MXPA02003091A - Nuevas enzimas que deshidratan glicerol. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y reactivos mejorados para la produccion de 1, 3-propanodiol. En particular, la presente invencion proporciona nuevos organismos termofilicos y enzimas termoestables capaces de catalizar la fermentacion del glicerol en 1,3-propanodiol. La presente invencion tambien se refiere a metodos para aislar tales organismos termofilicos, a metodos de clonacion de polinucleotidos que codifican para tales enzimas, a polinucleotidos que codifican para tales enzimas y a metodos para usar tales enzimas y organismos para la produccion de 1,3-propanodiol.

Description

NUEVAS ENZIMAS QUE DESHIDRATAN GLICEROL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos mejorados y reactivos para la producción de 1,3- propanodiol. En particular, la presente invención proporciona nuevos organismos termofílicos y enzimas termoestables capaces de catalizar la fermentación del glicerol a 1 , 3-propanodiol . La presente invención también se refiere a métodos para aislar tales organismos termofílicos, a métodos de clonación de polinucleótidos que codifican para tales enzimas, a polinucleótidos que codifican las enzimas y a métodos de uso de tales enzimas y organismos para la producción de 1 , 3-propanodiol . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El 1, 3-propanodiol es un monómero utilizado en la producción de fibras de poliéster y en la manufactura de poliuretanos y compuestos cíclicos. Se conoce una variedad de rutas sintéticas de 1, 3-propanodiol . Por ejemplo, el 1, 3-propanodiol puede ser sintetizado: (1) mediante la transformación del óxido de etileno por la acción de un catalizador en presencia de fosfina, agua, monóxido de carbono, hidrógeno y un ácido; (2) mediante una hidratación catalítica en solución de acroleína, seguida por una reducción; o (3) mediante la REF 137045 - - reacción de un hidrocarburo (e.g., glicerol) en presencia de monóxido de carbono e hidrógeno, por la acción de catalizadores que tengan átomos del grupo VIII de la tabla periódica de los elementos. Sin embargo, los métodos tradicionales de síntesis química son costosos y generan corrientes de deshechos que contienen contaminantes ambientales y, por lo tanto, están lejos de ser ideales. Sería deseable desarrollar métodos y reactivos alternativos para la producción de 1, 3-propanodiol, que sean menos costosos y ambientalmente más amigables. Un enfoque alternativo es el uso de enzimas, ya sea in vivo (i.e, en un microorganismo) o bien, in vi tro, para catalizar la fermentación del glicerol a 1,3- propanodiol. Véase e.g. las Publicaciones Internacionales de Patente WO 98/21339, WO 98/21341 y Patentes Norteamericanas Nos. US 5,821,092; 5,254,467; 5,633,362 y 5,686,276. Se han encontraao cepas de bacterias capaces de producir 1, 3-propanodiol a partir de glicerol, por ejemplo, en los grupos Ci trobacter, Clostridium, Enterobacter, Tlyo-bacter, Kl ebsiella, Lactobacill us y Pel obacter. Estas bacterias convierten el glicerol en 1, 3-propanodiol por medio de una reacción de dos etapas catalizada por enzimas. En la primera etapa, una deshidratasa cataliza la transformación del glicerol en 3-hidroxi-propionaldehído (3-HP) y agua (Ecuación 1) . En la segunda etapa, el 3-HP es reducido a 1, 3-propanodiol mediante una oxidorreductasa ligada a NAD"' (Ecuación 2) . Glicerol ? 3-HP + H20 (Ecuación 1) 3-HP + NADH * H+ ? 1 , 3-propanodiol + NAD" (Ecuación 2) El 1, 3-propanodiol no es metabolizado adicionalmente y, como consecuencia, se puede acumular en el medio de cultivo hasta una alta concentración. La reacción general da como resultado la oxidación de la forma reducida del dinucleótido b-nicotinamida-adenina (NADH) en el dinucleótido nicotinamida-adenina (NAD") . La biotransformación del glicerol en 1,3- propanodiol generalmente se realiza en condiciones anaeróbicas, utilizando el glicerol como la única fuente de carbono y en ausencia de otros receptores de reducción 15 equivalentes exógenos . En algunas cepas bacterianas, e.g. ciertas cepas de Ci trobacter, Cl ostridi um y Kl ebsi ell a , opera una ruta paralela para el metabolismo del glicerol, la cual primero involucra la oxidación del glicerol en dihidroxiacetona (DHA) por la acción de una glicerol 20 deshidrogenasa ligada a NAD^- (NADP~-) (Ecuación 3) . La DHA, después de una fosforilación para obtener dihidroxiacetonafosfato (DHAP) mediante una DHA cinasa (Ecuación 4) se vuelve disponible para la biosíntesis y para soportar la generación de ATP vía, por ejemplo, una 25 glicólisis. <a3tí*t*****t*kAl¿iLJ, Glicerol + NAD+ ? DHA + NADH + H+ (Ecuación 3) DHA + ATP ? DHAP + ADP (Ecuación 4) En contraste a la ruta del 1, 3-propanodiol, esta ruta puede proporcionar carbono y energía a la célula y produce, en vez de consumir, NADH. En Klebsiella pneumoniae y Ci trobacter freundii , los genes que codifican las actividades funcionalmente ligadas de la glicerol deshidratase ( dhaBCE) , 1,3- propanodiol oxidorreductasa { dhaT) , glicerol deshidrogenasa ( dhaD) y dihidroxiacetona cinasa [ dhaK) se encuentran en el reguión dha . Los regulones dha de Ci trcbacter y Kl ebsi ella han sido expresados en Escheri chia coli y se ha demostrado que transforman el glicerol en 1, 3-propanodiol (Tong et al . , Appl . Environ . Mi crobi ol . 57:3541-46 (1991); Seyfried et al . , J of Bact . 178:5793-96 (1996); Tobi atsu et al . J. Bi ol . Chem . , 271:22352-22357 (1996)). En vista de las ventajas potenciales inherentes al uso de métodos y reactivos biológicos para producir el 1, 3-propanodiol, existe la necesidad del desarrollo e identificación de nuevos microorganismos y enzimas capaces de transformar el glicerol y otros sustratos de carbono en 1, 3-propanodiol, que tengan características superiores. La presente invención satisface esa necesidad al proporcionar microorganismos y enzimas superiores, junto con métodos de identificación de otros microorganismos y enzimas -j-j-Üt -' '• »----,.-.- -.--.,»._•, --.--.----jA-,- ------_-.j.-i.--, -t-ü.-....? --..--i.-->!-.--_ Ja^J-.--ai-A-„----..-,,J,»,--£-,--, Asi. - _ j - - superiores. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y reactivos mejorados para la producción de 1, 3-propanodiol. En particular, la presente invención proporciona nuevos organismos termofílicos y enzimas termoestables capaces de catalizar la fermentación del glicerol en 1, 3-propanodiol . La presente invención también se refiere a métodos para aislar tales organismos termofílicos, a métodos para clonar polinucleótidos que codifican para tales enzimas, a polinucleótidos que codifican las enzimas y a métodos para utilizar tales enzimas y organismos para la producción de 1 , 3-propanodiol . En un aspecto, la presente invención proporciona un método para transformar glicerol en 1, 3-propanodiol en un organismo termofílico, en donde el método comprende: proporcionar un organismo termofílico que fermente glicerol en 1, 3-propanodiol y cultivar el organismo termofílico bajo condiciones tales que se produzca el 1, 3-propanodiol . En una modalidad preferida, el método además comprende el paso de reunir el 1, 3-propanodiol producido por el organismo termofílico. En otra modalidad preferida, el organismo termofílico es Calorama tor vi terbiensis, en donde se prefiere particularmente un organismo termofílico derivado del microorganismo depositado en la ATCC (American Type t- a,. - 1-1 - - Culture Collection, Colección Norteamericana de Cultivos Tipo) designado con la clave PTA-584. La presente invención además proporciona un método para producir 1, 3-propanodiol a partir de glicerol, en donde el método comprende: incubar glicerol con una enzima deshidratasa termoestable, transformando de esta manera el glicerol en 3-hidroxipropionaldehído; y reducir el 3-hiroxipropionaldehído en 1, 3-propanodiol. En una modalidad preferida, la reducción del 3-hidroxipropionaldehído en 1, 3-propanodiol es catalizada por una 1, 3-propanodiol oxidorreductasa termoestable. En otra modalidad preferida, el método además comprende el paso de reunir el 1, 3-propanodiol . En todavía otra modalidad preferida, la enzima deshidratasa termoestable se deriva de un organismo termofílico tal como Caloramator vi terbiensis, en donde se prefiere particularmente un organismo termofílico derivado del microorganismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada, que se deriva de C. vi terbiensis, en donde se prefiere particularmente una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada del microorganismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584. En modalidades particularmente a ---3-¿-- ..& .* - preferidas, la enzima de fermentación de glicerol termoestable es una deshidratasa, tal como una glicerol deshidratasa, o una oxidorreductasa ligada a NAD+, tal como la 1, 3-propanodiol oxidorreductasa. La presente invención también proporciona una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada que es homogénea a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis. La presente invención también proporciona un cultivo aislado o célula de C. vi terbiensi s . En una modalidad no limitante, el genoma del cultivo o célula tiene cuando menos 85% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584, de preferencia 90% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584, más preferiblemente 95% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584 y todavía más preferiblemente cuando menos 99% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584. En otra modalidad no limitante, la secuencia de 16S ADNr del cultivo o célula tiene cuando menos 95% de identidad a la secuencia de 16S ADNr de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584 y de preferencia cuando menos 98% de - ^i.¿a- ¿i--¿ . ---_-&--------£ . identidad con la secuencia de 16S ADNr de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de clonación de una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable, en donde el método comprende: hibridizar sondas de polinucleótido homologas a una porción de un gen de una enzima de fermentación de glicerol conocido, a una molécula de polinucleótido proveniente de una muestra ambiental que se sospeche que contenga un organismo termofílico; y aislar una secuencia de polinucleótido que se una a cuando menos una sonda de polinucleótido. En una modalidad no limitante, el método utiliza una reacción en cadena catalizada por polimerasa para amplificar la secuencia de polinucleótido que se une a las sondas de polinucleótido. En una modalidad preferida, la enzima de fermentación de glicerol termoestable se deriva de un organismo termofílico identificado como fermentador de glicerol en 1, 3-propanodiol, en donde se prefiere particularmente a C. vi terbiensis . En otra modalidad preferida, las sondas de polinucleótido son homologas a una porción de un gen dhaB conocido, en donde las sondas homologas al gen dhaB de Klebsiela son particularmente preferidas. La presente invención además proporciona un - - método para clonar una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable, en donde el método comprende: transformar un organismo blanco que no pueda crecer anaeróbicamente en glicerol, con un ADN proveniente de un organismo termofílico; e identificar aquellos organismos blanco transformados que contengan la secuencia de polinucleótidos que codifique para una enzima que fermente glicerol en 1,3-propanodiol, por su crecimiento anaeróbico en glicerol. En una modalidad no limitante, la enzima de fermentación de glicerol termoestable se deriva de un organismo termofílico que se haya identificado que fermenta el glicerol en 1,3-propanodiol, tal como C. vi terbiensis, en donde se prefiere particularmente un organismo termofílico derivado del organismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona un método para aislar un organismo termofílico que catalizada la fermentación de glicerol en 1,3-propanodiol, en donde el método comprende: incubar una muestra que contenga organismos termofílicos en un medio que contenga glicerol como la fuente primaria de carbono; y aislar cuando menos un organismo termofílico que fermente el glicerol en 1, 3-propanodiol. En modalidades no limitantes, la muestra se incuba a una temperatura en el -ulJ-ii AmÁí rango de aproximadamente 40 a aproximadamente 100°C y/c bajo condiciones anaeróbicas. En otra modalidad no limitante, la muestra se obtiene a partir de una fuente natural que tenga una temperatura de entre aproximadamente la temperatura ambiente y aproximadamente 100°C, y más preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100°C. En una modalidad preferida, el método además comprende el paso de detectar la producción de 1,3- propanodiol y/o acetato por el organismo termofílico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de la cepa JW/MS-VS-5, td = tiempo de duplicación . La Figura 2 muestra el efecto del pH"°c sobre el crecimiento de la cepa JW/MS-VS-5 a 60°C, td = tiempo de duplicación. La Figura 3 muestra un dendrograma filogenético no arraizado basado en una comparación de las secuencias del gen 16S ARNs de JW/MS-VS-5 y cepas relacionadas. El árbol de vinculación de vecinos fue reconstruido a partir de matrices de distancia. Los valores de datos del análisis de 1000 conjuntos de datos (expresados como porcentajes) se muestran en los puntos de ramificación. La barra de escala representa 5 sustituciones de nucleótidos por 100 nucleótidos. „ -- -, -¿--kü . í - - La Figura 4 muestra un ensayo de tiempo para la transformación del glicerol en 3-HPA por células JW/MS-VS-5 anaeróbicamente toluenizadas, a 60°C en condiciones anaeróbicas. La Figura 5 muestra un ensayo de tiempo de la transformación de 1, 3-propanodiol en propionaldehído, por células JW/MS-VS-5 anaeróbicamente toluenizadas, a 60°C en condiciones anaeróbicas.

- - DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los organismos termofílicos son organismos que viven y crecen a temperaturas elevadas, en donde gran parte de los demás organismos (e.g., mesófilos) no serían capaces de sobrevivir. Esta desusual resiliencia hacia las altas temperaturas, es el resultado en parte del uso de enzimas termoestables por estos organismos para catalizar las reacciones biológicas de la vida. Las enzimas termoestables les permiten a los organismos termofílicos catalizar reacciones metabólicas a temperaturas elevadas. Tales organismos pueden ser aislados de ambientes a temperatura ambiente, pero es más probable que sean aislados de ambientes a alta temperatura, incluyendo por ejemplo, aguas termales, respiraderos termales y aguas emanadas de lavanderías automáticas. La inusual termoestabilidad de las bacterias termofílicas y enzimas, permiten catalizar de manera económicamente valiosa biotransformaciones a temperaturas más elevadas que se pudieran lograr utilizando organismos y enzimas mesofílicos. En muchos casos, las bacterias termofílicas se utilizan para catalizar la reacción deseada ín vivo en un proceso de fermentación. Alternativamente, las enzimas termoestables se pueden utilizar para catalizar biotransformaciones in vi tro o "libres de células", típicamente por medio de enzimas que han sido inmovilizadas - - para facilitar el control de la reacción y la recuperación del producto de la reacción. Se pueden lograr un número de ventajas al realizar biotransformaciones a temperaturas elevadas. Como es el caso con cualquier reacción química, las velocidades de las reacciones enzimáticamente catalizadas generalmente se incrementan drásticamente con el incremento de la temperatura de reacción. Obviamente, los beneficios de eficiencia se derivan del aumento de la velocidad a la cual procede una biotransformación industrial. Además, es posible prevenir la contaminación microbiana de un medio de reacción al llevar a cabo la reacción a una temperatura elevada, en la cual gran parte de los organismos potencialmente contaminantes son incapaces de sobrevivir. Otra ventaja de utilizar un organismo termofílico para catalizar una biotransformación a altas temperaturas, es que en algunos casos la temperatura alta facilita la separación y el aislamiento del producto deseado del medio de reacción. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. US 5,182,199 describe el uso de enzimas termoestables y fermentaciones a alta temperatura para facilitar la separación de etanol de un medio de reacción. Más allá de ser estables a altas temperaturas, las enzimas termoestables generalmente también se encuentra que poseen una mayor estabilidad en otras condiciones y ü-nn..««-¡-É»-----'-.- ¡i-»- a---- . ta L-i ¿-.-e-a-frente a otras sustancias que normalmente inactivan a las enzimas. Las enzimas termoestables también tienden a tener una vida de anaquel más prolongada que las enzimas derivadas de un organismo mesofílico. La presente invención proporciona métodos y reactivos mejorados para la producción de 1, 3-propanodiol catalizada con enzimas. En parte, la presente invención proporciona, por primera vez, organismos termofílicos y enzimas termoestables capaces de catalizar la fermentación de glicerol en 1, 3-propanodiol . La nueva característica de estos organismos y enzimas es su capacidad de permanecer viables y catalíticamente activos a temperaturas elevadas, temperaturas a las cuales organismos y enzimas productores de 1, 3-propanodiol previamente identificados se inactivan rápidamente. Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden utilizar para transformar biológicamente glicerol en 1, 3-propanodiol a temperaturas elevadas, proporcionando de esta manera ventajas significativas sobre los métodos previamente descritos, particularmente métodos realizados a temperaturas más bajas. La presente invención además incluye métodos para identificar organismos termofílicos capaces de producir 1, 3-propanodiol a partir de glicerol, asi como métodos de clonación de polinucleótidos que codifican para enzimas termoestables que catalizan esta transformación. ti-i-taÉ,-tÁ ??iii?to?---i---' - - Organismos Termofilicos Capaces de Fermentar Glicerol en 1,3-Propanodiol a Temperaturas Elevadas y Métodos para Aislar tales Organismos En una modalidad, la presente invención proporciona un organismo termofílico capaz de fermentar glicerol en 1, 3-propanodiol a temperaturas elevadas. Tal como se utiliza en la presente, el término "organismo termofílico" se refiere a un organismo capaz de crecer a temperaturas altas, de preferencia a temperaturas mayores de 50°C, más preferiblemente a temperaturas mayores de 60°C, todavia más preferiblemente a temperaturas mayores de 70°C y lo más preferible a temperaturas mayores de 85°C. Los organismos que son capaces de crecer a temperaturas mayores de 85°C se denominan organismos hipertermofílicos . Ejemplos de organismos termofílicos se pueden encontrar, por ejemplo, entre los microorganismos procarióticos, eubacterias y arqueobacterias. Tales organismos habitan y pueden ser aislados de ambientes calientes tales como aguas termales, áreas volcánicas y respiraderos termales submarinos. Además, los organismos termofílicos se pueden aislar de fuentes a temperatura ambiente. En una modalidad preferida de la presente invención, el organismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol a temperaturas elevadas, es una cepa de Caloramator vi terbiensis . C. vi terbiensis es una - especie de bacteria termofílica capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol y acetato. C. vi terbiensis se define en la presente como una especie de bacteria que posee las siguientes características de identificación: la especie es (1) termofílica; (2) capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol y (3) comparte una "identidad de secuencia genómica sustancial" con la cepa tipo JW/MS- VS5T, depositada en la ATCC con la clave de designación PTA-584. En una modalidad no limitante de la presente invención, un miembro de la especie C. vi terbiensis también compartirá las siguientes características de identificación de la cepa tipo JW/MS-VS5T. Las células JW/MS-VS5T son bacilos rectos o ligeramente curvados, de 0.4 a 0.6 um de tamaño. Las células se presentan separadas y presentan una tinción de Gram positiva. El rango de temperatura de crecimiento a pH 6.0 es de 33 a 64°C, siendo el óptimo 58°C. El rango de pH25°c para el crecimiento es de 5.0 a 7.6, con un óptimo en 6.0-6.5. Se observa crecimiento con glicerol, glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, sacarosa, celobiosa, lactosa, almidón y extracto de levadura. La cepa no fermenta apreciablemente la xilosa, arabinosa, acetato, lactato, formiato, metanol, etanol, n-propanol, i- propanol, n-butanol, propionato, acetona, succinato, etilenglicol, 1, 2-propanodiol, fenol y benzoato. No se - - observa ningún crecimiento apreciable en condiciones autotróficas en presencia de H2:C02. La fermentación del glicerol produce acetato y 1, 3-propanodiol como principales productos orgánicos, produciendo cantidades significativas de H2 durante el crecimiento. El crecimiento es inhibido por la ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, rifampicina y kanamicina (todos ellos a 100 µg/mL) . La estreptomicina o tetraciclina a la misma concentración retarda el crecimiento. El contenido de G+C del ADN de la cepa es de 32 mol%, determinado por HPLC. Para los propósitos de identificar un miembro putativo de la especie C. vi terbi ensis, el término "identidad de secuencia genómica sustancial" se refiere a: cuando menos 90% de identidad, de preferencia cuando menos 95% de identidad y más preferiblemente cuando menos 99% de identidad de la secuencia genómica del organismo con respecto a la secuencia genómica de la cepa tipo JW/MS-VS5T ó, cuando menos 90% de identidad, de preferencia cuando menos 95% de identidad y más preferiblemente cuando menos 99% de identidad de la secuencia de 16S ADNr del organismo con respecto a la secuencia de 16S ADNr de la cepa tipo JW/MS-VS51. La identidad de secuencia sustancial se puede determinar comparando las secuencias genómicas enteras de una cepa putativa de C. vi terbiensis y la cepa J /MS/VS5T.

Alternativamente, la identidad de secuencia sustancial se puede determinar comparando las secuencias de 16S ADNr de una cepa putativa de C. vi terbiensis con la cepa JW/MS- VS5T. La secuencia de la totalidad o una porción del genoma de JW/MS-VS5T y una cepa putativa de C. vi terbiensis, particularmente la secuencia del 16S ADNr del organismo, se puede determinar por técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos convencionales, las cuales son conocidas para los técnicos en la materia (véase e.g., SAMBROOK et al , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (1989) y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al . , eds. 1989)). Después, las secuencias se pueden comparar utilizando métodos de comparación de secuencias conocidos para los técnicos en la materia. Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de computadora BLAST, versión 2.0, disponible en la Red Mundial World-Wide Web, en el sitio http://www.ncbi.nlm.nhi.gov. Para obtener una descripción del programa BLAST, véase e.g., Altschul et al . , J. Mol . Biol . 215:403-10 (1990) y Altschul et al . , Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). En una modalidad específica, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar glicerol en 1, 3-propanodiol, cuyo genoma es hibridizable con el genoma de la cepa tipo JW/MS-VS5T bajo - - condiciones poco estrictas. En una modalidad preferida alternativa, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, cuya secuencia de 16S ADNr es hibridizable con la secuencia de 16S ADNr de la cepa tipo JW/MS-VSd11 bajo condiciones poco estrictas. Los procedimientos utilizando tales condiciones poco estrictas pueden ser los siguientes (véase también Shilo y Weinberg, Proc. Nat 'l Acad. Sci . USA 78:6789-6792 (1981)): Filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), AEDT 5 mM, PVP al 0.1%, Ficoll al 0.1%, BSA al 1% y 500 µg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.2%, 100 µg/mL de ADN de esperma de salmón, sulfato de dextrán al 10% (peso/volumen) y 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada con 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 40°C y después se lavan durante 1.5 horas a 55°C en una solución que contiene 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4), AEDT 5 mM y SDS al 0.1%. La solución de lavado se reemplaza por solución fresca y se incuba durante 1.5 horas adicionales a 60°C. Los filtros se secan y se exponen a una película para autorradiografía. Si es necesario, los filtros se aj-tta-a*-- aaiJ - - lavan por tercera vez a 65-68°C y se vuelven a exponer a la película. Otras condiciones poco estrictas que se pueden utilizar son conocidas en la técnica (e.g., como las empleadas para hibridaciones de especies cruzadas) . En otra modalidad específica, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, cuyo genoma es hibridizable con el genoma de la cepa tipo JW/MS-VS5T bajo condiciones moderadamente estrictas. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, cuya secuencia de 16S ADNr es hibridizable con la secuencia de 16S ADNr de la cepa tipo JW/MS-VS5T bajo condiciones moderadamente estrictas. Los procedimientos utilizando tales condiciones moderadamente estrictas pueden ser los siguientes: Filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 55°C en una solución que contiene 6X SSC, 5X solución de Denhart, SDS al 0.5% y 100 µg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución y se utilizan 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada con 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55°C y después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60°C en una solución que contiene IX SSC y SDS al 0.1%. Los filtros se secan y se l--t--.i-.i-- -----i-.-..---.--.-----.---. _-j-fa_------t----.^. exponen a una película para autorradiografía. Otras condiciones moderadamente estrictas que se pueden utilizar son conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37°C durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, SDS al 0.1%. En otra modalidad específica, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, cuyo genoma es hibridizable con el genoma de la cepa tipo JW/MS-VS5T bajo condiciones altamente estrictas. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, cuya secuencia de 16S ADNr es hibridizable con la secuencia de 16S ADNr de la cepa tipo JW/MS-VS5T bajo condiciones altamente estrictas. Los procedimientos utilizando tales condiciones altamente estrictas pueden ser los siguientes: La prehibridación de los filtros que contienen ADN se lleva a cabo por un tiempo de 8 horas a una noche a 65°C en una solución reguladora compuesta por 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), AEDT 1 mM, PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.02% y 500 µg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridizan durante 48 horas a 65°C en una mezcla de prehibridación que contiene 100 µg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada - - con 32P. El lavado de los filtros se realiza a 37°C durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0.01%, Ficoll al 0.01% y BSA al 0.01%. Esto es seguido por un lavado en 0.1X SSC a 50°C durante 45 minutos antes de la radiografía. Se pueden utilizar otras condiciones altamente estrictas, las cuales son conocidas en la técnica. La especie C. viterbiensis además incluye la progenie de la cepa tipo JW/MS-VS5T, incluyendo progenie que posee genotipos alterados y/o fenotipos alterados en relación con la cepa tipo W/MS-VS5T. Los fenotipos y/o genotipos se pueden alterar por mutación, incluyendo como resultado de una mutagénesis dirigida o aleatoria. La presente invención proporciona células que tienen mutaciones únicas o múltiples específicamente diseñadas para mejorar la producción del 1, 3-propanodiol . Por ejemplo, se contempla que una cepa mutante capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol de manera que sea resistente al sustrato o a la represión del producto, sería particularmente útil en la presente invención. Los métodos para crear mutantes son comunes y conocidos en la técnica. Por ejemplo, las cepas silvestres se pueden exponer a una variedad de agentes, tales como radiación o mutágenos químicos y después se pueden seleccionar en busca del fenotipo deseado. Cuando se crean ^J?l^ - - mutaciones por radiación, se puede utilizar radiación ultravioleta (UV) o radiación ionizante. Los métodos específicos para crear mutantes utilizando radiación o agentes químicos están bien documentados en la técnica. Véase e.g. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., o Deshpande, Appl . Biochem. Biotechnol . 36:227-34 (1992), las cuales se incorporan en la presente como referencia. Después del tratamiento mutagénico, las mutantes que tengan el fenotipo deseado se pueden seleccionar mediante una variedad de métodos. La selección aleatoria es la más común cuando las células mutagenizadas se seleccionan en busca del atributo deseado. Los métodos de selección de mutantes están altamente desarrollados y son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial. Véase e.g., Brock, supra . La presente invención además proporciona métodos para aislar y mantener en cultivo organismos termofílicos capaces de fermentar glicerol en 1, 3-propanodiol . Tales organismos son útiles en la práctica de las modalidades de la presente invención e.g., se pueden utilizar para transformar biológicamente glicerol en 1, 3-propanodiol a temperatura elevada o se pueden usar como fuente de una enzima termoestable que fermenta el glicerol o un polinucleótido que codifique para la misma. _;-.,----- 1 t -*"*-- -'• - 4 - Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos se pueden encontrar, por ejemplo, en MANUAL OF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY (Gerhardt et al . , eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. o Brock, supra . Los reactivos y materiales utilizados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas, se pueden obtener de proveedores comerciales, por ejemplo Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis), Laboratorios DIFCO (Detroit, Mich.), GIBCO/BRL (Gaithersburg, Md.), o Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo. ) . Un organismo termofílico de la presente invención, e.g. C. Vi terbiensis se puede aislar de cualquier ambiente que sea apropiado para el crecimiento de organismos termofílicos, e.g. un respiradero termal, aguas termales o suelo y agua y sedimentos alrededor de ellos, o las aguas emanadas de lavanderías automáticas. Una muestra que consiste de, por ejemplo sedimento, agua o una mezcla de los mismos, se toma del ambiente de interés. Es deseable determinar el pH y la temperatura en el punto de muestreo como indicación de las condiciones óptimas para el crecimiento de cualquier organismo aislado a partir de la muestra. Después, la muestra se inocula en un medio de crecimiento basal, de preferencia un medio en el cual el glicerol es la única fuente o fuente primaria de carbono. -j-LA-t----** * -«i----*--.-»- -. *..* ._.---^---- - - Típicamente, el medio basal se inocula con la muestra hasta una concentración final de aproximadamente 10% (p/w) . El pH del medio de preferencia debe aproximarse al del punto de muestreo. Alternativamente, se pueden inocular una pluralidad de medios de crecimiento básales a diferentes pH para seleccionar organismos que tengan diferente dependencia del pH para su crecimiento. El cultivo de enriquecimiento, posteriormente, se incuba a una temperatura alta, de preferencia cuando menos aproximadamente 50°C, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 60°C y lo más preferible es a cuando menos aproximadamente 75°C, y se prefiere llevar a cabo en un ambiente anaeróbico o microaeróbico. Los lineamientos para el crecimiento de organismos termofílicos se pueden encontrar en, por ejemplo, Weigel, J., "Methods for Isolation and Study of Thermophiles", Capítulo 4 en THERMOPHILES: GENERAL, MOLECULAR AND APPLIED MICROBIOLOGY, T.D. Brock, ed. (John Wiley & Sons, N.Y.), pp. 17-37. Cuando se encuentra que un cultivo de enriquecimiento es capaz de utilizar glicerol como fuente de carbono, se puede aislar un cultivo homogéneo preparando una serie de diluciones del cultivo, sembrando la serie en un medio basal sólido (e.g., agar al 1.5%) utilizando sobrecapas de agar blando (e.g., medio basal conteniendo 0.8% de agar), picando colonias aisladas y subcultivándolas -..-_ .----i---- ? i .

