KR101366398B1

KR101366398B1 - 신규 크렙시엘라 뉴모니애 ｊ２ｂ 균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 균주

Info

Publication number: KR101366398B1
Application number: KR1020120016775A
Authority: KR
Inventors: 박성훈; 발란아라수; 아속소마순다; 고연주
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2014-02-25
Also published as: KR20130095395A

Abstract

본 발명은 감소된 지질다당체 형성과 향상된 성장 특성을 지닌 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 신규한 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주, 상기 균주를 3-하이드록시프로피온산의 생산력이 향상되도록 개량한 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 신규 균주는 저가의 비정제 글리세롤을 포함한 광범위한 탄소원을 대사하는 능력이 우수하고 높은 성장능력과 감소된 지질다당체를 생산하여 앞으로 원하는 대사산물을 생산하도록 배지내 탄소원을 이용할 가능성이 높으며, 감소된 지질다당체의 생산으로 인해 배양액으로부터 균체를 분리하는 것이 용이하고 유전자 조작이 용이하다는 장점을 갖기에, 이를 재조합을 통해 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 등 원하는 대사산물을 대량생산하도록 활용가능하다.

Description

신규 크렙시엘라 뉴모니애 Ｊ２Ｂ 균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 균주 {New Klebsiella pneumoniae J2B and Recombinant strain producing 3-hydroxypropionic acid using the same}

본 발명은 신규 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 균주에 관한 것이다.

인류가 지구상에 존재하는 여러 가지 에너지 자원들 가운데 화석연료를 주요 에너지원으로 사용함에 따라 석유 가격의 상승 및 환경오염 등이 해결해야 할 과제들로 지적되어왔다. 이를 효과적으로 해결하기 위한 방안으로 재생가능한 에너지 개발이 계속적으로 진행되고 있으며, 특히 바이오를 기반으로 한 연료의 생산이 주목을 받고 있다. 바이오 기반 연료 중 하나인 바이오디젤은 동식물의 폐유지로부터 트리글리세라이드의 에스테르 교환 반응에 의해 생산되어 질 수 있다.

바이오디젤 생산 공정에서 바이오디젤 생산량의 약 10%에 해당하는 글리세롤이 부산물로 발생하게 되는데, 세계적으로 바이오디젤 산업이 급격하게 성장함에 따라 부산물인 글리세롤이 필요이상으로 발생하여 그 양이 대략 10억 톤에 이르렀다. 이에 글리세롤의 가격은 급격히 하락하여 2004년에 톤당 350달러였던 비정제 글리세롤의 시장가격이 현재는 톤당 200달러 수준으로 알려져 있으며, 현재의 추세를 감안할 때 글리세롤 가격의 지속적 감소는 불가피한 것으로 판단된다.

글리세롤은 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 원료물질로 사용되어지나 비정제 글리세롤의 경우 글리세롤 내에 존재하는 여러가지 불순물들이 이와 같은 분야에서의 사용을 지연시켜왔다. 반면 생물학적 방법으로 다양한 화학물질을 생산하는데 있어 탄소원으로 사용되는 글리세롤은 높은 순도를 요구하지 않기 때문에 글리세롤로부터 1,3-프로판디올 (1,3-PDO) 및 3-하이드록시프로피온산(3-HP)과 같은 중요한 화학 물질들을 생물학적 방법으로 생산하는 연구들이 관심을 받고 있다.

3-HP는 여러 화학공정에 활용할 수 있는 합성 중간체로 1,3-프로판디올, 아크릴산, 메틸아크릴에이트, 아크릴아미드, 에틸 3-하이드록시프로피온산, 말로닉산, 프로피온락톤, 아크로니트릴 등의 합성원료로 사용된다.

또한 1,3-프로판디올은 폴리에스터, 폴리에테르, 폴리우레탄 등의 합성원료로 사용될 수 있으며, 특히 1,3-프라판디올과 테레프탈릭산의 중합반응에 의해 생성되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT)는 기능성 섬유재료의 제조에 사용되어 지고 있다.

글리세롤을 탄소원으로 사용하여 상기와 같이 가치있는 합성 중간체들을 효과적으로 생산할 수 있는 미생물로는 시트로박터 프로인디아이 (Citrobacter freundii), 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 클로스트리디움 파스데우리아뭄 (Clostridium pasteuriamum), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 엔테로박터 아글로머란스 (Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes) 등이 알려져 있다. 이 미생물들 가운데 크렙시엘라 뉴모니애는 글리세롤로부터 1,3-PDO를 생산하기 위한 대사경로가 가장 잘 연구되어져 있는 균주이다. 이 균주는 장내세균과 (enterobacteriaceae)에 속하는 그람 음성의 통성 혐기성 간균이며, 토양, 구강, 피부, 사람 및 동물들의 장기의 정상세균총에서 발견되어지는 것으로 알려져 있다.

크렙시엘라 뉴모니애는 글리세롤로부터 EmbdenMeyerhofParnas (EMP) 경로를 통해 피루브산 (pyruvate)를 생산하는 산화적 루트 (oxidative route)와 1,3-PDO 생산을 이끄는 환원적 루트 (reductive route)를 가진다.

산화적 루트 (oxidative route)에서 글리세롤은 NAD⁺를 조효소로 요구하는 글리세롤 디하이드로게네이즈에 의해 디히드로아세톤 (Dihydroxyacetone, DHA)를 생산하는 경로 및 ATP를 이용하는 글리세롤 키네이즈에 의해 글리세롤-3인산 (Glycerol-3-phosphate, G3P)로 변환되는 두 가지 경로를 가진다.

또한 환원적 루트 (reductive route)에서 글리세롤은 코엔자임 B₁₂를 요구하는 효소인 글리세롤 디하이드로지네이즈 (glycerol dehydrogenase)에 의해 3-하이드로프로피온알데히드 (3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)로 전환된다. 이 3-HPA는 NAD(P)⁺를 조효소로 이용하는 옥시도리덕테이즈 (oxidoreductase)에 의해 1,3-PDO로 환원되거나, 알데하이드 디하이드로지네이즈 (aldhehyde dehydrogenase)에 의해 3-HP를 형성한다. 한편 크렙시엘라 뉴모니애가 가지는 알데하이드 디하이드로지네이즈의 낮은 발현성은 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는데 있어 제한요소로 작용한다.

