CN101883853A - 具有生产1，4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够生产1，4-丁二醇的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法。通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入和增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯和把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因来制备该突变体微生物。该方法包括在含有碳水化合物的培养基中培养该突变体，并由培养物获得1，4-丁二醇。因此，可以生物学方法制备化学工业中必需的1，4-丁二醇。

Description

具有生产1，4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法

技术领域

本发明涉及一种能够生产1，4-丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生物制备1，4-丁二醇的方法。

背景技术

可生物降解的聚合物已经被建议作为合成聚合物的替代品，合成聚合物是严重环境污染的重要原因之一。在目前正在开发的各种可生物降解的聚合物中，聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate)是各种微生物在营养不平衡状态下储存的一种可生物降解的聚合物，其具有优良的特性，如生物可降解性、水抗性、压电性和生物相容性。尤其是4-羟基丁酸酯，其是聚羟基链烷酸酯(PHA)的一个例子，具有聚酯样特性，并显示从结晶塑料到高弹性橡胶的特性的许多特性。因此，目前正在对微生物可生物降解的塑料进行大量研究。

此外，4-羟基丁酸酯可以很容易被转变成具有4个碳原子的各种化学制品，如1，4-丁二醇、γ-丁内酯(GBL)和THF。尤其是，1，4-丁二醇是一种以如聚合物、溶剂和精细化学制品中间体多种形式存在的重要的工业化学制品。虽然具有4个碳原子的大多数化学制品目前是从1，4-丁二醇、马来酐等等合成的，但是由于油价格的增加而导致的增加的生产成本，需要开发用于补偿和替代常规的化学生产方法的另一种方法。生物学方法已经被建议作为这种替代方法。

同时，琥珀酸(succinate)，具有4个碳原子的二羧酸，是在厌氧条件下培养微生物时产生的一种有机酸。现在，多种微生物被用作生产琥珀酸的细胞，而且由于有效的发酵方法以及分离和纯化方法的发展，它的生产成本变得更低。还可以由琥珀酸生产4-羟基丁酸酯，而且具有4个碳原子的各种有机酸可以源自4-羟基丁酸酯。

PCT公开第WO 2005/052135号是公开了一种有效生产琥珀酸的方法的专利申请的一个例子，其中，腔细菌(Lumen bacterial)突变体在不产生其他有机酸的情况下生产高浓度的琥珀酸，和一种使用该突变体制备琥珀酸的方法。另外，韩国专利申请第10-2004-60149中公开了一种制备能够生产高浓度的琥珀酸的大肠杆菌突变体的方法，并且韩国专利申请第10-2005-0076301号、第10-2005-0076317号和第10-2005-0076348号中公开了一种使用新基因制备琥珀酸的方法。

如上面所解释的，迫切需要一种能够生产1，4-丁二醇的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的生物学方法，1，4-丁二醇是一种具有4个碳原子的工业上重要的化学制品。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种能够高效生产1，4-丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生物制备1，4-丁二醇的方法。

技术方案

一个方面，提供了一种能够生产琥珀酸的微生物和使用该微生物制备1，4-丁二醇的方法，所述微生物优选为显示出高1，4-丁二醇产量的突变体，其中，引入或增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因和编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因。

另一个方面，提供了SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的丁基-辅酶A脱氢酶基因和具有该基因的重组载体，该基因将4-羟基丁基-辅酶A有效生产为1，4-丁二醇。

在下文中，将更详细地描述本发明。

作为使用能够生产琥珀酸的微生物制备1，4-丁二醇的努力的结果，本发明人通过在能够生产琥珀酸的微生物中诱导或增强与4-羟基丁酸酯生物合成相关的基因和/或与1，4-丁二醇生物合成相关的基因，开发了一种生产1，4-丁二醇的突变体微生物，并发现，该突变体微生物有效生产1，4-丁二醇。该发现导致了本发明。

这里使用的术语“增强”指与原始表达水平相比基因表达水平的增加。如果在突变之前微生物中没有待增强的基因，那么可以向该微生物中引入至少一个基因，然后增强。并且，如果在突变之前在微生物中有待增强的基因，可以通过如上所述的相同的方法向该微生物中引入至少一个基因，或者可以通过遗传工程技术对原来存在于微生物中的基因进行操作以增加基因表达。例如，当增强表达的基因存在于待突变的微生物中时，可以用更强的启动子代替用于操纵基因表达的原始启动子，从而增强基因表达。

能够生产琥珀酸的微生物可显示出高琥珀酸产量，该微生物优选为选自细菌、酵母和真菌中的一种，更特别地为细菌，例如，腔细菌(Lumen bacteria)、棒状杆菌(Corynebacterium species)、短杆菌(Brevibacterium species)和大肠杆菌(E.coli)。

所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因，并在厌氧条件下在不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

这里使用的术语“失活”指由于突变基因没有被转录，或者转录的mRNA没有适当地被翻译成原始蛋白质。为了使基因失去活性，可通过丢失基因或改变基因的核酸序列来进行突变。

此外，所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在厌氧条件下在基本上不生产其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

做为选择，所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

所述腔细菌可选自Mannheimia sp、放线杆菌(Actinobacillus sp.)和厌氧螺菌(Anaerobiospirillum sp.)，但是本发明不局限于这些例子。Mannheimia sp.是优选的，而且Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)、Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)、LPK4和LPK7(KCTC 10626BP)是更优选的。

所述大肠杆菌可具有失活的编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA和pykF)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。特别地，大肠杆菌突变体优选是在韩国专利公开第10-2006-0011345号中公开的W3110GFA。

在上述高浓度生产琥珀酸的微生物中，可以以PCT公开第WO 2005/052135号中公开的方法制备腔细菌。也就是说，使Mannheimia succiniciproducens 55E中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶基因(pfl)失活，从而构建突变株，也即Mannheimnia sp.LPK(KCTC 10558BP)。然后，在LPK株中，使磷酸转乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶的基因(ppc)分别失活，从而构建突变株(Mannheimia sp.LPK7和LPK4)，然后在厌氧条件下进行培养以高产量生产琥珀酸。

另外，在高浓度生产琥珀酸的微生物中，通过韩国专利公开第10-2006-0011345号中公开的方法构建大肠杆菌。也就是说，通过在用表达噬菌体red操纵子(exo-β-gam)的重组表达载体转化的W3110菌株中，使编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)的基因和编码丙酮酸激酶(pykA和pykF)的两个基因失活，来产生突变体大肠杆菌菌株W3110GFA。然后，当在厌氧条件下培养突变体大肠杆菌菌株W3110GFA时，可以证实突变体的生产率大于母本菌株W3110的生产率。