---..---L--. en un medio líquido de la misma composición y verificando la formación de 1, 3-propanodiol y/o acetato. El 1,3-propanodiol se puede identificar directamente sometiendo el medio a un análisis de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . Por ejemplo, los medios de fermentación se pueden analizar en una columna analítica de intercambio iónico, utilizando una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01N, de manera isocrática. Alternativamente, el 1, 3-propanodiol se puede identificar utilizando otras técnicas analíticas apropiadas, incluyendo pero no limitándose a la cromatografia de gases (GC) y la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) . Una cepa de un organismo termofílico que se encuentre capaz de transformar el glicerol en 1,3-propanodiol, se puede mantener en cultivo utilizando técnicas de mantenimiento de cultivo y preservación, conocidas en este campo. Estos métodos incluyen la refrigeración por periodos cortos de tiempo, la congelación en nitrógeno líquido para almacenamiento prolongado y la liofilización para deshidratar las células. La elección del método de preservación depende de la naturaleza del cultivo y de las facilidades que estén disponibles. Cuando se utiliza el congelamiento, las velocidades de congelamiento y descongelamiento deben ser cuidadosamente controladas para asegurar la supervivencia de los -,..;--.-,,„.--- ».-------_----... . .-._--.----- ..-.- .--...-- --------. «««-->. - --i ----------.---»*--- '--- •-- . — * -«- •*'*-microorganismos, ya que los cristales de hielo formados durante el congelamiento pueden romper las membranas. El glicerol se emplea a menudo como agente "anticongelante" para prevenir daños causados por cristales de hielo y asegurar la capacidad de recuperar microorganismos viables cuando se descongelan los cultivos congelados. Enzimas Termoestables Capaces de Producir 1,3- Propanodiol a Temperaturas Elevadas En una modalidad, la presente invención proporciona una enzima termoestable que cataliza una etapa en la fermentación del glicerol en 1, 3-propanodiol a temperaturas elevadas, referida en la presente como una "enzima de fermentación de glicerol termoestable". Tal como se utiliza en la presente, el término "enzima de fermentación de glicerol termoestable" se refiere a una enzima que cataliza cuando menos una etapa de reacción en la fermentación de un glicerol para obtener 1, 3-propanodiol y que dicha enzima es "termoestable", i.e. estable y activa a altas temperaturas, de preferencia a temperaturas superiores a los 50°C, más preferiblemente a temperaturas superiores a los 60°C, todavía más preferiblemente a temperaturas superiores a los 70°C y lo más preferible a temperaturas superiores a 85°C. Una enzima es "estable" a una temperatura dada si es capaz de retener cuando menos el 50% de su actividad catalítica - - original después de ser expuesta a esa temperatura durante al menos 5 minutos, de preferencia al menos 30 minutos, más preferiblemente al menos 1 hora, todavía más preferiblemente al menos 8 horas y lo más preferible al menos 24 horas o más. En muchos casos, las enzimas termoestables también tienen una mayor vida de anaquel o almacenamiento y son más estables a las condiciones desnaturalizantes, tales como la agitación física o la exposición a disolventes orgánicos, en comparación con las enzimas no termoestables que comparten características funcionales similares. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una enzima de fermentación de glicerol termoestable que se deriva de C. vi terbiensis . En una modalidad preferida pero no limitante, la presente invención proporciona una deshidratasa termoestable derivada de C. vi terbiensis. En otra modalidad preferida pero no limitante, la presente invención proporciona una 1, 3-propanodiol oxidorreductasa termoestable derivada de C. vi terbi ensis . En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la enzima de fermentación de glicerol termoestable se deriva de la cepa JW/MS-Vs5t. Tal como se utiliza en la presente, el término "deshidratasa" se refiere a cualquier enzima que sea capaz de catalizar la transformación de una molécula de glicerol - - en el producto 3-hidroxipropionaldehído. Ejemplos específicos de deshidratasas son la glicerol deshidratasa y la diol deshidratasa, i.e., deshidratasas que tienen sustratos preferidos de glicerol y 1, 2-propanodiol, respectivamente. El término "1, 3-propanodiol oxidorreductasa" se refiere a una enzima capaz de catalizar la transformación de 3-hidroxipropionaldehído en 1, 3-propanodiol, con la concomitante oxidación de NADH. La capacidad de catalizar una etapa de la reacción en la fermentación de un glicerol en 1,3-propanodiol, se puede determinar ensayando la actividad de la enzima. La actividad de fermentación del glicerol se puede ensayar utilizando técnicas conocidas para los técnicos en la materia. Por ejemplo, algunos métodos para ensayar la actividad de una deshidratasa se describen en Poppe et al . , Eur. J. of Biochem 245:398-41 (1997), Honda et al . , J. o f Bact . 143:1458-65 (1980) y Macis et al . , FEMS Microbiology Letters 164:21-28 (1998), las cuales se incorporan en la presente, en su totalidad, como referencia. Un método para ensayar la actividad de la 1,3-propanodiol oxidorreductasa se describe, por ejemplo, en Johnson et al . , J. of Bact . 169:2050-54 (1987), que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. La actividad enzimática se puede determinar in si tu ....>..».----,------«_ •-»---- --------.-_..., . --i-A.-..-.->--^&«-- II ¡ " "-"^ '-utilizando células tratadas con tolueno o toluenizadas, de la manera descrita por ejemplo por Honda et al . La capacidad de una enzima para catalizar una etapa de reacción en la fermentación de un glicerol a 1,3-propanodiol, también se puede determinar expresando la enzima en una célula huésped que normalmente no es capaz de fermentar glicerol y ensayando si la expresión de la enzima permite que la célula fermente glicerol. Para los propósitos de la presente invención, una enzima termoestable productora de 1, 3-propanodiol es "derivada" de C. vi terbiensis o de una cepa especificada de C. vi terbiensis, si: (a) es expresada endógenamente por C. vi terbiensis o la cepa especificada de C. vi terbi ensis, o su secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia codificadora de polinucleótidos que esté presente en C. vi terbiensis o en la cepa especificada de C. vi terbiensis; y (b) es útil en la práctica de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente, una enzima es "útil en la práctica de la presente invención" si dicha enzima es una enzima de fermentación de glicerol termoestable, i.e., una enzima que catalice cuando menos una etapa de reacción en la fermentación del glicerol a 1, 3-propanodiol y que sea estable y activa a altas temperaturas, de preferencia a temperaturas mayores de 50°C, más preferiblemente a temperaturas mayores de 60°C, todavia más preferiblemente a temperaturas mayores de 70°C y lo más preferible a temperaturas mayores de 85°C. La presente invención además proporciona una enzima que es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis . Para los propósitos de la presente invención, una enzima es "homologa" a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, si: (a) su secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia codificadora de polinucleótidos que se hibridice con el complemento de una secuencia de polinucleótidos que codifique para una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, baj o condiciones moderadamente estrictas, i.e, hibridación con ADN unido a papel filtro en NaHP04 0.5M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, AEDT 1 mM, a 65°C y lavando con 0.2xSSC/0.1% de SDS a 42°C (Ausubel et al . , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la pág. 2:10.3 y (b) si es útil en la práctica de la presente invención. En una modalidad preferida, la enzima homologa es codificada por una secuencia codificadora de polinucleótido que se hibridiza con el complemento de una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C.

