转化：在中性pH下从L-山梨糖醛酮(L-sorbosone)到L-抗坏血酸(下文称作维生素C)的转化，在碱性pH下从L-山梨糖醛酮到2-酮-L-古洛糖酸(下文称作2-KGA)的转化。本发明还提供了一种生产该酶的方法和一种利用该酶从醛糖例如L-山梨糖醛酮直接生产维生素C和/或2-KGA的方法。
背景技术
维生素C是人类的非常重要的和不可缺少的营养因子之一。已经在各种生物中广泛地研究了产生维生素C的代谢途径。但是，尚无涉及将L-山梨糖醛酮直接转化成维生素C的纯化酶的报道。因此，本发明的酶对于代替现有方法例如Reichstein方法(Helvetica Chimica Acta 17：311(1934))的新的生产维生素C的方法是非常有用的。
发明内容
本发明提供了一种纯化的醛脱氢酶，它具有下述的物理化学性质：
a)分子量为100,000±10,000Da(由2个同源亚基组成)或分子量为150,000±15,000Da(由3个同源亚基组成)，其中每一个亚基的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对醛类化合物有活性，
c)辅因子：吡咯并喹啉醌(PQQ)，
d)最适pH从约6.5至约8.0(对于从L-山梨糖醛酮生产维生素C)或最适pH约9.0(对于从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸)，
e)抑制剂：Co2+，Cu2+，Fe3+，Ni2+，Zn2+和一碘乙酸盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分子量为100,000±10,000Da且具有上述物理化学性质的醛脱氢酶。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分子量为150,000±15,000Da且具有上述物理化学性质的醛脱氢酶。
本发明中SNDH II的来源不是关键的。因此，本发明中的SNDH II可以通过例如从葡糖杆菌(Gluconobacter)或其他能够生产具有上述性质的脱氢酶的生物中分离来生产，或者通过重组或化学合成来生产。
本发明的另一方面提供了一种生产上述SNDH II的方法，它包括在需氧条件下在水性营养培养基中培养能够生产具有上述性质的脱氢酶的葡糖杆菌属微生物，破碎微生物细胞，从破碎后的微生物细胞的无细胞提取物中分离和纯化所述醛脱氢酶。
在本发明的一方面，生产上述SNDH II的方法是通过培养能够生产具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物实现的，其中反应在pH约5.5至约9.0，温度约20至约50℃，优选约20至约40℃，最优选约20至约30℃进行。这样生产的SNDH II可用于生产维生素C和2-KGA。
本发明的另一目的在于提供一种从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯的方法，包括在有电子受体存在时将醛与具有上述性质的纯化后的SNDHII接触，或者与由能够生产具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触。
这里使用的醛糖包括但不限于L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、和D-木糖。
优选的内酯是维生素C，优选的羧酸是2-KGA，优选的醛糖是L-山梨糖醛酮。
在一个实施方案中，从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯的方法包括将所述醛与具有上述性质的纯化后的SNDH II接触，或者与由上面定义的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触，其中SNDH II的分子量是100,000±10,000Da。
在一个实施方案中，从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯的方法包括将所述醛与具有上述性质的纯化后的SNDH II接触，或者与由上面定义的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触，其中SNDH II的分子量是150,000±15,000Da。
在一方面，本发明涉及一种从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯的方法，包括将所述醛与具有上述性质的纯化后的SNDH II接触，或者与由能够生产具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触，其中反应在pH约5.5至约9.0，温度约20至约50℃，优选约20至约40℃，最优选约20至约30℃进行。在生产维生素C时，反应优选在pH约6.5至约8.0、温度约20至约40℃进行。在生产2-KGA时，反应优选在pH约9.0、温度约20至约30℃进行。
