JP2003516721A

JP2003516721A - グリセロールを脱水する新規な酵素

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Publication number: JP2003516721A
Application number: JP2001525383A
Authority: JP
Inventors: セイフリード，マーカス; ウィージェル，ジャーゲン; ホワイテッド，グレゴリー
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド; ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2003-05-20
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: KR100861905B1; DE60038886D1; US20050014238A1; KR20020060185A; WO2001021825A2; WO2001021825A3; KR101005453B1; KR20070118713A; AU4017901A; MXPA02003091A; CN100352932C; IL148762A; IL148762A0; BR0014662A; EP1944363A1; JP4694746B2; CA2384956C; KR20090069338A; DK1218530T3; EP1218530A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、１，３−プロパンジオールの生産のための改良された方法及び試薬に関する。特定すれば、本発明は、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒することができる新規な好熱性生物及び温度安定性酵素を提供する。本発明は、そのような好熱性生物を単離する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローン化する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレオチド、及び１，３−プロパンジオールの生産のためのそのような酵素及び生物の使用方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．技術分野本発明は１，３−プロパンジオール生産のための改良された方法および試薬に
関している。特に、本発明はグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発
酵を触媒できる新規好熱性生物および熱安定性酵素を提供する。本発明はまた、
そのような好熱性生物を単離する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレ
オチドをクローニングする方法、そのような酵素をコードしているポリヌクレオ
チド、および１，３−プロパンジオール製造のためにそのような酵素および生物
を使用する方法にも関している。

【０００２】２．背景技術１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産およびポリウレタンおよ
び環状化合物の製造に使用されるモノマーである。種々の１，３−プロパンジオール合成経路が知られている。例えば、１，３−
プロパンジオールは：（１）ホスフィン、水、一酸化炭素、水素および酸の存在
下、触媒上でのエチレンオキサイドの変換により；（２）アクロレインの触媒的
液相水和、続いての還元により；または（３）一酸化炭素および水素存在下、周
期律表のＶＩＩＩ族からの原子を持っている触媒上で炭化水素（例えば、グリセ
ロール）を反応させることにより合成できる。しかしながら、伝統的化学合成法
は費用がかかり、環境汚染物質を含んでいる一連の廃棄物を発生し、理想とはほ
ど遠い。より費用がかからず、およびより環境に優しい、１，３−プロパンジオ
ールを生産する別の方法および試薬を開発することが望まれている。

【０００３】別の方法は、インビボ（即ち、微生物内で）またはインビトロでグリセロール
から１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒する酵素を使用することである。
例えば、ＷＯ９８／２１３３９、ＷＯ９８／２１３４１および米国特許第５，８
２１，０９２、５，２５４，４６７、５，６３３，３６２および５，６８６，２
７６号を参照されたい。グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産でき
る細菌株は、例えば、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｒｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群で発見されている。これらの細菌は２工程酵
素触媒反応によりグリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する。第一の
工程において、脱水酵素がグリセロールの３−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒ
ド（３−ＨＰ）および水への変換を触媒する（式１）。第二の工程において、３
−ＨＰはＮＡＤ⁺−連結酸化還元酵素により１，３−プロパンジオールへ還元さ
れる（式２）。

【０００４】グリセロール → ３−ＨＰ＋Ｈ₂Ｏ（式１）３ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ⁺（式２）１，３−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、高濃度で培地中に蓄
積できる。全体の反応は、還元型ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤＨ）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ⁺）への酸化を生
じる。

【０００５】グリセロールの１，３−プロパンジオールへの生物変換反応は一般的に、グリ
セロールを唯一の炭素源として使用し、および他の外因性の還元的に等価な受容
体不在での嫌気的条件下で実施される。いくつかの細菌株において、例えば、シトロバクター、クロストリジウムおよびクレブシエラのある種の株、グリセロー
ルのための平行経路が働き、それは最初に、ＮＡＤ⁺−（またはＮＡＤＰ⁺−）連
結グリセロール脱水素酵素によるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ
）への酸化を含んでいる（式３）。ＤＨＡはＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシ
アセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）後、生合成に、および
ＡＴＰ発生を支えるため（例えば、解糖を経て）に利用可能となる。

【０００６】グリセロール＋ＮＡＤ⁺→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺ （式３）ＤＨＡ＋ＡＴＰ → ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ（式４）１，３−プロパンジオール経路と対照的に、この経路は細胞に炭素およびエネル
ギーを提供し、ＮＡＤＨを消費するよりもむしろ生成する。

【０００７】クレブシエラニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびシトロバクターフロインディイ（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）において、グリセロール脱水酵素（ｄｈａＢＣＥ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）、グリセロー
ル脱水素酵素（ｄｈａＤ）およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の
機能的連結活性をコードしている遺伝子はｄｈａレギュロン中に見いだされてい
る。シトロバクターおよびクレブシエラからのｄｈａレギュロンは大腸菌で発現
されており、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換することが示され
ている（Ｔｏｎｇｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：３５４１−４６（１９９１）；Ｓｅｙｆｒｉｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１７８：５７９３−９６（１９９６）；Ｔｏｂｉｍａｔｓ
ｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−２２３５７
（１９９６））。

【０００８】１，３−プロパンジオールを生産するための生物的方法および試薬の使用に内
在する潜在的利点のゆえ、優れた特性で、グリセロールおよび他の炭素基質を１
，３−プロパンジオールに変換できる新規微生物および酵素を開発および同定す
る必要性が存在する。本発明は優れた微生物および酵素、ならびに他の優れた微
生物および酵素を同定する方法を提供することによりそのような要求を満足させ
る。

【０００９】３．発明の要約本発明は１，３−プロパンジオール生産のための改良された方法および試薬に
関している。特に、本発明はグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発
酵を触媒できる新規好熱性生物および熱安定性酵素を提供する。本発明はまた、
そのような好熱性生物を単離する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレ
オチドをクローニングする方法、そのような酵素をコードしているポリヌクレオ
チド、および１，３−プロパンジオール製造のためにそのような酵素および生物
を使用する方法にも関している。

【００１０】一つの様相において、本発明は好熱性生物中でグリセロールを１，３−プロパ
ンジオールに変換するための方法を提供する、該方法は：グリセロールを１，３
−プロパンジオールへ発酵させる好熱性生物を提供し；および１，３−プロパン
ジオールが生成されるような条件下で該好熱性生物を培養することから成ってい
る。好適な態様において、本方法はさらに該好熱性生物により生成された１，３
−プロパンジオールを集める工程を含んでいる。別の好適な態様において、好熱
性生物はカロラマトールビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）であり、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されてい
る微生物に由来する好熱性生物が特に好適である。

【００１１】本発明はさらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産する方法
を提供し、該方法は：グリセロールを熱安定性脱水酵素とインキュベートし、そ
れによりグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへ変換し、および
３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールへ還元するこ
とから成っている。好適な態様において、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド
の１，３−プロパンジオールへの還元は熱安定性１，３−プロパンジオール酸化
還元酵素により触媒される。別の好適な態様において、該方法はさらに１，３−
プロパンジオールを集める工程を含んでいる。さらに別の好適な態様において、
熱安定性脱水酵素はカロラマトールビテルビエンシスのような好熱性生物に由
来し、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物に由来する好熱
性生物が特に好適である。

【００１２】さらに別の本発明の様相は、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する単離された熱安
定性グリセロール発酵酵素を提供し、ここでＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として
寄託されている微生物に由来する熱安定性グリセロール発酵酵素が特に好適であ
る。特に好適な態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素はグリセロール脱
水酵素のような脱水酵素、または１，３−プロパンジオール酸化還元酵素のよう
なＮＡＤ⁺−連結酸化還元酵素である。本発明はさらにＣ．ビテルビエンシスに
由来する熱安定性グリセロール発酵酵素に相同的である単離された熱安定性グリ
セロール発酵酵素を提供する。

【００１３】本発明でさらに提供されるのは、Ｃ．ビテルビエンシスの単離された培養物ま
たは細胞である。非制限的実施態様において、培養物または細胞のゲノムはＡＴ
ＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと少なくとも８５
％同一であり、好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生
物のゲノムと９０％同一であり、より好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４とし
て寄託されている微生物のゲノムと９５％同一であり、最も好適にはＡＴＣＣ名
称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと９９％同一である。別
の非制限的実施態様において、培養物または細胞の１６ＳｒＤＮＡ配列はＡＴ
ＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列と
少なくとも９５％同一であり、好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託
されている微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９８％同一である。

【００１４】別の様相において、本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリ
ヌクレオチド配列のクローニング法を提供し、該方法は：既知のグリセロール発
酵酵素の一部と相同的なポリヌクレオチドプローブを、好熱性生物を含んでいる
と予想される環境試料からのポリヌクレオチド分子とハイブリダイズさせ；およ
び少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブを結合するポリヌクレオチド配列
を単離することから成っている。非制限的態様において、該方法はポリヌクレオ
チドプローブを結合するポリヌクレオチド配列を増幅するためにポリメラーゼ連
鎖反応を使用する。好適な態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素はグリ
セロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させると同定された好熱性生物から
誘導され、Ｃ．ビテルビエンシスが特に好適である。別の好適な態様において、
ポリヌクレオチドプローブは既知のｄｈａＢ遺伝子の一部と相同的であり、クレブシエラからのｄｈａＢ遺伝子と相同的なプローブが特に好適である。

【００１５】本発明はさらに、熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチ
ド配列のクローニング法を提供し、該方法は：グリセロール上で嫌気的には増殖
できない標的生物を好熱性生物からのＤＮＡで形質転換し；およびグリセロール
上での嫌気的増殖により、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させ
る酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含む形質転換された標的生物を
同定することから成っている。非制限的態様において、熱安定性グリセロール発
酵酵素はＣ．ビテルビエンシスのように、グリセロールを１，３−プロパンジオ
ールへ発酵させると同定された好熱性生物から誘導され、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−
５８４として寄託されている微生物に由来する好熱性生物が特に好適である。

【００１６】本発明のさらに別の様相は、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発
酵を触媒する好熱性生物を単離する方法を提供し、該方法は：好熱性生物を含ん
でいる試料を、主たる炭素源としてグリセロールを含んでいる培地中でインキュ
ベートし；およびグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させる少なく
とも一つの好熱性生物を単離することから成っている。非制限的態様において、
試料は約４０℃から約１００℃の範囲の温度および／または嫌気的条件下でイン
キュベートする。別の非制限的態様において、試料は室温から約１００℃、より
好適には約５０℃から約１００℃の間の温度を持つ天然起源物から得られる。好
適な態様において、本方法はさらに好熱性生物による１，３−プロパンジオール
および／またはアセテートの生成を検出する工程を含んでいる。

【００１７】５．発明の詳細な説明好熱性生物とは、ほとんどの他の生物（例えば、中温）は生存することができ
ない、高められた温度で生存および増殖できる生物である。この異常な高温に対
する弾力性は、一部、これらの生物が生命の生物学的反応を触媒するために熱安
定性酵素を使用しているためである。熱安定性酵素は好熱性生物が代謝反応を高
められた温度で触媒することを可能にする。そのような生物は室温環境から単離
することもできるが、例えば、温泉、熱通風口およびローンドロマット流出物を
含む高温環境からより有望に単離される。好熱性細菌および酵素の異常な熱安定
性は、経済的に価値がある生物変換反応を、中温生物および酵素を使用して達成
できるより高い温度で触媒することを可能にする。多くの場合、好熱性細菌は発
酵過程においてインビボで所望の反応を触媒するために使用される。もしくは、
熱安定性酵素はインビトロまたは“無細胞”生物変換反応で触媒させるために、
典型的には反応の制御および反応生成物の回収を容易にするために固定化されて
いる酵素として使用できる。

【００１８】高められた温度で生物変換反応を実施することにより多くの利点が達成できる
。化学反応の場合のように、反応の温度を高くするにつれて、酵素的触媒反応の
速度が一般的に劇的に増加する。工業的生物変換反応が進行する速度を速くする
ことから明白な効率恩恵が誘導される。加えて、ほとんどの可能性のある夾雑生
物が生存できない高い温度で反応を行うことにより、反応媒質の微生物夾雑を防
止することが可能である。

【００１９】高温で生物変換反応を触媒させるために好熱性生物を使用する別の利点は、い
くつかの場合、高温は反応媒質からの所望の生成物の分離および単離を容易にす
る。例えば、米国特許第５，１８２，１９９号は反応媒質からのエタノールの分
離を容易にするための、熱安定性酵素および高温発酵の使用を開示している。

【００２０】高温に対して安定性であることを超えて、熱安定性酵素はまた、通常酵素を不
活性化する別の条件および基質に対する高められた安定性を持っていることも一
般的に観察されている。熱安定性酵素はまた、中温生物に由来する酵素よりも長
い保存期間を持っている傾向がある。本発明は１，３−プロパンジオールの酵素
触媒生産のための改良された方法および試薬を提供する。本発明の一部は、最初
の、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒できる好熱性生物
および熱安定性酵素を提供する。これらの生物および酵素の一つの新規な特徴は
、従来同定された１，３−プロパンジオール産生生物および酵素が急速に不活性
化される、高められた温度において、生存可能および触媒的に活性のまま残って
いるそれらの能力である。本発明の方法および組成物は高められた温度でグリセ
ロールを１，３−プロパンジオールへ生物的に変換するために使用でき、それに
より従来説明された方法、特に低温で実施される方法に対して著しい利点を提供
する。本発明はさらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生成でき
る好熱性生物を同定する方法、ならびに、この変換を触媒する熱安定性酵素をコ
ードするポリヌクレオチドのクローニング法も含んでいる。