J.i.fc«H-,....-.i-- - - - vi terbiensis, bajo condiciones altamente estrictas, i.e., hibridación con ADN unido a papel filtro en NaHP04 0.5M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, AEDT 1 mM, a 65°C y lavando con O.lxSSC/0.1% de SDS a 68°C (Ausubel et al . , 1989 supra) y si es útil en la práctica de la presente invención. Una enzima que es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, puede tomar varias formas. En algunas modalidades de la presente invención, la enzima homologa es una mutante de una enzima fermentadora de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, en donde uno o más residuos de aminoácido han sido sustituidos por diferentes residuos de aminoácido, dando como resultado una enzima útil en la práctica de la presente invención. Las mutaciones pueden ser conservadoras, en un donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que comparta características funcionales y estructurales similares, tal como acidez, polaridad o tamaño del bulto de las cadenas laterales. Las mutaciones también pueden ser no conservadoras, en donde las propiedades funcionales y/o estructurales del residuo de aminoácido sustituido no se conservan. En algunos casos, una forma mutante de una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, poseerá propiedades funcionales alteradas n& & *&Jkmí k£?'J!í- -fe- -6--,-----^ .i-.-. „_fc«-, --------- _..------.-----«»-' • - --«---.-¿-- -* -----.- .-.----^i- * « - -» con relación a las enzimas nativas, tal como capacidad catalítica, estabilidad alteradas o pH o temperatura óptima alteradas. Tales mutantes caen dentro de los alcances de la presente invención en tanto que sean homologas a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis . Se pueden generar formas mutantes de la enzima mediante una variedad de técnicas conocidas por los técnicos en la materia. Un número de estas técnicas se ha revisado en la Patente Norteamericana US 5,830,696, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia, en donde dicha patente describe la evolución dirigida de enzimas termoestables. Alternativamente, se pueden crear aleatoriamente enzimas mutantes o pueden ocurrir espontáneamente en un organismo. Además, una enzima que es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbi ensi s, puede ser una mutante por deleción o una variante truncada de una enzima de C. vi terbi ensi s nativo. El uso de tales formas enzimáticas en algunos casos puede ser deseable, por ejemplo, cuando una deleción o truncamiento da como resultado una mayor estabilidad o una mayor facilidad de purificación en relación con la enzima nativa correspondiente. La presente invención además proporciona una - 3 - enzima que es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, que es una forma quimérica de una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbi ensis, i.e., una proteína de fusión. Las quimeras pueden ser útiles por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la enzima o facilitar la purificación, e.g. mediante la inclusión de una porción capaz de asociarse con una resina de intercambio iónico, un quelato metálico, un sustrato de afinidad o una matriz de inmunoafinidad. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una enzima homologa covalentemente unida a un soporte sólido, tal como celulosa. Además, la presente invención proporciona una enzima que es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis y que se deriva de un diferente microorganismo, de preferencia un microorganismo termofílico. Un ejemplo de tal enzima es una enzima de fermentación de glicerol termoestable "homologa", la cual se define como una enzima codificada por un gen proveniente de una diferente especie, en donde el gen es reconocido por los técnicos en la materia como un gen homólogo de un gen de fermentación de glicerol de C. vi terbiensis, basándose en un grado de identidad de secuencia de nucleótidos mayor de aproximadamente 80%. La identidad de secuencia se puede determinar utilizando el programa BLAST, tal como se describió supra . En una modalidad, la presente invención proporciona una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada, en donde el término "aislada" indica que la enzima está cuando menos parcialmente pura i.e., que se proporciona en una preparación en donde el porcentaje en peso de la enzima, con relación a otros materiales en la preparación, es mayor de lo que se encontraría en la naturaleza. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada que está cuando menos 90% pura en peso de proteinas contaminantes y más preferiblemente cuando menos 95% pura en peso de proteínas contaminantes. Los materiales y métodos útiles en la preparación y aislamiento de las enzimas anteriormente mencionadas, se describen infra . En una modalidad, una enzima de la presente invención se puede aislar a partir de un organismo termofílico, particularmente una cepa de C. vi terbiensis, que expresa la enzima de manera endógena. Alternativamente, una enzima de la presente invención se puede producir de manera recombinante al introducir una secuencia de polinucleótidos que codifica para la enzima, en una célula huésped apropiada y expresar el producto .,-U.i-ii-fa--. ^ —~- --------_---- --• ..«.-.^.---- .-----•--- .«--- ---.-----. *~ * l . * - --------- - - génico codificado. Una enzima de la presente invención también se puede producir por medio de traducción in vi tro o por técnicas de síntesis química. Métodos de Clonación de un Polinucleótido que Codifica para una Enzima Termoestable que Transforma al Glicerol en 1,3-Propanodiol La presente invención proporciona secuencias de polinucleótidos que codifican para una enzima de fermentación de glicerol termoestable, o un fragmento de la misma, y métodos para identificar, aislar y clonar tales polinucleótidos. Estos métodos involucran proporcionar una muestra que contiene secuencias codificadoras de polinucleótidos derivadas de un organismo termofílico u organismos termofílicos y seleccionar una secuencia de polinucleótidos codificadora de una enzima de fermentación de glicerol termoestable, o un fragmento de la misma. La muestra puede tomar cualquier variedad de formas y se puede preparar por una variedad de diferentes técnicas conocidas para los técnicos en la materia. De manera similar, la selección de la muestra se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de un número de técnicas adecuadas, algunos ejemplos no limitantes de las cuales se describen infra . La producción y manipulación de las moléculas de polinucleótido y moléculas de oligonucleótido descritas en la presente, están dentro de los conocimientos de los Í & ¿-af -t-A- fe -•*^^^-*^fc.*^-.J--_J------------técnicos en la materia y se pueden llevar a cabo de conformidad con las técnicas recombinantes descritas, entre otros lugares, en SAMBROOK et al . , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (1989), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOOGY (Ausubel et al . , eds., 1989), PCR STRATEGIES (Innis et al . , eds., 1995), y PCR TECHNOLOGY (Erlich ed., 1992), todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. En algunas modalidades de la presente invención, la muestra se selecciona con una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos que se piensa que codifica para una enzima de fermentación de glicerol, o una sonda o sondas que representan una porción de la misma. Una secuencia de sonda se puede basar en la secuencia de aminoácidos de una enzima de fermentación de glicerol conocida, o algún fragmento de la misma, o una secuencia de polinucleótidos que codifica para tal enzima. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una porción de una enzima de fermentación de glicerol se puede determinar utilizando técnicas de secuenciación de aminoácidos, e.g. como las descritas en CREIGHTON, PROTEIN STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES (1983) y la información se puede utilizar para generar un conjunto de sondas degeneradas. En una modalidad preferida de la presente invención, se selecciona una muestra utilizando una sonda o sondas basadas en una i ,.. t ., .1.^-...^-^----..*^---...,^-,--^----.^-.^----»-^ .---«---------* ^«.A.M----.»-..-*- -* "-"*-' ^ * secuencia que codifica para una deshidratasa u oxidorreductasa derivada de un organismo termofílico tal como C. vi terbiensis . Alternativamente, la sonda se puede basar en un gen codificador de una enzima de fermentación de glicerol derivado de un organismo no termofílico (e.g., K. pasteuriamum, C. freundii o C. pasteuriamum) , tales como los genes dhaBCE ó dhaT, los cuales codifican para la glicerol deshidratasa y oxidorreductasa, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los genes dhaBCE han sido reportadas en la literatura científica (véase e.g., Macis et al . , FEMS Microbiology Lettersi 164:21-28 (1998) (C. pasteuriamum) ; Seyfried et aJ . , J. of Bacteriology 178:5793-96 (1996) (C. freundii ) y Tobimatsu et al . , J. Biol . Chem. 271:22352.57 (1996) (K. penumoniae) ) . Las secuencias de nucleótidos del gen dhaT también se han reportado en la literatura científica (véase e.g. Luers et al . , FEMS Microbiol . Lett . 154:337-45 (1997) (C. pasteuriamum) y Daniel et al . , J. of Bacteriol . 177:2151-56 (1995) (C. freundii ) ) . Las sondas específicas proporcionadas por la presente invención incluyen pares de cebadores basados en el gen dhaB de K. pasteuriamum ( e . g . , tal como se detalla más adelante a manera de modalidades ilustrativas en dhaB15' (SEQ ID NO: 1); dhaB13' (SEQ ID NO: 2); dhab25' (SEQ ID NO: 3); dhab23' (SEQ ID NO: 4); dhab35' (SEQ ID NO: 5) y dhaB33' (SEQ ID NO: 6)) las cuales son - i -Aa-fc-á-i-particularmente útiles para amplificar un polinucleótido codificador de una enzima de fermentación de glicerol, o un fragmento del mismo, mediante una reacción en cadena catalizada por polimerasa ("PCR") . Dicho par de cebadores se puede utilizar para amplificar un segmento de un polinucleótido codificador de una enzima de fermentación de glicerol a partir de un organismo de interés, el cual, a su vez, se puede utilizar como sonda para identificar y clonar la secuencia codificadora de longitud completa del mismo organismo o de uno diferente. Las sondas se pueden marcar para identificar las secuencias homologas, por ejemplo en una biblioteca de ADNc. Alternativamente, se pueden usar sondas como cebadores para amplificar una secuencia de polinucleótidos flanqueada por secuencias reconocidas por los cebadores, particularmente por medio de PCR o RT-PCR (reacción en cadena catalizada por polimerasa-transcriptasa inversa) . En particular, una secuencia de interés se puede amplificar a partir de una biblioteca de ADNc o de ADN genómico de un microorganismo de interés o de una muestra ambiental, tal como se describirá en mayor detalle más adelante. En una modalidad de la presente invención, la muestra a ser seleccionada es una muestra ambiental que se sospecha que es portadora de un organismo termofílico, tal como una muestra de agua, suelo o lodo, tomada de un t «^A-------------fa-?--->"----»-.-- ----»--"~--^*-- ------i.-^*""-* - -—' ambiente propicio para la vida termofílica. Típicamente, una muestra ambiental será preparada de manera tal que los ácidos nucleicos presentes en la muestra estén disponibles para interactuar con una sonda complementaria, e.g. un cebador de PCR. Un polinucleótido codificador de una enzima de fermentación de glicerol, o un fragmento de la misma se puede reconocer mediante su capacidad de hibridizarse con una sonda como la anteriormente descrita. Una método preferido de aislamiento y clonación de un polinucleótido de conformidad con la presente invención a partir de una muestra ambiental, es por medio de PCR. Esta técnica aprovecha la homología de secuencia entre polinucleótidos que codifican para enzimas homologas, o enzimas con actividad similar. El método emplea un conjunto de cebadores basados en una secuencia de polinucleótidos codificadora de una enzima de fermentación de glicerol conocida, o una porción de la misma, para amplificar una secuencia de polinucleótidos homologa, o un fragmento de la misma, en una muestra ambiental. El polinucleótido homólogo se puede amplificar a partir del ADN en la muestra, particularmente ADN genómico de microorganismos presentes en la muestra, utilizando la metodología de PCR convencional conocida en la técnica. Alternativamente, el polinucleótido homólogo se puede amplificar a partir de ARN en la muestra, particularmente ARNm o ARN total, sintetizando una primera cadena de ADNc copia del ARN y amplificando el ADNc mediante una PCR, e.g., una RT-PCR. Al utilizar técnicas conocidas para los técnicos en la materia, se pueden ajustar las condiciones de apareamiento de ia reacción, para permitir la hibridación de cebadores a un nivel deseado de homología, permitiendo de esta manera la amplificación de secuencias que comparten más o menos homología con la secuencia sobre la cual se basan los cebadores. Este método permite el aislamiento de un marco de lectura abierta ("ORF") completo que codifica para una enzima de fermentación de glicerol, o un fragmento del mismo. Uno o más fragmentos de un ORF que codifica para una enzima de fermentación de glicerol, se pueden clonar y amplificar juntos para producir un ORF completo. El ORF codificador de una enzima de fermentación de glicerol amplificado, entonces, se puede utilizar para expresar la enzima de fermentación de glicerol codificada en la práctica de varios aspectos de la presente invención. Por ejemplo, la secuencia se puede introducir en una célula huésped, haciendo posible que la célula huésped fermente el glicerol. Alternativamente, la enzima expresada se puede purificar para aplicaciones tales como fermentación libre de células. Alternativamente, la secuencia del ORF por sí misma se puede utilizar para diseñar nuevos cebadores y sondas para la detección y aislamiento adicionales de nuevas secuencias codificadoras de enzimas de fermentación de glicerol termoestables. En otra modalidad de la presente invención, la muestra es una biblioteca de polinucleótidos, de preferencia una biblioteca de ADN genómico o de ADNc preparada a partir de un organismo termofílico, especialmente un organismo que se sabe que es capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol. Para obtener antecedentes generales sobre las técnicas de biología molecular y sobre cómo preparar una biblioteca de ADNc y una biblioteca de ADN ger.ómico, véase e.g. Ausubel et al . , supra; Sambrook et al . , supra y la Patente Norteamericana US 5,650,148. La biblioteca se puede seleccionar utilizando técnicas de selección por hibridación de ácidos nucleicos, en conjunto con las sondas marcadas apropiadas, tal como se describió anteriormente. Las técnicas de selección apropiadas se establecen, entre otros documentos, en Benton y Davis, Science 196:180 (1977) (bibliotecas de bacteriófagos) y Grunstein y Hogness, Proc. Nat rl Acad. Sci . USA 72:3961-65 (1975) (bibliotecas de plásmidos), incorporándose estas publicaciones en la presente como referencia. En todavía otra modalidad de la presente invención, la muestra comprende un organismo u organismos aislados, o una biblioteca de polinucleótidos generada a partir de un organismo u organismos aislados, a partir de la cual se puede amplificar un polinucleótido de la presente invención utilizando PCR o RT-PCR. De preferencia, el organismo u organismos aislados utilizados son termofílicos y capaces de fermentar el glicerol. En una modalidad de la presente invención, se construye una biblioteca de expresión que es capaz de dirigir la expresión de los productos génicos codificados por los polinucleótidos constituyentes de la biblioteca. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se selecciona funcionalmente una biblioteca de expresión mediante la prueba de sus constituyentes en busca de la capacidad de codificar para un producto génico que catalice una etapa en la fermentación del glicerol. En una modalidad preferida, un organismo que normalmente es incapaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, es transformado con un constituyente de una biblioteca de ADN de la manera anteriormente descrita, de preferencia una biblioteca preparada a partir de un organismo termofílico que se sabe que es capaz de fermentar el glicerol. Los organismos transformados, entonces, se seleccionan en busca de su capacidad de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, por su crecimiento aneaeróbico en glicerol. Los microorganismos transformados se pueden seleccionar en busca de la producción de 1, 3-propanodiol y/o acetato. La capacidad de crecer anaeróbicamente en glicerol o de producir 1, 3-propanodiol y/o acetato, indica que el constituyente de la biblioteca utilizado para transformar el microorganismo, codifica para una enzima que es capaz de proporcionar una actividad enzimática requerida para la fermentación del glicerol. El constituyente de la biblioteca, posteriormente, se puede clonar y caracterizar mediante las técnicas estándar y se puede usar en la práctica de varios aspectos de la presente invención. El microorganismo transformado en la estrategia de clonación funcional anteriormente descrita, puede ser uno que carezca inherentemente de la capacidad de fermentar el glicerol, o un microorganismo que haya perdido la capacidad de fermentar el glicerol como resultado de una mutación, e.g. una mutación nuil en uno de los genes requeridos para la fermentación del glicerol. Tal mutación se puede manipular por ingeniería en un organismo utilizando técnicas conocidas en este campo. El microorganismo puede, pero no necesariamente, ser termofílico. Es preferible que el organismo de prueba posea todas excepto una de las actividades enzimáticas requeridas para la fermentación del glicerol, para que la capacidad de fermentar el glicerol pueda ser recuperada mediante la introducción de una sola actividad enzimática. _-A t_--- -!--_---.

Alternativamente, los productos génicos expresados pueden ser seleccionados inmunológicamente utilizando las técnicas normales en conjunto con anticuerpos dirigidos contra una enzima de fermentación del glicerol. Para tales técnicas de selección, véase e.g. ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow y Lañe, eds., 1988) . Organismos Recombinantes Capaces de Fermentar el Glicerol en 1,3-Propanodiol La presente invención también proporciona un organismo recombinante que ha sido manipulado por ingeniería genética para expresar una o más enzimas de fermentación de glicerol termoestables exógenas, i.e., heterólogas. El término "exógeno" cuando se utiliza en este contexto, indica que la enzima es codificada por una secuencia codificadora de polinucleótidos heteróloga, i.e. una secuencia de polinucleótidos que no es nativa o endógena al organismo huésped. En una modalidad preferida, el organismo recombinante es manipulado por ingeniería genética para expresar una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, o una enzima que sea homologa a tal enzima. En una modalidad particularmente preferida, el organismo recombinante es manipulado por ingeniería genética para expresar una deshidratasa o una 1, 3-propanodiol oxidorreductasa derivada de una cepa de C. vi terbiensis, tal como la cepa J /MS-VS5T. Un organismo recombinante de la presente invención puede ser útil en la práctica de varios aspectos de la misma. Por ejemplo, el organismo recombinante se puede utilizar para catalizar un proceso para la transformación biológica del glicerol en 1, 3-propanodiol. En otra modalidad no limitante, el organismo recombinante puede servir como fuente de una enzima de fermentación de glicerol termoestable, la cual puede ser aislada utilizando las técnicas de purificación de proteínas familiares para los técnicos en la materia. La presente invención proporciona una variedad de vectores y cartuchos de transformación y expresión adecuados para clonar, transformar y expresar una secuencia de polinucleótidos codificadora de una enzima de fermentación de glicerol termoestable, o un fragmento de la misma. Los vectores adecuados serán aquellos que sean compatibles con el microorganismo huésped y el uso p ' tendido del microorganismo recombinante que resulte. Por ejemplo, un vector adecuado se puede derivar de un plásmido, un virus (tal como el bacteriófago T7 ó un fago derivado de M13) o un cósmido. Los protocolos para obtener y utilizar tales vectores son conocidos para los técnicos en la materia. Véase e.g., Sambrook et al . , supra .