그러나 최근 알데하이드 디하이드로지네이즈를 과발현한 재조합 크렙시엘라 뉴모니애 DSMZ (KpDSMZ)가 글리세롤을 이용하여 3-HP 16g/L, 1,3-PDO 16g/L를 생산할 수 있음이 보고된 바 있다. 또한 크렙시엘라 뉴모니애는 글리세롤 디하이드라테이즈의 활성을 위해 요구되는 필수 조효소인 코엔자임 B₁₂를 생산할 수 있는 신생합성경로를 가지고 있다는 장점이 있다.

이와 같은 장점에도 불구하고 크렙시엘라 뉴모니애는 성장이 느리다는 특성과 지질다당체 (LPS)의 과도한 생산으로 인해 상업적 적용에 많은 어려움을 지니고 있다. 특히 LPS의 과도한 생산은 원하는 대사산물 대신 LPS가 생산되는 쪽으로 탄소가 이용되도록 함으로써 원하는 대산산물의 생산 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 배양액으로부터 균체를 분리하는 것을 어렵게 하며, 또한 고농도 배양과 유전자 조작을 상당히 어렵게 하는 주요 원인으로 분석되었다.

본 발명은 종래의 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 균주인 크렙시엘라 뉴모니애가 지닌 문제점인 느린 생장과 과도한 LPS 생성을 해결하기 위하여 LPS 생산이 낮고 높은 생장 특성을 가진 신규 크렙시엘라 뉴모니애를 분리, 동정하고자 한다.

본 발명은 3-하이드록시프로피온산의 생산력을 향상시키기 위해 상기 분리된 신규한 균주에 알데히드 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질도입시켜 재조합 균주를 생성하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 균주 및 재조합 균주를 이용한 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주를 제공한다.

상기 균주의 기탁번호는 KCCM11213P일 수 있다.

상기 균주는 락토오스 (Lactose), 크실로오스 (Xylose), 말토오스 (Maltose), 프럭토오스 (Fructose), 덱스트로오스 (Dextrose), 갈락토오스 (Galactose), 라피노스 (Raffinose), 트레할로오스 (Trehalose), 멜리비오스 (Melibiose), 수크로오스 (Sucrose), L-아라비노오스 (L-Arabinose), 글리세롤 (Glycerol), 살리신 (Salicin), 이노시톨 (Inositol), 소르비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 아도니톨 (Adonitol), α-메틸-D-글루코사이드 (α-Metyl-D-Glucoside), 람노오스 (Rhamnose), 또는 D-아라비노오스 (D-Arabinose)을 탄소원으로 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주에 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질도입시켜 생성된 재조합 균주를 제공한다.

상기 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자는 아조스피릴리움 브라질렌스 균주로부터 유래된 KGSADH 유전자일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 도 6의 개열지도를 가질 수 있다.

본 발명은 상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 균주를 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 균주에 상기 재조합 벡터를 형질도입하여 재조합 균주를 생산하는 단계; 및 상기 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에 배양하는 단계;포함하는 재조합 균주를 이용한 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 분리균인 J2B는 감소된 지질다당체의 생산과 향상된 성장 특성을 보일 뿐만 아니라, 탄소원으로 저가의 글리세롤을 이용할 수 있으며 1,3-PDO, 3-HP, 락테이트, 에탄올과 같은 대사산물들을 상당히 높은 농도로 생산할 수 있으므로, 적절한 공학기술 (engineering)을 통해 상업적으로 중요한 여러 가지 화학물질들을 효과적으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 J2B 균주를 재조합을 통해 알데히드 디하이드로지네이즈의 과발현을 유도함으로 3-HP를 효과적으로 생산할 수 있어 활용가치가 크다.

도1은 신규 분리균인 KpJ2B (B)와 대조균인 KpDSMZ (A)에 대한 SEM 사진을 나타낸 것이다.
도2는 신규 분리균인 KpJ2B와 대조균인 KpDSMZ에 대한 침강성 평가 사진을 나타낸 것이다.
도3은 신규 분리균인 KpJ2B (B, D)와 대조균인 KpDSMZ (A, C)에 대한 호기 및 혐기 배양 결과를 나타낸 것이다.
도4는 신규 분리균인 KpJ2B (B)와 대조균인 KpDSMZ (A)에 대한 유가식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도5는 신규 분리균인 KpJ2B를 숙주세포로 알데히드 디하이드로지네이즈를 과발현하는데 사용된 플라스미드 및 이를 통하여 얻어진 유전자재조합 균주의 플라스크 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

신규 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주, 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 균주 및 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공하고자 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

종래의 크렙시엘라 뉴모니애는 성장이 느리다는 특성과 지질다당체 (LPS)의 과도한 생산으로 인해 상업적 적용에 많은 어려움을 지니고 있었다. 특히 LPS의 과도한 생산은 원하는 대사산물 대신 LPS가 생산되는 쪽으로 탄소가 이용되도록 함으로써 원하는 대산산물의 생산 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 배양액으로부터 균체를 분리하는 것을 어렵게 하며, 또한 고농도 배양과 유전자 조작을 상당히 어렵게 하는 주요 원인으로 분석되었기 때문에, 본 발명에서는 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 균주인 크렙시엘라 뉴모니애 중에서 지질다당체의 생산량이 감소되고 성장능력이 향상된 새로운 균주를 분리, 동정하고자 노력하던 중, 본 발명에서 동정된 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주가 상기 문제점을 해결할 수 있음을 발견하고 이를 이용하여 3-하이드록시프로피온산 생산하는 재조합 균주를 제조함으로 본 발명을 완성하였다.