本发明还涉及具有上述性质的纯化后的醛脱氢酶在从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯的方法中的应用，其包括在有电子受体存在时将所述醛与所述的纯化后的醛脱氢酶接触，或者与由能够生产所述的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触。
具体实施方式
根据下文提及的实施例制备出的纯化后的SNDH II样品的物理化学性质如下：
1)酶活性
在有电子受体存在时，本发明的SNDH II催化从L-山梨糖醛酮到维生素C和/或2-KGA的氧化，反应式如下：
L-山梨糖醛酮+电子受体→维生素C和/或2-KGA+还原的电子受体
当氧作为电子受体时该酶不起作用。这一点通过氧作为可能的电子受体时该酶不能将L-山梨糖醛酮转化成维生素C和/或2-KGA而得到证实。而且，用溶解氧探头检测时，未检测出反应混合物中有氧消耗。另外NAD和NADP也不是合适的电子受体。但是，其他常规的电子受体可以与本发明的酶联合使用。优选的电子受体是吩嗪硫酸二甲酯(PMS)、2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol，DCIP)、铁氰化物和细胞色素c。为了将至少一些醛底物转化成其相应的酸，对于必须存在的电子受体的最小量，并无限制。但是，可以被氧化的底物的量依赖于具体电子受体的量和它的电子接受特性。
按如下进行酶试验：
a)测定将L-山梨糖醛酮转化成各产物(维生素C或2-KGA)的酶活性的试验
反应混合物由1.0mM PMS、25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μMPQQ、1.0mM CaCl2、50mM L-山梨糖醛酮和酶溶液在终体积为100μl的水中制成，所述的反应混合物在临实验前制成。除非特别说明，反应是在30℃进行60分钟。用高效液相色谱系统(HPLC)在264nm波长处测定维生素C的量作为酶活性的指标，该高效液相色谱系统由UV检测仪(TOSOH UV8000；TOSOH Co.，Kyobashi 3-2-4，Chuo-ku，Tokyo，日本)、双泵(dualpump)(TOSOH CCPE；TOSOH Co.)、积分仪(Shimadzu C-R6A；Shimadzu Co.，Kuwahara-cho 1，Nishinokyo，Chukyo-ku，Kyoto，日本)和柱(YMC-Pack多胺II；YMC，Inc.，3233 Burnt Mill Drive Wilimington，NC28403，美国)组成。用上述HPLC测定生成的2-KGA的量作为另外一个酶活性指标。对于每种产物，1个酶活性单位定义为在反应混合物中分别生成1mg维生素C和2-KGA的酶的量。
b)SNDH II的光度分析试验
反应混合物由0.1mM DCIP、1.0mM PMS、50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μM PQQ、2～100mM底物(L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖等)和酶溶液在终体积为100μl的水中制成，所述的反应混合物在临实验前制成。反应在25℃从L-山梨糖醛酮开始，在600nm以DCIP的初始还原速度测定酶活性。1个酶活性单位定义为每分钟催化还原1μmolDCIP的酶的量。DCIP在pH 7.0的消光系数为14.2mM-1。对照池中含有除L-山梨糖醛酮以外的所有上述成分。
用蛋白试验CBB溶液(Protein Assay CBB Solution)(Nacalaitesque，Inc.Kyoto，日本)测量蛋白浓度。
2)底物特异性
a)使用与上面1b)所述的仅有如下不同的酶试验方法测定酶的底物特异性，不同之处是用100mM磷酸钾(pH7.5)或100mMTris-HCl(pH9.0)作为缓冲液。在pH 7.5和9.0时，SNDH II对D-葡糖醛酮(2mM)、D-葡萄糖(100mM)和D-木糖(100mM)的相对活性比对L-山梨糖醛酮(2mM)的高。但是，在pH 7.5和9.0时对L-山梨糖(100mM)、D-山梨糖醇(100mM)和L-古洛糖-γ-内酯(100mM)的相对活性低于对L-山梨糖醛酮的相对活性的1％。结果如表1A所示。
表1A纯化后的酶的底物特异性
底物   相对活性(％)pH7.5     pH9.0
  L-山梨糖醛酮D-葡糖醛酮D-葡萄糖L-山梨糖D-山梨糖醇D-木糖L-古洛糖-γ-内酯 100       100483       1591769       1519＜1       ＜1＜1       ＜12123      1323＜1       ＜1
b)表1A所示的底物的推导氧化产物如下面的表1B所示。
表1B
  底物   产物
  L-山梨糖醛酮D-葡糖醛酮D-葡萄糖D-木糖   维生素C/2-KGAD-异-抗坏血酸/2-酮-D-葡糖酸盐D-葡糖酸盐D-木糖酸