把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因和与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的酶的基因可以来源于科氏梭菌(Clostridium kluyveri)，而把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因可来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。虽然科氏梭菌和丙酮丁醇梭菌不生产4-羟基丁酸酯和1，4-丁二醇，但是在这些菌株中克隆的酶在生产4-羟基丁酸酯和1，4-丁二醇中发挥重要作用。

另外，把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因可选自编码琥珀酰辅酶A转移酶(Cat1)的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶(SucD)的基因、编码4-羟基丁酸脱氢酶(hbD)的基因、编码4-羟基丁酸脱氢酶(GHB)的基因。优选地，编码Cat1的基因具有SEQID NO：1的碱基序列，编码SucD的基因具有SEQ ID NO：2的碱基序列，编码4hbD的基因具有SEQ ID NO：3的碱基序列，以及编码GHB的基因具有SEQ ID NO：4的碱基序列。

例如，根据本发明的突变体微生物可以具有编码Cat1的基因、编码SucD的基因和编码4hbD的基因，或者编码Cat1的基因、编码SucD的基因和编码GHB的基因，但是本发明不局限于这些例子。

此外，琥珀酸的有效使用对实现本发明的目标是非常重要的，因此可以从高浓度生产琥珀酸的微生物重组大肠杆菌中除去与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)。因此，根据本发明的突变体微生物也可具有失活的与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的基因，其优选是编码琥珀酸GabD的基因。编码GabD的基因具有SEQ ID NO：10的碱基序列，但是本发明不局限于该序列。

同时，为了在微生物中有效转运琥珀酸，可以增强与琥珀酸的转运相关的C4-二羧酸转运蛋白(DctA)酶。因此，突变体微生物可另外具有编码与琥珀酸的转运相关的Dct4的基因，其被引入到突变体微生物中或被增强，而且编码Dct4的基因优选具有SEQ ID NO：11的碱基序列。

所述把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因可以是编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶和使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因，或者编码磷酸转丁酰酶、丁酰激酶和使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因。

所述编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因可以具有SEQ ID NO：5的碱基序列，其可以用磷酸转丁酰酶(ptb；SEQ ID NO：6)和丁酰激酶(BuK；SEQ ID NO：7)取代，以把4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A。

所述醇脱氢酶可以是来源于丙酮丁醇梭菌的丁基-辅酶A脱氢酶，而且编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因优选具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的碱基序列(CAP0035或CAP0162)。SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的基因对于在根据本发明的突变体微生物中生产1，4-丁二醇是非常有用的。因此，本发明提供了一种编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因和含有该基因的重组载体。

术语“载体”指含有与适于在合适的宿主中表达DNA的调控序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体。在本发明中，载体可包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、酵母人工染色体(YAC)载体，而且优选质粒载体。例如，质粒载体可以具有这样的结构，其包括(a)用于有效复制以在一个宿主细胞中具有几百个拷贝的复制起点，(b)用于筛选用该质粒载体转化了的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中能够插入外源DNA片段的限制性内切酶位点。即使没有适合的限制性内切酶位点，可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸适体或接头，很容易地连接载体与外源DNA。

因此，本发明提供了一种能够生产琥珀酸的微生物，且优选显示高1，4-丁二醇产量的突变体微生物，其中，使编码GabD的基因失活，而且引入或增强编码Cat1的基因、编码SucD的基因、编码4hbD(或GHB)的基因、编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因和编码丁基辅酶A脱氢酶的基因的全部。

此外，本发明提供了一种能够生产琥珀酸的微生物，且优选显示高1，4-丁二醇产量的突变体微生物，其中，引入或增强编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因(或编码磷酸转丁酰酶的基因和编码丁酰激酶的基因)和编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因，以及使用该微生物制备1，4-丁二醇的方法。

本发明进一步提供了一种制备1，4-丁二醇的方法，其包括在含有碳源的培养基中培养该突变体，并从所述培养物中获得1，4-丁二醇。

有益效果

如上面详细描述的，本发明提供了一种能够高浓度生产琥珀酸的微生物，且更优选地，一种显示高1，4-丁二醇产量的突变体以及使用该微生物制备1，4-丁二醇的生物学方法，1，4-丁二醇是一种具有4个碳原子的化学制品，其在化学工业中具有广泛的重要应用。

附图说明

图1是由琥珀酸生产4-羟基丁酸酯的途径的示意图；

图2是通过由琥珀酸产生的4-羟基丁酸酯生产1，4-丁二醇的途径的示意图；和

图3显示了1，4-丁二醇产物的GC分析结果。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。本领域技术人员将清楚理解，提供实施例只是为了解释本发明，而不是为了限制它的范围。

同时，在本发明中，制备1，4-丁二醇的方法使用腔细菌(如突变体Mannheimiasp.LPK(KCTC 10558BP)、LPK7和LPK4，其具有来源于Mannheimia sp.菌株的失活基因并高浓度生产琥珀酸)、大肠杆菌和突变体大肠杆菌W3110GFA，本领域技术人员将清楚理解，可以使用另一种腔细菌菌株，通过产生高浓度生产琥珀酸的突变体，并引入和增强与生产1，4-丁二醇相关的基因来生产1，4-丁二醇。

另外，下面的实施例提供了具体的培养基和培养方法，本领域技术人员将清楚地理解，如文献(Lee等人，Bioprocess Biosyst.Eng.，26：63，2003；Lee等人，Appl.Microbiol.Biotechnol，58：663，2002；Lee等人，Biotechnol.Lett，25：111，2003；Lee等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.54：23，2000；以及Lee等人，Biotechnol.Bioeng.，72：41，2001)中所公开的，这里使用的培养基可以不同于水解物(如乳清或玉米浆)，或者可以使用不同的培养方法(如加料分批培养和连续培养)。

实施例1：制备显示出高琥珀酸产量的微生物的方法

1-1.具有高琥珀酸产量的腔细菌的制备

通过PCT公开第WO 2005/052135号中公开的方法制备根据本发明的微生物，腔细菌，其显示出高琥珀酸产量。也就是说，通过使Mannheimia succiniciproducens55E(一种腔细菌)中的乳酸脱氢酶(ldhA)的基因和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因失活来制备突变株Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)，并通过使LPK菌株中的磷酸转乙酰酶(pta)的基因、乙酸激酶(ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因失活制备突变株(Mannheimia sp.LPK7和LPK4)。