Típicamente, el vector o cartucho contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción del gen relevante, un marcador seleccionable y secuencias que permitan la replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' de la secuencia codificadora que es portadora de los controles de inicio de transcripción y una región 3' de la secuencia codificadora que controla la terminación de la transcripción. En una modalidad preferida, las regiones de control se derivan de genes homólogos a la célula huésped transformada. Los vectores recombinantes de la presente invención, particularmente los vectores de expresión, de preferencia se construyen de tal manera que la secuencia codificadora esté en asociación operativa con uno o más elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora. Tal como se utiliza en la presente, el término "elemento regulador" incluye, pero no se limita a, secuencias de nucleótidos que codifican para promotores inducibles y no inducibles, intensificadores, operadores y otros elementos conocidos en la técnica para conducir y/o regular la expresión de secuencias codificadoras de polinucleótidos. Asimismo, tal como se utiliza en la presente, la secuencia codificadora está en "asociación operativa" con uno o más elementos ¡a-tii .- » -á_-il?.-a--J>.?-t----?a-....-~--fc. ^„-^^^^-^»-->J-^--.---J--.-a--fa^--^^*'-"-"-J-- -- reguladores, cuando los elementos reguladores regulan de manera efectiva o permiten la transcripción de la secuencia codificadora o la traducción de su ARNm, o ambas. Los elementos reguladores de estos vectores 5 pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Algunos ejemplos no limitantes de regiones reguladoras de la transcripción o promotores para 10 bacterias, incluyen el promotor ß-gal, el promotor T7, el promotor TAC, los promotores lambda izquierdo y derecho, los promotores trp y lac, y los promotores de fusión trp- lac . Los métodos generales para expresar proteínas 15 recombinantes son conocidos en la técnica, tal como se ejemplifica en R. Kaufman, Methods in Enzymol ogy 185:537- 566 (1990). Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte características 20 deseadas, e.g., la estabilización o la purificación simplificada del producto recombinante expresado. Para dirigir la enzima de fermentación del glicerol en la ruta secretoria de las células huésped, se puede proporcionar una secuencia de señal secretoria en el vector de expresión. La secuencia de señal secretoria se une a la secuencia de polinucleótido codificadora de la enzima de fermentación de glicerol en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal secretorias comúnmente se posicionan del lado 5' de la secuencia codificadora. La secuencia de señal secretoria puede ser aquella normalmente asociada con una proteína secretada por el organismo huésped. Una vez que se ha construido un vector de transformación o expresión adecuado, se puede utilizar para transformar una célula huésped apropiada, utilizando los procedimientos conocidos tales como e.g., células permeabilizadas con calcio, electroporación, transformación por protoplastos o por transfección utilizando un virus fago recombinante. Los huéspedes de expresión adecuados incluyen células de E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuri um y varias especies dentro del género Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros como materia de elección. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante termofílico que ha sido manipulado por ingeniería genética para expresar una o más enzimas de fermentación de glicerol termoestables exógenas. Tales microorganismos son particularmente útiles en la transformación biológica del glicerol en 1,3-propanodiol, tal como se describe infra . Ejemplos de microorganismos termofílicos incluyen miembros de los géneros, Bacillus, Thermus, Sulfolobus, Thermo anaer obacter , Thermobrachi um y Calorama tor. El microorganismo huésped seleccionado, de preferencia será capaz de producir el cofactor adenosil-cobalamina (coenzima Bi2) . Si es necesario, se pueden introducir genes de síntesis de B?2 en el microorganismo y/o el medio puede ser suplementado con vitamina B?2. Métodos para Aislar Enzimas de Fermentación de Glicerol Termoestables La presente invención proporciona un método para preparar y aislar una enzima de fermentación de glicerol termoestable. En una modalidad preferida, la enzima se proporciona en una forma sustancialmente purificada. En una modalidad no limitante, la enzima se aisla de un microorganismo termofílico que expresa una enzima de fermentación de glicerol termoestable nativa. En otra modalidad no limitante, la enzima se aisla de un organismo recombinante manipulado para expresar una secuencia de polinucleótidos exógena codificadora de una enzima de fermentación de glicerol termoestable. Alternativamente, una enzima termoestable de la presente invención se puede preparar utilizando los procedimientos convencionales de síntesis peptídica en solución o en fase sólida, tal como se describe, e.g., en CREIGHTON, supra . **&*** **-.

Las células huésped que expresan la enzima de fermentación de glicerol termoestable de interés, típicamente se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la enzima, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada en un matraz en agitación, por fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continua, por lotes, alimentada/por lotes o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, en donde la fermentación se realiza en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que la enzima sea expresada y/o aislada . Un medio nutritivo adecuado típicamente comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles con proveedores comerciales, o se pueden preparar de conformidad con composiciones publicadas, e.g., en los catálogos de la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) . Dependiendo de la naturaleza de la célula huésped y del vector de expresión utilizados, la enzima puede quedar retenida en el citoplasma, a menudo en forma de granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) o se puede dirigir hacia el espacio periplásmico a través de una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, --_-.4--.---M Jt-L-titA-t^i^fc, las células se lisan y los granulos se recuperan y se desnaturalizan, después de lo cual la enzima se vuelve a conformar diluyendo el agente desnaturalizante. En el último caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico al romper las células, e.g. por sonicación o por choque osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima. Si la enzima es secretada al medio nutritivo, ésta puede ser recuperada directamente del medio. Después, la enzima producida puede ser recuperada por medio de técnicas convencionales conocidas en este campo, incluyendo pero no limitándose a, centrifugación, filtración, extracción, deshidratación por aspersión, evaporación, solubilidad diferencial (e.g., precipitación con sulfato de amonio), cromatografía (e.g., de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y de exclusión de tamaño) o procedimientos electroforéticos (e.g., electroforesis isoeléctrica de enfoque preparativa (IEF) (véase e.g., PROTEIN PURIFICATION (Janson y Ryden eds., 1989)); SCOPES, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE (1994); Sambrook et al . , supra y Ausubel et al . , supra . En una modalidad preferida, la enzima se purifica en forma de una proteína de fusión incluyendo un elemento de fusión que facilita una purificación rápida por ... I.. -.-Í.Í.Í-A-Í-Í afinidad. Los elementos de fusión de purificación útiles incluyen las marcas con histidina y glutatión S-transferasa (GST) . Se puede incluir un sitio de reconocimiento de proteasa, e.g. un sitio de reconocimiento de trombina o de factor Xa, para permitir el rompimiento del producto proteico deseado por el elemento de fusión. Los vectores útiles para la construcción de sistemas de expresión de fusión génica están disponibles en el comercio, por ejemplo en Amersham Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ) . Los protocolos de purificación de proteínas específicos útiles para el aislamiento de las enzimas de fermentación de glicerol, se han descrito en la literatura científica (véase e.g., Seyfried, et al . , J. of Bact . 178:5793-96 (1996) (glicerol deshidratasa); Tobimatsu et al . , J. of Bact . 181:4110-13 (1996) (glicerol deshidratasa) y Johnson et al . , J. of Bact . 169:2050-54 (1987) (1,3-propanediol oxidoreductasa) . Por ejemplo, Seyfried et al . describen el uso de una resina con vitamina B?2-agarosa como matriz de afinidad para la purificación de la glicerol deshidratasa. Métodos de Transformación Biológica del Glicerol en 1,3-Propanodio1 La presente invención proporciona métodos biológicos para la transformación del glicerol en 1,3-propanodiol. Tal como se utiliza en la presente, el -A A . í -.- --.AM----».---..---... término método "biológico" de transformación del glicerol en 1, 3-propanodiol, es un método que emplea un catalizador biológico, e.g. una enzima de fermentación de glicerol, ya sea como constituyente de un microorganismo, o bien, en un sistema de reacción catalizada por enzimas, libre de células. En particular, la presente invención proporciona procesos de transformación biológica que pueden ser llevados a cabo a altas temperaturas, catalizados por organismos termofílicos y/o enzimas termoestables. En una modalidad preferida, el método se lleva a cabo a temperaturas mayores de 50°C, de preferencia a temperaturas mayores de 60°C y emplea un microorganismo termofílico capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol . En una modalidad no limitante, el proceso emplea un microorganismo termofílico que expresa de manera natural un complemento completo de enzimas de fermentación de glicerol termoestables, suficientes para catalizar todas las etapas de reacción en la fermentación del glicerol en 1, 3-propanodiol, e.g., las enzimas 1, 3-propanodiol oxidorreductasa, glicerol deshidratasa y/o diol deshidratasa. En una modalidad particularmente preferida, se emplea una cepa de C. vi terbiensis, la cepa JW/MS-VS5T, como el catalizador biológico. En una modalidad alternativa, el proceso emplea un microorganismo recombinante, de preferencia un i i * -¿fcji •& microorganismo recombinante termofílico que ha sido manipulado por ingeniería genética para expresar una o más enzimas de fermentación de glicerol termoestables exógenas. Algunos ejemplos de microorganismos termofílicos incluyen miembros de los géneros Bacillus, Thermus, Sulfolobus, Thermoanaerobacter, Thermobrachi um y Caloramator. El término "exógeno" cuando se utiliza en este contexto, indica que la enzima es codificada por una secuencia codificadora de polinucleótidos heteróloga, i.e., una secuencia de polinucleótidos que no es nativa, o endógena, al organismo huésped termofílico. En una modalidad preferida, la secuencia de polinucleótidos heteróloga codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis, o una enzima que es homologa a tal enzima. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de polinucleótidos heteróloga se deriva de una cepa de C. vi terbiensis. Opcionalmente, un microorganismo termofílico utilizado en el proceso de la presente invención, puede producir el cofactor adenosil-cobalamina (coenzima B?2) . Si es necesario, se pueden introducir genes de síntesis de B12 en el microorganismo y/o el medio puede ser suplementado con vitamina B12. La presente invención proporciona un proceso de fermentación para la biotransformación del glicerol en 1,3- ¿-i.t-1 1. M. á-at-ita--.-----_--**- - -propanodiol, utilizando un organismo termofílico de la presente invención. Las condiciones de fermentación deberán ser optimizadas, balanceando el costo y la conveniencia con el rendimiento del producto y la eficiencia. El desarrollo de un proceso de fermentación comercial típicamente ocurre por pasos, usando inicialmente matraces pequeños, después fermentadores pequeños (menores de 10 galones) , termentadores de tamaño intermedio (hasta varios cientos de galones) y finalmente termentadores a gran escala (de miles de galones) . En cada etapa de producción, las condiciones de desarrollo se ajustan para producir rendimientos máximos a costos mínimos. La composición orgánica e inorgánica del medio, asi como el pH, temperatura y concentración de oxígeno, son los principales factores que se pueden variar para maximizar la eficiencia del proceso de producción. Incluso en un proceso por lotes, las condiciones a menudo se pueden variar durante la fermentación para lograr el rendimiento máximo del producto y las condiciones se monitorean durante el proceso de fermentación para asegurar que los parámetros críticos permanezcan dentro de límites permisibles. Las cámaras de reacción y soluciones de sustrato deberán ser esterilizadas antes de adicionar la cepa microbiana que se está utilizando en el proceso de producción. Cuando se fermenta a temperatura baja, la infección de la reacción -Jlitti,.----uli- con contaminantes microbianos puede conducir fácilmente a un desplazamiento competitivo de la cepa que se está empleando para producir el producto, con resultados obviamente detrimentales. Una ventaja importante de la presente invención es que al utilizar microorganismos termofílicos y/o enzimas termoestables, la reacción se puede llevar a cabo a altas temperaturas en las que gran parte de los contaminantes potenciales no son viables. La composición del medio de fermentación debe incluir los nutrientes esenciales para soportar el crecimiento del microorganismo y la formación del producto deseado. Los nutrientes esenciales incluyen fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo. La elección de una fuente nutritiva particular se realiza en el terreno económico así como en el biológico. Dependiendo de la naturaleza del proceso de fermentación, todas las materias primas pueden ser agregadas al iniciar la fermentación, o los nutrientes pueden ser alimentados a los microorganismos gradualmente durante el proceso. El pH de la reacción puede afectar sustancialmente la fermentación. Todas las enzimas involucradas en la formación del producto deseado tienen rangos de pH óptimo para su máxima actividad y rangos de pH limitados en los cuales se mantiene su actividad. El crecimiento rápido de organismos en un fermentador puede ^^^¡? --. - .i.? l-ti^-- alterar rápidamente el pH del medio de reacción. Por ejemplo, la acumulación de ácido, e.g. ácido acético, puede causar que el pH de un medio no regulado disminuya precipitadamente, inhibiendo o deteniendo la producción del producto de fermentación deseado. Para prevenir tales cambios, el medio de fermentación deberá ser amortiguado o regulado para disminuir los cambios de pH. Adicionalmente, el pH de la solución de reacción normalmente se supervisa de manera continua y se agrega un ácido o una base, conforme sea necesario, para mantenerlo dentro de límites de tolerancia aceptables. En procesos de fermentación que emplean la cepa JS/MS-VS5T, el pH del medio deberá ser mantenido entre aproximadamente 5.0 y 7.8, de preferencia entre aproximadamente pH 6.0 y 6.5. La temperatura de la reacción también deberá ser cuidadosamente regulada para lograr un rendimiento óptimo del producto. Se pueden utilizar serpentines de calefacción para mantener las temperaturas elevadas para lograr las velocidades óptimas de formación del producto y para inhibir la infección por microbios contaminantes. Los serpentines de calefacción también se pueden utilizar para la esterilización periódica de la cámara del fermentador. La fermentación se puede llevar a cabo a cualquier temperatura que concuerde con la actividad y la viabilidad del microorganismo. En una modalidad preferida, la presente invención se lleva a cabo a una temperatura de cuando menos 40°C, de preferencia a una temperatura de cuando menos 50°C y más preferiblemente a una temperatura de 60°C o mayor. En procesos de fermentación que emplean la cepa JW/MS-VS5T, la temperatura se debe mantener entre 33 y 64°C, de preferencia entre 50 y 64°C y más preferiblemente entre 57 y 64°C. En adición a sus parámetros nutricionales y ambientales, un proceso de fermentación puede ser diseñado como un proceso por lotes, el cual es análogo a la inoculación de un matraz que contiene un caldo con un cultivo microbiano, o en forma de un proceso de flujo continuo, el cual es análogo al de un quimiostato. La elección del diseño del proceso depende de factores económicos, de producción y de recuperación del producto deseado. En comparación con los procesos por lotes, los termentadores de flujo continuo son más propensos a la contaminación por microorganismos no deseados, los cuales pueden dificultar el mantenimiento del control de calidad, particularmente si la fermentación se realiza a una temperatura moderada. Sin embargo, el diseño de flujo continuo tiene la ventaja de producir un suministro continuo del producto que puede ser recuperado a una velocidad constante para su distribución comercial. Por su naturaleza, el proceso por lotes requiere de un tiempo de JlfaMltiltáM----1 -.-...«-..„-_"« **£.•< --dá-i-á-i*.-*' *-*"-t-a+~»-<---. inicio significativc para iniciar el proceso de fermentación, tiempos de incubación para permitir que el producto de la fermentación se acumule y tiempos de recuperación durante los cuales el producto es separado del medio utilizado y las células microbianas. En otra modalidad de la presente invención, el proceso se puede utilizar para transformar un sustrato de carbono fermentable diferente al glicerol en 1,3- propanodiol. En una modalidad no limitante, un microorganismo termofílico capaz de transformar un sustrato de carbono fermentable, por ejemplo, un monosacárido tal como glucosa o un polisacárido en glicerol, puede ser manipulado por ingeniería para producir 1, 3-propanodiol mediante la introducción recombinante, en el microorganismo, del complemento de las enzimas productoras de 1, 3-propanodiol termoestables necesarias para transformar el glicerol en 1, 3-propanodiol . Estas enzimas se pueden derivar de un organismo termofílico capaz de transformar el glicerol en 1, 3-propanodiol, por ejemplo C. vi terbiensis . Las técnicas para manipular por ingeniería recombinante la actividad enzimática requerida para fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol en un organismo no termofílico, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,686,276, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. l-t-J.-*.A--t--,.- -^*--*> " »-.«. .-^-.---^---,-il. ---..--..-^-.^^^--^--^-«a-d------,.-.,------ . . - <. . naa-mi--.