3)最适pH
使用与上面1a)所述的仅有如下不同的试验方法测定SNDH II的反应速度和反应混合物pH值之间的关系，不同之处是用不同的pH和浓度为100mM的缓冲液。
该酶在pH约6.5～约8.0生产维生素C时相对地显示出高活性，在pH约9.0生产2-KGA时相对地显示出高活性。
4)温度影响
使用与上面1a)所述的仅有如下不同的试验方法测定温度对酶反应的影响，不同之处是周不同的温度。在生产维生素C和2-KGA时，高达至少40℃时酶反应都稳定进行。
5)金属离子和抑制剂的影响
使用与上面1b)所述相同的试验方法测定活性，检测金属离子和抑制剂对该酶的L-山梨糖醛酮脱氢酶活性的影响。每种化合物溶液都搅拌到基础反应混合物中，加入酶后开始反应。结果如表2所示。
表2抑制剂和金属对纯化的酶的活性的影响
  化合物   相对活性(％)
  无EDTANaN3一碘乙酸盐CaCl2·2H2OCoCl2·6H2OCuSO4Fe2(SO4)3·xH2ONiSO4·6H2OTiCl4ZnCl2MgCl2   100.097.998.434.794.760.8＜173.282.995.964.988.5
每种化合物都以1.0mM的浓度加入到反应混合物中，除了EDTA、NaN3和一碘乙酸盐的浓度为5.0mM。
如表2所示，Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+和Zn2+抑制酶活性。加入浓度为5.0mM的一碘乙酸盐强烈抑制酶活性。
6)分子量
用尺寸排阻凝胶柱(TSK-凝胶G3000 SWXL；TOSOH Co.，Akasaka1-7-7，Minato-ku，Tokyo，日本)测量该酶的分子量。在色谱中，该酶显示出相应于表观分子量为约100,000±10,000Da和约150,000±15,000Da的两个峰。通过CBB染色的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该酶，表明纯化后的酶由2至3个同源亚基组成，每一个亚基的分子量为约55,000±2,000Da。该酶的二聚体和三聚体形式都有活性。
7)辅基
向50μl100mM NaH2PO4-HCl(pH约1.0)中的纯化后的SNDH II(0.1mg)中加入等体积的甲醇并充分混合。样品离心去除沉淀。得到的上清用于分析辅基。提取物的吸收光谱几乎等同于真正的PQQ样品(MitsubishiGas Chemical，日本)。在251和348nm发现其吸收峰。而且，使用反相柱(YMC-Pack Pro C18 AS-312；YMC Co.，Ltd)在313nm波长进行HPLC分析发现，SNDH II的甲醇提取物显示出与真正的PQQ相同的停留时间。
用UV-VIS记录分光光度计(Shimadzu UV-2200；Shimadzu Co.)获取还原的减去氧化的差异光谱，尝试检测纯化后的酶的血红素c。该酶以50μg/ml的浓度悬浮于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，制备连二亚硫酸盐还原形式的酶和过硫酸铵氧化形式的酶以测量差异光谱。但是，得到的光谱在450～650nm的波长没有显示出明显的峰。
这些结果强烈地暗示，该酶有PQQ，但是没有血红素c作为辅基。
8)底物浓度的影响
测定1mM～8mM不同浓度的L-山梨糖醛酮的氧化反应的速度来确定L-山梨糖醛酮的Km值。当DCIP用作反应的电子受体时，从基于反应速度的Lineweaver-Burk图计算出的米氏常数在pH为7.5和9.0时分别为14.7mM和20.0mM。
9)纯化方法
该酶的纯化可以通过现有纯化方法的任意组合来实现，例如离子交换柱层析、疏水柱层析、盐析和透析。
本发明提供的酶可以通过下述方法制备：在需氧条件下在水性营养培养基中培养合适的微生物，破碎微生物细胞，从破碎后的微生物细胞的无细胞提取物中分离和纯化脱氢酶。
本发明的方法中使用的微生物是能够生产前面定义的脱氢酶的葡糖杆菌属微生物。
优选菌株是氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明中最优选使用的菌株是氧化葡糖杆菌DSM 4025，根据布达佩斯条约的规定，它已经于1987年3月17日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen in Gottingen)(德国)，保藏号为DSM 4025。保藏人是中国科学院微生物学研究所(中国北京三里河路52号)东方科学仪器进出口公司。有效保藏人是该研究所，其详细地址是中国科学院微生物学研究所，中国北京海淀区中关村，邮编100080。
而且，根据布达佩斯条约的规定，该菌株的继代培养物也已经于1992年3月30日保藏在国家高级工业科技研究所(the National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，AIST)(日本)，保藏号为氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)。保藏人是Nippon Roche K.K.，6-1，Shiba 2-chome，Minato-ku，Tokyo，日本。本发明也最优选使用该继代培养物。