【００２１】５．１高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる好熱性生物、およびそのような生物の単離一つの態様において、本発明は高められた温度でグリセロールを１，３−プロ
パンジオールへ発酵できる好熱性生物を提供する。

【００２２】本明細書で使用される場合、用語“好熱性生物”とは高温で、好適には５０℃
より高い温度で、より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０
℃より高い温度で、最も好適には８５℃より高い温度で増殖できる生物を指して
いる。８５℃より高い温度で増殖できる生物は高好熱性生物と呼ばれている。好
熱性生物の例は、例えば、原核微生物真性細菌および古細菌間で発見できる。そ
のような生物は、温泉、火山地域および潜水艦熱通風口のような熱い環境に住ん
でおり、そこから単離できる。加えて、好熱性生物は室温で供給源から単離でき
る。

【００２３】本発明の好適な態様において、高められた温度でグリセロールを１，３−プロ
パンジオールへ発酵できる好熱性生物はカロラマトールビテルビエンシスの株
である。Ｃ．ビテルビエンシスはグリセロールを１，３−プロパンジオールおよ
びアセテートへ発酵できる好熱性細菌の種である。Ｃ．ビテルビエンシスは本明
細書では以下のような同定特性を持っている細菌種として定義される：該種は（
１）好熱性であり；（２）グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵でき
；および（３）ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されているＪＷ／ＭＳ−
ＶＳ５^T株型と“実質的なゲノム配列同一性”を共有している。

【００２４】本発明の非制限的実施態様において、種Ｃ．ビテルビエンシスのメンバーはま
たＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型の以下の同定特性も共有している。ＪＷ／ＭＳ−Ｖ
Ｓ５^T細胞は直径が０．４から０．６μｍの、まっすぐなまたはわずかに湾曲し
た杆菌である。細胞は単独で存在し、グラム染色陽性である。ｐＨ６．０での増
殖するための温度範囲は３３−６４℃であり、至適温度は５８℃である。増殖の
ためのｐＨ^25C範囲は５．０から７．６、至適には６．０−６．５である。グリ
セロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース
、セレビオース、ラクトース、デンプンおよび酵母抽出物で増殖が観察される。
この株はキシロース、アラビノース、アセテート、ラクテート、ホルメート、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール
、プロピオナート、アセトン、スクシネート、エチレングリコール、１，２−プ
ロパンジオール、フェノールおよびベンゾエートを認められるほど発酵させない
。Ｈ₂：ＣＯ₂存在下、自己栄養条件下では増殖は認められない。グリセロールの
発酵から主有機生成物としてアセテートおよび１，３−プロパンジオールが得ら
れ、増殖の間に著しい量のＨ₂が発生される。増殖はアンピシリン、クロラムフ
ェニコール、エリスロマイシン、リファンピシンおよびカナマイシンで阻害され
る（すべて１００μｇ／ｍｌで）。ストレプトマイシンまたはテトラサイクリン
は同量で増殖を遅らせる。ＨＰＬＣで決定された株ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は３２モ
ル％である。

【００２５】種Ｃ．ビテルビエンシスの推定メンバーを同定するため、用語“実質的なゲノ
ム配列同一性”とは：ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型のゲノム配列と生物のゲノム配
列が少なくとも９０％の同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、およびよ
り好適には少なくとも９９％の同一性であるか；またはＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株
型の１６ＳｒＤＮＡ配列と生物の１６ＳｒＤＮＡ配列が少なくとも９０％の
同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、およびより好適には少なくとも９
９％の同一性であることを指している。

【００２６】実質的な配列同一性は推定Ｃ．ビテルビエンシスおよびＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T
の全ゲノム配列を比較することにより決定できる。もしくは、実質的な配列同一
性は推定Ｃ．ビテルビエンシスおよびＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tの１６ＳｒＤＮＡ
配列を比較することにより決定できる。ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tおよび推定Ｃ．ビ
テルビエンシスゲノムのすべてまたは一部の配列、特に生物の１６ＳｒＤＮＡ
の配列、は当業者にはよく知られている通常の核酸配列決定技術により決定でき
る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮ
ＩＮＧ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ（１９８９）およびＣＵＲＲ
ＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａ
ｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，編，１９８９）を参照されたい）。続いて、当業
者にはよく知られている配列比較法を使用して配列が比較できる。例えば、Ｗｏ
ｒｌｄ−ＷｉｄｅＷｅｂ上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ．から入手可能なＢＬＡＳＴコンピュータープログラム、バージョン
２．０を使用して、パーセント同一性が計算できる。ＢＬＡＳＴの説明は、例え
ば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
−１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照されたい。

【００２７】特別な態様において、本発明はそのゲノムが低ストリンジェンシー条件下でＪ
Ｗ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型のゲノムへハイブリダイズ可能で、グリセロールから１
，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。別の好適な
態様において、本発明はその１６ＳｒＤＮＡ配列が低ストリンジェンシー条件
下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型の１６ＳｒＤＮＡ配列へハイブリダイズ可能な
、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を
提供する。低ストリンジェンシーのそのような条件を使用する方法は以下のよう
であろう（ＳｈｉｌｏａｎｄＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６７８９−６７９２（１９８１）もまた参照され
たい）：ＤＮＡを含んでいるフィルターは３５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ
、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ
、０．１％フィコール、１％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
を含んでいる溶液中、４０℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは下
記の変更を加えた同じ溶液中で実施する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコ
ール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）硫酸デキストランおよび５−２０ｘ１０⁶ｃｐｍ³²Ｐ−標識プローブを使用
する。フィルターはハイブリダイゼーション混合物中、４０℃で１８−２０時間
インキュベートし、次に２ＸＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含んでいる溶液中、５５℃で１．５
時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液に置き換え、さらに６０℃で１．５時間洗
浄する。フィルターは吸い取って乾燥し、オートラジオグラフィーのために暴露
する。必要に応じ、フィルターは６５−６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルム
に暴露する。低ストリンジェンシーの他の条件は当業者にはよく知られている（
例えば、交差−種ハイブリダイゼーションで用いるような）。

【００２８】別の特別な態様において、本発明はそのゲノムが中程度のストリンジェンシー
条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型のゲノムへハイブリダイズ可能な、グリセロ
ールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。
好適な態様において、本発明はその１６ＳｒＤＮＡ配列が中程度のストリンジ
ェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型の１６ＳｒＤＮＡ配列へハイブリ
ダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好
熱性微生物を提供する。中程度のストリンジェンシーのそのような条件を使用す
る方法は以下のようであろう：ＤＮＡを含んでいるフィルターは６ＸＳＳＣ、
５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａを含んでいる溶液中、５５℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは
同じ溶液中で実施し、および５−２０ｘ１０⁶ｃｐｍ³²Ｐ−標識プローブを使用
する。フィルターはハイブリダイゼーション混合物中、５５℃で１８−２０時間
インキュベートし、次に１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含んでいる溶液中
、６０℃で３０分間洗浄する。フィルターは吸い取って乾燥し、オートラジオグ
ラフィーのために暴露する。中程度のストリンジェンシーの他の条件は本分野で
はよく知られている。フィルターの洗浄は２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを
含んでいる溶液中、３７℃で１時間行う。

【００２９】別の特別な態様において、本発明はそのゲノムが高ストリンジェンシー条件下
でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型のゲノムへハイブリダイズ可能な、グリセロールか
ら１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。好適な
態様において、本発明はその１６ＳｒＤＮＡ配列が高ストリンジェンシー条件
下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型の１６ＳｒＤＮＡ配列へハイブリダイズ可能な
、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を
提供する。高ストリンジェンシーのそのような条件を使用する方法は以下のよう
であろう：ＤＮＡを含んでいるフィルターは５ＸＳＳＣ、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコ
ール、０．０２％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る緩
衝液中、６０℃で８時間から一夜、前ハイブリダイゼーションを実施する。フィ
ルターは１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５−２０ｘ１０⁶ｃｐｍ³²
Ｐ−標識プローブを含んでいる前ハイブリダイゼーション混合液中、６５℃で４
８時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄は２ＸＳＳＣ、０．０１％ＰＶ
Ｐ、０．０１％フィコールおよび０．０１％ＢＳＡを含んでいる溶液中、３７℃
で１時間行う。続いて０．１ＸＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄洗浄した後に
オートラジオグラフィーを行う。使用されるであろう高ストリンジェンシーの他
の条件は本分野ではよく知られている。

【００３０】種Ｃ．ビテルビエンシスはさらにＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型の子孫を含んでお
り、ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^T株型に関して改変された遺伝子型および／または表現
型を持っている子孫を含んでいる。表現型および／または遺伝子型は方向付けら
れたおよび無作為の突然変異発生の結果を含んでいる突然変異により改変できる
。本発明は１，３−プロパンジオールの産生を促進するように特異的に設計され
た単一または多突然変異を持っている細胞を提供する。例えば、基質または生成
物抑制に抵抗性である様式でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵で
きる変異株を意図することが本発明で特に有用であろう。

【００３１】変異体を作り出す方法は普通であり、本分野ではよく知られている。例えば、
野生型細胞は、放射線または化学的突然変異誘発剤のような種々の因子へ暴露で
き、所望の表現型でスクリーニングされる。放射線照射により突然変異を作り出
す場合、紫外（ＵＶ）またはイオン化放射線が使用できる。放射線または化学薬
品を使用して変異体を作り出す特異的方法は本分野では十分に証明されている。
例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ：ＡＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第二版（１９８９）Ｓｉｎ
ａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ
．，またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−３４（１９９２）（本明細書に組み入れられる）を参照
されたい。突然変異発生処理に続いて、所望の表現型を持っている変異体は種々
の方法により選択される。無作為スクリーニングが最も普通であり、突然変異誘
発された細胞は所望の特質で選択される。変異体選択の方法は高度に開発されて
おり、工業微生物学の分野ではよく知られている。例えば、Ｂｒｏｃｋ、前記文
献、を参照されたい。

【００３２】本発明はさらに、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる培養
好熱性生物を単離および維持するための方法に関している。そのような生物は本
発明の態様の実施に有用であり、例えば、それらは高められた温度でグリセロー
ルを１，３−プロパンジオールへ生物学的に変換するために使用でき、またはそ
れらはグリセロールを発酵する熱安定性酵素またはそれをコードしているポリヌ
クレオチド源として使用できる。

【００３３】細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、ＭＡＮＵＡ
ＬＯＦＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＧＥＮＥＲＡＬＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧ
Ｙ（Ｇｅｒｈａｒｄｔｅｔａｌ．，編），ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔ
ｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．また
はＢｒｏｃｋ，前記文献、に見ることができる。細菌細胞の維持および増殖に使
用される試薬および材料は商業的供給会社、例えば、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ
ｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇＭｄ．）またはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から得ることができる。

【００３４】本発明の好熱性生物（例えば、Ｃ．ビテルビエンシス）は好熱性生物の増殖を
導く任意の環境、例えば、熱通気口、温泉または土壌および水およびそれらの周
りの堆積物またはローンドロマット流出物、から単離できる。例えば、堆積物、
水またはそれらの混合物から成る試料が興味を引く環境から集められる。試料か
ら単離された生物増殖の至適状態の指標として、採取地点でのｐＨおよび温度を
決定することが望ましい。試料は次に基本増殖培地、好適にはグリセロールが唯
一のまたは主たる炭素源である培地に接種するために使用される。典型的には、
約１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度で基本培地に試料が接種される。培地のｐＨは好
適には採取地点のｐＨとほとんど同じであるべきである。もしくは、異なったｐ
Ｈ増殖依存性を持っている生物を選択するため、異なったｐＨの多数の基本増殖
培地へ接種できる。増菌培養物は次に高温で、好適には少なくとも約５０℃で、
より好適には少なくとも約６０℃で、および最も好適には少なくとも約７５℃で
インキュベートされ、好適には嫌気的または微好気的環境で実施される。増殖し
ている好熱性生物のためのガイダンスは例えば、ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＥＳ：Ｇ
ＥＮＥＲＡＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＡＮＤＡＰＰＬＩＥＤＭＩＣＲＯＢＩ
ＯＬＯＧＹ，Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，編，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，Ｎ．Ｙ．），第４章，Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．，“ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＩｓ
ｏｌａｔｉｏｎａｎｄＳｔｕｄｙｏｆＴｈｒｍｏｐｈｉｌｅｓ”，ｐｐ
．１７−３７に見ることができる。

【００３５】増菌培養が炭素源としてグリセロールを利用できることが観察された場合、均
質培養物は培養物の希釈系列を調製することにより単離でき、軟寒天オーバーレ
イ（例えば、０．８％寒天を含んでいる基本培地）を使用して固形基本培地（例
えば、１．５％寒天）上に該系列をプレーティングし、選び出し、同一の組成の
液体培地中で単一コロニーを継代培養し、１，３−プロパンジオールおよび／ま
たはアセテートの形成を検査する。１，３−プロパンジオールは培地を高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより直接的に同定できる。
例えば、発酵培地は、０．０１Ｎ硫酸の移動相をイソクラクティック様式で使用
する分析用イオン交換カラムで分析できる。もしくは、１，３−プロパンジオー
ルは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）およびガスクロマトグラフィー−質量分
光法（ＧＣ−ＭＳ）を含む（これらに制限されるわけではない）他の適当な分析
技術を使用して同定できる。