1-2.显示出高琥珀酸产量的大肠杆菌的制备

通过韩国专利公开第10-2006-0011345号中公开的方法制备根据本发明的微生物，大肠杆菌，其显出示高琥珀酸产量。就是说，通过使W3110菌株中编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)的基因和编码丙酮酸激酶(pykA和pykF)的两个基因失活，来产生突变体大肠杆菌菌株W3110GFA，W3110菌株用表达噬菌体red操纵子(exo-β-gam)的重组表达载体pTrcEBG转化。

实施例2：1，4-丁二醇转变酶的克隆

2-1.编码4-羟基丁酸酯转变酶(Cat1、SucD和4hbD)的基因的克隆

本发明人使用基于已知的基因序列(L21902)合成的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，扩增了cat1、sucD和4hbD基因，以便克隆编码来源于科氏梭菌DSM 555的Cat1、SucD和4hbD的基因的操纵子。用于PCR的引物如下。

SEQ ID NO 12：Cat1f-SacI

5′-tttcccgagctc TGTGAGGCGATTAAATGAGTAAAGGGATAAAG

SEQ ID NO 13：4hbDb-XabI

gc tctaga tta gat aaa aaa gag gac att tca caa tat gg

为了构建表达载体pTacLac4HBl，将扩增的cat1、sucD和4hbD基因的操纵子插入到表达载体pTacLacI中，其用SacI/XbaI切割。通过用SspI切割载体pTac99A(Parkand Lee，J Bacteriol.185，5391-5397，2003)，并连接该切割的载体与也用SspI切割的pTrc991(Amersham Pharmacia Biotech)来构建载体pTacLacI。载体pTacLacI具有与pTrc99A相同的序列，而且丢失了存在于pTrc99A中的来自多克隆位点(MCS)的NcoI限性内切酶识别位点(限制性位点)。此时，MCS从EcoRI位点开始。

2-2.编码与琥珀酸转运相关的DctA的基因的克隆

为了克隆大肠杆菌W3110中编码与琥珀酸转运相关的DctA的基因，使用基于已知的基因序列(NC_000913)合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增DctA基因。用于PCR的引物如下。

SEQ ID NO 14：DctAf-EcoRI

ggaattc ATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGC

SEQ ID NO 15：DctAb-XbaI

gc tctaga tta aga gga taa ttc gtg cgt ttt gcc

为了构建表达载体p 10499DctA，用EcoRI/XbaI切割扩增的DctA基因，然后插入到表达载体p10499A(Park等人.(2002)FEMS Microbiol.Lett 214：217-222)中。

2-3.编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因的克隆

为了克隆SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因，丁基-辅酶A脱氢酶是丙酮丁醇梭菌中把丁酸转变成丁醇的酶，使用基于已知的基因序列(NC_003030)合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增cap0035和cap0162基因。用于PCR的引物如下。

SEQ ID NO：16：CAP0035f-SacI

tttcccgagctc atgaaagttacaaatcaaaaa

SEQ ID NO：17：CAP0035b-XbaI

gc tctaga tta aaa tgc ttt tat ata gat

SEQ ID NO：18：CAP0162f-EcoRI

GGAATT C atgaaagtcacaacagtaaag

SEQ ID NO：19：CAP0162b-XbaI

gc tctaga tta agg ttg ttt ttt aaa

为了构建表达载体pTacLacCAP35和pTacLacCAP 162，将扩增的cap0035和cap0162基因独立地插入到表达载体pTacLacI中，该表达载体用SacI/XbaI和EcoRI/XbaI切割。

为了把4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A，使用基于SEQ ID NO：5的序列合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增SEQ ID NO：5的Cat2基因的操纵子。用于PCR的引物如下。

SEQ ID NO：20：cat2f-EcoRI

ggaattc ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAG

SEQ ID NO：21：cat2b-BamHI

cg ggatcc tta aaa tct ctt ttt aaa ttc att cat taa tg

为了构建表达载体pTacLacCat2，把扩增的cat2基因插入到表达载体pTacLacI中，其用EcoRI/BamHI切割。

为了把4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A，使用基于SEQ ID NO：6和SEQID NO：7的序列合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7的ptb和buk基因的操纵子。用于PCR的引物如下。

SEQ ID NO：22：ptbf-RcoRI

ggaattc ATGATTAAGAGTTTTAATGAAATATCATG

SEQ ID NO：23：bukb-XbaI

gc tctaga tta ttt gta ttc ctt agc ttt ttc ttc tcc

为了构建表达载体，把扩增的ptb和buk基因的操纵子插入到表达载体pTacLacI中，其用EcoRI/XbaI切割，从而获得pTacLacPtbBuk。用SspI切割载体pTacLacPtbBuk，以获得包括tac启动子、ptb和buk基因和转录终止子的基因片段，并把该基因片段插入到载体pBBR1MCS2(Kovach等人，Gene.166：175，1995)中，其用EcoRV切割，从而获得载体pMCS2TacPtbBuk。

实施例3：1，4-BDO的产生

载体pTacCAP162和pMCS2Tacptbbuk用大肠杆菌XL1-Blue通过电穿孔同时转化，然后铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml醌那霉素的LB平板上，并于37℃培养过夜。把培养的克隆接种到具有3ml LB液体培养基(包含100μg/ml氨苄青霉素)的15ml管(Falcon，USA)中，并以200rpm于37℃在振动孵育箱中生长过夜。将孵育的细胞接种到新鲜的LB液体培养基(含有100ml 2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)中，然后以200rpm于37℃生长于振动孵育箱中。当OD₆₀₀达到0.7时，以1mM的终浓度添加IPTG来诱导蛋白表达，并且将细胞培养过夜。

然后，离心培养物，并从其中除去上清液。然后，将细胞沉淀用MR培养基洗涤一次，重悬于包含50ml 2％葡萄糖和2％γ-羟基丁内酯和1mM IPTG的MR培养基中，并使用5％H₂、5％CO₂和余量N₂的气体混合物起绒毛30分钟以建立厌氧条件。培养物以200rpm于37℃在振动孵育箱中生长过夜，并持续大约3天，然后离心培养物以获得上清液。获得的上清液浓缩两次，并用作GC分析样品用于分析，以证实1，4-丁二醇的产生。在下列条件下进行分析，且结果示于图3中。

柱：AT-Waw(0.53mm ID x 15ml，1.2um u.f.毛细管)