这样，本发明的一个目的是提供一种如前所定义的醛脱氢酶，它来自具有菌株氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴别特征的氧化葡糖杆菌或其继代培养物或突变株。
通过例如紫外线或X-射线辐照、或化学诱变剂如氮芥或N-甲基-n′-硝基-N-亚硝基胍处理细胞，可以获得氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERMBP-3812)的突变株或具有氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴别特征的葡糖杆菌属微生物。
任何类型的微生物都可以使用以直接作用于底物，例如静止细胞、丙酮处理的细胞、冻干细胞、固定化细胞等。任何本身已知的与微生物培养技术有关的方法手段都可以使用，但使用通气搅拌浸没式发酵罐是特别优选的。进行反应的优选细胞浓度范围是约0.01g湿细胞重/ml至0.7g湿细胞/ml，优选约0.03g湿细胞/ml至0.5g湿细胞/ml。
微生物“氧化葡糖杆菌”也包括根据原核生物国际命名法定义的具有相同物理化学性质的该物种的同物异名或基原异名。
氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的特征如下：
a)从山梨糖生成2-KGA，
b)将乙醇氧化成乙酸，
c)将D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸，
d)多元醇的生酮作用，
e)在pH 4和5的甘露醇培养液中(24小时培养)成菌膜和环状生长，在pH 4.5的葡萄糖培养液中成菌膜生长，
f)甘油基本上不被氧化成二羟基丙酮，
g)从山梨糖醇和葡糖二酸生成2-酮-D-葡糖二酸，但是不能从葡萄糖、果糖、葡糖酸、甘露醇和2-酮-D-葡糖酸生成2-酮-D-葡糖二酸，
h)多形态，明显无鞭毛，
i)从果糖生成褐色素，
j)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或其细胞提取物共培养时生长良好，
k)对链霉素敏感。
该微生物可以在需氧条件下在补充了合适营养物的水性培养基中培养。培养条件可以是pH约4.0至约9.0，优选约6.0至约8.0。培养期随使用的pH、温度和营养培养基而变，优选约1～5天。进行培养的优选温度为约13℃至约36℃，更优选约18℃至约33℃。高达约50℃的温度也可适合该微生物的培养。
培养基一般需要含有可同化的碳源这样的营养物质，例如甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇，赤藓糖醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选D-山梨糖醇，D-甘露醇和甘油；和可消化的氮源如有机物质，例如蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浆。多种无机物也可以用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。而且，培养基一般含有无机盐，例如硫酸镁、磷酸钾和碳酸钙。
培养后从微生物分离和纯化SNDH II的一个实施方案简述如下：
(1)通过离心或过滤从培养液中收集细胞；
(2)用水、生理盐水或具有合适pH的缓冲液洗涤收集的细胞；
(3)洗后的细胞悬浮到缓冲液中，利用匀浆机、超声仪或弗式细胞压碎器破碎，或用溶菌酶等进行处理，得到破碎细胞的溶液；
(4)从破碎细胞的无细胞提取物中，优选从微生物的可溶级分中，分离和纯化SNDH II。
可以通过任何常规技术，包括但不限于离心，从破碎细胞获得无细胞提取物。
本发明提供的SNDH II可以用作从L-山梨糖醛酮生产维生素C和/或2-KGA的催化剂。生产维生素C和2-KGA的反应可以在存在电子受体例如DCIP、PMS等时，在溶剂(例如磷酸盐缓冲液、Tris-缓冲液等)中在pH约5.5～约9.0下进行。在生产维生素C时，如果把pH设定在约6.5～约8.0、把温度设定在约20～约40℃，一般可以得到最好的结果。在生产2-KGA时，如果把pH设定在约9.0、把温度设定在约20～约30℃，一般可以得到最好的结果。
反应混合物中L-山梨糖醛酮的浓度可以根据其他反应条件而变，但是一般是约0.5～约50g/l，最优选约1～约30g/l。
在反应中，SNDH II也可以以在适当载体上固定化的状态使用。任何本领域习知的固定化酶的方法都可以使用。例如，该酶可以直接结合到具有一或多个官能团的树脂膜、颗粒等上，或者可以通过具有一或多个官能团的桥联化合物例如戊二醛结合到树脂上。