【００３６】グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換できることが観察された好熱
性生物株は本分野で知られている培養維持および保存技術を使用して培養物とし
て維持できる。これらの方法には短期間保存のための冷蔵、より長い保存のため
の液体窒素中での凍結、および細胞を脱水する凍結乾燥が含まれる。保存法の選
択は培養物の性質、利用可能な設備に依存する。凍結が使用される場合、凍結お
よび融解の速度は、凍結間に形成される氷の結晶は膜を破壊できるので、微生物
の生存を確実にするため注意深く制御されなければならない。グリセロールはし
ばしば氷の結晶による損傷を防止し、凍結培養物が融解される場合に生存可能な
微生物を回復させる能力を確実にするための“アンチフリーズ”剤として用いら
れる。

【００３７】５．２高められた温度で１，３−プロパンジオールを産生できる熱安定性酵素一つの態様において、本発明は高められた温度でグリセロールから１，３−プ
ロパンジオールへの発酵工程を触媒する酵素を提供し、本明細書では熱安定性グ
リセロール発酵酵素と称される。

【００３８】本明細書で使用される場合、用語“熱安定性グリセロール発酵酵素”とはグリ
セロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における少なくとも一つの反応
工程を触媒し、それは“熱安定性”である、即ち、高温、好適には５０℃より高
い温度で、より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０℃より
高い温度で、および最も好適には８５℃より高い温度で安定でありおよび活性で
ある。与えられた温度で、もし酵素が少なくとも５分間、好適には少なくとも３
０分間、より好適には少なくとも１時間、さらにより好適には少なくとも８時間
、および最も好適には少なくとも２４時間またはそれ以上その温度に暴露された
後にその本来の触媒活性の５０％保持できるとしたら、酵素は“熱安定性”であ
る。多くの例において、熱安定性酵素はまた類似の機能的特性を共有する非熱安
定性酵素よりも、より長い保存寿命も持っており、物理的撹拌または有機溶媒へ
の暴露のような変性条件に対してより安定である。

【００３９】好適な態様において、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリ
セロール発酵酵素を提供する。好適な、しかし非制限的である実施態様において
、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性脱水酵素を提供する。別の
好適な、しかし非制限的である実施態様において、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を提供する。本発
明の特に好適な実施態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素は株ＪＷ／Ｍ
Ｓ−ＶＳ５^Tに由来する。

【００４０】本明細書で使用される場合、用語“脱水酵素”とは、グリセロール分子の生成
物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換を触媒できる酵素を指している
。脱水酵素の特別の例はグリセロール脱水酵素およびジオール脱水酵素、即ち、
各々グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの好ましい基質を持っている
脱水酵素である。

【００４１】用語“１，３−プロパンジオール酸化還元酵素”とはＮＡＤＨの随伴性酸化を
伴って、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの
変換を触媒できる酵素を指している。

【００４２】グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における反応工程を触媒
する能力は、酵素の活性をアッセイすることにより決定できる。グリセロール発
酵活性は当業者にはよく知られている技術を使用してアッセイできる。例えば、
脱水酵素の活性をアッセイする方法はＰｏｐｐｅｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆＢｉｏｃｈｅｍ２４５：３９８−４１（１９９７），Ｈｏｎｄａｅｔ
ａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１４３：１４５８−６５（１９８０），および
Ｍａｃｉｓｅｔａｌ．，ＦＥＭＳ：ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ１６４：２１−２８（１９９８）、（本明細書に全体が組み入れられる）
に説明されている。１，３−プロパンジオール酸化還元酵素活性をアッセイする
方法は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．．Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１６
９：２０５０−５４（１９８７）（本明細書に全体が組み入れられる）に説明さ
れている。酵素活性は例えば、Ｈｏｎｄａらにより説明されているように、トル
エン処理細胞を使用してその場所で決定できる。グリセロールから１，３−プロ
パンジオールへの発酵における反応工程を触媒する能力はまた、通常はグリセロ
ールを発酵できない宿主細胞中で酵素を発現させ、酵素の発現が細胞のグリセロ
ール発酵を可能にしたかどうかをアッセイすることによっても決定できる。

【００４３】本発明の目的のため、熱安定性１，３−プロパンジオール産生酵素は、もし（
ａ）それがＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株により
内因的に発現され、またはそのアミノ酸配列がＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株に存在するポリヌクレオチドコード配列によりコー
ドされている、および（ｂ）それが本発明の実施に有用である、であればＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株に“由来”している。本
明細書で使用される場合、もし酵素が熱安定性グリセロール発酵酵素であり（即
ち、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における少なくとも一
つの反応工程を触媒する酵素）、および高温、好適には５０℃より高い温度で、
より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０℃より高い温度で
、および最も好適には８５℃より高い温度で安定でありおよび活性であれば、酵
素は“本発明の実施に有用”である。

【００４４】本発明はさらに、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵
酵素と相同的である酵素も提供する。本発明の目的には、もし（ａ）中程度のス
トリンジェンシー条件下、即ち、０．５ＭＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへ
のハイブリダイゼーション、および０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃
での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒ
ｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄＪ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ；ｐ．２．１
０．３）、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素をコ
ードするポリヌクレオチドの相補体へハイブリダイズするポリヌクレオチドコー
ド配列によりそのアミノ酸配列がコードされ；および（ｂ）それが本発明の実施
に有用である、であれば酵素はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセ
ロール発酵酵素と“相同的”である。好適な態様において、相同的酵素は、高度
にストリンジェントな条件下、０．５ＭＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへの
ハイブリダイゼーション、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で
の洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８９、前記文献）、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチ
ドの相補体へハイブリダイズするポリヌクレオチドコード配列によりコードされ
ており、本発明の実施に有用である。

【００４５】Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的であ
る酵素は、種々の形をとることができる。本発明のいくつかの態様において、相
同的酵素はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素から
の変異体であり、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基で
置換されており、本発明の実施に有用な酵素を生じている。突然変異は保存的で
あってもよく、そこではアミノ酸残基は、酸性度、極性または側鎖のかさ高さの
ような同様の機能的および構造的特性を共有する別のアミノ酸残基置換されてい
る。突然変異は非保存的であってもよく、そこでは置換されたアミノ酸残基の機
能的および／または構造的特性は保存されていない。いくつかの場合、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素からの変異体は天然の酵
素と比較すると、改変された触媒能力、安定性またはｐＨまたは温度至適性のよ
うな改変された機能的特性を持っているであろう。そのような変異体は、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である限り、
本発明の範囲内に含まれている。

【００４６】酵素の変異体形は当業者にはよく知られている種々の技術により発生できる。
これらの技術の多くは米国特許第５，８３０，６９６号（本明細書に全体が組み
入れられる）に概説されており、それは熱安定性酵素の方向付けられた発生を説
明している。もしくは、変異体酵素は無作為に作製でき、または生物中で自発的
に発生する。

【００４７】さらに、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相
同的である酵素は、天然のＣ．ビテルビエンシス酵素の欠失変異体または端切断
変異体でもよい。そのような酵素形の使用はある場合には望ましく、例えば、欠
失または端切断は対応する天然の酵素と比較して安定性が促進されおよび精製が
容易である。

【００４８】本発明はさらにＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵
素のキメラ形であるＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵
酵素と相同的である酵素を提供する（即ち、蛋白質融合）。例えば、キメラは酵
素の安定性を改良し、または精製を容易にするため（例えば、イオン交換、金属
キレート、基質親和性またはイムノアフィニティーマトリックスと会合できる部
分の包含）に有用であろう。好適な態様において、本発明はセルロースのような
固形支持体へ共有結合で結合された相同的酵素を提供する。

【００４９】さらに、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵
酵素と相同的である酵素を提供し、それは異なった微生物（好適には好熱性微生
物）に由来する。そのような酵素の例は、異なった種からの遺伝子によりコード
された酵素として定義される熱安定性グリセロール発酵酵素“同族体”であり、
ここで該遺伝子は当業者により、約８０％より高いヌクレオチド配列同一性の程
度に基づいてＣ．ビテルビエンシスグリセロール発酵酵素同族体と認められる。
配列同一性は前に説明したようなＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定できる。

【００５０】一つの態様において、本発明は単離された熱安定性グリセロール発酵酵素を提
供し、ここで用語“単離された”とは、酵素が少なくとも部分的に純粋であるこ
と、即ち、酵素の重量パーセントが、調製試料中の他の物質と比較して、天然に
観察されるであろうよりは高い調製試料が提供されることを示している。好適な
態様において、本発明は夾雑している蛋白質の重量で少なくとも９０％純粋、お
よびより好適には夾雑している蛋白質の重量で少なくとも９５％純粋である単離
された熱安定性グリセロール発酵酵素を提供する。

【００５１】前記酵素の調製および単離に有用な材料および方法は以下に説明される。一つ
の態様において本発明の酵素は好熱性生物、特に該酵素を内因的に発現するのＣ．ビテルビエンシス株から単離される。もしくは、本発明の酵素は、酵素をコー
ドしているポリヌクレオチド配列を適した宿主細胞内へ導入し、コードされた遺
伝子産物を発現することにより組換え的に産生できる。本発明の酵素はまたイン
ビトロ翻訳、または化学合成技術によっても製造できる。

【００５２】５．３グリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する熱安定性酵素をコードしているポリヌクレオチドのクローニング法本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素またはその断片をコードしているポリ
ヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの同定、単離およびクローニ
ングのための方法を提供する。これらの方法は、好熱性生物に由来するポリヌク
レオチドコーディング配列または好熱性生物を提供し、熱安定性グリセロール発
酵酵素をコードしているポリヌクレオチド配列またはその断片のスクリーニング
を含んでいる。試料は種々の形をとることができ、当業者には既知の種々の異な
った技術で調製される。同様に、試料のスクリーニングは多くの適した技術を使
用して達成でき、そのいくつかの非制限的例は以下に説明されている。

【００５３】本明細書に開示されているポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分
子の生成および操作は当業者には普通のことであり、とりわけ、ＳＡＭＢＲＯＯ
Ｋｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ，ＡＬＡＢＯＲＡＴ
ＯＲＹＭＡＮＵＡＬ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩ
ＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，編
，１９８９）；ＰＣＲＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ．ａｌ．，編
，１９９５）；およびＰＣＲＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｅｒｌｉｃｈ編，１９９
２）（これらはすべて本明細書に組み入れられる）に説明されている組換え技術
に従って実施できる。

【００５４】本発明のいくつかの態様において、グリセロール発酵酵素をコードしていると
信じられているヌクレオチド配列を持つプローブ、またはその一部に相当するプ
ローブ（類）で試料がスクリーニングされる。プローブ配列は既知のグリセロー
ル発酵酵素のアミノ酸配列またはそのいくつかの配列、またはそのよう酵素をコ
ードしているポリヌクレオチド配列に基づくことができる。例えば、ＣＲＥＩＧ
ＨＴＯＮ，ＰＲＯＴＥＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡ
ＲＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ（１９８３）に説明されているアミノ酸配列決定技術
を使用してグリセロール発酵酵素の一部のアミノ酸配列が決定でき、その情報が
縮重プローブの組を発生させるために使用される。本発明の好適な態様において
、試料はＣ．ビテルビエンシスのような好熱性生物に由来する脱水酵素または酸
化還元酵素をコードしている配列に基づいたプローブ（類）を使用してスクリー
ニングされる。もしくは、プローブはｄｈａＢＣＥまたはｄｈａＴ遺伝子（各々
グリセロール脱水酵素および酸化還元酵素をコードしている）のような非好熱性
生物（例えば、Ｋ．パステウリアヌム（ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｃ．フロインディイ（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）またはＣ．パステウリアヌム（ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ））に由来するグリセロール発酵酵素−コーディング遺伝子に基づく
こともできる。ｄｈａＢＣＥ遺伝子のヌクレオチド配列は文献に報告されている
（例えば、Ｍａｃｉｓｅｔａｌ．，ＦＥＭＳ：ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ１６４：２１−２８（１９９８）（Ｃ．パステウリアヌム）；
Ｓｅｙｆｒｉｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７
８：５７９３−９６（１９９６）（Ｃ．フロインディイ）；およびＴｏｂｉｍａ
ｔｓｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−５７（
１９９６）（Ｋ．パステウリアヌム）を参照されたい）。ｄｈａＴ遺伝子のヌク
レオチド配列も報告されている（例えば、Ｌｕｅｒｓｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４：３３７−４５（１９９７）（Ｃ．パステウリアヌム）；およびＤａｎｉｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−５６（１９９５）（Ｃ．フロインディイ）を参照
されたい）。本発明により提供される特異的プローブにはＫ．パステウリアヌムのｄｈａＢ遺伝子に基づいたプライマー対が含まれ（例えば、ｄｈａＢ１５’（
配列番号：１）；ｄｈａＢ１３’（配列番号：２）；ｄｈａＢ２５’（配列番号
：３）；ｄｈａＢ２３’（配列番号：４）；ｄｈａＢ３５’（配列番号：５）；
およびｄｈａＢ３３’（配列番号：６）での例示的実施態様により以下に説明さ
れるように）、それらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるグリセロール発
酵酵素−コーディングポリヌクレオチドまたはその断片の増幅に特に有用である
。そのようなプライマー対は、問題とする生物からのグリセロール発酵酵素−コ
ーディングポリヌクレオチドのセグメントの増幅に使用でき、それは順に、同一
のまたは異なった生物からの完全長コード配列の同定およびクローニングに使用
できる。プローブは例えば、ｃＤＮＡライブラリー中の相同的配列を同定するた
めに標識できる。もしくは、プローブは、プライマーにより認識された配列に隣
接するポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとして使用できる（特
にＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる）。特に、問題とする配列は、ｃＤＮＡまた
はゲノムライブラリーから、単離された生物から、または環境試料から、以下に
より詳細に説明するように増幅できる。