상기 균주는 혐기소화조로부터 샘플을 채취하여 20여 종의 균주를 확보하고, 이 중 빠른 세포 생장과 감소된 지질다당체 (LPS) 및 1,3-PDO 생산 능력이 우수한 균주를 분리하여 16S rRNA를 추출하여 분석한 다음 그 염기서열을 게놈 데이터베이스 은행 (genomic database bank)에 등록된 박테리아들과 유사성을 비교한 결과, 크렙시엘라 뉴모니애 변종 뉴모니애 NTUH-K2044 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044, AP006725.1)의 염기서열과 99%이상의 상동성을 보여 상기 균주를 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)로 분류되었고, 크렙시엘라 뉴모니애 J2B (Klebsiella pneumoniae J2B)라 명명하였다.

상기 균주를 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM11213P 기탁번호를 부여받았다.

본 발명은 종래의 크렙시엘라 뉴모니애 (Kp) 중 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 생성능이 뛰어나다고 알려진 양성 대조군인 DSMZ 균주와 비교하여, 이와 거의 동일하거나 뛰어난 생리적 활성 및 대사체계를 지님을 확인할 수 있었다.

크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주의 증가된 성장속도를 확인할 수 있는 일 실시예로, 호기적 배양시 DSMZ의 최대성장속도 (μmax)는 0.82h^-1인데 비해 J2B의 최대성장속도(μmax)는 0.92h^-1이었으며, 12시간 후에 OD₆₀₀는 각각 3.9와 5.0을 나타내어, KpJ2B 균주가 세포 성장에 있어 KpDSMZ 균주보다 우수한 균주임을 확인할 수 있다.

크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주의 감소된 지질다당체 생성력을 확인할 수 있는 일 실시예로, 직접적으로는 2-케토-3-디옥시오토네이트 (KDO) 및 SEM 사진을 통해, 간접적으로는 침강성 및 항생제 감수성을 통해 확인할 수 있다.

LPS에 포함된 2-케토-3-디옥시오토네이트 (KDO)를 측정하여 지질다당체의 생성량을 확인하였는데, 그 결과 J2B의 KDO 함유량은 1.4μg/gCDW, DSMZ의 KDO 함유량은 1.9μg/gCDW로 J2B의 LPS생산량이 DSMZ의 LPS생산량 보다 25% 가량 낮으며, SEM 사진 결과, DSMZ은 과도하게 형성된 LPS로 인해 거친 표면을 가지는 반면 J2B는 매끈한 표면을 가짐을 통해 두 균주가 LPS 합성량에 있어 현저한 차이를 보임을 확인할 수 있다. 또한, J2B균주는 대부분의 항생제에 대해 대조균인 DSMZ보다 높은 감수성을 나타내고, 침강성이 높고 점성이 낮아 배양액으로부터 균체의 분리가 쉬움을 확인함으로 본 발명의 J2B균주의 지질다당체 생산량이 DSMZ 균주보다 낮음을 알 수 있다.

본 발명의 균주는 코엔자임 B₁₂를 생산할 수 있는 신생합성경로를 가지고 있기 때문에, 고가의 비타민 B₁₂의 사용없이 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산를 생산할 수 있는 장점이 있다.

또한, 상기 균주가 사용가능한 탄소원은 특별히 한정된 것은 아니나, 락토오스 (Lactose), 크실로오스 (Xylose), 말토오스 (Maltose), 프럭토오스 (Fructose), 덱스트로오스 (Dextrose), 갈락토오스 (Galactose), 라피노스 (Raffinose), 트레할로오스 (Trehalose), 멜리비오스 (Melibiose), 수크로오스 (Sucrose), L-아라비노오스 (L-Arabinose), 글리세롤 (Glycerol), 살리신 (Salicin), 이노시톨 (Inositol), 소르비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 아도니톨 (Adonitol), α-메틸-D-글루코사이드 (α-Metyl-D-Glucoside), 람노오스 (Rhamnose), ONPG, 또는 D-아라비노오스 (D-Arabinose) 등 광범위한 탄소원을 사용할 수 있다.

본 발명의 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주는 저가의 비정제 글리세롤을 포함한 광범위한 탄소원을 대사하는 능력이 우수하고 높은 성장능력과 감소된 지질다당체를 생산하여 앞으로 원하는 대사산물을 생산하도록 배지내 탄소원을 이용할 가능성이 높으며, 감소된 지질다당체의 생산으로 인해 배양액으로부터 균체를 분리하는 것이 용이하고 유전자 조작이 용이하다는 장점을 갖는 균주로, 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 생산 등 크렙시엘라 뉴모니애를 이용한 다양한 대사산물의 생산에 상업적 균주로 활용가능성이 높다.

상기 재조합 균주는 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산할 수 있으며, 특히 향상된 3-HP 생산을 위해 고안된 것일 수 있다.

알데하이드 디하이드로지네이즈는 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는데 관여하는 효소로서, 글리세롤 디하이드라테이즈가 글리세롤을 탈수화시켜 중간물질인 3-하이드록시프로피온알데히드 (3-HPA) 생산 반응을 촉매하면 알데히드 디하이드로지네이즈는 중간물질인 3-HPA를 산화시켜 최종산물인 3-HP를 생산한다.

이때, 글리세롤을 탈수화시켜 3-HPA를 생성하는 크렙시엘라 뉴모니애 유래 글리세롤 디하이드라테이즈는 비타민 B₁₂를 필요로 하는데, 본 발명의 균주는 코엔자임 B12의 신생합성경로를 가지기 때문에 고가의 B₁₂를 외부에서 공급하지 않고 3-HPA를 생산할 수 있다.

상기 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자는 특별히 한정된 것은 아니나, 본 발명의 일례로 아조스피릴리움 브라질렌스 균주로부터 유래된 KGSADH 유전자를 사용할 수 있다.

상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주에 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 특별히 한정된 것은 아니나, 도 6의 개열지도 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명의 형질도입 방법은 유전공학계에서 널리 알려진 공지방법에 의할 수 있다.