除了上述内容以外，培养的细胞还可以用于从相应的醛糖生产羧酸和/或其内酯，特别是从L-山梨糖醛酮生产2-KGA和/或维生素C。可以在与上述用于L-山梨糖醛酮向2-KGA和/或维生素C转化相同的条件(包括底物浓度)下从相应的醛糖生产其他羧酸和/或其内酯。
下面的实施例进一步举例解释了本发明。
实施例1制备SNDH II
除非特别说明，所有操作都是在8℃进行，缓冲液是0.05M磷酸钾(pH7.0)。
(1)培养氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)
在27℃，氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)在含有5.0％D-甘露醇、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浆、5.0％面包酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3和2.0％琼脂的琼脂平板上生长4天。取一满环的细胞接种到装在500ml锥形瓶中的50ml含有2％L-山梨糖、0.2％酵母提取物、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浆、0.5％尿素和1.5％CaCO3的种子培养基中，于30℃、180rpm在旋转摇床上培养1天。这样制备的种子培养物用于接种装在3升小型发酵罐中的2升培养基，其中含有8.0％L-山梨糖、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O，3.0％玉米浆、0.4％酵母提取物和0.15％消泡剂。发酵参数为：搅拌速度800rpm，通气量0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟)，温度30℃。在发酵过程中，用氢氧化钠维持pH在7.0。培养48小时后，连续离心收集3个发酵罐中的6升含有氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)细胞的培养液。回收含有细胞的沉淀，悬浮于适当体积的盐水中。悬浮液以2,500rpm(1,000×g)离心后，回收含有稍微红细胞的上清液，以去除由作为培养基成分的玉米浆和酵母提取物产生的不溶物。上清液然后在8,000rpm(10,000×g)离心，得到细胞沉淀。结果，从6升培养液中得到湿重38.4g的氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)细胞。
(2)制备胞质级分
用100ml缓冲液把细胞糊的一部分(19.2g)悬浮起来，通过弗式细胞压碎器。离心去除完整细胞后，将上清液定义为无细胞提取物，该无细胞提取物在100,000×g离心60分钟。得到的上清液(112ml)定义为氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的可溶级分。该级分在缓冲液中透析后，将112ml从L-山梨糖醛酮生产维生素C时比活为0.172单位/mg蛋白的透析级分用于下一步纯化。
(3)二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素柱层析
透析液(112ml)上用缓冲液平衡后的DEAE-纤维素柱(WhatmanDE-52，3×50cm；Whatman BioSystems Ltd.，Springfield MIII，JamesWhatman Way，Maidstone，Kent，英国)，用缓冲液洗脱次要蛋白。然后用含有0.28～0.58M NaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱。主要酶活性在0.36MNaCl下洗脱。收集活性级分(97.5ml)。
(4)DEAE-琼脂糖柱层析
上一步透析后的活性级分中的一部分(97ml)上用缓冲液平衡后的DEAE-琼脂糖CL-6B柱(Pharmacia，3.0×25cm)。该柱用含有0.3M NaCl的缓冲液洗涤后，向缓冲液中加入0.3～0.45M线性梯度的NaCl。活性级分在0.44～0.47M的NaCl浓度下洗脱。收集活性级分(40ml)，在缓冲液中透析。
(5)Q-琼脂糖柱层析(第1步)
透析后的活性级分(40ml)上用缓冲液平衡后的Q-琼脂糖(Pharmacia，1.5×25cm)柱。该柱用含有0.3M NaCl的缓冲液洗涤后，向缓冲液中加入0.3～0.5M线性梯度的NaCl。活性级分在0.44～0.46M的NaCl浓度下洗脱。
(6)Q-琼脂糖柱层析(第2步)
上一步合并后的活性级分(17ml)在缓冲液中透析。透析后的样品(17ml)上用缓冲液平衡后的Q-琼脂糖(Pharmacia，1.5×25cm)柱。该柱用含有0.33M NaCl的缓冲液洗涤后，向缓冲液中加入0.33～0.48M线性梯度的NaCl。活性级分在0.45～0.48M的NaCl浓度下洗脱。
(7)疏水柱层析