【００５５】本発明の一つの態様において、スクリーニングされるべき試料は好熱性生命を
導く環境から集められた水、土壌または泥試料のような好熱性生物を含んでいる
ことが疑われる環境試料である。典型的には、試料中に存在する核酸が相補的プ
ローブ（例えば、ＰＣＲプライマー）との相互作用に利用できように環境試料が
調製されるであろう。グリセロール発酵酵素−コーディング化ポリヌクレオチド
またはその断片は、前記のようにプローブとハイブリダイズするその能力で認識
できる。

【００５６】環境試料から本発明のポリヌクレオチドを単離およびクローニングする好適な
方法はＰＣＲによるものである。この技術は相同的酵素または同様の活性を持つ
酵素をコードしているポリヌクレオチド間の配列相同性を利用する。本方法は、
環境試料からの相同的ポリヌクレオチド配列またはその断片を増幅するために、
既知のグリセロール発酵酵素−コーディングポリヌクレオチドまたはその断片に
基づいたプライマー組を用いる。相同的ポリヌクレオチドは、本分野でよく知ら
れている通常のＰＣＲ方法論を使用し、試料中のＤＮＡから、特に試料中の微生
物のゲノムＤＮＡから増幅できる。もしくは、相同的ポリヌクレオチドは、試料
中のＲＮＡ、特にｍＲＮＡまたは全ＲＮＡから、ＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡコピー
を合成し、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅することにより（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ
）増幅できる。当業者には既知の技術を使用して、反応のアニーリング条件を調
整して相同性の望まれるレベルでのプライマーのハイブリダイゼーションが可能
であり、それにより、プライマーが基づいている配列とより多いまたはより少な
い相同性を共有する配列の増幅が可能である。この方法は完全グリセロール発酵
酵素−コーディングオープンリ−ディングフレーム（“ＯＲＦ”）またはその断
片の単離を可能にする。グリセロール発酵酵素−コーディングＯＲＦの一つまた
はそれ以上の断片がクローン化でき、完全ＯＲＦを生成するように一緒にスプラ
イスできる。増幅されたグリセロール発酵酵素−コーディングＯＲＦは次に、本
発明の種々の態様での実施においてコードされたグリセロール発酵酵素を発現す
るために使用できる。例えば、配列は宿主細胞内へ導入でき、それにより宿主細
胞がグリセロールを発酵するのを可能にする。もしくは、発現された酵素は無細
胞発酵のような応用のために精製できる。もしくは、ＯＲＦ配列はそれ自身、新
規熱安定性グリセロール発酵酵素−コーディング配列のさらなる検出および単離
のための新規プライマーおよびプローブを設計するために使用できる。

【００５７】本発明の別の態様において、試料はポリヌクレオチドライブラリー、好適には
好熱性生物、特にグリセロールから１，３−プロパンジオールの発酵ができるこ
とが知られている生物から調製されたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーである
。分子生物学技術およびどのようにｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラ
リーを作製するかについての一般的バックグラウンドについては、例えば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，前記文献；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，前記
文献；および米国特許第５，６５０，１４８号を参照されたい。ライブラリーは
、前記のように、適切な標識プローブと共に核酸ハイブリダイゼーションスクリ
ーニング技術を使用してスクリーニングできる。適したスクリーニング技術は、
とりわけ、ＢｅｎｔｏｎａｎｄＤａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６：１８
０（１９７７）（バクテリオファージライブラリー）およびＣｒｕｎｓｔｅｉｎ
ａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７２：３９６１−６５（１９７５）（プラスミドライブラリー）（これらの報文
は本明細書に組み入れられる）に示されている。

【００５８】本発明のさらに別の態様において、試料は単離された生物または複数の生物、
または単離された生物または複数の生物から発生されたポリヌクレオチドライブ
ラリーを含んでおり、それらからＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用して本発明の
ポリヌクレオチドが増幅できる。好適には、使用した単離された生物または複数
の生物は好熱性であり、グリセロールを発酵できる。

【００５９】本発明の一つの態様において、発現ライブラリーが構築され、それはライブラ
リーのポリヌクレオチド構築物によりコードされている遺伝子産物の発現を方向
付けできる。

【００６０】本発明の特に好適な態様において、発現ライブラリーは、グリセロールの発酵
中の工程を触媒する遺伝子産物をコードする能力でその構築物を試験することに
より機能的にスクリーニングされる。好適な態様において、通常はグリセロール
の１，３−プロパンジオールへの発酵ができない生物が、前記のようなＤＮＡラ
イブラリー、好適にはグリセロールを発酵できることが知られている好熱性生物
から調製されたライブラリーの構築物で形質転換される。形質転換された生物は
次に、グリセロール上の嫌気的増殖による、グリセロールから１，３−プロパン
ジオールへ発酵させる能力でスクリーニングされる。形質転換された微生物は１
，３−プロパンジオールおよび／またはアセテートの産生でスクリーニングでき
る。グリセロール上で嫌気的に増殖する、また１，３−プロパンジオールおよび
／またはアセテートを産生する能力は、生物を形質転換するために使用されたラ
イブラリー構築物が、グリセロールの発酵に必要とされる酵素活性を提供できる
酵素をコードしていることを示している。ライブラリー構築物は続いて標準技術
によりクローン化および特徴付けでき、および本発明の種々の様相での実施に使
用できる。

【００６１】上記の機能的クローニング戦略で形質転換された微生物は、グリセロールを発
酵する能力が本来欠けているものか、または突然変異（例えば、グリセロール発
酵に必要とされる遺伝子の一つにおけるヌル突然変異）の結果としてグリセロー
ルを発酵する能力を失った微生物であろう。そのような突然変異は本分野ではよ
く知られている技術を使用して生物内で遺伝子操作できる。微生物は好熱性であ
ろうが、必ずしもそうでなくてもよい。単一の酵素活性の導入によりグリセロー
ルを発酵する能力が回復できるように、試験生物は一つを除き、すべてのグリセ
ロール発酵に必要とされる酵素活性を持っているものが好適である。

【００６２】もしくは、発現された遺伝子産物は、グリセロール発酵酵素に対して高められ
た抗体と共に標準技術を使用して免疫学的にスクリーニングできる。そのような
スクリーニング技術については、例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬＡＢＯ
ＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，編，１９８８
）を参照されたい。

【００６３】５．４グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる組換え生物本発明はまた、一つまたはそれ以上の外因性（即ち、異種）熱安定性グリセロ
ール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された組換え生物も提供する。本文脈
で使用される場合、用語“外因性”とは酵素が異種ポリヌクレオチドコーディン
グ配列によりコードされていること、即ち、ポリヌクレオチド配列は宿主生物に
とっては天然または内因性ではないことを示している。好適な態様において、組
換え生物はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素また
はそのような酵素に相同的である酵素を発現するように遺伝子操作される。特に
好適な態様において組換え生物はＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^TのようなＣ．ビテルビエ
ンシスの株に由来する脱水酵素または１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を
発現するように遺伝子操作される。

【００６４】本発明の組換え生物は本発明の種々の様相での実施において有用であろう。例
えば、組換え生物はグリセロールから１，３−プロパンジオールへ生物的に変換
する過程での触媒として使用できる。別の非制限的態様において、組換え生物は
熱安定性グリセロール発酵酵素源として働くことができ、それは当業者にはなじ
みの深い蛋白質精製技術を使用して単離できる。

【００６５】本発明は、熱安定性グリセロール発酵酵素またはその断片をコードしているポ
リヌクレオチド配列のクローニング、形質転換および発現のために適した種々の
ベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する。適したベクターは、宿
主微生物および生じた組換え微生物の意図される使用に両立するものであろう。
例えば、適したベクターはプラスミド、ウイルス（バクテリオファージＴ７また
はＭ１３由来ファージ）またはコスミドから誘導できる。そのようなベクターを
得るおよび使用するプロトコールは本分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋｅｔ．ａｌ．，前記文献、を参照されたい。

【００６６】典型的にはベクターまたはカセットは関連する遺伝子の転写および翻訳を方向
付ける配列、選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能に
する配列を含んでいる。適したベクターは転写開始制御を含んでいるコード配列
の５’領域および転写停止を制御するコード配列の３’領域を含んでいる。好適
な態様において、調節領域は形質転換された宿主細胞とは異種の遺伝子から誘導
される。

【００６７】本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好適にはコード配列がコード
配列の転写および翻訳に必要とされる一つまたはそれ以上の調節要素と作動可能
なように結び付けられるように構築される。本明細書で使用する場合、用語“調
節要素”は誘導可能および誘導不可能プロモーター、エンハンサー、オペレータ
ーおよびポリヌクレオチドコーディング配列の発現を駆動および／または調節す
るための本分野で知られているその他の要素を含んでいるが、これらに限定され
るものではない。また、ここで使用される場合、コード配列は一つまたはそれ以
上の調節要素と“作動可能なように結合”されており、ここで調節要素はコード
配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳、またはそれら両方を有効に調節または可
能にする。

【００６８】これらのベクターの調節要素はその長さおよび特異性が変更できる。利用され
た宿主／ベクター系に依存して、多くの適した転写および翻訳要素が使用できる
。細菌のための転写調節領域またはプロモーターの非制限的例には、β−ｇａｌ
プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ラムダ左および右プロ
モーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、およびｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモ
ーターが含まれる。

【００６９】組換え蛋白質を発現する一般的方法は、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：５３７−５６６（１９９０）に例示さ
れるように、本分野ではよく知られている。随意に、異種配列は望ましい特性（
例えば、安定化または発現された組換え産物の単純化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードできる。

【００７０】グリセロール発酵酵素を宿主細胞の分泌経路内へ方向付けるため、発現ベクタ
ー中に分泌シグナル配列を提供してもよい。分泌シグナル配列はグリセロール発
酵酵素をコードしているポリヌクレオチド配列に正しい読み枠で連結される。分
泌シグナル配列は通常コード配列の５’側に位置されている。分泌シグナル配列
は普通、宿主生物により分泌された蛋白質と会合する。

【００７１】適した形質転換または発現ベクターが構築されたら、例えば、カルシウム透過
化細胞、エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換または組換えファー
ジウイルスを使用するトランスフェクションのような既知の方法を使用し、適し
た宿主細胞を形質転換するために使用できる。適した発現宿主には大腸菌、枯草
菌、鼠チフス菌およびバチルス、シュードモナス、ストレプトミセスおよびスタ
フィロコッカス属内の種々の種が含まれるが、選択によっては他のものを使用し
てもよい。

【００７２】好適な態様において、本発明は一つまたはそれ以上の外因性熱安定性グリセロ
ール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された好熱性組換え微生物を提供する
。そのような微生物は以下に説明するようにグリセロールから１，３−プロパン
ジオールへの生物的変換に特に有用である。好熱性微生物の例には、バチルス、
テルムス、スルフォロブス、テルモアエロバクター、テルモブラキウムおよびカ
ロラモトール属のメンバーが含まれる。

【００７３】選択された熱微生物は好適には補因子アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ₁₂）
を産生できるであろう。必要なら、Ｂ₁₂合成酵素が微生物に導入できおよび／ま
たは培地にビタミンＢ₁₂を補給してもよい。

【００７４】５．５熱安定性グリセロール発酵酵素の単離法本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素を調製および単離するために方法を提
供する。好適な態様において、酵素は実質的に純粋な形で提供される。非制限的
態様において、酵素は天然の熱安定性グリセロール発酵酵素を発現する好熱性微
生物から単離される。別の非制限的態様において、酵素は、熱安定性グリセロー
ル発酵酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作さ
れた組換え生物から単離される。もしくは、本発明の熱安定性酵素は、例えば、
ＣＲＥＩＧＨＴＯＮ、前記文献に説明されているように、通常の液体または固相
ペプチド合成を使用して製造できる。

【００７５】問題とする熱安定性グリセロール発酵酵素を発現している宿主細胞は典型的に
は、本分野で既知の方法を使用して、酵素の産生に適した栄養培地中で培養され
る。例えば、細胞は酵素の発現および／または単離を可能にする、適した培地お
よび条件で実施され、振盪フラスコ培養、実験室または工業的発酵漕での小規模
または大規模発酵（連続、バッチ、フェド−バッチまたは固体状態発酵を含んで
）により培養される。適した栄養培地は本分野で既知の方法を使用し、典型的に
は炭素および窒素源および無機塩を含んでいる。適した培地は商業的供給会社か
ら入手可能であり、または公表されている組成物に従って調製してもよい（例え
ば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカ
タログ）。