상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B균주는 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 균주로 종래의 우수한 균주인 KpDSMZ 만큼 또는 그 이상의 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 생산력을 지니고 있다.

상기 탄소원은 특별히 한정된 것은 아니며, 락토오스 (Lactose), 크실로오스 (Xylose), 말토오스 (Maltose), 프럭토오스 (Fructose), 덱스트로오스 (Dextrose), 갈락토오스 (Galactose), 라피노스 (Raffinose), 트레할로오스 (Trehalose), 멜리비오스 (Melibiose), 수크로오스 (Sucrose), L-아라비노오스 (L-Arabinose), 글리세롤 (Glycerol), 살리신 (Salicin), 이노시톨 (Inositol), 소르비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 아도니톨 (Adonitol), α-메틸-D-글루코사이드 (α-Metyl-D-Glucoside), 람노오스 (Rhamnose), ONPG, 또는 D-아라비노오스 (D-Arabinose) 등 광범위한 탄소원을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 글리세롤 (Glycerol)를 사용할 수 있다.

본 발명은 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 균주에 상기 재조합 벡터를 형질도입하여 재조합 균주를 생산하는 단계; 및 상기 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에 배양하는 단계;를 포함하는 재조합 균주를 이용한 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

상기 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자는 특별히 한정된 것은 아니나, 아조스피릴리움 브라질렌스 균주로부터 유래된 KGSADH 유전자일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 특별히 한정된 것은 아니나, 도 6의 개열지도 벡터를 포함할 수 있다.

상기 재조합 균주는 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산할 수 있으며, 특히 향상된 3-HP 생산을 위해 고안된 균주일 수 있다.

3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid)은 25℃에서 pKa 4.51 인 약산일 수 있으며, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비 카이랄 유기산으로 젖산 (2-하이드록시프로피온산)과 이성질체일 수 있다. 또한 비결정질이며, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45 일 수 있다.

상기 탄소원은 특별히 한정된 것은 아니며, 락토오스 (Lactose), 크실로오스 (Xylose), 말토오스 (Maltose), 프럭토오스 (Fructose), 덱스트로오스 (Dextrose), 갈락토오스 (Galactose), 라피노스 (Raffinose), 트레할로오스 (Trehalose), 멜리비오스 (Melibiose), 수크로오스 (Sucrose), L-아라비노오스 (L-Arabinose), 글리세롤 (Glycerol), 살리신 (Salicin), 이노시톨 (Inositol), 소르비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 아도니톨 (Adonitol), α-메틸-D-글루코사이드 (α-Metyl-D-Glucoside), 람노오스 (Rhamnose), ONPG, 또는 D-아라비노오스 (D-Arabinose) 등을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 글리세롤일 수 있다.

이와 같은 글리세롤의 사용은 바이오디젤 생산 공정 등에서 생산된 불순물이 크게 함유된 저가의 비정제 글리세롤로부터 산업적 활용가치가 높은 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 생산을 가능하게 하는 것이다.

본 발명의 신규 미생물 또는 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산를 회수하는 과정은 종래 발효공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산 분리정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 의 분리 및 동정

1-1. 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 의 분리

신규 균주를 분리하기 위해 부산 근교 하수 처리장에 있는 혐기성 소화조로부터 시료를 채취하였다. 채취한 시료는 8000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 무거운 입자를 제거하였으며, 상등액은 여러 차례 글리세롤 배지에서 농후 배양을 거친 후 희석하고 100mM 글리세롤이 포함된 M9 미네랄 염분 평판 배지에 도말하였다. 균을 도말한 평판배지는 37℃에서 24시간 동안 배양되었으며, 크렙시엘라 (Klebsiella)와 비슷한 형태를 가지는 20여 종의 균주를 확보하였다. 분리된 신규 균주들 중 성장 특성과 1,3-PDO 생산 능력이 가장 좋은 크렙시엘라 뉴모니애 J2B (J2B)를 선발하였다. J2B 균주는 그람음성의 통성혐기균으로 밝은 크림색을 띄고 있음을 확인하였다. J2B 균주는 한국 균주은행에 기탁 (기탁번호: KCCM11213P) 보존하였다.

1-2. 16S rRNA 증폭에 의한 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 의 확인

신규 분리균인 크렙시엘라 뉴모니애 J2B로부터 게놈 DNA는 27 정방향 프라이머(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492 역방향 프라이머 (3'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-5')를 사용해 PCR (중합효소연쇄반응)을 수행하여 16S 리보솜 RNA를 얻었다. 16S rRNA 증폭을 위한 조건을 PCR 조건 (30 cycle), 초기변성과정 95℃ 10분, 변성과정 95℃ 2분, 어닐링과정 58℃ 1분, 연장(중합)과정 72℃ 2분, 최종 연장 과정 72℃ 10분으로 하였다.

PCR 산물은 pGEM-T 벡터에 접합하였으며 Cosmotech Co. Ltd. (Seoul, Korea)에서 유전자 염기 서열을 밝혔다. 유전자 염기서열 분석 결과는 NCBI BLAST를 사용하여 게놈 데이터베이스 은행 (genomic database bank)에 등록된 박테리아의 reference species로 유사성을 비교한 결과 J2B의 시퀀스 데이터가 크렙시엘라 뉴모니애 변종 뉴모니애 NTUH-K2044 (Klebsiella pneumoniae subsp. pnueumoniae NTUH-K2044, AP006725.1)의 시퀀스와 99% 이상의 상동성을 가짐을 확인하였다. 이상의 16S rDAN 분석 결과로부터 분리균주는 크렙시엘라 뉴모니애로 분류되었고, 크렙시엘라 뉴모니애 J2B라 명명하였다. J2B의 16S rDNA 유전자 시퀀스는 NCBI 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 (nucleotide sequence database)에 등록번호 JF957138로 기탁하였다.