Alternativamente, un microorganismo recombinante de la presente invención se puede manipular por ingeniería para fermentar fuentes de carbono diferentes al glicerol y obtener 1, 3-propanodiol. El uso de tales organismos puede 5 ser ventajoso, particularmente para la producción de 1,3- propanodiol a partir de fuentes de carbono no costosas tales como la glucosa o polisacáridos fermentables. Por ejemplo, un microorganismo capaz de fermentar el glicerol en 1, 3-propanodiol, se puede manipular por ingeniería 10 genética para transformar un intermediario glicolítico, e.g. el fosfato de dihidroxiacetona, en glicerol, permitiendo de esta manera la introducción de carbón proveniente de fuentes diferentes al glicerol en la ruta de fermentación. La Publicación Internacional de Patente WO 15 98/21340, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia, describe métodos para la producción de glicerol a partir de un organismo recombinante mediante la transformación de una célula huésped adecuada con un cartucho de expresión que comprende 20 un gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y un gen que codifica para una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, o ambos. Tales organismos son capaces de fermentar azúcares simples, e.g. glucosa, para obtener glicerol. Estos organismos, o de hecho 5 cualquier organismo manipulado por ingeniería genética para Étt-M-á.?-ti a.-i,i.m-J--. •-»• ~» - - --------- --- ..,--.-- .--»--.----.--. -,.-^---?-.-----.-----B-.-. ---*--------..-----------.----.- ' * t---itWi-----producir estas enzimas o enzimas de rutas sintéticas del glicerol alternativas, se pueden utilizar como células huésped para fermentar adicionalmente el glicerol en 1,3-propanodiol, utilizando las composiciones y métodos de la presente invención. Además, la Publicación Internacional de Patente WO 98/21339, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia, describe microorganismos recombinantes manipulados por ingeniería para expresar genes que codifican para las enzimas glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, glicerol-3-fosfatasa, glicerol deshidratasa y 1, 3-propanodiol oxidorreductasas, haciendo posible de esta manera que transformen glucosa y otros azúcares en 1, 3-propanodiol, así pues, esta estrategia puede ser aplicada por los técnicos en la materia para producir 1,3-propanodiol a partir de cualquier sustrato de carbono que pueda ser transformado ya sea en glicerol, en dihidroxiacetona, en compuestos C3 en el estado de oxidación del glicerol (e.g., glicerol-3-fosfato) o compuestos C3 en el estado de oxidación de la dihidroxiacetona (e.g., fosfato de dihidroxiacetona o gliceraldehído-3-fosfato) (véase e.g., la Publicación Internacional de Patente WO 98/21339) . En otra modalidad de la presente invención, el organismo termofílico recombinante se puede manipular por ingeniería para expresar o expresar a niveles intensificados, una proteína capaz de suprimir la inactivación de una enzima de fermentación de glicerol. Por ejemplo, las técnicas descritas en la Publicación Internacional de Patente WO 98/21341, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia, se pueden usar para introducir la expresión de una enzima capaz de revertir la inactivación mediada por el sustrato de la enzima glicerol deshidratasa. El proceso de la presente invención se lleva a cabo en un medio que contiene el sustrato de carbón a ser transformado en 1, 3-propanodiol, de preferencia como la única fuente o fuente primaria de carbono. En una modalidad preferida, se usa un medio basal en donde el glicerol está presente como la única fuente o fuente primaria de carbono. Además de una fuente apropiada de carbono, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, cofactores, soluciones reguladoras adecuados y otros componentes, los cuales son conocidos para los técnicos en la materia, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de las actividades enzimáticas necesarias para la producción del 1, 3-propanodiol. Debe tenerse particular atención en las sales de Co (II) y/o vitamina B12 ó precursores de las mismas. Un ejemplo no limitante específico de un medio adecuado para utilizarse en la transformación del glicerol en 1, 3-propanodiol por C. viterbiensis, se proporciona a continuación en los ejemplos. El proceso de la presente invención se puede llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, en donde son preferidas las condiciones anaeróbicas o microaeróbicas. En una modalidad particularmente preferida, el proceso se lleva a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno o argón, por ejemplo, bajo una atmósfera de N2/CO- a una relación de 80:20. También se agregan compuestos químicos que reaccionan y remueven el oxígeno molecular del medio de crecimiento. Por ejemplo, el tioglicolato de sodio reaccionará con el oxígeno libre y lo removeré de la solución. De manera similar, el aminoácido cisteína y otros compuestos que contienen grupos sulfhidrilo, también se pueden utilizar para recoger al oxígeno molecular en un medio de cultivo. Para cultivos líquidos, se puede burbujear nitrógeno a través del medio para remover el aire y las trazas de oxígeno, después de lo cual el recipiente de cultivo se sella fuertemente para evitar la reentrada de oxígeno. Adiciona-mente, se puede emplear una cámara de cultivo anaerobio para excluir el oxígeno de la atmósfera. Las formas comunes de cámaras anaeróbicas, tales como el sistema Gas Pak, generan hidrógeno el cual reacciona con el oxígeno como catalizador dentro de la cámara para producir agua. El bióxido de carbono también se genera en este i---_- -- -kJ_-É-a-_-- -------_------ - 6 - sistema para reemplazar el volumen de gas agotado por la transformación del oxígeno en agua. El 1, 3-propanodiol se puede identificar directamente sometiendo al medio a un análisis de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . Por ejemplo, los medios de fermentación se pueden analizar en una columna de intercambio iónico analítica utilizando una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01N, de manera isocrática. Alternativamente, el 1, 3-propanodiol se puede identificar utilizando otras técnicas analíticas apropiadas, incluyendo pero no limitándose a la cromatografía de gases (GC) y a la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) . El 1, 3-propanodiol se puede purificar a partir del medio de fermentación, utilizando técnicas conocidas para los técnicos en la materia, incluyendo destilación, centrifugación, filtración y separación cromatográfica. Por ejemplo, los propanodioles se pueden obtener de medios celulares sometiendo a la mezcla de reacción a una extracción con un disolvente orgánico, destilación y cromatografía en columna, tal como se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana U.S. No. 5,356,812, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Un disolvente orgánico particularmente bueno para este proceso es el ciciohexano, tal como se describe en la Patente Norteamericana U.S. No. 5,008,473.

Alternativamente, el 1, 3-propanodiol se puede producir en un sistema de fermentación empleando enzimas y/o células microbianas adsorbidas o unidas a un soporte sólido, tal como celulosa. Las enzimas unidas y por lo tanto inmovilizadas, actúan como un catalizador en superficie sólida. Entonces, una solución que contiene el sustrato de reacción, e.g. glicerol, se hace pasar a través de la superficie sólida. La temperatura, el pH y la concentración de oxígeno se establecen en niveles óptimos para lograr las máximas velocidades de transformación. Este tipo de proceso es particularmente apropiado cuando la transformación deseada involucra una sola etapa metabólica, e.g., la transformación de glicerol en un intermediario en la formación de 1, 3-propanodiol, o la transformación de tal intermediario en 1, 3-propanodiol. El proceso es más complejo cuando se requieren actividades enzimáticas múltiples para transformar un sustrato inicial en un producto deseado. Generalmente el medio del proceso debe incluir cualquier factor auxiliar requerido para la catálisis, tal como cofactores de enzimas (e.g., vitamina BX2) y equivalentes de reducción. El producto deseado se puede purificar del medio de fermentación utilizando las técnicas descritas supra . Cuando se utilizan tales sistemas inmovilizados, es esencial proporcionar condiciones que mantengan la actividad enzimática y minimicen la inactivación o pérdida de enzima. Cuando se emplean células completas en vez de enzimas libres de células, en tales sistemas inmovilizados, es importante mantener la viabilidad de los microorganismos durante el proceso. Este proceso utilizando células inmovilizadas generalmente involucra agregar los sustratos necesarios para el crecimiento. El proceso de conformidad con la presente invención hace posible que el glicerol sea transformado de manera sustancialmente estequiométrica en 1, 3-propanodiol. El rendimiento de 1, 3-propanodiol a menudo es de 2 moles de 1, 3-propanodiol por 3 moles de glicerol. En el presente contexto, el término "sustancialmente" se entiende que significa el consumo del glicerol en cuando menos un 80% y de preferencia en cuando menos un 95%. El 1, 3-propanodiol producido por los métodos y composiciones de la presente invención, es útil en la producción de poliésteres y películas. Por ejemplo, el poli (tereftalato de 1, 3-propileno) (PPT) ha sido sintetizado por Whinfield y Dickson utilizando 1,3-propanodiol como la materia prima. Las propiedades físicas del PPT son superiores que el poliéster poli (tereftalato de etileno) (PET) generalmente disponible en el comercio. Otros procesos para sintetizar PPT se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. U.S. ,340,908 y 5,872,204, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Otros polímeros también se pueden sintetizar. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la presente invención. EJEMPLO: Aislamiento de la cepa tipo de C. riterbiensis JW/MS-Vs5t Materiales y Métodos Fuente del organismo La cepa fue aislada de una muestra de sedimento/agua tomada de aguas termales dulces en el área de Bagnaccio Spring, cerca de Viterbo, Italia, en junio de 1997. Las temperaturas en los puntos de muestreo fueron 63°C y el pH era de 6.6-6.7. Las condiciones se describen más detalladamente en Canganella et al . J. Basic Microbiol . 35:9-19 (1995), la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. Medios y Cultivo Se preparó un medio basal utilizado para el enriquecimiento, aislamiento y cultivo por la técnica de Hungate modificada, bajo una fase gaseosa de N2/C02 (80:20), de la manera descrita en Ljungdahl et al . , MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY (Demain y Solomon eds., 1986). El medio basal contenía (por litro de agua desionizada): 0.5 g de (NH4)S04, 0.5 g de NH4C1, 2.0 g - - de KH2P04, 0.04 g de MgCl2-6H20, 0.04 g de CaCl2-2H20, 4.2 g de NaHC03, 0.13 g de Na2S-9H20, 0.13 g de cisteína-HCl, 0.3 g de extracto de levadura, 0.001 g de resazurina, 3.0 g de glicerol, 2 mL de solución de vitaminas (descrita en Wolin 5 et al . , J. Biol . Chem. , 238:2882-86 (1963)) y 1 mL de solución de elementos traza. La solución de elementos traza contenía (mmol/L): 2.0 de (NH4) 2Fe (S04) 2-6H20, 1.0 de CoCl2-6H20, 1.0 de (NH4) 2Ni (S04) 2-6H20, 0.1 de Na2Mo04-2H20, 0.1 de Na2W04-2H20, 0.5 de ZnS04-7H20, 0.01 de CuCl2-2H20, 0.5 de 10 Na2Se03, 0.1 de H3B03, 0.5 de MnCl2-4H20 y 0.01 de A1K(S04)2-12H20. El pH se ajustó a 6.0 (a 25°C) . Los enriquecimientos y cultivos puros se hicieron crecer normalmente en 10 mL de medio en tubos de Hungate, bajo una atmósfera de N2/C02 (80:20) . Todas las incubaciones se 15 realizaron a 60°C, a menos de que se indique de otra manera. Determinación del Crecimiento El crecimiento de las bacterias fue determinado midiendo el incremento de la densidad óptica a una longitud 20 de onda de 600 nm (Spectronic 21, Bausch & Lomb, Rochester, NY) . pH y Rangos de Temperatura Para determinar el rango de pH para el crecimiento, el pH fue determinado a 25°C utilizando un medidor de pH modelo 815 MP (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) . El rango de temperatura para el crecimiento se determinó utilizando una incubadora de gradiente de temperatura (Scientific Industries, Inc., Bohemia, N.Y.) en agitación (15 spm) en medio basal a pH25°c 6.0. Utilización del Sustrato Se probó la capacidad del organismo para utilizar diferentes sustratos, empleando el medio basal suplementado con sustratos esterilizados en autoclave o por filtración, en vez de glicerol. Los cultivos se incubaron durante dos semanas y se supervisó el crecimiento mediante la medición de la densidad óptica. Receptores de Electrones El uso potencial de diferentes receptores de electrones se estudió en el medio basal que contenía glicerol (3 g/L) como sustrato. Los diferentes receptores de electrones fueron añadidos en las soluciones concentradas esterilizadas por autoclave. Los cultivos crecidos en medio basal se utilizaron como inoculo (10% v/v) . El uso de receptores de electrones (10 mM) fue supervisado mediante la determinación de la producción de nitritos (a partir de nitratos), la producción de sulfuro (a partir de sulfato y azufre elemental) o el cambio en el color (AQDS) . Susceptibilidad a Antibióticos .-.fe.-----^^-5- --•--- -' ' " -^"*^***-^ La susceptibilidad a antibióticos se determinó transfiriendo un cultivo en crecimiento exponencial a un medio de cultivo basal fresco conteniendo 100 µg/mL de antibióticos esterilizados por filtración. Los cultivos se incubaron durante dos semanas . Microscopia Se realizaron exámenes rutinarios utilizando microscopía óptica (modelo PM 10AD, Olympus Optical Co.

Ltd. Tokio, Japón, equipado con óptica de contraste de fases) . Se realizó una microscopía electrónica de transmisión con un microscopio electrónico modelo 100CX (JEOL, Tokio, Japón) . Lae muestras utilizadas para cortes ultrafinos se prepararon utilizando acetato de uranilo y citrato de plomo para tinción posterior de la manera descrita por Spurr, J. Ul trastruc. Res. 26:31-43 (1969).