【００７６】使用された宿主細胞および発現ベクターの性質に依存して、酵素は細胞質中に
保持されるか、しばしば不溶性顆粒として（封入対として知られている）、また
は細菌分泌配列により細胞周辺腔へ方向付けられる。前者の場合、細胞は溶解さ
れ、顆粒は回収されおよび変性され、その後酵素は変性剤を希釈することにより
再び折りたたまれる。後者の場合、細胞周辺腔の内容物を放出させるために細胞
を破壊し（例えば、超音波または浸透圧ショックにより）および酵素を回収する
ことにより細胞周辺腔から酵素が回収される。もし酵素が栄養培地内へ分泌され
るとしたら、酵素は培地から直接回収できる。

【００７７】細胞により産生された酵素は次に、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、
溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イ
オン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除
）または電気泳動的方法（例えば、分取等電集束法（ＩＥＦ）を含む（しかしこ
れらに限定されるわけではない）本分野で知られている通常の技術により回収で
きる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（Ｊａｎｓｏｎａ
ｎｄＲｙｄｅｎ編，１９８９）；ＳＣＯＰＥＳ，ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦ
ＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＡＮＤＰＲＡＣＴＩＣＥ（１９９４
）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．前記文献；およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔ．
ａｌ．前記文献、を参照されたい）。

【００７８】好適な態様において、迅速なアフィニティー精製を容易にする融合要素を含ん
でいる融合蛋白質として酵素が精製される。有益な精製融合要素にはヒスチジン
およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグが含まれる。プロテ
アーゼ認識部位（例えば、トロンビンまたは因子Ｘａ認識部位）を融合要素から
の所望の蛋白質産物切断を可能にするために含ませることができる。遺伝子融合
発現系の構築に有用なベクターは商業的に入手可能である、例えば、Ａｍｅｒｓ
ｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，ＮＪ）。

【００７９】グリセロール発酵酵素を単離するために有用な特異的蛋白質精製プロトコール
は文献に記載されている（例えば、Ｓｅｙｆｒｉｅｄｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１７８：５７９３−９６（１９９６）（グリセロール脱水酵素）；
Ｔｏｂｉｍａｔｓｕｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１８１：４１１０−
１３（１９９６）（グリセロール脱水酵素）；およびＪｏｈｎｓｏｎｅｔａ
ｌ．，Ｊ．ｏｆＢａｃｔ．１６９：２０５０−５４（１９８７）（１，３−プ
ロパンジオール酸化還元酵素）を参照されたい）。例えば、Ｓｅｙｆｒｉｅｄ
ｅｔａｌ．はグリセロール脱水酵素精製のためのアフィニティーマトリックス
としてビタミンＢ₁₂−アガロース樹脂の使用を記載している。５．６生物によりグリセロールを１，３−プロパンジオールに変換する方法本発明は、生物によりグリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する方
法を提供する。本明細書に使用される、グリセロールを１，３−プロパンジオー
ルに変換する「生物による」方法は、微生物の構成物としてか、または細胞を含
まない酵素触媒による反応系の何れかにおいて、生物触媒、例えばグリセロール
発酵酵素を用いる方法である。特に、本発明は、好熱性生物および／または高温
安定性酵素により触媒される高温において実施可能な生物による慣用の方法を提
供する。好ましい態様において、上記方法は、５０℃より高い温度において、よ
り好ましくは６０℃より高い温度において実施され、そしてグリセロールを１，
３−プロパンジオールへ発酵させることができる好熱性微生物を用いる。

【００８０】非限定の態様において、上記のプロセスは、グリセロールの１，３−プロパン
ジオールへの発酵における全ての反応工程を触媒するのに十分な高温安定性グリ
セロール発酵酵素、例えば１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ及び／又はジオールデヒドロゲナーゼの完全な成分
を天然で発現する好熱性微生物を用いる。特に好ましい態様において、Ｃ．ビテルビエンシスの株、例えば株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tを生物触媒として用いる。

【００８１】別の態様において、上記プロセスは、一つまたは複数の外因性の温度安定性グ
リセロール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された、組換え微生物、好まし
くは好熱性組換え微生物を用いる、好熱性微生物の例は、属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サーモブラキウム（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ）、およびカロラマトール（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ）のメンバーを含む。このコンテクストにおいて使用さ
れる場合の用語「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」は、酵素が異種ポリヌクレオ
チドコード配列、即ち好熱性宿主生物にとって天然ではないかまたは内因性では
ないポリヌクレオチドによりコードされる酵素を示す。好ましい態様において、
異種ポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ビテルビエンシス由来の温度安定性グリセロ
ール発酵酵素、またはそのような酵素に相同な酵素をコードする。特に好ましい
態様において、上記異種ポリヌクレオチド配列はＣ．ビテルビエンシスの株に由
来する。

【００８２】任意に、本発明のプロセスにおいて使用される好熱性微生物は共因子アデノシ
ル−コバラミン（補酵素Ｂ₁₂）を生産することができる。必要ならば、Ｂ₁₂合成
遺伝子を上記微生物により導入し、そして／または培地にＢ₁₂を追加することが
できる。

【００８３】本発明は、本発明の好熱性生物を使用したグリセロールの１，３−プロパンジ
オールへの生物による変換のための発酵プロセスを提供する。発酵条件は、コス
トと利便性と、生産収量および効率を釣り合わせて、最適化するべきである。市
販の発酵プロセスの開発は、段階的な様式において起こるのが典型的であり、最
初に小さなフラスコを用い、次に小さな発酵器（１０ガロン以下）、中間のサイ
ズの発酵器（数百ガロンまで）、そして最後に大きなスケールの発酵器（数千ガ
ロン）を用いる。生産の各工程において、開発条件を調節することにより、最少
のコストにて最大の収量を生じさせる。培地の有機及び無機の組成、並びにｐＨ
、温度、及び酸素濃度が生産プロセスの効率を最大にするために変更される主要
な因子である。バッチプロセスにおいてさえ、発酵の間に条件をしばしば変更す
ることにより、最大生産収量を達成し、そして発酵プロセスの間に条件を監視す
ることにより、必要不可欠なパラメーターが許容限界範囲内に留まることを確実
にする。反応チャンバーおよび基質溶液は、生産プロセスにおいて使用される微
生物株の添加前に安定化するべきである。低温において発酵させる場合、反応物
の微生物汚染物による感染が、生産物を生産するのに用いられた株の競合による
置き換えを容易に導くことができ、明らかに有害な結果をもたらす。本発明の重
要な利点は、好熱性生物および／または高温安定性酵素を用いることにより、も
っとも有力な汚染物が生存できない高温において反応を行えることである。

【００８４】発酵培地の組成は、微生物の成長および所望の生産物の発酵を支えるのに必須
の栄養を含まなければならない。必須の栄養は、炭素、窒素及びリンの源を含む
。特定の栄養源の選択は、経済性根拠並びに生物学上の根拠を基になされる。発
酵プロセスの性質に依存して、未加工の成分全てを発酵の最初に加えてよいか、
またはプロセスを通じて栄養を徐々に微生物に給餌してよい。

【００８５】反応のｐＨは実質上発酵に影響し得る。所望の生産物を形成させることに関与
する酵素は全て、最大活性のための最適ｐＨ範囲および活性が保持される限定さ
れたｐＨ範囲を有する。発酵器中の生物の早い成長は、反応培地のｐＨを急速に
変え得る。例えば、酸、例えば、酢酸の蓄積は、非緩衝培地のｐＨが急激に低下
することを導き、所望の発酵精製物の生産を阻害または停止させる。そのような
変化を防ぐため、発酵培地は緩衝させられることにより、ｐＨの変化を低下させ
るべきである。さらに、反応溶液のｐＨは通常は連続して監視して、酸または塩
基を必要に応じて加えることにより受容可能な寛容限度内に維持する。株ＪＷ／
ＭＳ−ＶＳ５^Tを用いる発酵プロセスにおいては、培地のｐＨを約５．０と７．
８の間、好ましくは約ｐＨ６．０と６．５の間に維持するべきである。

【００８６】反応の温度は生産物の最終収量を達成するために、注意深く制御されるべきで
ある。加熱したコイルを用いることにより、上昇温度を維持し、それにより生産
物の形成の最適な速度を達成し、そして微生物の汚染物による感染を阻害するこ
とができる。加熱したコイルは発酵チャンバーの定期的な滅菌のために使用する
こともできる。発酵は、微生物の活性および生存性に一致させて、あらゆる温度
にて実施することができる。好ましい態様において、本発明は、少なくとも４０
℃の温度、好ましくは少なくとも５０℃の温度、そしてもっとも好ましくは６０
℃またはそれ以上の温度にて実施される。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tを用いる発酵
プロセスにおいては、温度を３３から６４℃の間、好ましくは５０から６４℃の
間、そしてもっとも好ましくは５７から６４℃の間に維持するべきである。

【００８７】その栄養のパラメーターおよび環境のパラメーターに加えて、発酵プロセスは
、ブロスを含むフラスコに微生物培養物を接種するのと類似である、バッチプロ
セスとしてデザインしてよく、あるいは、恒成分培養槽のそれと類似である、連
続フロープロセスとしてデザインしてよい。プロセスのデザインの選択は、所望
の生産物の生産並びに回収の両者の経済性に依存する。バッチプロセスに比較し
て、フロースルー発酵器は不所望の生物によりより汚染しやすく、特に発酵が中
間の温度において実施される場合に、素早い制御を保持することを難しくさせ得
る。フロースルーデザインは、しかしながら、商業上の流通のために一定の率に
て回収できる製品の連続供給を生じる利点を有する。それらの究極の性質により
、バッチプロセスは、発酵を開始するために重大なスタートアップ時間、発酵生
産物が蓄積することを可能にするインキュベーション時間、および生産物が消費
された培地および微生物の細胞から分離される期間の回収時間を必要とする。

【００８８】本発明の別の態様においては、上記プロセスを使用することにより、グリセロ
ール以外の発酵可能な炭素基質の１，３−プロパンジオールへの変換を可能にす
る。非限定態様において、発酵可能な炭素基質、例えばモノサッカライド、例え
ばグルコースまたはポリサッカライドをグリセロールに変換できる好熱性微生物
は、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換するのに必要な温度安定性
１，３−プロパンジオール生産酵素の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を微生物に
組換え導入することにより、１，３−プロパンジオールを生産できるように、操
作され得る。これらの酵素は、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換
することができる好熱性生物、例えばＣ．ビテルビエンシスに由来することがで
きる。グリセロールを発酵して１，３−プロパンジオールにするのに必要な酵素
活性を非好熱性生物に組換え操作する技術は、引用によりその全体が取り込まれ
る米国特許第５，６８６，２７６号に記載される。

【００８９】あるいは、本発明の組換え微生物を操作することにより、グリセロール以外の
炭素源を１，３−プロパンジオールに発酵させることができる。そのような生物
の使用は、特に、安価な炭素源、例えばグルコース又は発酵可能なポリサッカラ
イドからの１，３−プロパンジオールの生産に有利であり得る。例えば、グリセ
ロールを１，３−プロパンジオールに発酵させることができる微生物を操作して
、解糖中間体、例えばジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロールに変換し、そ
れにより、非グリセロール源由来の炭素の発酵経路への導入を可能にすることが
できる。引用によりその全体が取り込まれるＷＯ９８／２１３４０は、グリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子及びグリセロール−
３−リン酸ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子の何れか又は両方を含む発現
カセットを用いて適当な宿主細胞を形質転換することにより、組換え生物からグ
リセロールを生産する方法を記載する。そのような生物は、単純な糖、例えばグ
ルコースをグリセロールに発酵させることができる。これらの生物、又は実際に
これらの酵素又は別のグリセロール合成経路の酵素を生産するように遺伝学上操
作されたあらゆる生物は、本発明の組成物及び方法を用いてグリセロールから１
，３−プロパンジオールへのさらに先への発酵のために宿主細胞として使用する
ことができる。さらに、ＷＯ９８／２１３３９は、グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子
を発現するように操作され、そしてそれによりグルコース及び他の糖を１，３−
プロパンジオールに変換できる組換え微生物を記載する。即ち、この戦略は、グ
リセロール、ジヒドロキシアセトン、Ｃ₃化合物へ、グリセロールの酸化状態に
おいて変換され得るか（例えば、グリセロール３−リン酸）、又はＣ₃化合物へ
ジヒドロキシアセトンの酸化状態において変換され得る（例えば、ジヒドロキシ
アセトンリン酸又はグリセルアルデヒド３−リン酸）あらゆる炭素基質から１，
３−プロパンジオールを生産させることを当業者に振り向けることができる（例
えば、ＷＯ９８／２１３３９を参照）。

【００９０】本発明の別の態様において、使用された組換え好熱性生物は、グリセロール発
酵酵素の不活性化を抑圧することができる蛋白質を発現するか、又は増強された
レベルにおいて発現するように、操作することができる。例えば、引用によりそ
の全体が取り込まれるＷＯ９８／２１３４１に記載された技術は、グリセロール
デヒドロゲナーゼの基質媒介不活性化を逆転することができる酵素の発現を導入
するために使用できる。