气体流速：柱(He)：4.0ml/min

烘箱温度：初始值&时间：50℃，5min

编程速率：10℃/min

终值&时间：250℃，5min

喷射器温度：250℃

检测器温度：250℃

喷射器分流比：20/1

喷射器体积：1.0μl

如图3所示，证实产生了1，4-丁二醇。

虽然已经参考其某些实施例显示和描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以多种形式和细节对其进行各种改变，而不背离如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>LG化学株式会社

韩国科学技术院

 

<120>具有生产1，4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法

<130>IP10-0298-XC37

 

<150>KR10-2007-0091081

<151>2007-09-07

 

<160>23

 

<170>KopatentIn 1.71

 

<210>1

<211>1617

<212>DNA

<213>Cat1编码基因

 

<400>1

atgagtaaag ggataaagaa ttcacaattg aaaaaaaaga atgtaaaggc tagtaatgtg     60

gcagaaaaga ttgaagagaa agttgaaaaa acagataagg ttgttgaaaa ggcagctgag    120

gttactgaaa aacgaattag aaacttgaag cttcaggaaa aagttgtaac agcagatgtg    180

gcagctgata tgatagaaaa cggtatgatt gttgcaatta gcggatttac tccttccggg    240

tatcctaaag aagtacctaa agcattgact aaaaaagtta atgccttaga ggaagaattc    300

aaggtaacac tttatacagg ttcatctaca ggagccgata tagacggaga atgggcaaaa    360

gcaggaataa tagaaagaag aattccatat cagacaaatt ctgatatgag gaaaaaaata    420

aatgatggtt ctattaagta tgctgatatg catttaagcc atatggctca atatattaat    480

tattctgtaa ttcctaaagt agatatagct ataatagagg cagtagctat tacagaagaa    540

ggggatatta ttccttcaac aggaattgga aatacagcta cttttgtgga aaatgcagat    600

aaggtaatag tggaaattaa tgaggctcaa ccgcttgaat tggaaggtat ggcagatata    660

tatacattaa aaaaccctcc aagaagagag cccataccta tagttaatgc aggcaatagg    720

atagggacca catatgtgac ctgtggttct gaaaaaatat gcgctatagt gatgacaaat    780

acccaggata aaacaagacc tcttacagaa gtgtctcctg tatctcaggc tatatccgat    840

aatcttatag gatttttaaa taaagaggtt gaagagggaa aattacctaa gaacctgctt    900

cctatacagt caggagttgg aagtgtagca aatgcagttt tggccggact ttgtgaatca    960

aattttaaaa atttgagttg ttatacagaa gttatacagg attctatgct gaagcttata   1020

aaatgtggta aagcagatgt ggtgtcaggc acttccataa gtccttcacc ggagatgttg   1080

cctgagttca taaaggacat aaatttcttt agagaaaaga tagtattaag accacaggaa   1140

ataagtaata atccagagat agcaagaaga ataggagtta tatccataaa cactgctttg   1200

gaagtagata tatatggtaa tgtaaactcc actcatgtta tgggaagcaa aatgatgaat   1260

ggtataggcg gttctggaga ctttgccaga aatgcatatt tgactatatt cactacagag   1320

tctatcgcca aaaaaggaga tatatcatct atagttccta tggtatccca tgtggatcat   1380

acagaacatg atgtaatggt aattgttaca gaacagggag tagcagattt aagaggtctt   1440

tctcctaggg aaaaggccgt ggctataata gaaaattgtg ttcatcctga ttacaaggat   1500

atgcttatgg aatattttga agaggcttgt aagtcatcag gtggaaatac accacataat   1560

cttgaaaaag ctctttcctg gcatacaaaa tttataaaaa ctggtagtat gaaataa      1617

<210>2

<211>1419

<212>DNA

<213>SucD编码基因

 

<400>2

atgagtaatg aagtatctat aaaagaatta attgaaaagg caaaggcggc acaaaaaaaa     60

ttggaagcct atagtcaaga acaagttgat gtactagtaa aagcactagg aaaagtggtt    120

tatgataatg cagaaatgtt tgcaaaagaa gcagttgaag aaacagaaat gggtgtttat    180

gaagataaag tagctaaatg tcatttgaaa tcaggagcta tttggaatca tataaaagac    240

aagaaaactg taggcataat aaaagaagaa cctgaaaggg cacttgttta tgttgctaag    300

ccaaagggag ttgtggcagc tactacgcct ataactaatc cagtggtaac tcctatgtgt    360

aatgcaatgg ctgctataaa gggcagaaat acaataatag tagcaccaca tcctaaagca    420

aagaaagttt cagctcatac tgtagaactt atgaatgctg agcttaaaaa attgggagca    480

ccagaaaata tcatacagat agtagaagca ccatcaagag aagctgctaa ggaacttatg    540

gaaagtgctg atgtagttat tgctacaggc ggtgctggaa gagttaaagc tgcttactcc    600

agtggaagac cagcttatgg cgttggacct ggaaattcac aggtaatagt tgataaggga    660

tacgattata acaaagctgc acaggatata ataacaggaa gaaaatatga caatggaatt    720

atatgttctt cagagcaatc agttatagct cctgctgaag attatgataa ggtaatagca    780

gcttttgtag aaaatggggc attctatgta gaagatgagg aaacagtaga aaagtttaga    840

tcaactttat ttaaagatgg aaaaataaac agcaagatta taggtaaatc cgtccaaatt    900

attgcggatc ttgcaggagt aaaagtacca gaaggtacta aggttatagt acttaagggt    960

aaaggtgcag gagaaaaaga tgtactttgt aaagaaaaaa tgtgtccagt tttagtagca   1020

ttgaaatatg atacttttga agaagcagtt gaaatagcta tggctaatta tatgtatgaa   1080

ggagctggtc atacagcagg catacattct gacaatgacg agaacataag atatgcaaga   1140

actgtattac ctataagcag attagttgta aatcagcctg caactactgc tggaggaact   1200

gtattaccta taagcagatt agttgtaaat cagcctgcaa ctactgctgg aggaagtttc   1260

aataatggat ttaaccctac tactacacta ggctgcggat catggggcag aaacagtatt   1320

tcagaaaatc ttacttacga gcatcttata aatgtttcaa gaatagggta tttcaataaa   1380

gaagcaaaag ttcctagcta tgaggaaata tggggataa                          1419

 

<210>3

<211>1116

<212>DNA

<213>4hbD编码基因

 