1-3. 크렙시엘라 뉴모니애 J2B 의 생화학적 분석

J2B 균주와 DSMZ 균주에 대한 대사반응은 API20E micro test kit (Himedia, Mumbai, India)를 사용하여 수행되었다. 두 균주 모두 넓은 범위의 탄소원을 사용하는 능력을 보였으나 L-아라비노오스(L-arabinose), 살리신 (salicin), 글루콘산염 (gluconate), 둘시톨 (dulcitol)과 같은 탄소원의 흡수에서 다소 차이를 보였다. L-아라비노오스와 살리신은 KpJ2B에 의해서만 이용되었으며, 글루콘산염과 둘시톨은 KpDSMZ에 의해서만 소비되어졌다. 또한 두 균주는 황화수소물은 생산할 수 없지만 질삼염을 환원시키는 것이 가능함을 확인하였다.

실시예 2. J2B 와 DSMZ 균주를 이용한 플라스크 실험

신규 균주 J2B는 DSMZ를 대조균으로하여 호기 및 혐기조건에서 성장과 1,3-PDO 생산 경향이 조사되었다. 세포는 50mL의 M9 배지를 포함하는 250mL 삼각플라스크를 사용하여 진탕배양기에서 온도 37℃, 교반속도 200rpm의 조건으로 배양하였다. 균주를 배양하기 위해 사용한 M9배지의 조성은 다음과 같다. MgSO₄7H₂O, 0.25 (g/L); NaCl, 1.0 (g/L); NH₄Cl, 1.0 (g/L); 효모 추출물, 1,0 (g/L); 글리세롤, 9.2 (g/L) (100mM) 이 때 배양액의 pH를 유지시키기 위하여 100mM 인산화 칼륨 완충 용액을 사용하였다. 호기성 배양 동안 플라스크 입구는 산소가 투과할 수 있도록 면전을 사용하여 막았다. 혐기성 배양 동안에는 스크루 캡이 사용되었으며, 접종하기 전 플라스크의 상부 공극 (head space)은 아르곤 가스로 채웠다. 샘플은 주기적으로 채취하여 건조균체량 (CDW), 글리세롤, 대사산물들 (1,3-PDO, ethanol, acetic acid, lactic acid, succinate)을 분석하였으며 최대성장속도 (μ_max)는 0에서 3시간 동안 측정되었다.

2-1. J2B 와 DSMZ 균주의 호기성 배양

J2B와 DSMZ 균주의 호기성 배양 결과 도 3에 도시된 바와 같이, J2B와 DSMZ 균주의 글리세롤 소비 경향은 비슷한 반면 DSMZ 균주에 비해 J2B균주의 최대성장속도와 최종 OD₆₀₀가 높은 값을 나타냄을 알 수 있었다. DSMZ의 최대성장속도 (μ_max)는 0.82h^-1인데 비해 J2B의 최대성장속도 (μ_max)는 0.92h^-1이었으며, 12시간 후에 OD₆₀₀는 각각 3.9와 5.0을 나타내었다. 이 결과는 KpJ2B 균주가 세포 성장에 있어 KpDSM 균주보다 우수한 균주임을 말해준다.

표 2에 호기성 배양에 대한 탄소수지 분석을 나타내었다. 바이오매스에 의한 탄소회수율이 J2B는 20.8%, DSMZ은 14.6%였으며, J2B와 DSMZ이 대사산물 생산을 위해 흡수한 탄소는 각각 46.7%, 54.7%였다. 이 결과는 J2B 균주가 DSM보다 1,3-PDO생산량이 높은 이유를 설명해준다.

2-2. J2B 와 DSMZ 균주의 혐기성 배양

J2B와 DSMZ 균주의 혐기성 배양 결과 도 3에 도시된 바와 같이, J2B 균주의 경우 100mM 글리세롤을 소모하는데 9시간이 걸렸으며, 1.3-PDO는 33.0mM을 생산하였다. 한편 대조군 균주인 DSMZ의 경우 100mM 글리세롤을 소모하는데 6시간이 걸렸으며, 1,3-PDO의 생산량은 38.5mM로 J2B 보다 약간 높은 것을 알 수 있었다.

표 2는 혐기성 배양에서의 얻은 탄소수지분석을 보여준다. 탄소 회수율이 호기성 배양에서보다 높은 90%로 나타났으며, 바이오매스 형성과 대사산물 생산에 사용된 두 균주의 탄소 분배는 DSMZ 균주가 J2B 균주보다 좀 더 많은 1,3-PDO와 적은 양의 젖산 (lactic acid)를 축적한다는 것을 제외하고 비슷했다. 또한 혐기성 상태에서는 호기성 상태에서와 달리 대사산물 생산 경로 (70-80%)보다 바이오매스 쪽으로의 탄소분배 (10-11%)가 적었다

실시예 3. J2B와 DSMZ 균주를 이용한 바이오리액터 실험

바이오리액터 실험은 신규 분리균인 J2B와 대조균으로 DSMZ를 사용하여 수소이온농도 (pH) 및 공기 공급 속도를 유지하며 유가식 배양을 수행하였다. 바이오리액터는 1.5L 규모의 반응기내에 0.5L의 조업부피로 운전되었으며, 100mM 글리세롤, 100mM 인산화 칼륨 용액 (pH 7.0)이 포함된 M9배지가 사용되었다. 온도 37℃, 교반속도 200rpm으로 운전되었으며, pH는 5N NaOH와 2.5 HCl로 조절하였다. 또한 호기 조건을 유지하기 위해 멸균된 공기를 1.0vvm 속도로 공급하였다. 반응기 내의 글리세롤 농도는 10.0mM 이상으로 유지하였으며, 샘플은 주기적으로 채취하여 건조균체량, 글리세롤, 대사산물들 (1,3-PDO, ethanol, acetic acid, lactic acid, succinate)을 분석하였다.