La tinción de Gram se realizó por el método de Hucker (Doetsch en MANUAL OF METHODS FOR GENERAL MICROBIOLOGY (Gerhardt et al . , eds. 1981)). Técnicas Analíticas La determinación del glicerol, glucosa, ácidos orgánicos de cadena corta y alcoholes fue realizada por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de la manera previamente descrita en Svetlitshnyi et al . , Int .

J. , Syst . Microbiol . 46:1131-37 (1996). El hidrógeno molecular fue analizado por cromatografía de gases l-t-i- it.

(Svetlitschnyi et al . ) . La producción de nitritos se midió utilizando un paquete de análisis enzimático de Boehringer Mannheim (No. de catálogo 905608) . El sulfuro se determinó por el método de Cord-Ruwisch, J. Microbiol . Methods . 4:33-36 (1985) . Contenido de G+C del ADN El ADN se aisló y se purificó utilizando el protocolo de purificación de ADN genómico de QIAGEN, de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ADN fue digerido enzimáticamente y se determinó el contenido de guanina-más-citosina (G+C) separando los nucleósidos por HPLC, de la manera descrita por Whitman et ai., Syst . Appl . Microbíol . 7:235-240 (1986) y Mesbah et al . , Int . J. Syst . Bacteriol . 39:159-167 (1989). Determinación de la Secuencia Génica 16S ARNr y Análisis Filogenéticos La extracción del ADN genómico, la amplificación por PCR del gen 16S ARNr y la secuenciación de los productos purificados por PCR, se llevaron a cabo de la manera descrita por Rainey et al . , Int . J. Syst . Bacteriol . 46:28-96 (1996) . Los productos de la reacción de secuencia se purificaron por precipitación en etanol y se sometieron a electroforesis en un equipo Genetic Analyzer modelo 310 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Las secuencias de 16S ARNr génico obtenidas en este estudio se alinearon .JJ .i-l- k^l-1^. ..._._..^_--.._..-.-«-v---^-?-------.---__-________-_----_----...---->_----.------ < t W1------ contra las secuencias Gram positivas de bajo contenido de G+C determinadas previamente, disponibles en las bases de datos públicas, utilizando el paquete ae2 editor, Maidak et al . , Nucleic Acids Res . 27:171-173 (1999). Se utilizaron los programas de paquete PHYLIP incluyendo DNADIST y NEIGHBOR para los análisis filogenéticos (Felsenstein (1993), paquete de inferencia filogenética, versión 3.5.1. Departamento de Genética, Universidad de Washington, Seattle). Se empleó el método de Jukes et al . , en MAMMALIAN PROTEIN METABOLISM (Munro, ed., 1969), para calcular las distancias evolutivas. Se realizó una topología triple utilizando datos de 1000 conjuntos de datos y los programas SEQBOOT, DNADIST y CONSENSE del paquete PHYLIP, Felsenstein, supra . Números de Acceso de Secuencia de Nucleótidos La secuencia de 16S ARNr génico determinada en este estudio está depositada en el GenBank con el número de acceso AF181848. Los números de acceso y designaciones de cepa de las secuencias 16S ARNr génicas de referencia utilizadas en los análisis filogenéticos son las siguientes: Anaerobranca horikoshii DSM 9786t (U21809) , Caldicell ulospiruptor saccralolyticus ATCC 43494t (L09178), Caloramator coolhaasii DSM 12679 AF104215, Caloramator fervidus ATCC 432045t (L09187) , Caloramator indicus ACM 3982t (X75788), Calorama tor proteoclasticus DSM 10124t JÍ l 1l ,? -I.A.----- -Í-Ai---, -t---.,»-, .

(X90488), Clostridi um butyricum ATCC 19398t (M59085) , Clostridium perfringens ATCC 13124t (M59103) , Moorella glyceríni DSM 11254t (U82327), Moorella thermoacetica LJDT (M59121), Moorella ther oautotrophica DSM (1974t (L09168), Oxobacter pfennigii DSM 3222t (X77838) , Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 31550t (109162), Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes ATCC 3374t (L09171), Thermobrachi um célere DSM 8682 X99238, Thermosyntropho lipolytica DSM 11003t (X99980) . Resultados Enriquecimiento y Aislamiento El medio basal que contenía glicerol fue inoculado con aproximadamente 10% de la muestra (p/v) y se incubó a 60°C. Además, se inocularon medios de la misma composición pero que exhibían pH de 7.5 y 9.0 con la muestra (10% (p/v) cada uno) . Sólo se obtuvo un cultivo de enriquecimiento a pH 6.0 que utilizaba glicerol. Después de transferencias subsecuentes (10% v/V) , se prepararon diluciones en serie de este cultivo de enriquecimiento y se sembraron en medio basal sólido (1.5% de agar) utilizando sobrecapas de agar blando, las cuales consistían de medio basal que contenía agar al 0.8%. Se picaron colonias aisladas, se subcultivaron en medio líquido de la misma composición y se determinó la formación de 1, 3-propanodiol por HPLC. Para subsecuentes inoculaciones, el l -i.-i.--j *-------- >.------------procedimiento se repitió varias veces utilizando medio basal así como el medio complejo definido descrito por Kell et al . , Biochem. Biophys. Res. Commum. 99:81-88 (1981). El crecimiento en medio líquido se intensificó en gran medida cuando los cultivos se incubaron en agitación. Después de transferir colonias en medios básales líquidos a 60°C en agitación, se obtuvo una curva de fermentación de glicerol, la cual se consideró como pura y se designó como la cepa JW/MS-VS5T. Morfología de Colonias y Celular En las placas que contenían medio basal, las colonias aparecieron después de 7-10 días. Una vez adaptadas al crecimiento en las placas, las subsecuentes inoculaciones en placas frescas produjeron colonias después de 2-3 días. Las colonias eran uniformemente redondas, de color blanco y de 1.0 a 1.5 in de diámetro. Las células de la cepa JW/MS-VS5T eran bacilos rectos o ligeramente curvados, de 0.4 a 0.6 µm de diámetro y de 2.0 a 3.0 µm de longitud. Las células aparecían en su mayoría aisladas. No se obtuvieron indicaciones de movilidad por microscopía óptica. El análisis por microscopía electrónica realizado después de una tinción negativa, no reveló la presencia de flagelos, utilizando células en diferentes etapas de crecimiento. No se observó presencia de esporas en ninguna etapa del crecimiento.

IA?.?.? -U-.-----------.-WI---t.-r-..-.. .----- --- ------- - ----- J.^ ^ ^-.------,-----««••-^"'"tr-f ... r -ir - - Reacción de Tinción de Gram y Tipo de Gram Las células presentaban tinción Gram positiva sólo en la fase exponencial temprana del crecimiento. Cortes ultradelgados de la cepa J /MS-VS5T revelaron un péptidoglicano grueso, así pues el microorganismo fue considerado como de tipo Gram positivo, Wiegel, Jnt. J. Syst . Bacteriol . 47:651-56 (1997). Esta determinación concuerda con los datos de secuenciación de 16S ARNr que colocaban al microorganismo en la rama de Clostridi um-Bacill us . Además del péptidoglicano, se observó otra capa externa que podía representar una capa S, sin embargo las micrografías por microscopía electrónica no pudieron revelar ningún arreglo geométrico. Rangos de Temperatura y pH El rango de temperatura a pH25°c 6.0 para el crecimiento de la cepa JW/MS-VS51, fue de 33 a 64°C con un óptimo de 58°C (Fig. 1) . No se detectó crecimiento a 67°C ni a temperaturas inferiores a 33°C. La cepa creció en un rango de pH25°c de 5.0 a 7.8, con un óptimo a pH2°c de 6.0-6.5 (Fig. 2). No se detectó crecimiento a pH25°c de 4.7 ni a pH* de 8.0. El tiempo de duplicación más corto bajo condiciones óptimas fue de 2.8 horas. Utilización del Sustrato y Productos de Fermentación Los sustratos utilizados incluyeron glicerol, .--,-..-».- . - 11 - glucosa, fructosa, sacarosa, celobiosa, lactosa, galactosa, mañosa (20 mM) , almidón y extracto de levadura (5 g/L). La cepa JW/MS-VS5T no utilizó xilosa, arabinosa, acetato, lactato, formiato, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, 5 n-butanol, propionato, acetona, succinato, etílenglicol, 1,2-propanodiol, fenol, benzoato y H2/C02. Como se muestra en la Tabla 1, la fermentación del glicerol produjo acetato y 1, 3-propanodiol como los únicos productos metabólicos orgánicos. No se detectaron 10 alcoholes de 1 a 3 átomos de carbono, dioles diferentes al 1, 3-propanodiol ni ácidos orgánicos diferentes al acetato en cantidades medibles . Se produjeron cantidades significativas de H2 en estos cultivos. El patrón de fermentación obtenido sugiere una 15 transformación del glicerol de conformidad con la siguiente ecuación: 3 glicerol => 2 1, 3-propanodiol + acetato + C02 + H2 Receptores de Electrones En presencia de glicerol como sustrato, la cepa JW/MS-VS5T no redujo el nitrato (10 mM) , el óxido de fierro (III) amorfo (90 mM) , ácido 9, 10-antraquinon-2, 6- disulfónico (AQDS) , sulfato (10 mM) ni se observó precipitación o sublimación de S0 (30 mM) . La producción de 1, 3-propanodiol no fue efectuada en presencia de cualquiera de estos receptores de electrones. La cepa -8-----Í-Í---É Él--^-i-l-ti-k---H-M-l»t ----«...-n.A.»a^ -.j.-.. -------1..-,--.-.:-..---- -.--.

JW/MS-VS5T no fue capaz de crecer con 02 (20% v/v) en fase gaseosa. Susceptibilidad a Antibióticos La ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, rifampicina y kanamicina, inhibieron por completo el crecimiento a una concentración de 100 mg/mL de medio. La adición de estreptomicina y tetraciclina a la misma concentración, dieron como resultado un retardo en el crecimiento. Composición de bases de ADN El contenido de G+C del ADN genómico fue de 32 mol% (HPLC) . Comparación de la Secuencia 16S ARNr Génica Se determinó una secuencia de 16S ARNr génica casi completa de la cepa JW/MS-VS5 que comprendía 1480 nucleótidos de longitud. Se utilizaron dos conjuntos de datos para los análisis filogenéticos. El primer conjunto de datos contenía la secuencia determinada en este estudio y una selección de secuencias de referencia de bacterias Gram positivas con bajo contenido de G+C, mientras que el segundo conjunto de datos contenía una nueva secuencia y las secuencias disponibles en las bases de datos para las cinco especies de los géneros Caloramator y Thermobrachium.