<400>3

atgaagttat taaaattggc acctgatgtt tataaatttg atactgcaga ggagtttatg     60

aaatacttta aggttggaaa aggtgacttt atacttacta atgaattttt atataaacct    120

ttccttgaga aattcaatga tggtgcagat gctgtatttc aggagaaata tggactcggt    180

gaaccttctg atgaaatgat aaacaatata attaaggata ttggagataa acaatataat    240

agaattattg ctgtaggggg aggatctgta atagatatag ccaaaatcct cagtcttaag    300

tatactgatg attcattgga tttgtttgag ggaaaagtac ctcttgtaaa aaacaaagaa    360

ttaattatag ttccaactac atgtggaaca ggttcagaag ttacaaatgt atcagttgca    420

gaattaaaga gaagacatac taaaaaagga attgcttcag acgaattata tgcaacttat    480

gcagtacttg taccagaatt tataaaagga cttccatata agttttttgt aaccagctcc    540

gtagatgcct taatacatgc aacagaagct tatgtatctc caaatgcaaa tccttatact    600

gatatgttta gtgtaaaagc tatggagtta attttaaatg gatacatgca aatggtagag    660

aaaggaaatg attacagagt tgaaataatt gaggattttg ttataggcag caattatgca    720

ggtatagctt ttggaaatgc aggagtggga gcggttcacg cactctcata tccaataggc    780

ggaaattatc atgtgcctca tggagaagca aattatctgt tttttacaga aatatttaaa    840

acttattatg agaaaaatcc aaatggcaag attaaagatg taaataaact attagcaggc    900

atactaaaat gtgatgaaag tgaagcttat gacagtttat cacaactttt agataaatta    960

ttgtcaagaa aaccattaag agaatatgga atgaaagagg aagaaattga aacttttgct   1020

gattcagtaa tagaaggaca gcagagactg ttggtaaaca attatgaacc tttttcaaga   1080

gaagacatag taaacacata taaaaagtta tattaa                             1116

 

<210>4

<211>1460

<212>DNA

<213>GHB编码基因

 

<400>4

gaattgtgaa cgatcgctcg attttagtat gatgccagat gttccaggtg cccggcagta     60

cgagataacc ccgaaaagtc gctgtcagcc tgccacgcgg caagtttttg cgcgatgatc    120

ggctgaagcg gtcccgaggg ctccggaaac gcagtagtgc aggtccattg aaacccaaga    180

cagcgggcct ggcgagcatc cgctccaggc ccgtgcaaaa gacaatttgg cggcagatcc    240

cggcaggaga caagcaaaca tggcgtttat ctactatctg acccacatcc acctggattt    300

cggcgcggta agcctgctca agtccgaatg cgagcgcatc ggcatccgcc gcccgttgct    360

ggtgaccgac aagggcgtgg tcgccgcggg agtggcgcag cgtgccatcg atgcaatgca    420

gggcctgcag gttgcggtat tcgatgaaac cccgtcgaac ccgaccgagg ccatggtgcg    480

caaggccgcc gcacaatacc gcgaggccgg ctgcgacggg ctggtggcag tgggcggcgg    540

ctcgtcgatc gacctcgcca agggcatcgc catcctggcc acgcatgagg gcgagctgac    600

cacctatgcc accatcgaag gcggcagcgc caggatcacc gacaaggcgg cgccgctgat    660

cgcggtgccc accacctcgg gcaccggcag cgaggtggcg cgcggcgcca tcatcatcct    720

ggacgacggc cgcaagctgg gcttccattc ctggcatttg ctgcccaagt ccgccgtctg    780

cgacccggaa ctgacgctgg ggctgccggc cgggctgacc gcggccaccg gcatggatgc    840

gatcgcgcac tgcatcgaga ccttcctggc ccccgccttc aacccgcccg cggacggcat    900

tgcgctggac gggctggagc gcggctgggg ccatatcgaa cgcgccaccc gcgacggtca    960

ggaccgcgac gcacgcctga acatgatgag cgcgtcgatg cagggcgcaa tggcgttcca   1020

gaaggggctg ggctgcgtgc attcgctgtc gcacccgctg ggcgggctga agatcgacgg   1080

ccgcaccggc ctgcaccacg gcacgctcaa cgcggtggtg atgccggcgg tgctgcgctt   1140

caacgccgat gcgcccacgg tggtgcgcga cgaccgctac gcacgcctgc gccgcgccat   1200

gcacctgccc gacggcgccg atatcgcgca ggccgtgcac gacatgaccg tgcgcctggg   1260

cctgcccacc gggctgcgtc agatgggtgt caccgaggac atgttcgaca aggtgattgc   1320

cggtgcgctg gtcgaccatt gccacaagac caacccgaaa gaagccagcg ccgcggatta   1380

tcggcgtatg cttgagcagt ccatgtagca cacagcggct tcccgccggt cagaccgacc   1440

aagcggctgt ccggcggccc                                               1460

 

<210>5

<211>1290

<212>DNA

<213>4HB-辅酶A转移酶编码基因

 

<400>5

atggagtggg aagagatata taaagagaaa ctggtaactg cagaaaaagc tgtttcaaaa     60

atagaaaacc atagcagggt agtttttgca catgcagtag gagaacccgt agatttagta    120

aatgcactag ttaaaaataa ggataattat ataggactag aaatagttca catggtagct    180

atgggcaaag gtgtatatac aaaagagggt atgcaaagac attttagaca taatgctttg    240

tttgtaggcg gatctactag agatgcagta aattcaggaa gagcagttta tacaccttgt    300

tttttctatg aagtgccaag tttgtttaaa gaaaaacgtt tgcctgtaga tgtagcactt    360

attcaggtaa gtgagccaga taaatatggc tactgcagtt ttggagtttc caatgactat    420

accaagccag cagcagaaag tgctaagctt gtaattgcag aagtgaataa aaacatgcca    480

agaactcttg gagattcttt tatacatgta tcagatattg attatatagt ggaagcttca    540

cacccattgt tagaattgca gcctcctaaa ttgggagatg tagaaaaagc cataggagaa    600

aactgtgcat ctttaattga agatggagct actcttcagc ttggaatagg tgctatacca    660

gatgcggtac ttttattctt aaagaacaaa aagaatttag gaatacattc tgagatgata    720

tcagatggtg tgatggaact ggtgaaggca ggggttatca ataacaagaa aaagaccctc    780

catccaggca aaatagttgt aacattttta atgggaacaa aaaaattata tgattttgta    840

aacaataatc caatggtaga aacttattct gtagattatg taaataatcc actggtaatt    900

atgaaaaatg acaatatggt ttcaataaat tcttgtgttc aagtagactt aatgggacaa    960

gtatgttctg aaagtatagg attgaaacag ataagtggag tgggaggcca ggtagatttt   1020

attagaggag ctaatctatc aaagggtgga aaggctatta tagctatacc ttccacagct   1080

ggaaaaggaa aagtttcaag aataactcca cttctagata ctggtgctgc agttacaact   1140

tctagaaatg aagtagatta tgtagttact gaatatggtg ttgctcatct taagggcaaa   1200

actttaagaa atagggcaag agctctaata aatatcgctc atccaaaatt cagagaatca   1260

ttaatgaatg aatttaaaaa gagattttag                                    1290

 