그 결과 도 4에서 도시된 바와 같이 J2B와 DSMZ 균주 모두 3시간 안에 100mM 글리세롤을 소모 시켰으며, 그때의 OD₆₀₀ 값은 각각 3.20, 3.69임을 알 수 있었다. 글리세롤의 추가적인 첨가는 J2B의 OD₆₀₀값을 계속적으로 증가시켜 30시간에는 13.0으로 나타난 반면, DSMZ는 12시간 후에 관찰된 OD₆₀₀값 6.0에서 더 이상 변화가 없었다.

실시예 4. 효소 활성의 측정 및 비교

크렙시엘라 뉴모니애 (K. pneumoniae )에 의해 글리세롤 대사(metabolism)에 포함된 중요한 효소의 활성은 미호기성 상태에서 배양된 J2B와 DSMZ 균주를 대상으로 측정 및 비교하였다.

4-1. 글리세롤 디하이드라테이즈(DhaB)의 활성

글리세롤 디하이드라테이즈 (DhaB)의 활성은 Raj et al.에서 기술된 방법에 따라 결정하였다. 적절한 양의 세포추추물을 35mM 인산화 칼륨 용액 (pH 8.0), 50mM 글리세롤, 15mM 비타민 B₁₂가 포함된 반응 혼합물에 넣고 37℃에서 5분간 배양시킨 뒤 100mM 구연산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 3-HPA의 생산량은 고성능액체크로마토그래피 (HPLC, Agilent 1100 series, USA)를 이용해 분석하였다. 글리세롤 디하이드라테이즈의 효소 활성 단위는 분당 1μmol의 3-HPA를 형성하기 위해 요구되는 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 대조균인 DSMZ의 글리세롤 디하이드라테이즈의 효소 활성은 6.8U/mg 이었으며, 신규 분리균인 J2B의 글리세롤 디하이드라테이즈의 효소 활성은 0.48U/mg으로 나타났다.

4-2. 글리세롤 디하이드로지네이즈 ( DhaD )의 활성

글리세롤 디하이드로지네이즈 (DhaD)의 활성은 Ahrens et al.에서 기술된 방법에 따라 결정하였다. 0.2M 글리세롤 (glycerol), 1.2mM NAD을 포함한 30mM 황산암모늄 (ammonium sulfate)을 pH가 7.0이 되도록 1M NaOH로 조절한 다음 세포추출물을 첨가하여 30℃에서 반응이 일어나도록 하였다. 반응 결과 생성된 NADH₂의 흡광도를 340nm에서 측정하여 효소활성을 확인하였으며, 효소 활성 단위는 분당 기질 1μmol을 환원시키는데 요구되는 효소의 양으로 하였다.

그 결과 DSMZ의 DhaD 활성은 5.9U/mg, J2B의 DhaD 활성은 1.27U/mg로 활성이 존재하므로 두 균주 모두 혐기상태에서 글리세롤을 산화적 (oxidative) 경로로 대사할 수 있다는 효소적 측면의 증거가 된다.

4-3. 1,3- 프로판디올 옥시도리덕테이즈 ( DhaT )의 활성

1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈 (DhaT)의 활성은 Ahrens et al.에서 기술된 방법에 따라 결정하였다. 30mM 황산암모늄 (pH 7.0), 0.1M 1,3-프로판디올로 구성된 반응용액에 2mM NAD와 세포추출물을 넣고 37℃에서 NAD를 NADH₂로 환원시키는 반응을 수행하였다. 증가한 NADH₂의 양은 분광광도계의 흡광도를 340nm로 조절하여 측정하였으며, 효소 활성 단위는 분당 기질 1μmol을 환원시키는데 요구되는 효소의 양으로 하였다.

그 결과 J2B는 0.23U/mg, DSMZ은 0.75U/mg으로 KpJ2B의 DhaT 활성이 낮은 것을 알 수 있었다.

4-4. NADPH 의존성 옥시도리덕테이즈 ( NADPH - HOR )의 활성

NADPH 의존성 옥시도리덕테이즈 (NADHPH-HOR)의 활성은 Perez et al.에서 기술된 방법에 따라 결정하였다. 기질로써 아세트알데히드를 첨가한 50mM 인산화 칼륨용액 (pH 7.0)에 세포추출물과 2mM NADPH를 넣고 37℃에서 2분간 배양하였다. 그 결과 산화된 NADPH의 양은 분광광도계로 340nm에서 측정하였으며, 측정된 값은 효소 활성 계산에 이용하였다. 효소 활성 단위는 분당 1pmol의 NADPH를 산화시키는 단백질 양으로 결정하였다.

NADPH-HOR의 활성은 J2B가 0.068U/mg, DSMZ이 0.07U/mg로 두 균주 비슷하였다.

4-5. 감마- 글루타밀 -감마- 아미노부틸알데하이드 디하이드로지네이즈 ( PuuC )의 활성

감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데하이드 디하이드로지네이즈 (PuuC)의 활성은 Raj et al.에서 기술된 방법에 따라 수행하였다. 1mM DTT를 포함한 50mM 인산칼륨버퍼 (potssium phosphate buffer, pH8.0)에 2.0μg/mL 농도의 세포추출물을 넣고 45℃에서 5분간 배양한 뒤, 1.8mM 알데히드(s)와 0.76mM NAD(P)⁺를 첨가하여 NAD(P)⁺가 NAD(P)H로 환원되는 양으로 결정하였다. 환원된 NAD(P)H의 양은 UV분광광도계를 이용하여 340nm에서 측정하였으며, 생성된 NAD(P)H의 양은 몰랄 흡광계수 (extinction coefficient; △ε₃₄₀ ) 6.22× 10³M^-1cm^-1을 사용하여 계산하였다.

그 결과 DSMZ 균주와 J2B 균주 모두 PuuC에 대한 활성이 나타나지 않았다.