【００９１】本発明のプロセスは、１，３−プロパンジオールに変換される炭素基質、好ま
しくは単独又は第１級の炭素源を含む培地中で実施される。適切な炭素源に加え
て、発酵培地は、適切なミネラル、塩、共因子、バッファー及び当業者に知られ
た、培養物の成長並びに１，３−プロパンジオールの生産に必要な酵素活性の増
進に適切である他の成分を含まなければならない。特別な注意がＣｏ（ＩＩ）塩
及び／又はビタミンＢ₁₂又はそれらの前駆体に払われるべきである。グリセロー
ルから１，３−プロパンジオールへのＣ．ビテルビエンシスによる変換における
使用のための適切な培地の特定の非限定例は、以下に実施例に提供される。

【００９２】本発明のプロセスは、好気性又は微好気性条件が好ましい場合に、好気性又は
嫌気性条件下で実施することができる。特に好ましい態様においては、上記プロ
セスを窒素又はアルゴン雰囲気下、例えば８０：２０の比のＮ₂／ＣＯ₂下で実施
される。成長培地からの酸素と反応して除去する化学物質も添加してよい。例え
ば、チオグリコール酸ナトリウムは遊離酸素と反応して、溶液からそれを除去す
る。同様に、アミノ酸システイン及びスルフィドリル基を含む他の化合物も、成
長培地からの分子酸素を除去するために使用できる。流体培地に関しては、窒素
を培地中に泡立たせることにより、空気及び酸素の痕跡を除去してよく、その後
、培養容器をきつく封印して酸素が再度侵入することを防ぐ。

【００９３】さらに、嫌気性培養チャンバーを用いることにより、酸素を雰囲気から除去し
てよい。嫌気性チャンバーの共通の形態は、例えば、ガスパックシステムは、水
素を生成し、触媒として酸素のチャンバー内で反応して水を生成する。二酸化炭
素もこのシステムにおいて生じ、酸素から水への変換により奪われたガスの容積
を置き換える。

【００９４】１，３−プロパンジオールは、中圧から高圧の液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）分析に培地を供することにより直接同定してよい。例えば、発酵培地を、
アイソクラチック様式において０．０１Ｎの硫酸の流動相を用いた分析用イオン
交換カラム上で分析することができる。あるいは、１，３−プロパンジオールは
、限定ではないがガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフィー
−質量分光分析（ＧＣ−ＭＳ）を含む他の適切な分析技術を用いて同定すること
ができる。

【００９５】１，３−プロパンジオールは、蒸留、遠心分離、濾過、及びクロマトグラフィ
ー分離を含む当業者に知られた技術を使用して発酵培地から精製することができ
る。例えば、プロパンジオールは、反応混合物を有機溶剤を用いた抽出、蒸留及
びカラムクロマトグラフィーに供することにより、細胞培地から得ることができ
、引用によりその全体が取り込まれる米国特許第５，３５６，８１２号に記載さ
れるとおりである。このプロセスのための特に良好な有機溶剤はシクロヘキサン
であり、米国特許第５，００８，４７３号に記載されるとおりである。

【００９６】あるいは、１，３−プロパンジオールを、固相支持体、例えばセルロースに吸
着又は結合させた酵素及び／又は微生物細胞を用いる発酵系において生産するこ
とができる。結合し、即ち固定化された酵素は固相表面触媒として作用する。反
応基質、例えばグリセロールを含む溶液を、次に上記固相表面を横切るように通
過させる。温度、ｐＨ及び酸素濃度を最適レベルに設定することにより、変換の
最大率を達成する。この種のプロセスは、所望の形質転換が単一の代謝工程、例
えばグリセロールから１，３−プロパンジオールの形成における中間体への変換
又はそのような中間体から１，３−プロパンジオールへの変換を含む場合に、特
に適している。上記プロセスは、最初の基質を所望の生産物へ変換するために複
数の酵素活性が必要な場合に、より複雑である。通常、上記のプロセスの培地は
触媒作用に必要なあらゆる補助的な因子、例えば酵素の補酵素（例えば、ビタミ
ンＢ₁₂）及び還元する均等物を含まなければならない。所望の生産物は、前記の
技術を用いて発酵罰から精製することができる。そのような固定化系を用いる場
合、酵素活性を保持して酵素の不活性化又は損失を最少にすることが必須である
。細胞を含まない酵素よりむしろ全細胞がそのような固定化系において用いられ
る場合、プロセスの間に微生物の生存を保持することが重要である。固定化細胞
を用いるこのプロセスは必要な成長基質を加えることを含む。

【００９７】本発明によるプロセスは、グリセロールを、実質上化学量論的に１，３−プロ
パンジオールに変換することができる。１，３−プロパンジオールの収量は、し
ばしば、３モルのグリセロール２モルの１，３−プロパンジオールの桁である。
本コンテクストにおいては少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９５
％のグリセロール消費を意味することが実質上理解される。

【００９８】本発明の方法及び組成物により生産された１，３−プロパンジオールはポリエ
ステル及びフィルムの生産に有用である。例えば、ポリ（１，３−プロピレンテ
レフタレート）（ＰＰＴ）は１，３−プロパンジオールを出発物質としてＷｈｉ
ｎｆｉｅｌｄａｎｄＤｉｃｋｓｏｎにより合成された。ＰＰＴの物理特性は
一般に市販されているポリエステルポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）
の特性よりも優る。ＰＰＴを合成する他のプロセスは、例えば引用によりその全
体が取り込まれる米国特許第５，３４０，９０９号及び米国特許第５，８７２，
２０４号に記載される。他のポリマーも合成できる。

【００９９】以下の実施例は本発明を例示するために提供されるのであり、限定するためで
はない。

【０１００】６実施例：Ｃ．ビテルビエンシス種の株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tの単離６．１材料と方法６．１．１生物の源株は、イタリアのＶｉｔｅｒｂｏ付近のＢａｇｎａｃｃｉｏＳｐｒｉｎｇエ
リアの新鮮な水から１９９７年に回収された混合された堆積物／水サンプルから
単離した。サンプリング点における温度は６３℃であり、そしてｐＨは６．６−
６．７であった。条件は、引用によりその全体が取り込まれるＣａｎｇａｎｅｌ
ｌａｅｔａｌ．，Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：９−１９（
１９９５）に完全に記載される。培地と培養

【０１０１】６．１．２培地と培養富裕化、単離及び培養のために使用された基本培地は、Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ
ｅｔａｌ．，ＭＡＮＵＡＬＯＦＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯ
ＬＯＧＹＡＮＤＢＩＯＴＥＣＧＮＯＬＯＧＹ（ＤｅｍａｉｎａｎｄＳｏ
ｌｏｍｏｎ編纂、１８９６）に記載されたとおりに、Ｎ₂／ＣＯ₂（８０：２０）
ガス相下でＨｕｎｇａｔｅ技術により製造した。基本培地は（脱イオン水リット
ルあたり）、０．５ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，０．５ｇＮＨ₄Ｃｌ，２．０ｇＫＨ ₂ ＰＯ₄，０．０４ｇＭｇＣｌ₂＊６Ｈ₂Ｏ，０．０４ｇＣａＣｌ₂＊２Ｈ₂Ｏ，
４．２ｇＮａＨＣＯ₃，０．１３ｇＮａ₂Ｓ：９Ｈ₂Ｏ，０．１３ｇシステ
イン−ＨＣｌ，０．３ｇ酵母抽出物、０．００１ｇレサズリン、３．０ｇグリセ
ロール、２ｍｌビタミン溶液（Ｗｏｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３８：２８８２−８６（１９６３）に記載された）及び１ｍｌ痕跡元素
溶液を含んだ。痕跡元素溶液は（ｍｍｏｌ／ｌ）：２．０（ＮＨ₄）₂Ｆｅ（Ｓ
Ｏ₄）₂＊６Ｈ₂Ｏ，１．０ＣｏＣｌ₂＊６Ｈ₂Ｏ，１．０（ＮＨ₄）₂Ｎｉ（Ｓ
Ｏ₄）₂＊６Ｈ₂Ｏ，０．１ＮａＭｏＯ₄＊２Ｈ₂Ｏ，０．１Ｎａ₂ＷＯ₄＊２Ｈ₂ Ｏ，０．５ＺｎＳＯ₄＊７Ｈ₂Ｏ，０．０１ＣｕＣｌ₂＊２Ｈ₂Ｏ，０．５Ｎ
ａ₂ＳｅＯ₃，０．１Ｈ₃ＢＯ₃，０．５ＭｎＣｌ₂＊４Ｈ₂Ｏ及び０．０１Ａ
ｌＫ（ＳＯ₄）₂＊１２Ｈ₂Ｏを含んだ。ｐＨは６．０に調節した（２５℃におい
て）。栄養強化された純粋な培養物を１０ｍｌ培地中でＨｕｎｇａｔｅチューブ
中にてＮ₂／ＣＯ₂（８０：２０）雰囲気下で通常は成長させた。全てのインキュ
ベーションは他に指示しない限り６０℃においてであった。

【０１０２】６．１．３成長の測定細菌の成長は６００ｎｍの波長における光学密度の増加を測地することにより
測定した（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ２１，Ｂａｕｓｈ＆Ｌｏｍｂ，Ｒｏｃｈ
ｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。

【０１０３】６．１．４成長のためのｐＨ範囲の測定に関しては、ｐＨを２５℃においてモデル８１５
ＭＰｐＨメーター（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒ
ｇ，ＰＡ）を用いて測定した。成長のための温度範囲は温度勾配インキュベータ
ー（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ
，Ｎ．Ｙ．）を用いて振盪しながら（１５ｓｐｍ）塩基性培地中でｐＨ^25C６．
０において測定した。

【０１０４】６．１．５基質の利用生物が異なる基質を利用する能力を、グリセロールの代わりに、オートクレー
ブ又はフィルター滅菌した基質を追加した塩基性培地を用いて試験した。培養物
は２週間インキュベートして、光学密度を測定することにより成長を監視した。

【０１０５】６．１．６電子受容体異なる電子受容体の可能な用途はグリセロール（３ｇ／ｌ）を基質として含む
塩基性培地中で研究した。異なる電子受容体はオートクレーブしたストック溶液
から加えた。電子受容体の使用（１０ｍＭ）は、亜硝酸塩生成物（窒素に関して
）、硫化物生成物（硫酸及び元素イオウに関して）又は色の変化（ＡＱＤＳ）の
測定により関しした。

【０１０６】６．１．７抗生物質感受性抗生物質に対する感受性は、対数成長期の培養物を、１００ｇ／ｍｌのフィル
ター滅菌抗生物質を含む新規な塩基性培地へ移すことにより決定した。培養物を
２週間インキュベートした。

【０１０７】６．１．８顕微鏡日常的な試験は光学顕微鏡（モデルＰＭ１０ＡＤ，ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔ
ｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ、フェーズコントラスト構
成部分を備えた）を用いて実施した。極めて薄い切片に使用されるサンプルは、
Ｓｐｕｒｒ，Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃ．Ｒｅｓ．２６：３１−４３（１９６９
）に記載されたとおりに、染色後のために酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を使用す
ることにより調製した。グラム染色はＨｕｃｈｅｒの方法により実施した（Ｄｏ
ｅｓｔｃｈｉｎＭａｎｕａｌＯＦＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＧＥＮＥＲ
ＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｅｒｈａｒｄｔｅｔａｌ．，編纂、１
９８１））。

【０１０８】６．１．９分析技術グリセロール、グルコース、短鎖有機酸及びアルコールの測定は、Ｓｖｅｔｌ
ｉｔｓｈｎｙｉｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．４６：１１３１−１１３７（１９９６）において以前に記載されたとおりに、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施した。分子水素はガスクロ
マトグラフィーにより分析した（Ｓｖｅｔｌｉｔｓｈｎｙｉｅｔａｌ．）。
窒素の生産は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍの酵素分析キット（カ
タログ番号９０５６０８）を用いて測定した。硫化物はＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｃ
ｈ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４：３３−３６（１９８５）の
方法により測定した。

【０１０９】６．１．１０ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量ＤＮＡを単離して、ＱＩＡＧＥＮゲノムＤＮＡ精製プロトコルを用いて製造者
の指示に従い精製した。ＤＮＡを酵素消化して、ヌクレオシドをＨＰＬＣにより
分離することによりグアニンプラスシトシン（Ｇ＋Ｃ）含有量をＷｈｉｔｍａｎ
ｅｔａｌ．，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：２３５−２４
０（１９８６）及びＭｅｓｂａｈｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．３９：１５９−１６７（１９８９）に記載されるとおりに測定
した。

【０１１０】６．１．１１１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列決定及び系統発生分析ゲノムＤＮＡの抽出、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅及び精製されたＰ
ＣＲ産物の配列決定はＲａｉｎｅｙｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：２８−９６（１９９６）に記載されたとおりに実施し
た。配列反応の生成物はエタノール沈殿により精製し、そしてモデル３１０Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）により電気泳動した。この研究において得
られた１６ＳのｒＲＮＡの遺伝子配列を、ｅ２編纂者Ｍａｉｄａｋｅｔａｌ
．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２７：１７１−１７３（１９９９）
を用いて公共のデータベースから利用可能な、予め決定された低Ｇ＋Ｃグラム陽
性配列に対して並置した。ＤＮＡＤＩＳＴ及びＮＥＩＧＨＢＯＲを含むＰＨＹＬ
ＩＰパッケージのプログラムを系統発生分析に用いた（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ
（１９９３），ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｅｒｅｎｃｅｐａｃｋａｇ
ｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ３．５．１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）
。Ｊｕｋｅｓｅｔａｌ．，ｉｎＭＡＭＭＡＬＩＡＮＰＲＯＴＥＩＮ
ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ（Ｍｕｎｒｏ，編纂、１９６９）の方法を進化の距離の計
算に用いた。系図のトポロジーを１０００ブーストストラップデータセット及び
ＰＨＹＬＩＰパッケージＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，前記のプログラムＳＥＱＢＯ
ＯＴ，ＤＮＡＤＩＳＴ及びＣＯＮＳＥＮＳＥを用いて再度分析した。