Los análisis filogenéticos basados en el primer conjunto de datos que comprendía 1206 nucleótidos no ambiguos entre las -i-i..-- .-- - ' -..»------. posiciones 98 y 1469 (posiciones de E. coli, Brosius et al . , Proc. Nat 'l Acad. Sci . USA 75:4801-4805 (1978)) demostraron que el nuevo aislamiento se agrupaba como una ramificación distinta en el radio de influencia de los géneros previamente descritos Caloramator y Thermobrachi um (Fig. 3). La cepa JW/MS-VS5 comparte 91.7 a 94.1% de similitud de secuencia de 16S ARNr génica con especies de los géneros previamente descritos Caloramator y Thermobrachium y entre 83.4 y 87.1% de similitud con secuencias de los otros taxones incluidos en el primer conjunto de datos y que se muestran en la Figura 3. El segundo conjunto de datos que contenía secuencias del nuevo aislamiento y aquellas de las otras cinco especies de Calorama tor y Thermobrachi um y que comprendía 1393 nucleótidos no ambiguos entre las posiciones 38 y 1469 (posiciones de E. coli , Brosius et al . , supra) se utilizó para calcular por pares valores de similitud entre los taxones de este grupo. Las similitudes de secuencia de 16S ARNr génico entre la cepa JW/MS-VS5 y los taxones previamente descritos, estuvieron en el rango de 91.3 a 93.7%. Dentro del grupo Caloramator/Thermobrachium, el valor más alto de similitud de secuencia (93.7%) se encontró entre la cepa JS/MS-VS5 y Thermobrachium célere. Los análisis de secuencias o datos iniciales en las ramas recuperadas en la Figura 5, claramente respaldan al grupo kjá A ,?..x. i - **--áií -i- - Caloramator /Thermobrachium y la relación de este grupo con el género Clostridium grupo I, definido en Collins et al . , Int . J. Swiss P. Bacteriol . 44:812-826 (1994). Tal como es evidente por el análisis filogenético (Fig. 3), la cepa está más estrechamente relacionada con Thermobrachi um célere y tres especies de Caloramator que forman un distinto grupo dentro de la rama Bacillus- Clostridium Gram positivos del árbol filogenético. Estas cuatro especies son bacterias anaeróbicas termofílicas, quimioorganoheterotróficas, que exhiben un bajo contenido de G+C, lo cual se aplica a la cepa JW/MS-VS5T también. La Tabla 2 muestra una comparación de los rasgos morfológicos y fisiológicos de las cinco especies encontradas en este grupo . Tabla 1. Fermentación de Glicerol por la Cepa J /MS-VS5T La concentración inicial de glicerol utilizada para el cultivo de la cepa JW/MS-VS5T en el medio basal, ,-fflsü-a fue 33 mM. Tabla 2. Propiedades Seleccionadas de las Cepas Utilizadas en este Estudio: JS/MS-VS5T, Thermobrachium célere y Especies de Caloramator, C. férvidas, C. Indlcus y C. proteoclasticus . Propiedad NR: no reportado *: diferentes cepas EJEMPLO: Detección de un Gen Similar a dhaB en la Cepa J /MS-VS5T Materiales y Métodos La cepa J /MS-VS5T fue caracterizada por un método de PCR utilizando el gen dhaB de K. pneumoniae como control positivo. Se utilizaron cuatro conjuntos de cebadores: (a) dhaBl, que consistía de dhaB15' GGA ATT CAG ATC TCA GCA ATG AAA AGA TCA AAA CG (SEQ ID NO: 1) y dhaB13' GCT CTA GAT TAT TCA ATG GTG TCG GG (SEQ ID NO: 2); (b) dhaB2, que consistía de dhaB25' GGA ATA CAG ATC TCA GCA ATG CAÁ CAG ACA ACC C (SEQ ID NO: 3) y dhaB23' GCT CTA GAT CAC TCC CTT ACT AAG TCG (SEQ ID NO: 4); (c) dhaB3, que consistía de dhaB35' GGA ATT CAG ATC TCA GCA ATG AGC GAG AAA ACC ATG C (SEQ ID NO: 5) y dhaB33' GCT CTA GAT TAG CTT CCT TTA CGC AGC (SEQ ID NO: 6) ; y (d) dhaX, que consistía de dhaX5' AGG TGG TGC GGA TCC TGT CGA ATC CCT A (SEQ ID NO: 7) y dhaX3' GAT ACG AGA TCT TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG TAG CAG (SEQ ID NO: 8) . Todos los cebadores se compraron en GIBCO BRL. La reacción de PCR se llevó a cabo en tubos de PCR Hot Start (Molecular Bio-Products, Inc.) con 100 µL de reactivos de reacción de PCR. Cada 100 µL de la solución de reacción de PCR contenía: 2 µL del cultivo de bacterias, 20 µL de dNTPs 1 mM, 10 µL de solución reguladora 10X PCR (KCl 100 mM, (NH4)2S04 100 mM, Tris-HCl 200 mM (pH 8.75), MgS04 20 mM, Tritón al 1%, 1 mg/mL de BSA) -[Stratagene, La Jolla, CA], 3 µL de cada uno de los 2 conjuntos de cebadores opuestos (10 O.D./µL) y 1 µL de Pfu DNA Polimerasa (2.5 U/µL) -[Stratagene, La Jolla, CA.]. Las amplificaciones por PCR se realizaron en un ciclizador térmico MiniCycler (MJ Research) a tres diferentes temperaturas de apareamiento para probar las mejores condiciones. Las condiciones finales fueron las siguientes: cinco ciclos iniciales de desnaturalización (94°C, 1.5 mm) , apareamiento de rigor bajo (37°C, 1.5 mm) y extensión (72°C, 2.5 mm) . Después de los ciclos iniciales, se llevaron a cabo 25 ciclos adicionales en condiciones de apareamiento de mayor rigor: desnaturalización (94°C, 1.5 mm) , apareamiento (55°C, 1.5 mm) y extensión (72°C, 2.5 mm) . Se agregaron 10 µL de 10X ADN a cada muestra y 15 µL de cada producto de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa. Resultados El control positivo produjo las bandas apropiadas tal como se esperaba. El microorganismo desconocido mostró bandas de ADN débiles con el mismo tamaño de dhaBl y dhaB3, pero no en dhaB2 y dhaX. Las bandas débiles pueden deberse a una baja homología de los cebadores de PCR y los genes blanco. Estos resultados sugirieron que la cepa J /MS-VS5T podría ser portadora de un gen similar a dhaB que sirve para la misma función o una similar que el gen dhaB de K. pneumoniae . EJEMPLO: Determinación in vitro de la Actividad de la Glicerol Deshidratasa de J /MS-VS5T Se probaron células de la cepa JW/MS-VS5T -A.--.-t- --.-t-"AjA-i-'---«««--M-*«- ....--a-t----»J**»-^^--^--*.'- .--..-H..---.-J-1ÍÍI--- „.-----t.i- -.í i- tratadas con tolueno con respecto a su capacidad de transformar el glicerol en 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) y el 1,2-propanodiol en propionaldehído. Materiales y Métodos Las células se hicieron crecer anaeróbicamente a 60°C en un medio con sales minerales suplementado con 0.5 g/L de extracto de levadura y 3 g/L de glicerol, pH 6.8. Las células se cosecharon anaeróbicamente y se almacenaron a -70°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Las células congeladas se descongelaron y se trataron con tolueno en una caja con guantes en condiciones anaeróbicas. El tratamiento con tolueno consistió en los siguientes pasos: (a) lavar las células con 1 mL de KP04 50 mM, pH 8.0; (b) centrifugar las células durante 6 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5415C; (c) lavar las células con 1.5 L de KP0 50 mM, pH 8.0; (d) centrifugar nuevamente las células durante 6 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5415C; (e) redisolver las células en 2 mL de KP04 50 mM, pH 8.0; (f) agregar 20 µL de tolueno; (g) agitar vigorosamente durante 15 minutos; (h) centrifugar las células durante 10 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5415C; (i) lavar las células con 2 mL de KP0 50 M, pH 8.0; (j) centrifugar las células durante 6 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5415C; (k) repetir los pasos de los t*---.-.-----!-..-. --------- .- . -.--.--^-.--._-.-,-^^ t -mn*>*i incisos (i) y (j); (1) redisolver las células tratadas con tolueno en KP04 50 mM, pH 8.0; (m) medir la absorbancia de las células disueltas a 60 nM y (n) almacenar las células a -70°C. Las mezclas de reacción contenían, en 1.0 mL: KP04 15 mM, pH 8.0; KCl 0.25M; glicerol 200 mM ó 1,2-propanodiol; células tratadas con tolueno, 0.38 OD600; y coenzima B?2 12 µM. Las mezclas de reacción se incubaron a 60°C en condiciones anaeróbicas y se tomaron muestras a los tiempos indicados en la Figura 4. Se agregaron muestras de 100 µL a 50 µL de metilbenciltiazolinonhidrazona (MBTH) (6 mg/mL en glicina-HCl 375 mM, pH 2.7), se calentaron a 100°C durante 3 minutos, se enfriaron en hielo durante 30 segundos y se clarificaron por centrifugación a 14K rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes clarificados, posteriormente, se analizaron mediante una detección del producto en un sistema de HPLC de fase reversa de C8, de la siguiente manera: (a) la columna era una columna de 15 x 4.6 cm Supelco, Supelcosil LC-8-DB, tamaño de partícula 3 µm; (b) el disolvente A era TFA al 0.1%; (c) el disolvente B era acetonitrilo al 90%, TFA al 0.08%; (d) el gradiente fue (tiempo[min]/%B) : 0/0, 7/45, 17/65, 22/100, 24/100, 25/0, 30/0; (e) el volumen de eyección fue de 20 µL; (f) la velocidad del inyector fue de 833.3 µL/min; (g) la detección se llevó a cabo a 305 nm con una referencia de 500 nm; y (h) el ancho de banda fue de 4 para la longitud de onda de la muestra y 80 para la longitud de onda de referencia. Utilizando este sistema, el tiempo de retención para el 3-HPA fue de 8.7 minutos y para el propionaldehído de 10.7 minutos. Resultados Los tiempos para la transformación del glicerol en 3-HPA y del 1, 2-propanodiol en propionaldehído a 60°Cm se muestran en la Figura 4. Los resultados indican que la glicerol deshidratasa es activa a 60°C, la temperatura de crecimiento del microorganismo. La enzima es inactivada por glicerol, pero no por 1, 2-propanodiol. Se ha reportado una inactivación similar en la literatura científica para otras glicerol deshidratasas. Sin embargo, la glicerol deshidratasa de Klebsiella es inactiva a 60°C. De hecho, no se ha reportado ninguna glicerol deshidratasa con actividad a 60°C. BREVE DESCRIPCIÓN DEL DEPÓSITO BIOLÓGICO Y LISTADO DE SECUENCIAS La cepa tipo de C. vi terbiensis JW/MS-VS5T fue depositada el 27 de agosto de 1999 en la ATCC (American Type Culture Collection, Colección Norteamericana de Cultivos Tipo) bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patente y está designada como ATCC PTA-584. El término "ATCC" se refiere al depósito internacional de American Type Culture Collection ubicado en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 E.U.A. Las designaciones se refieren al número de acceso del material depositado. La secuencia de 16S ADNr de la cepa JW/MS-VS5T fue depositada en la base de datos Genbank, con el número de acceso AF181848. EQUIVALENTES La especificación anterior es suficiente para hacer posible que un técnico en la materia practique la presente invención. De hecho, varias modificaciones de los medios anteriormente descritos para llevar a cabo la presente invención que son obvias para los técnicos en el campo de la biología molecular, biotecnología o campos relacionados, quedan dentro de los alcances de las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (45)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para transformar glicerol en 1,3-propanodiol en un organismo termofílico, caracterizado porque el método comprende: proporcionar un organismo termofílico que fermente glicerol en 1, 3-propanodiol; y cultivar el organismo termofílico en condiciones tales que se produzca 1, 3-propanodiol .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de colectar el 1, 3-propanodiol producido por el organismo termofílico.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque además comprende el paso de polimerizar el 1, 3-propanodiol para formar un polímero.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polimero es poli (tereftalato de 1, 3-propileno) (PPT).
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo termofílico es Caloramator vi terbiensis . .-A.... -,.-...t -1.J- .-t.-r. -. -t--- ----- -3ftft..---. ..--.---^-------A--»-----»----.-.--.---^-----J--,---------..-~i-.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el organismo termofílico se deriva del organismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
7. 7. Un método para producir 1, 3-propanodiol a partir de glicerol, caracterizado porque comprende: incubar glícerol con una enzima deshidratasa termoestable, transformando de esta manera el glicerol en 3-hidroxipropionaldehído; y agregar un agente reductor capaz de reducir el 3- hidroxipropionaldehído a 1, 3-propanodiol .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la reducción del 3- hidroxipropionaldehído a 1, 3-propanodiol, es catalizada por una enzima 1, 3-propanodiol oxidorreductasa termoestable.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque además comprende el paso de colectar el 1, 3-propanodiol .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende el paso de polimerizar el 1, 3-propanodiol para formar un polímero .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polímero es poli (tereftalato de 1, 3-propileno) (PPT). -H-A-i»- ---.-----teji-tü---. i •t?----»---<-"iat."-*A«A"-»*-•&. --__---_-.»*"* j----n.á„A-i
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la enzima deshidratasa termoestable se deriva de un organismo termofílico.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el organismo termofílico es Caloramator vi terbiensis .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el organismo termofílico se deriva del organismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
15. 15. Una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada, caracterizada porque se deriva de C. vi terbiensis .
16. 16. Una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada, caracterizada porque se deriva del organismo depositado en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
17. 17. Una enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada, caracterizada porque es homologa a una enzima de fermentación de glicerol termoestable derivada de C. vi terbiensis .
18. 18. La enzima de fermentación de glicerol termoestable aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, caracterizada porque es una i -a deshidratasa.
19. 19. La enzima de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque es la glicerol deshidratasa.
20. 20. La enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 ó 17, caracterizada porque es la 1, 3-propanodiol oxidorreductasa.
21. 21. Un cultivo o célula aislada de Caloramator vi terbiensis.
22. 22. El cultivo o célula aislada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el genoma del cultivo o célula tiene cuando menos 95% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
23. 23. El cultivo o célula aislada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el genoma del cultivo o célula tiene cuando menos 99% de identidad con el genoma de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
24. 24. El cultivo o célula aislada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la secuencia de 16S ADNr del cultivo o célula tiene cuando menos 95% de identidad a la secuencia de 16S ADNr de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
25. 25. El cultivo o célula aislada de conformidad -----_._--..*---..?¿Mt^^~*~*¿**~j??áJ ?ai?*?j?&»*l>» '? **»**" ----"< con la reivindicación 21, caracterizado porque la secuencia de 16S ADNr del cultivo o célula tiene cuando menos 99% de identidad con el 16S ADNr de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
26. 26. El cultivo o célula aislada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es progenie de los organismos depositados en la ATCC con la clave de designación PTA-584.
27. 27. Un método para clonar una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable, caracterizado porque comprende: hibridizar una sonda de polinucleótido homologa a una porción de un gen de la enzima de fermentación de glicerol conocido, con una molécula de polinucleótido proveniente de una muestra ambiental que se sospecha que contiene un organismo termofílico; y aislar una secuencia de polinucleótido que se una a la sonda de polinucleótido.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque se utiliza una reacción en cadena catalizada por polimerasa empleando una segunda sonda de polinucleótido para amplificar la secuencia de polinucleótido que se une a las sondas de polinucleótido .
29. 29. El método de conformidad con cualquiera de -.--^--^-A------------ .---.--.-.-------.-- •--•<--.--------» -^--^-a-i-----------i-i las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque la enzima de fermentación de glicerol termoestable se deriva de un organismo termofílico identificado como fermentador de glicerol en 1, 3-propanodiol.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el organismo termofílico es Caloramator vi terbiensis .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la sonda de polinucleótido es homologa a una porción de un gen dhaB conocido.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el gen dhaB es de Klebsiella .
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque cuando menos una sonda de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la sonda de polinucleótido y la segunda sonda de polinucleótido son las SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la sonda de polinucleótído y la segunda sonda de polinucleótido son las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
36. 36. Un método para clonar una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de fermentación de glicerol termoestable, caracterizado porque el método comprende: transformar un organismo blanco que no pueda crecer anaeróbicamente en glicerol, con ADN proveniente de un organismo termofílico; y identificar los organismos blanco transformados que contengan la secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima que fermenta el glicerol en 1,3-propanodiol, por su crecimiento anaeróbico en presencia de glicerol .
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la enzima de fermentación de glicerol termoestable se deriva de un organismo termofílico identificado como fermentador de glicerol en 1, 3-propanodiol .
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el organismo termofílico es Caloramator vi terbiensis .
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque Caloramator vi terbi ensis se deriva del organismo depositado en la ATCC ---ni----. -• * *^^^>'---i-i,iiA^»'"a^^-,J"^*'"«^^^'¿^riu' AJfri-? .--. con la clave de designación PTA-584.
40. 40. Un método para aislar un organismo termofílico que cataliza la fermentación del glicerol en 1, 3-propanodiol, caracterizado porque comprende: incubar una muestra que contiene organismos termofílicos en un medio que contiene glicerol como fuente primaria de carbono; y aislar cuando menos un organismo termofílico que fermente el glicerol en 1, 3-propanodiol .
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la muestra se incuba a una temperatura en el rango de aproximadamente 40 a aproximadamente 100°C.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la muestra se incuba en condiciones anaeróbicas.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la muestra se obtiene a partir de una fuente natural que tiene una temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100°C.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende el paso de detectar la producción de 1, 3-propanodiol por parte del organismo termofílico.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende el paso de determinar la producción de acetato por parte del organismo termofílico.