실시예 5. LPS 에 포함된 2- 케토 -3- 디옥시오토네이트 ( KDO )의 측정

LPS의 분리는 Chembio UK에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행하였으며, LPS에 포함된 2-케토-3-디옥시오토네이트 (KDO)는 티오바르비툴산 (thiobarbutric) 방법을 사용하여 측정하였다. 세포벽에 존재하는 LPS의 가수분해는 황산 (H₂SO₄)으로 세포를 100℃에서 30분 동안 끓임으로써 수행되었으며, 이는 또한 KDO의 분리를 가능하게 하였다. 상기의 방법으로 얻은 KDO의 발색단을 형성하기 위해 과요오드산, 비소산나트륨, 티오바르비툴산으로 처리하였으며 형성된 발색단의 흡광도는 분광광도계로 552nm 파장에서 측정하였다.

그 결과 J2B의 KDO 함유량은 1.4μg/gCDW, DSMZ의 KDO 함유량은 1.9μg/gCDW로 J2B의 LPS생산량이 DSMZ의 LPS생산량 보다 25% 가량 낮은 것을 알 수 있었다.

실시예 6. J2B 와 DSMZ 균주의 형태학적 관찰

DSMZ과 J2B 균주의 형태학적 관찰을 위하여 주사전자현미경 (SEM)으로 관찰하였으며 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 균주는 M9배지에서 혐기성상태로 배양하였으며, 세포 펠렛은 4℃에서 10분간 원심분리하여 수집하였다. 상기 회수한 세포 펠렛은 글루타르알데히드 (2.5%), 파라포름알데히드 (2.0%), 0.1M 나트륨카코딜산염 (pH7.2)를 포함하는 고정액으로 4℃에서 3시간 동안 1차 고정시켰다. 1차 고정된 세포는 폴리-L-리신 (poly-L-lycine)으로 코팅된 슬라이드 위에 부착시켰다. 2차 고정은 페리시안화 칼륨 (1.5%), 사산화 오스뮴 (1.0%), 0.1M 나트륨 카코딜산염 (pH 7.2)을 사용하여 4℃에서 3시간 동안 고정시켰다. 2차 고정을 마친 시료는 에탄올의 함량(50, 60, 70, 80, 90 및 95%)을 달리하며 건조시킨 다음, 헥사메틸 디실라잔을 이용하여 2회 재건조시켰다. 마지막으로 건조된 세포는 150초 동안 30mA에서 금으로 스퍼터 (sputter) 코팅되었고, 주사전자현미경을 이용하여 12kV에서 미세구조를 관찰하였다.

그 결과 도 1에 도시된 바와 같이 DSMZ은 과도하게 형성된 LPS로 인해 거친 표면을 가지는 반면 J2B는 매끈한 표면을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 7. 다양한 항생제에 대한 J2B 와 DSMZ 의 감수성 평가

다양한 항생제에 대한 J2B와 DSMZ의 감수성은 Kirby-Bauer 디스크 확산법을 사용하여 평가되었다. 균주들의 배양을 위해 한천 배지를 사용하였으며, 억제 영역은 CLSI의 지침서에 따라 37℃에서 18시간 동안 배양한 뒤 측정하였다.

그 결과 표 5에서 보는 바와 같이 J2B는 DSMZ보다 대부분의 항생제에 더 높은 감수성을 보였다.

실시예 8. J2B 와 DSM 의 침강성 조사

J2B와 DSMZ의 침강성을 비교하기 위해서 두 균주들은 24시간 동안 M9 배지에서 배양하였다. 배양된 세포는 같은 OD₆₀₀값을 가지도록 2.0mL 튜브에 준비하였으며 1분동안 4℃, 13000rpm에서 원심분리한 것과 10분 동안 같은 조건으로 원심분리한 것을 이용하여 침강성을 조사하였다.

그 결과 도 2에 도시된 바에서 알 수 있듯이 신규 분리균인 J2B의 경우 원심분리를 1분 동안 수행하였을 때도 펠렛이 쉽게 형성된 반면 대조균인 DSMZ의 경우 원심분리를 10동안 수행하였음에도 불구하고 여전히 펠렛이 형성되지 않았다.

또한 원심분리에 의해 형성된 펠렛의 형태 보존 정도를 조사하기 위해서 펠렛이 형성되어 있는 튜브를 상하로 뒤집으면서 펠렛의 재부유 정도를 확인하였다.

DSMZ의 펠렛은 쉽게 재부유되었으나 KpJ2B의 펠렛은 단단하게 형성되어 있어 쉽게 재부유 되지 않았다. 뿐만 아니라 DSMZ 균주와 비교하였을 때 J2B 균주는 점성이 낮은 것을 알 수 있었다.

실시예 9. J2B 균주를 숙주세포로 하는 알데하이드 디하이드로지네이즈의 클로닝 및 유전자 재조합 균주를 이용한 3- HP 생산 플라스크 실험

신규 균주 J2B를 숙주세포로 하여 알데하이드 디하이드로지네이즈를 과발현하는 유전자재조합균주가 제작되었다. 그리고 이를 이용하여 플라스크 규모에서 3-HP 생산을 연구하였다.