【０１１１】６．１．１２核酸配列加盟番号この研究において決定した１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋに加
盟番号ＡＦ１８１８４８にて寄託した。系統発生分析において使用された参照用
１６ＳｒＲＮＡの遺伝子配列の加盟番号及び株名は以下のとおりである。

【０１１２】

【表１】

【０１１３】６．２結果６．２．１富裕及び単離グリセロールを含む塩基性培地に約１０％（ｗ／ｖ）のサンプルを接種し、そ
して６０℃においてインキュベートした。さらに、ｐＨ７．０及びｐＨ９．０を
示す同じ組成の培地にサンプル（１０％（ｗ／ｖ）各々）を接種した。ｐＨ６．
０においてのみ、グリセロールを利用した富裕化培養物が得られた。次の移し替
え（１０％ｖ／ｖ）の後で、この富裕化培養物の連続希釈を調製して固形塩基
性培地（１．５％寒天）にソフトアガー重層を用いてプレートしたが、０．８％
寒天を含む塩基性培地からなった。単一コロニーを複数拾い上げ、同じ組成の流
体培地中に継代培養し、そして１，３−プロパンジオールの形成をＨＰＬＣによ
り測定した。次のプレーティングのため、上記手法を数回、塩基性培地並びにＫ
ｅｌｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｍ．９９：８１−８８（１９８１）に記載された規定された複合培地を用いて繰
り返した。流体培地上での成長は、培養物を撹拌しながらインキュベートした場
合に大きく増加した。コロニーを６０℃にて振盪する流体塩基性培地に移し替え
た後、グリセロール発酵培養物を得たところ、純粋と考えられ、株ＪＷ／ＭＳ−
ＶＳ５^Tと命名した。

【０１１４】６．２．２コロニーと細胞の形態塩基性培地を含むプレート上において、コロニーが７−１０日後に出現した。
プレート上での成長に適合させたら、新たなプレート上での次のストリークは２
−３日後にコロニーを生じさせた。上記コロニーを均一に丸く、白色であり、そ
して１．０から１．５ｍｍの直径であった。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tの細胞は直
線からやや曲がった桿菌であり、０．４から０．６ｍｍの直径であり、そして２
．０から３．０ｍｍの長さであった。細胞はほとんど単一で生じた。運動性の指
標は光学顕微鏡を用いて得られなかった。陰性染色後に実施した電子顕微鏡分析
は、異なる成長段階からの細胞を用いて、鞭毛の存在を明らかにはしなかった。
胞子の出現はあらゆる成長段階において観察されなかった。

【０１１５】６．２．３グラム染色反応及びグラムの種類初期対数成長期にのみ上記細胞はグラム陽性染色された。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ
５^Tの極めて薄い切片は、薄いペプチドグリカンを明らかにしたことから、即ち
上記生物はグラム陽性であると見なされた、Ｗｉｅｇｅｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ
ｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４７：６５１−５６（１９９７）。この置き換えは
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ中に生物を入れた１６ＳｒＲＮＡ
配列決定データと一致する。ペプチドグリカンに加えて、他の外層が観察され、
Ｓ相を表すかもしれないが、しかしながらＥＭマイクログラフは何の幾何学上の
列も明らかにし損なった。

【０１１６】６．２．４温度とｐＨの範囲株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tの成長のためのｐＨ^25C６．０における温度範囲は３３
から６４℃であり、最適なのは５８℃であった（図１）。６７℃において又は３
３℃未満では成長が観察されなかった。上記株は５．０から７．８のｐＨ^25Cに
おいて成長したが最適ｐＨ^25Cは６．０から６．５であった（図２）。ｐＨ^25C４
．７及びｐＨ^25C８．０においては成長が観察されなかった。最適条件下でのも
っとも短い倍加時間は２．８時間であった。

【０１１７】６．２．５基質の利用と発酵生成物利用された基質は、グリセロール、グルコース、フルクトース、シュークロー
ス、セロビオース、ラルトース、ガラクトース、マンノース（２０ｍＭ）、デン
プン及び酵母抽出物（５ｇ／ｌ）を含んだ。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tは、キシロ
ース、アラビノース、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、メタノール、エタノール、ｎ−
プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、プロピオネート、アセトン
、琥珀酸塩、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、フェノール、安
息香酸塩及びＨ₂／ＣＯ₂を使用しなかった。

【０１１８】表１に示すとおり、グリセロールの発酵は酢酸塩及び１，３−プロパンジオー
ルを有機代謝産物としてのみ生成した。Ｃ₁−Ｃ₃アルコール、１，３−プロパン
ジオール以外のジオール又は酢酸以外の有機酸は測定可能な量にて検出されなか
った。顕著な量のＨ₂がこれらの培養物中で生成した。

【０１１９】得られた発酵パターンは以下の式に従うグリセロールの変換を示唆する：３グ
リセロール＝２１，３−プロパンジオール＋酢酸塩＋ＣＯ₂＋Ｈ₂。６．２．６電子受容体基質としてのグリセロールの存在下で、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tは、硝酸塩（
１０ｍＭ）、非晶質酸化Ｆｅ（ＩＩＩ）（９０ｍＭ）、９，１０−アントラキノ
ン−２，６−亜硫酸（ＡＱＤＳ）、硫酸塩（１０ｍＭ）、又は沈殿したか又は昇
華したＳｏ（３０ｍＭ）を還元しなかった。１，３−プロパンジオールの生産は
、これらの電子受容体のいずれの存在下でも影響されなかった。株ＪＷ／ＭＳ−
ＶＳ５^Tはガス相においてＯ₂（２０％ｖ／ｖ）により成長できなかった。

【０１２０】６．２．７抗生物質感受性アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リファンピシン及
びカナマイシンは１００ｍｇ／ｍｌの培地濃度にて完全に成長を阻害した。同じ
濃度のストレプトマイシン及びテトラサイクリンの添加は成長の遅延をもたらし
た。

【０１２１】６．２．８ＤＮＡ塩基組成ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は３２モル％であった（ＨＰＬＣ）。６．２．９１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列組成１４８０ヌクレオチド長からなる株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tのほとんど完全な１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が決定された。二つのデータセットを系統発生分析に
使用した。一つのセットのデータは、この研究において決定された配列及び低Ｇ
＋Ｃグラム陽性細菌からの選抜された参照配列を含んだが、該データセットの二
つは新規な配列と、カロラマトール及びサーモブラキウム属の５種に関するデー
タベース中の利用可能な配列を含んだ。９８位と１４６９位の間の１２０６の不
明瞭なヌクレオチドを含むデータセットの一つに基づいた系統発生分析（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ位置、Ｂｒｏｓｉｕｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：４８０１−４８０５（１９７８））は、以前に記載され
たカロラマトール及びサーモブラキウム属の放散内の異なる系列として共に群が
る新規な単離物を示した（図３）。株株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tは、以前に記載さ
れたカロラマトール及びサーモブラキウム属の種と９１．７から９４．１％の１
６ＳｒＲＮＡ９遺伝配列類似性及びデータセットの一つに含まれて（図３）に
おいて示された他の分類群の配列に８３．４から８７．１％の間の類似性を共有
する。新規な単離物と他の５つのカロラマトール及びサーモブラキウム種の単離
物の配列を含み、且つ３８位と１４６９位の間に１３９３の不明瞭なヌクレオチ
ド（Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）位置、Ｂｒｏｓｉｕｓｅｔａｌ，前記）を含む第
２のデータセットを使用して、この群の分類群の間の二つ一組の類似性の値を計
算した。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tと以前に記載された分類群の間の１６ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子配列類似性は９１．３から９３．７％の範囲であった。カロラマトール／サーモブラキウム群内では、もっとも高い配列類似性の値（９３．７％）が
、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tとサーモブラキウムセレレ（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃ
ｈｉｕｍｃｅｌｅｒｅ）の間に見いだされた。図５において回収されたブラン
チに基づく独力の分析は、明らかに、カロラマトール／サーモブラキウム群と、
この群のＣｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＳｗｉｓｓＰ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．４４：８１２−８２６（１９９４）により定義された属クロストリジウムの群Ｉに対する関係を指示する。

【０１２２】系統発生分析（図３）から明らかなとおり、上記株は、系統発生樹のグラムタ
イプ陽性バチルス−クロストリジウムのブランチ内の異なる群からのサーモブラキウムセレレ及びカロラマトール種に近縁である。これらの４つの種は、好熱
性、有機従属栄養性嫌気性細菌であり、低Ｇ＋Ｃ含有量を示し、株ＪＷ／ＭＳ−
ＶＳ５^Tにも同じく適用される。表２は、この群に見いだされた５つの種の形態
学上及び生理学上の特性の比較を示す。

【０１２３】

【表２】

【０１２４】

【表３】

【０１２５】７実施例：株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^TのｄｈａＢ−様遺伝子の検出７．１材料と方法陽性対照として、Ｋ．ニューモニエのｄｈａＢ遺伝子を用いたＰＣＲ法により
株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tを特性決定した。４セットのプライマーを用いた：（ａ
）ｄｈａＢ１，ｄｈａＢ１５’ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧ（配列番号：１）及びｄｈａＢ１３’
ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＧＧ（配
列番号：２）からなる；（ｂ）ｄｈａＢ２，ｄｈａＢ２５’ＧＧＡＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＣＣＣ（配列番号：３）及びｄｈａＢ２３’Ｇ
ＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＡＣＴＡＡＧＴＣＧ（配
列番号：４）からなる；（ｃ）ｄｈａＢ３，ｄｈａＢ３５’ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＡＧＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＣ（配列番号：５）及びｄｈａＢ３
３’ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＧＣＡ
ＧＣ（配列番号：６）からなる；及び（ｄ）ｄｈａＸ，ｄｈａＸ５’ＡＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ
ＴＣＣＣＴＡ（配列番号：７）及びｄｈａＸ３’ＧＡＴＡＣＧＡＧＡ
ＴＣＴＴＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧ
ＣＡＧ（配列番号：８）。全てのプライマーは、ＧＩＢＣＯＢＲＬから購入
した。ＰＣＲ反応は、ＨｏｔＳｔａｒｔＰＣＲチューブ（Ｍｏｌｃｕｌａｒ
Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）内で、１００μｌのＰＣＲ反応試薬を
用いて実施した。ＰＣＲ反応物の各１００μｌは、２ｕｌの細菌培養物、２０ｕ
ｌの１ｍＭｄＮＴＰｓ，１０ｕｌの１０ＸＰＣＲバッファー（１００ｍＭ
ＫＣＬ，１００ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，２００ｍＭＴｒｉｓ−ＣＬ（ｐＨ８
．７５），２０ｍＭＭｇＳＯ₄，１％Ｔｒｉｔｏｎ，１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
）−［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ］、３ｕｌの各２つの反
対のプライマーセット（１０Ｏ．Ｄ．／ｕｌ）、及び１ｕｌのＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｕｌ）−［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ
，ＣＡ］を含む。ＰＣＲ増幅は、自動化温度ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ（ＭＪＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）を用いて、良好な条件を試験するために３つの異なるアニーリン
グ温度において実施した。最終条件は以下のとおりである：変性（９４Ｃ，１．
５分）、低ストリンジェンシーアニーリング（３７Ｃ，１．５分）、及び伸長合
成（７２Ｃ，２．５分）の５つの初期循環。初期循環の後、高いアニーリングス
トリンジェンシーにおける追加の２５循環を実施した：変性（９４Ｃ，１．５分
）、アニーリング（５５Ｃ，１．５分）、及び伸長合成（７２Ｃ，２．５分）。
１０μｌの１０ＸＤＮＡ負荷染料を各サンプルに加え、そして１５μｌのＰＣ
Ｒ生成物をアガロースゲル上で電気泳動した。

【０１２６】７．２結果陽性対照は予測されたとおり正確なバンドを提供する。未知の微生物は、ｄｈ
ａＢ１及びｄｈａＢ３と同じサイズの弱いＤＮＡバンドを示したが、ｄｈａＢ２
及びｄｈａＸ上には示さなかった。上記弱いバンドは低い相同性のＰＣＲプライ
マーと標的遺伝子によるかもしれない。これらの結果は、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５ ^T がＫ．ニューモニエにおいてｄｈａＢとして同じか又は類似の機能を担うｄｈ
ａＢ−様遺伝子を有するかもしれないことを示唆した。

【０１２７】８実施例：株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tグリセロールデヒドロゲナーゼのインビト
ロ測定株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５^Tのトルエン標的化細胞がグリセロールを３−ヒドロキ
シプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）に、そして１，２−プロパンジオールを
プロピオンアルデヒドに変換する能力を試験した。

【０１２８】８．１材料と方法６８℃において、０．５ｇ／ｌ酵母抽出物及び３ｇ／ｌグリセロールを追加し
たミネラル塩培地、ｐＨ６．８中で、細胞を嫌気成長させた。細胞を嫌気にて回
収して、窒素下で−７０℃に保存した。