<210>6

<211>906

<212>DNA

<213>Ptb编码基因

 

<400>6

gtgattaaga gttttaatga aattatcatg aaggtaaaga gcaaagaaat gaaaaaagtt     60

gctgttgctg tagcacaaga cgagccagta cttgaagcag taagagatgc taagaaaaat    120

ggtattgcag atgctattct tgttggagac catgacgaaa tcgtgtcaat cgcgcttaaa    180

ataggaatgg atgtaaatga ttttgaaata gtaaacgagc ctaacgttaa gaaagctgct    240

ttaaaggcag tagagcttgt atcaactgga aaagctgata tggtaatgaa gggacttgta    300

aatacagcaa ctttcttaag atctgtatta aacaaagaag ttggacttag aacaggaaaa    360

actatgtctc acgttgcagt atttgaaact gagaaatttg atagactatt atttttaaca    420

gatgttgctt tcaatactta tcctgaatta aaggaaaaaa ttgatatagt aaacaattca    480

gttaaggttg cacatgcaat aggaattgaa aatccaaagg ttgctccaat ttgtgcagtt    540

gaggttataa accctaaaat gccatcaaca cttgatgcag caatgctttc aaaaatgagt    600

gacagaggac aaattaaagg ttgtgtagtt gacggacctt tagcacttga tatagcttta    660

tcagaagaag cagcacatca taagggagta acaggagaag ttgctggaaa agctgatatc    720

ttcttaatgc caaacataga aacaggaaat gtaatgtata agactttaac atatacaact    780

gattcaaaaa atggaggaat cttagttgga acttctgcac cagttgtttt aacttcaaga    840

gctgacagcc atgaaacaaa aatgaactct atagcacttg cagctttagt tgcaggcaat    900

aaataa                                                               906

 

<210>7

<211>1068

<212>DNA

<213>Buk编码基因

 

<400>7

atgtatagat tactaataat caatcctggc tcgacctcaa ctaaaattgg tatttatgac     60

gatgaaaaag agatatttga gaagacttta agacattcag ctgaagagat agaaaaatat    120

aacactatat ttgatcaatt tcaattcaga aagaatgtaa ttttagatgc gttaaaagaa    180

gcaaacatag aagtaagttc tttaaatgct gtagttggaa gaggcggact cttaaagcca    240

atagtaagtg gaacttatgc agtaaatcaa aaaatgcttg aagaccttaa agtaggagtt    300

caaggtcagc atgcgtcaaa tcttggtgga attattgcaa atgaaatagc aaaagaaata    360

aatgttccag catacatagt tgatccagtt gttgtggatg agcttgatga agtttcaaga    420

atatcaggaa tggctgacat tccaagaaaa agtatattcc atgcattaaa tcaaaaagca    480

gttgctagaa gatatgcaaa agaagttgga aaaaaatacg aagatcttaa tttaatcgta    540

gtccacatgg gtggaggtac ttcagtaggt actcataaag atggtagagt aatagaagtt    600

aataatacac ttgatggaga aggtccattc tcaccagaaa gaagtggtgg agttccaata    660

ggagatcttg taagattgtg cttcagcaac aaatatactt atgaagaagt aatgaaaaag    720

ataaacggca aaggcggagt tgttagttac ttaaatacta tcgattttaa ggctgtagtt    780

gataaagctc ttgaaggaga taagaaatgt gcacttatat atgaagcttt cacattccag    840

gtagcaaaag agataggaaa atgttcaacc gttttaaaag gaaatgtaga tgcaataatc    900

ttaacaggcg gaattgcgta caacgagcat gtatgtaatg ccatagagga tagagtaaaa    960

ttcatagcac ctgtagttag atatggtgga gaagatgaac ttcttgcact tgcagaaggt   1020

ggacttagag ttttaagagg agaagaaaaa gctaaggaat acaaataa                1068

 

<210>8

<211>2577

<212>DNA

<213>丁基-辅酶A脱氢酶(cAP0035)编码基因

 