9-1. J2B 균주를 숙주세포로 하는 알데하이드 디하이드로지네이즈의 클로닝

아조스피릴리움 브라질렌스 (Azospirillum brasilense) 균주로부터 유래된 알데하이드 디하이드로지네이즈 유전자인 KGSADH를 과발현하기 위해 pQKS1 (Rathnasingh et al. 2009) 벡터를 사용하였다. 먼저 pUC19/puuC 벡터를 이용하여 제한효소 PciⅠ를 포함한 정방향 프라이머 (5'-ACA TGT TCT TTC CTG CGT TAT CCC CTG-3')와 KGSADH 유전자의 5 프라임 일부를 포함한 역방향 프라이머 (5'-GTA TAA GTC ACG TTA GCC ATA GCT GTT TCC TGT GTG-3')로 PCR를 수행하여 lacZ 프로모터와 KGSADH 유전자의 일부분을 가지는 PCR단편을 구축하였다. 그 후 pQKS1 (Rathnasingh et. al. 2009) 벡터를 주형으로 하고, lacZ프로모터 유전자의 3프라임 일부를 포함한 정방향 프라이머 (5'-CAC ACA GGA AAC AGC TAT GGC TAA CGT GAC TTA TAC-3')와 제한효소 HindⅢ를 포함한 역방향 프라이머 (5'-AAG CTT TCA GAC GGC CAT CAC CGT CAC CG-3')로 PCR를 수행하여 lacZ 프로모터의 일부분을 가지는 KGSADH PCR 단편을 제작하였다. 앞서 증폭된 PCR 단편은 lacZ프로모터와 제한효소 PciⅠ를 포함한 정방향 프라이머 (5'-ACA TGT TCT TTC CTG CGT TAT CCC CTG-3')와 KGSADH 유전자 및 제한효소 HindⅢ를 포함한 역방향 프라이머 (5'-AAG CTT TCA GAC GGC CAT CAC CGT CAC CG-3')로 오버랩핑 PCR이 수행되었다. 그 결과 lacZ 프로모터를 포함하는 KGSADH가 만들어 졌으며, 최종적으로 생성된 두 PCR 결과물은 pUC19/puuC벡터를 제한효소 PciⅠ과 HindⅢ로 절단하여 제작된 pUC19/Km^r 플라스미드에 각각 접합하였으며, 플라스미드는 pUC19/KGSADH로 명명하였다.

제작된 플라스미드는 전기천공법을 사용하여 E. coli DH5α에 도입되었으며, 50μg/mL 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 16 시간에 걸쳐 배양한 후, 형성된 콜로니들 중 몇 개를 선택하여 50μg/mL 카나마이신이 포함된 액체배지에 접종하였고, 37℃에서 16시간 동안 배양한 뒤 미니플렙 (miniprep) 방법으로 플라스미드를 얻었다.

9-2. 알데하이드 디하이드로지네이즈를 과발현하는 유전자재조합 J2B 균주를 이용한 3- HP 생산

J2B 야생형을 LB 고체배지에 도말하여 16시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜로니를 0.7mM EDTA가 포함된 LB 액체배지 10mL에 접종하여 200rpm 37℃진탕 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 0.7mM EDTA가 포함된 LB 액체배지에 0.01 OD₆₀₀가 되도록 접종하여 배양하였다. 약 2시간 후 OD₆₀₀가 0.2~0.3 정도가 되면 4℃, 5000rpm, 10분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 10mL로 세포를 두 차례 세척하고 10% 글리세롤 용액 100μl를 넣은 뒤 10분간 4℃ 아이스에 보관하였다.

상기 수득된 세포농축액에 pUC19/KGSADH 플라스미드를 도입하기 위해 18kV/cm, 25μF, 400Ω의 조건으로 전기천공법을 수행하였다. 전기충격 후 1mL의 뇌심장침출액 (Brain Heart Infusion) 배지를 가하여 37℃, 200rpm 진탕배양기에서 1시간 동안 배양한 뒤, 배양액을 50μg/mL 카나마이신이 포함된 고체배지에 도말하였다. 형성된 콜로니는 동일한 항생제가 함유된 LB 액체배지에서 12시간 이상 배양하였다.

상기 제작한 재조합 균주를 MgSO47H2O, 0.25 (g/L); NaCl, 1.0 (g/L); NH4Cl, 1.0 (g/L); 효모추출물, 1,0(g/L); 글리세롤, 9.2(g/L) 그리고 50μg/mL의 카나마이신을 첨가한 M9배지 (pH7.0)에서 배양하였다. 이 때 배양액의 pH를 유지시키기 위하여 100mM인산화 칼륨 완충 용액을 사용하였다. 세포는 50mL의 M9 배지를 포함하는 250mL 삼각플라스크를 사용하여 진탕배양기에서 온도 37℃, 교반속도 100rpm의 미호기조건으로 배양하였다. 이 후 단백질 유도 물질인 IPTG는 0.6 OD₆₀₀에서 1mM의 농도로 첨가되었으며, 배양시간은 24시간으로 하였다. 시료는 주기적으로 채취하여 건조균체량(CDW), 글리세롤, 1,3-PDO 및 3-HP을 분석하였으며, 최대성장속도 (μ_max)는 0시간에서 6시간 동안 측정되었다.

그 결과 도 5에 도시된 바와 같이 24시간 배양시간에 최대 35.8 mmol/L의 3-HP가 얻어졌으며, 15.7 mmol/L의 1,3-PDO가 생산되었다. 이때 최대성장속도 (μ_max)는 0.5h^- ¹ 였으며, 12시간 후에 OD₆₀₀는 3.3을 나타내었다. 또한 사용된 글리세롤 대비 생산된 3-HP의 비는 약 0.36 (수율 36%)이었다. 한편 동일한 방법으로 J2B 야생형을 배양하였을 때, 24시간 동안 1,3-PDO는 48.2 mmol/L만큼 생산된 반면 재조합 균주는 3-HP는 약 1.8 mmol/L 만이 생산되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11213P

20111014

Claims

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아조스피릴리움 브라질렌스(Azospirillum brasilense) 균주로부터 유래된 알데하이드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase) 유전자인, KGSADH 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 형질도입된 것을 특징으로 하는, 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 및 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid)을 생산하는 크렙시엘라 뉴모니애 J2B(Klebsiella pneumoniae J2B) (KCCM11213P) 재조합 균주.
삭제
제 4항에 있어서, 상기 벡터는 도 6의 개열지도 벡터인 것을 특징으로 하는 크렙시엘라 뉴모니애 J2B(Klebsiella pneumoniae J2B) (KCCM11213P) 재조합균주.
삭제
아조스피릴리움 브라질렌스(Azospirillum brasilense) 균주로부터 유래된 알데하이드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase) 유전자인, KGSADH 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
크렙시엘라 뉴모니애 J2B(Klebsiella pneumoniae J2B) (KCCM11213P)에 상기 재조합 벡터를 형질도입하여 재조합 균주를 생산하는 단계; 및
상기 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에 배양하는 단계를 포함하는 상기 재조합 균주를 이용한 1,3-프로판디올(1,3-propanediol) 및 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid)의 생산방법.