上一步的活性级分经过超滤器(Centriprep-10)过滤以脱盐浓缩。脱盐浓缩样品(780μl)中的一部分(750μl)加入到等体积(750μl)的含有3M硫酸铵(终浓度1.5M)的缓冲液中。样品离心(15,000×g)后，上清液上用含有1.5M硫酸铵的缓冲液平衡后的疏水柱RESOURCE-ISO(Pharmacia.床体积：1.0ml)。该柱用含有1.5M硫酸铵的缓冲液洗涤后，蛋白用含有1.5～0.75M线性梯度硫酸铵的缓冲液洗脱。相应于SNDH II的活性在1.04～1.00M的硫酸铵浓度下洗脱。该活性级分用透析杯(Dialysis-cupMWCO8000，Daiichi pure chemicals，Nihonbashi 3-13-5，Chuo-ku，Tokyo，日本)在缓冲液中透析。
然后，合并这些级分并于-20℃储存。
该酶纯化步骤的总结如表3所示。
表3来自氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的醛脱氢酶的纯化
  步骤   总活性(单位)   总蛋白(mg)   比活(单位*/mg蛋白)
  可溶性级分DEAE-纤维素DE52DEAE-Sepharose CL-6BQ-Sepharose(第1步)Q-Sepharose(第2步)RESOURCE-ISO   151.4173.045.0723.6513.704.84   879.337.7310.631.4620.5270.099   0.1724.5844.24216.1726.0348.90
该酶的1个单位*定义为在1a)中所述的反应混合物中每小时生成1mg维生素C的酶量。
(8)分离后的酶的纯化
生产维生素C时的比活为48.9单位/mg蛋白而生产2-KGA时的比活为12.3单位/mg蛋白的纯化后的酶(0.039mg/ml)用于下述分析：
用含有0.3M NaCl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡后的尺寸排阻凝胶柱(TSK凝胶G3000 SWXL柱，7.8×300mm)在280nm通过高效液相色谱测量天然酶的分子量，流速为1.5ml/分。氰钴胺素(1.35kDa)、肌红蛋白(17kDa)、卵清蛋白(44kDa)、γ-球蛋白(158kDa)和甲状腺球蛋白(670kDa)用作分子量标准。纯化后的酶显示出分子量分别为100,000±10,000Da和150,000±15,000Da的两个峰。
根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，表明该酶的亚基的分子量为约55,000±2,000Da。因此，估计纯化后的酶由2个或3个同源亚基组成。
(9)反应产物的鉴定
在30℃，将含有纯化的酶(0.39μg)、L-山梨糖醛酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混合物在100μl缓冲液中温育1小时。在薄层层析(硅胶60F254，MERCK，64271Darmstadt，德国)和HPLC上分析反应产物。从酶反应得到两种产物，维生素C和2-KGA。对于维生素C，在HPLC系统的氨基柱(YMC-Pack多胺-11，YMC，Inc.)上分析样品。对于2-KGA，在HPLC系统的C-18柱(YMC-Pack Pro C18，YMC，Inc.)上分析样品。
实施例2
pH对SNDH II从L-山梨糖醛酮生产维生素C或2-KGA的影响
测试了pH对酶反应的影响。在30℃，将含有纯化的酶(273ng)、L-山梨糖醛酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混合物在100μl缓冲液(100mM)中温育1小时。通过HPLC分析反应产物。结果如表4所示。
表4：pH对SNDH II从L-山梨糖醛酮生产维生素C或2-KGA的影响
  缓冲液   pH   生成的维生素C(mg/l)   生成的2-KGA(mg/l)
  柠檬酸盐-NaOH柠檬酸盐-NaOH柠檬酸盐-NaOH磷酸钾磷酸钾磷酸钾磷酸钾Tris-HClTris-HClTris-HCl   4.505.506.506.767.157.557.977.868.348.83   0.03.864.77.864.476.349.670.718.57.2   0.027.721.2未做未做1.019.5117.8124.0170.7
实施例3
温度对SNDH II从L-山梨糖醛酮生产维生素C或2-KGA的影响
测试了温度对酶反应的影响。在不同的温度(20～60℃)，将含有纯化的酶(390ng)、L-山梨糖醛酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混合物在100μl25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中温育1小时。通过HPLC分析反应产物。结果如表5所示。
表5温度对SNDH II从L-山梨糖醛酮生产维生素C或2-KGA的影响