<400>8

atgaaagtta caaatcaaaa agaactaaaa caaaagctaa atgaattgag agaagcgcaa     60

aagaagtttg caacctatac tcaagagcaa gttgataaaa tttttaaaca atgtgccata    120

gccgcagcta aagaaagaat aaacttagct aaattagcag tagaagaaac aggaataggt    180

cttgtagaag ataaaattat aaaaaatcat tttgcagcag aatatatata caataaatat    240

aaaaatgaaa aaacttgtgg cataatagac catgacgatt ctttaggcat aacaaaggtt    300

gctgaaccaa ttggaattgt tgcagccata gttcctacta ctaatccaac ttccacagca    360

attttcaaat cattaatttc tttaaaaaca agaaacgcaa tattcttttc accacatcca    420

cgtgcaaaaa aatctacaat tgctgcagca aaattaattt tagatgcagc tgttaaagca    480

ggagcaccta aaaatataat aggctggata gatgagccat caatagaact ttctcaagat    540

ttgatgagtg aagctgatat aatattagca acaggaggtc cttcaatggt taaagcggcc    600

tattcatctg gaaaacctgc aattggtgtt ggagcaggaa atacaccagc aataatagat    660

gagagtgcag atatagatat ggcagtaagc tccataattt tatcaaagac ttatgacaat    720

ggagtaatat gcgcttctga acaatcaata ttagttatga attcaatata cgaaaaagtt    780

aaagaggaat ttgtaaaacg aggatcatat atactcaatc aaaatgaaat agctaaaata    840

aaagaaacta tgtttaaaaa tggagctatt aatgctgaca tagttggaaa atctgcttat    900

ataattgcta aaatggcagg aattgaagtt cctcaaacta caaagatact tataggcgaa    960

gtacaatctg ttgaaaaaag cgagctgttc tcacatgaaa aactatcacc agtacttgca   1020

atgtataaag ttaaggattt tgatgaagct ctaaaaaagg cacaaaggct aatagaatta   1080

ggtggaagtg gacacacgtc atctttatat atagattcac aaaacaataa ggataaagtt   1140

aaagaatttg gattagcaat gaaaacttca aggacattta ttaacatgcc ttcttcacag   1200

ggagcaagcg gagatttata caattttgcg atagcaccat catttactct tggatgcggc   1260

acttggggag gaaactctgt atcgcaaaat gtagagccta aacatttatt aaatattaaa   1320

agtgttgctg aaagaaggga aaatatgctt tggtttaaag tgccacaaaa aatatatttt   1380

aaatatggat gtcttagatt tgcattaaaa gaattaaaag atatgaataa gaaaagagcc   1440

tttatagtaa cagataaaga tctttttaaa cttggatatg ttaataaaat aacaaaggta   1500

ctagatgaga tagatattaa atacagtata tttacagata ttaaatctga tccaactatt   1560

gattcagtaa aaaaaggtgc taaagaaatg cttaactttg aacctgatac tataatctct   1620

attggtggtg gatcgccaat ggatgcagca aaggttatgc acttgttata tgaatatcca   1680

gaagcagaaa ttgaaaatct agctataaac tttatggata taagaaagag aatatgcaat   1740

ttccctaaat taggtacaaa ggcgatttca gtagctattc ctacaactgc tggtaccggt   1800

tcagaggcaa caccttttgc agttataact aatgatgaaa caggaatgaa atacccttta   1860

acttcttatg aattgacccc aaacatggca ataatagata ctgaattaat gttaaatatg   1920

cctagaaaat taacagcagc aactggaata gatgcattag ttcatgctat agaagcatat   1980

gtttcggtta tggctacgga ttatactgat gaattagcct taagagcaat aaaaatgata   2040

tttaaatatt tgcctagagc ctataaaaat gggactaacg acattgaagc aagagaaaaa   2100

atggcacatg cctctaatat tgcggggatg gcatttgcaa atgctttctt aggtgtatgc   2160

cattcaatgg ctcataaact tggggcaatg catcacgttc cacatggaat tgcttgtgct   2220

gtattaatag aagaagttat taaatataac gctacagact gtccaacaaa gcaaacagca   2280

ttccctcaat ataaatctcc taatgctaag agaaaatatg ctgaaattgc agagtatttg   2340

aatttaaagg gtactagcga taccgaaaag gtaacagcct taatagaagc tatttcaaag   2400

ttaaagatag atttgagtat tccacaaaat ataagtgccg ctggaataaa taaaaaagat   2460

ttttataata cgctagataa aatgtcagag cttgcttttg atgaccaatg tacaacagct   2520

aatcctaggt atccacttat aagtgaactt aaggatatct atataaaatc attttaa      2577

 

<210>9

<211>2589

<212>DNA

<213>丁基-辅酶A脱氢酶(CAP0162)编码基因

 

<400>9

atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa     60

aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg    120

gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc    180

ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat    240

aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata    300

gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca    360

atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca    420

agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt    480

ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat    540

ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct    600

tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat    660

gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat    720

ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta    780

aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc    840

cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat    900

actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa    960

gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct   1020

atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta   1080

ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata   1140

gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa   1200

ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga   1260

ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa   1320

accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt tggtttagag ttccacataa agtatatttt   1380

aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc   1440

tttatagtta ctgatagtga cccctataat ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata   1500

cttgagcacc tagatattga ttttaaagta tttaataagg ttggaagaga agctgatctt   1560

aaaaccataa aaaaagcaac tgaagaaatg tcctccttta tgccagacac tataatagct   1620

ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca aagctaatgt gggtactata tgaacatcca   1680

gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa tttatggaca taagaaagag aatatatact   1740

ttcccaaaac tcggtaaaaa ggctatgtta gttgcaatta caacttctgc tggttccggt   1800

tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta   1860

gcagattatg aaatgacacc aaatatggca attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg   1920

ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata gatgcactag taaatagtat agaagcatac   1980

acatccgtat atgcttcaga atacacaaac ggactagcac tagaggcaat acgattaata   2040

tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa   2100

atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt   2160

cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca   2220

ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct   2280

tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata   2340

aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa   2400

ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac   2460

ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct   2520

aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa   2580

caaccttaa                                                           2589

 

<210>10

<211>1449

<212>DNA

<213>GabD编码基因

 

<400>10

atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattaacgg ggaatggctg     60

gacgccaaca atggtgaagc catcgacgtc accaatccgg cgaacggcga caagctgggt    120

agcgtgccga aaatgggcgc ggatgaaacc cgcgccgcta tcgacgccgc caaccgcgcc    180

ctgcccgcct ggcgcgcgct caccgccaaa gaacgcgcca ccattctgcg caactggttc    240

aatttgatga tggagcatca ggacgattta gcgcgcctga tgaccctcga acagggtaaa    300

ccactggccg aagcgaaagg cgaaatcagc tacgccgcct cctttattga gtggtttgcc    360

gaagaaggca aacgcattta tggcgacacc attcctggtc atcaggccga taaacgcctg    420

attgttatca agcagccgat tggcgtcacc gcggctatca cgccgtggaa cttcccggcg    480

gcgatgatta cccgcaaagc cggtccggcg ctggcagcag gctgcaccat ggtgctgaag    540

cccgccagtc agacgccgtt ctctgcgctg gcgctggcgg agctggcgat ccgcgcgggc    600

gttccggctg gggtatttaa cgtggtcacc ggttcggcgg gcgcggtcgg taacgaactg    660

accagtaacc cgctggtgcg caaactgtcg tttaccggtt cgaccgaaat tggccgccag    720

ttaatggaac agtgcgcgaa agacatcaag aaagtgtcgc tggagctggg cggtaacgcg    780

ccgtttatcg tctttgacga tgccgacctc gacaaagccg tggaaggcgc gctggcctcg    840

aaattccgca acgccgggca aacctgcgtc tgcgccaacc gcctgtatgt gcaggacggc    900

gtgtatgacc gttttgccga aaaattgcag caggcagtga gcaaactgca catcggcgac    960

gggctggata acggcgtcac catcgggccg ctgatcgatg aaaaagcggt agcaaaagtg   1020

gaagagcata ttgccgatgc gctggagaaa ggcgcgcgcg tggtttgcgg cggtaaagcg   1080

cacgaacgcg gcggcaactt cttccagccg accattctgg tggacgttcc ggccaacgcc   1140

aaagtgtcga aagaagagac gttcggcccc ctcgccccgc tgttccgctt taaagatgaa   1200

gctgatgtga ttgcgcaagc caatgacacc gagtttggcc ttgccgccta tttctacgcc   1260

cgtgatttaa gccgcgtctt ccgcgtgggc gaagcgctgg agtacggcat cgtcggcatc   1320

aataccggca ttatttccaa tgaagtggcc ccgttcggcg gcatcaaagc ctcgggtctg   1380

ggtcgtgaag gttcgaagta tggcatcgaa gattacttag aaatcaaata tatgtgcatc   1440

ggtctttaa                                                           1449

 