【０１２９】凍結細胞を解凍して嫌気条件下でグローブボックス中でトルエン処理した。ト
ルエン処理は以下の工程からなった：（ａ）１ｍｌの５０ｍＭＫＰＯ₄ｐＨ８
．０中で細胞を洗浄する；（ｂ）エッペンドルフ５４１５Ｃチューブ中での１４
，０００ＲＰＭにおいて細胞を６分間回転する；（ｃ）１．５ｍｌの５０ｍＭ
ＫＰＯ₄ｐＨ８．０中で細胞を洗浄する；（ｄ）エッペンドルフ５４１５Ｃチュ
ーブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を再び６分間回転する；（ｅ）２ｍ
ｌの５０ｍＭＫＰＯ₄ｐＨ８．０に細胞を溶解する；（ｆ）２０μｌのトルエ
ンを加える；（ｇ）１５分間激しく振盪する；（ｈ）エッペンドルフ５４１５Ｃ
チューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を１０分間回転する；（ｉ）２
ｍｌの５０ｍＭＫＰＯ₄ｐＨ８．０中で細胞を洗浄する；（ｊ）エッペンドル
フ５４１５Ｃチューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を６分間回転する
；（ｋ）工程（ｉ）及び（ｊ）を繰り返す；（ｌ）トルエン処理された細胞を５
０ｍＭＫＰＯ₄ｐＨ８．０中に溶解する；（ｍ）溶解した細胞能力を吸光度を
６００ｎｍにおいて測定する；そして（ｎ）細胞を−７０℃において保存する。

【０１３０】反応混合物は、１．０ｍｌ中に、１５ｍＭＫＰＯ₄，ｐＨ８．０；０．２５
ＭＫＣｌ；２００ｍＭグリセロール又は１，２−プロパンジオール；トルエン
処理された細胞、０．３８ＯＤ６００；及び１２μＭ補酵素Ｂ₁₂を含んだ。
反応物を６０℃において嫌気性にてインキュベートして、図４に示された時間に
サンプルを取り出した。１００μｌのサンプルを、５０μｌのメチルベンジルチ
アゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）溶液（３７５ｍＭグリシン−ＨＣｌｐＨ２
．７中に６ｍｇ／ｍｌ）に加え、そして１００℃において３分間加熱し、氷の上
で３０秒間冷却し、そして１４ＫＲＰＭにおける５分間の遠心分離により清浄
化した。

【０１３１】清浄化した上清は、次に、以下のＣ₈−逆相ＨＰＬＣ系上での生成物の検出に
より分析した：（ａ）カラムは１５ｘ４．６ｃｍのＳｕｐｅｌｃｏ，Ｓｕｐ
ｅｌｃｏｓｉｌＬＣ−８−ＤＢ，３μＭ粒子サイズであった；（ｂ）溶剤Ａは
０．１％のＴＦＡであった；（ｃ）溶剤Ｂは９０％アセトニトリル、０．０８％
ＴＦＡであった；（ｄ）勾配は（時間［分］／％Ｂ）：０／０、７／４５、１
７／６５、２２／１００、２４／１００、２５／０、３０／０であった；（ｅ）
注入容量は２０μｌであった；（ｆ）注入器の引き抜く速度は８３３．３μｌ／
分であった；（ｇ）検出は５００ｎｍの参照を用いて３０５ｎｍにおいてであっ
た；そして（ｈ）バンドの幅はサンプル波長に関して４０及び参照波長に関して
８０であった。この系を用いて、３−ＨＰＡの保持時間は８．７分、そしてプロ
ピオンアルデヒドは１０．７分であった。

【０１３２】８．２結果グリセロールから３−ＨＰＡ及び１，２−プロパンジオールからプロピオンア
ルデヒドへの６０℃における変換の時間経過を図４に示す。結果は、グリセロー
ルデヒドロゲナーゼが上記生物の成長温度である６０℃において活性化されるこ
とを示す。上記酵素はグリセロールにより不活性化されるが、１，２−プロパン
ジオールによっては不活性化されない。類似の不活性化は他のグリセロールデヒ
ドロゲナーゼに関する文献において報告されていた。しかしながら、Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ由来のグリセロールデヒドロゲナーゼは６０℃において不活性である
。事実、６０℃において活性なグリセロールデヒドロゲナーゼは報告されていな
い。

【０１３３】９生物の寄託及び配列表の簡単な記載Ｃ．ビテルビエンシス種の株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^Tは、１９９９年８月２７日
にＡＴＣＣに、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認のブダペスト条約の
権限の下に寄託され、ＡＴＣＣＰＴＡ−５８４と命名された。「ＡＴＣＣ」は
１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０
８５２ＵＳＡに位置するアメリカンタイプカルチャーコレクション国際寄託機
関を意味する。上記の名称は寄託物質の加盟番号である。

【０１３４】株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^Tの１６ＳｒＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベー
スに加盟番号ＡＦ１８１８４８にて寄託された。

【０１３５】均等物上に書かれた明細書は、当業者に発明を実施可能とさせるのに十分である。事
実、分子生物学、生物工学の分野又は関連分野の当業者に明らかな発明を実施す
るために上に記載された手段の様々な修飾が特許請求の範囲の範囲内で修飾され
ることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^Tの成長に対する温度の効果を示し、ｔｄ＝倍
加時間である。

【図２】図２は、株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^Tの成長に対するｐＨ^25Cの効果を示し、ｔｄ＝
倍加時間である。

【図３】図３は、ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^T及び近縁の株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の
比較に基づく根絶された系統発生系統樹を示す。隣の系統樹は距離マトリックス
から構築した。１０００のデータセットの分析からの独力の値（パーセンテージ
として表現された）が枝分かれする点において示される。スケールバーは１００
ヌクレオチドあたり５ヌクレオチドの痴漢を表す。

【図４】図４は、嫌気性にてトルエン処理されたＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^T細胞の嫌気条件
下、６０℃における、グリセロールから３−ＨＰＡへの変換の時間経過アッセイ
を示す。

【図５】図５は、嫌気性にてトルエン処理されたＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５^T細胞の嫌気条件
下、６０℃における、１，２−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドへの
変換の時間経過アッセイを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｐ 7/62 7/62 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者セイフリード，マーカスアメリカ合衆国メリーランド州20910，シルバー・スプリングス，シックスティーンス・ストリート 8403 (72)発明者ウィージェル，ジャーゲンアメリカ合衆国ジョージア州30602，アセンズ，バイオロジカル・サイエンスィズ 215 (72)発明者ホワイテッド，グレゴリーアメリカ合衆国カリフォルニア州94002，ベルモント，サウス・ロード 304 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 CA09 DA05 EA04 GA19 HA03 HA12 HA14 HA19 4B050 CC01 CC03 DD02 EE03 LL05 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR32 QR38 QR55 QR75 QR82 QS25 QS34 QS39 QX01 4B064 AC32 CA02 CA19 CB21 CC24 DA16 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC14 BA02 BA21 CA28 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】好熱性生物においてグリセロールから１，３−プロパンジオー
ルに変換する方法であって、グリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵する好熱性生物を用意し；そ
して１，３−プロパンジオールが生産されるような条件下で上記好熱性生物を培養
することからなる、上記方法。
【請求項２】好熱性生物により生産された１，３−プロパンジオールを回収
する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】１，３−プロパンジオールをポリマーに重合する工程をさらに
含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】ポリマーがポリ（１，３−プロパンジオールテレフタレート）
である、請求項３記載の方法。
【請求項５】好熱性生物がカロラマトールビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）である、請求項１記載の方法。
【請求項６】好熱性生物がＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託された
生物に由来する、請求項５記載の方法。
【請求項７】グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する方法で
あって、グリセロールを好熱性生物温度安定性デヒドロゲナーゼ酵素とインキュベート
し、それによりグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換し；
そして３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに還元する
ことができる還元剤を加えることからなる、上記方法。
【請求項８】３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから１，３−プロパンジ
オールへの還元が温度安定性１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼに
より触媒される、請求項７記載の方法。
【請求項９】１，３−プロパンジオールを回収する工程をさらに含む、請求
項７又は８記載の方法。
【請求項１０】１，３−プロパンジオールをポリマーに重合する工程をさら
に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】ポリマーがポリ（１，３−プロパンジオールテレフタレート
）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】温度安定性デヒドロゲナーゼ酵素が好熱性生物に由来する、
請求項８記載の方法。
【請求項１３】好熱性生物がカロラマトールビテルビエンシスである、請
求項１２記載の方法。
【請求項１４】好熱性生物がＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託され
た生物に由来する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】Ｃ．ビテルビエンシスに由来する、単離された温度安定性グ
リセロール発酵酵素。
【請求項１６】ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託された生物に由来
する、単離された温度安定性グリセロール発酵酵素。
【請求項１７】Ｃ．ビテルビエンシス由来の温度安定性グリセロール発酵酵
素に相同な、単離された温度安定性グリセロール発酵酵素。
【請求項１８】デヒドロゲナーゼである、請求項１１、１２又は１３に記載
の単離された温度安定性グリセロール発酵酵素。
【請求項１９】グリセロールデヒドロゲナーゼである、請求項１８記載の酵
素。
【請求項２０】１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼである、請
求項１５、１６又は１７記載の酵素。
【請求項２１】カロラマトールビテルビエンシスの単離された培養物又は
細胞。
【請求項２２】培養物又は細胞のゲノムがＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４と
して寄託された生物のゲノムに少なくとも９５％同一である、請求項２１記載の
単離された培養物又は細胞。
【請求項２３】培養物又は細胞のゲノムがＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４と
して寄託された生物のゲノムに少なくとも９９％同一である、請求項２１記載の
単離された培養物又は細胞。
【請求項２４】培養物又は細胞の１６ＳｒＤＮＡ配列がＡＴＣＣの命名Ｐ
ＴＡ−５８４として寄託された生物の１６ＳｒＤＮＡに少なくとも９５％同一
である、請求項２１記載の単離された培養物又は細胞。
【請求項２５】培養物又は細胞の１６ＳｒＤＮＡ配列がＡＴＣＣの命名Ｐ
ＴＡ−５８４として寄託された生物の１６ＳｒＤＮＡに少なくとも９９％同一
である、請求項２１記載の単離された培養物又は細胞。
【請求項２６】ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託された生物の子孫
である、請求項２１記載の単離された培養物又は細胞。
【請求項２７】温度安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオ
チド配列をクローン化する方法であって、公知のグリセロール発酵酵素遺伝子の一部に相同なポリヌクレオチドプローブ
を、好熱性生物を含み得る環境サンプルからのポリヌクレオチド分子にハイブリ
ダイズさせ；そして上記プローブに結合するポリヌクレオチド配列を単離することからなる上記方法。
【請求項２８】第２のポリヌクレオチドプローブを用いたポリメラーゼ鎖反
応を用いることにより上記ポリヌクレオチドプローブに結合するポリヌクレオチ
ド配列を増幅する、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】温度安定性グリセロール発酵酵素が、グリセロールを１，３
−プロパンジオールに発酵させると同定された好熱性生物に由来する、請求項２
７又は２８記載の方法。
【請求項３０】好熱性生物がカロラマトールビテルビエンシスである、請
求項２９記載の方法。
【請求項３１】ポリヌクレオチドプローブが公知のｄｎａＢ遺伝子の一部に
相同である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】ｄｎａＢ遺伝子がクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）由
来である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブが配列番号：１
、配列番号：２、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択される、請
求項２９記載の方法。
【請求項３４】ポリヌクレオチドプローブ及び第二のポリヌクレオチドプロ
ーブが配列番号：１及び配列番号：２である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】ポリヌクレオチドプローブ及び第二のポリヌクレオチドプロ
ーブが配列番号：５及び配列番号：６である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】温度安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオ
チド配列をクローン化する方法であって、グリセロール上では嫌気性において成長できない標的生物を、好熱性生物から
のＤＮＡを用いて形質転換し；そしてグリセロール上でのそれらの嫌気性成長によりグリセロールを１，３−プロパ
ンジオールに発酵させる酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む、それら
形質転換された標的細胞を同定することからなる上記方法。
【請求項３７】温度安定性グリセロール発酵酵素が、グリセロールを１，３
−プロパンジオールに発酵させると同定された好熱性生物に由来する、請求項３
６記載の方法。
【請求項３８】好熱性生物がカロラマトールビテルビエンシスである、請
求項３７記載の方法。
【請求項３９】カロラマトールビテルビエンシスがＡＴＣＣの命名ＰＴＡ
−５８４として寄託された生物に由来する、請求項３８記載の単離された培養物
又は細胞。
【請求項４０】グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒
する好熱性生物を単離する方法であって、主要炭素源としてグリセロールを含む培地中で好熱性生物を含むサンプルをイ
ンキュベートし；そしてグリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵させる少なくとも一つの好熱
性生物を単離することからなる上記方法。
【請求項４１】サンプルを約４０℃から約１００℃の範囲の温度にてインキ
ュベートする、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】サンプルを嫌気性条件下でインキュベートする、請求項４０
記載の方法。
【請求項４３】約５０℃から約１００℃の間の温度を有する天然源からサン
プルを得る、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】好熱性生物により１，３−プロパンジオールの生産を検出す
る工程をさらに含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】好熱性生物により酢酸塩の生産を測定する工程をさらに含む
、請求項４０記載の方法。