  温度(℃)   生成的维生素C(mg/l)   生成的2-KGA(mg/l)
  20253035405060   187.4218.8190.7196.4176.7138.047.3   50.653.548.140.337.232.84.3

Claims (11)

1.一种纯化的醛脱氢酶，它来自能够生产所述的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物，并具有下述的物理化学性质：
a)由2个同源亚基组成、分子量为100,000±10,000Da或由3个同源亚基组成、分子量为150,000±15,000Da，其中每一个亚基的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、D-木糖有活性，
c)辅因子：吡咯并喹啉醌，
d)对于从L-山梨糖醛酮生产维生素C的最适pH为6.5至8.0，对于从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸的最适pH为9.0，
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和一碘乙酸盐。
2.一种生产具有下述物理化学性质的醛脱氢酶的方法：
a)由2个同源亚基组成、分子量为100,000±10,000Da或由3个同源亚基组成、分子量为150,000±15,000Da，其中每一个亚基的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、D-木糖有活性，
c)辅因子：吡咯并喹啉醌，
d)对于从L-山梨糖醛酮生产维生素C的最适pH为6.5至8.0，对于从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸的最适pH为9.0，
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和一碘乙酸盐，
所述方法包括：在需氧条件下在水性营养培养基中培养能够生产具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物，破碎微生物细胞，从破碎后的微生物细胞的无细胞提取物中分离和纯化醛脱氢酶。
3.根据权利要求2的方法，其中培养在pH5.5至9.0、温度20至50℃进行。
4.根据权利要求2-3中任一项的方法，其中所述的微生物是具有菌株氧化葡糖杆菌DSM No.4025的鉴别特征的氧化葡糖杆菌。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的微生物是氧化葡糖杆菌DSMNo.4025。
6.一种从选自L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、D-木糖的底物生产2-酮-L-古洛糖酸和/或维生素C的方法，它包括在非NAD、NADP及氧的电子受体存在时将所述底物与具有下述物理化学性质的纯化的醛脱氢酶接触：
a)由2个同源亚基组成、分子量为100,000±10,000Da或由3个同源亚基组成、分子量为150,000±15,000Da，其中每一个亚基的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对L-山梨糖醛酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖、D-木糖有活性，
c)辅因子：吡咯并喹啉醌，
d)对于从L-山梨糖醛酮生产维生素C的最适pH为6.5至8.0，对于从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸的最适pH为9.0，
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和一碘乙酸盐，
或者与由能够生产具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物制备出的无细胞提取物接触。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的微生物是具有菌株氧化葡糖杆菌DSM No.4025的鉴别特征的氧化葡糖杆菌。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的微生物是氧化葡糖杆菌DSMNo.4025。
9.根据权利要求6的方法，其中所述底物是L-山梨糖醛酮。
10.根据权利要求6-9中任意一项的方法，其中对于维生素C和2-酮-L-古洛糖酸的生产，反应在pH5.5至9.0、温度20至50℃时进行。
11.根据权利要求6-9中任意一项的方法，其中生产维生素C的反应在pH6.5至8.0及温度20至40℃进行，生产2-酮-L-古洛糖酸的反应在pH9.0及温度20至30℃进行。
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