<210>11

<211>1287

<212>DNA

<213>DctA编码基因

 

<400>11

atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt     60

attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc    120

ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc    180

attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac    240

tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag    300

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac    360

gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc    420

gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt    480

ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt    540

ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg    600

ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg    660

cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca    720

atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg    780

ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg    840

gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt    900

aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact    960

aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct   1020

aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg   1080

gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca   1140

gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag   1200

tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat   1260

ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa                                       1287

 

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>Catlf-SacI引物

 

<400>12

tttcccgagc tctgtgaggc gattaaatga gtaaagggat aaag 44

 

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>4hbDb-XabI引物

 

<400>13

gctctagatt agataaaaaa gaggacattt cacaatatgg                              40

 

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>DctAf-EcoRI引物

 

<400>14

ggaattcatg aaaacctctc tgtttaaaag c                                       31

 

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>gctAb-XbaI引物

 

<400>15

gctctagatt aagaggataa ttcgtgcgtt ttgcc                                   35

 

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>CAP0035f-SacI引物

<400>16

tttcccgagc tcatgaaagt tacaaatcaa aaa                                    33

 

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>CAP0035b-XbaI引物

 

<400>17

gctctagatt aaaatgcttt tatatagat                                        29

 

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>CAP0162f-EcoRI引物

 

<400>18

ggaattcatg aaagtcacaa cagtaaag                                        28

 

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>CAP0162b-XbaI引物

 

<400>19

gctctagatt aaggttgttt tttaaa                                            26

 

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>cat2f-EcoRI引物

 

<400>20

ggaattcatg gagtgggaag agatatataa agag                                   34

 

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>cat2b-BamHI引物

 

<400>21

cgggatcctt aaaatctctt tttaaattca ttcattaatg                             40

 

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ptbf-EcoRI引物

 

<400>22

ggaattcatg attaagagtt ttaatgaaat tatcatg                                   37

 

<210>23

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>bukb-XbaI引物

 

<400>23

gctctagatt atttgtattc cttagctttt tcttctcc                                 38

Claims (32)

1.一种显示高1，4-丁二醇产量的突变体，其通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入或增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯和把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因来制备。

2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述能够生产琥珀酸的微生物选自显示出高琥珀酸产量的细菌、酵母和真菌中。

3.根据权利要求2所述的突变体，其中，所述细菌选自腔细菌、棒状杆菌、短杆菌和大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

5.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

6.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

7.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌选自Mannheimia species、放线杆菌和厌氧螺菌。

8.根据权利要求7所述的突变体，其中，所述腔细菌是Mannheimia species。

9.根据权利要求8所述的突变体，其中，所述腔细菌选自Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)和Mannheimia species LPK(KCTC10558BP)、LPK4和LPK7(KCTC 10626BP)中。

10.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述大肠杆菌具有失活的编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA和pykF)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。

11.根据权利要求10所述的突变体，其中，所述大肠杆菌突变体是W3110GFA。

12.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因来源于科氏梭菌。

13.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因选自编码琥珀酰辅酶A转移酶(Cat1)、琥珀酸半醛脱氢酶(SucD)、4-羟基丁酸脱氢酶(4hbD)和4-羟基丁酸脱氢酶(GHB)的基因中。

14.根据权利要求13所述的突变体，其中，所述编码Cat1的基因具有SEQ IDNO：1的碱基序列，所述编码SucD的基因具有SEQ ID NO：2的碱基序列，所述编码4hbD的基因具有SEQ ID NO：3的碱基序列，以及所述编码GHB的基因具有SEQID NO：4的碱基序列。

15.根据权利要求13所述的突变体，其中，所述突变体包含编码Cat1的基因；编码SucD的基因；和编码4hbD的基因或编码GHB的基因。

16.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因来源于丙酮丁醇梭菌。

17.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因是编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因和编码使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因；或者编码磷酸转丁酰酶的基因、编码丁酰激酶的基因和编码使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因。

18.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因具有SEQ ID NO：5的碱基序列。

19.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述编码磷酸转丁酰酶的基因和编码丁酰激酶的基因分别具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的碱基序列。

20.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述醇脱氢酶是来源于丙酮丁醇梭菌的丁基-辅酶A脱氢酶。

21.根据权利要求20所述的突变体，其中，所述编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的碱基序列。

22.根据权利要求1所述的突变体，其中，该突变体具有失活的与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的基因。

23.根据权利要求22所述的突变体，其中，所述与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的基因是编码琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)的基因。

24.根据权利要求23所述的突变体，其中，所述编码GabD的基因具有SEQ IDNO：10的碱基序列。

25.根据权利要求1所述的突变体，其中，在所述突变体中另外引入或增强编码与琥珀酸转运相关的C4-二羧酸转运蛋白(DctA)的基因。

26.根据权利要求25所述的突变体，其中，所述编码DctA的基因具有SEQ IDNO：11的大碱基序列。

27.一种显示高1，4-丁二醇产量的突变体，其通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入或增强编码Cat1的基因；编码SucD的基因；编码4hbD或GHB的基因；编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因或编码Ptb的基因和编码Buk的基因；和编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因而制备。

28.根据权利要求27所述的突变体，其中，在所述突变体中使编码GabD的基因失活。

29.根据权利要求27所述的突变体，其中，在所述突变体中引入或增强编码与琥珀酸转运相关的DctA的基因。

30.一种制备1，4-丁二醇的方法，包括：

在含有碳源的培养基中培养根据权利要求1到29中任一项所述的突变体；和

从所述培养基中收获1，4-丁二醇。

31.一种具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的碱基序列的丁基-辅酶A脱氢酶基因。

32.一种包含根据权利要求31所述的基因的重组载体。

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