CN104926930B - 出芽短梗霉二羧酸转运蛋白及其重组载体和应用 - Google Patents

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李正华
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Abstract

本发明公开了出芽短梗霉二羧酸转运蛋白及其重组载体和应用，出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，在出芽短梗霉中过表达二羧酸转运蛋白能够提高聚苹果酸产量，并且发酵液中未检测到游离的苹果酸，表明二羧酸转运蛋白基因与聚苹果酸的合成转运有关，为提高聚苹果酸的产量奠定了基础。

Description

出芽短梗霉二羧酸转运蛋白及其重组载体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，还涉及含有出芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体和出芽短梗霉二羧酸转运蛋白应用。
背景技术
聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物，由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作为药物载体与微胶囊材料、生物医学材料、吸水材料、化妆品、食品包装等材料，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单体为L-苹果酸，是一种优良的食品酸味剂和C4平台化合物，市场年需求在10万吨以上。
聚苹果酸主要由出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)合成并分泌到胞外，对聚苹果酸的生物合成途径研究表明，聚苹果酸可能由TCA循环产生的苹果酸为底物进行合成，然而苹果酸如何从线粒体转运及参与合成的聚苹果酸如何从胞内转运到胞外，尚未报道。聚苹果酸聚合物的转运过程不同于单体羧酸的转运，可能存在一些功能独特的转运蛋白参与。但是目前并无有关出芽短梗霉菌转运蛋白的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉二羧酸转运蛋白；本发明的目的之二在于提供含有出芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供含有重组载体的转化子；本发明的目的之四在于提供出芽短梗霉二羧酸转运蛋白在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用；本发明的目的之五在于提供重组载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
优选的，所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的基因组序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
2、含有所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体。
优选的，所述重组载体为在pBARGPE1质粒的EcoRV和XhoI酶切位点之间连入SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列而得。
3、含有所述重组载体的转化子，优选的，所述转化子为出芽短梗霉；更优选的，出芽短梗霉为CCTCC M2012223菌株。
4、所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
5、所述的重组载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明首次从真核生物出芽短梗霉克隆了5个涉及聚苹果酸有关的二羧酸转运蛋白的基因组序列，利用二羧酸转运蛋白的编码序列，构建过表达二羧酸转运蛋白的重组载体，将重组载体转化出芽短梗霉后可提高聚苹果酸发酵产量10-30％，同时发酵液中未检测到游离的苹果酸，表明过量表达的二羧酸转运蛋白基因与聚苹果酸的合成转运有关；由于聚苹果酸可进一步酸水解制备L-苹果酸，因此本发明过表达二羧酸转运蛋白，也可有效提高L-苹果酸的发酵产量。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为pBARGPE1质粒结构图。
图2为原生质体转化OE::g6666转化子基因组中草铵磷抗性基因bar检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明通过对公开号为102827778A的中国专利公开的高产聚苹果酸出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株CCTCC M2012223的全基因组测序分析，结合生物信息学相关知识预测获得5个可能与聚苹果酸合成转运有关的二羧酸转运蛋白基因的编码序列，基因序号分别为g1688，g4644，g6666，g5215和g6113，其基因组序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6～10所示。
然后设计引物从出芽短梗霉中成功克隆得到5个二羧酸转运蛋白的基因全长，并通过构建过表达载体，原生质体转化获得转化子，摇瓶和发酵罐发酵试验表明可有效提高聚苹果酸和苹果酸的发酵产量。
实施例1、克隆二羧酸转运蛋白基因
根据二羧酸转运蛋白基因的编码序列，设计克隆g1688，g4644，g6666，g5215和g6113的引物，为了便于构建重组载体，在上游引物的5’端设计EcoRV酶切位点，在下游引物的5’端设计XhoI酶切位点，具体的引物如表1所示。
表1、克隆二羧酸转运蛋白基因的引物
引物名称 序列5’-3’
g1688_up_EcoRV gcgcggatatcgtcgactcccataaaactgt(SEQ ID NO.11)
g1688_down_XhoI ccgctcgaggtctttcatcctctcacacc(SEQ ID NO.12)
g4644_up_EcoRV cgcgatatcttgccgctctcttttcagtagtct(SEQ ID NO.13)
g4644_down_XhoI ccgctcgagcgaaatcaatatagcgttggcgtt(SEQ ID NO.14)
g6666_up_EcoRV gcgcgatatccctttttttccccgccaatc(SEQ ID NO.15)
g6666_down_XhoI cggctcgagcggtcagaaccaatgtcg(SEQ ID NO.16)
g5215_up_EcoRV cgcgatatctgacacaccagagcaagacg(SEQ ID NO.17)
g5215_down_XhoI ccgctcgagtgaccattgaaaagcaccat(SEQ ID NO.18)
g6113_up_EcoRI ccggaattcaacgacccagtcacccacat(SEQ ID NO.19)
g6113_down_XhoI ccgctcgaggtcataattactccggccc(SEQ ID NO.20)
然后分别以g1688_up_EcoRV与g1688_down_XhoI，g4644_up_EcoRV与g4644_down_XhoI，g6666_up_EcoRV与g6666_down_XhoI，g5215_up_EcoRV与g5215_down_XhoI，g6113_up_EcoRI与g6113_down_XhoI为引物对，出芽短梗霉基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的退火温度为50-65℃，延伸时间为1min 45s。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示获得了与预期大小相同的条带。
实施例2、出芽短梗霉过表达g1688提高聚苹果酸产量
一、质粒构建
将实施例1克隆的g1688基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收g1688基因酶切片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPE1质粒(图1)，回收载体骨架。然后将回收的g1688基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选获得过表达g1688基因的重组表达载体pBARGPE1-g1644(简称为OE::g1688)。
二、OE::g1688转化出芽短梗霉
将OE::g1688制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/mL草铵磷为筛选压力经两次复筛得到OE::g1688转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL草铵磷的平板中，OE::g1688转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物检测OE::g1688转化子的g1688基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，PCR分析的引物为：bar.S：5’-tctgcaccatcgtcaaccact-3’(SEQ ID NO.21)，bar.A:5’-ctgccagaaacccacgtcat-3’(SEQ ID NO.22)；退火温度为59℃，延伸时间为35s。结果显示，草铵磷抗性基因bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。
三、OE::g1688转化子发酵
将OE::g1688转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、CaCO330g/L的发酵培养基中，然后在温度为25℃下220rpm，摇瓶发酵96小时，取样分析生物量；同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同条件下发酵，作为对照。结果显示，OE::g1644转化子生物量为23.4±0.6g/L，出芽短梗霉的生物量为22.6±1.3g/L，OE::g1644转化子聚苹果酸产量为48.6g/L，比对照株提高了17.4％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。
然后用5L发酵罐进行放大试验，结果表明，OE::g1644转化子发酵60小时，聚苹果酸产量为46.8g/L，比对照组提高了27.2％。
实施例3、出芽短梗霉过表达g6666提高聚苹果酸产量
一、质粒构建
将实施例1克隆的g6666基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收g6666基因酶切片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPE1质粒(图1)，回收载体骨架。然后将回收的g6666基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选获得过表达g6666基因的重组表达载体pBARGPE1-g6666(简称为OE::g6666)。
二、OE::g6666转化出芽短梗霉
将OE::g6666制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/mL天草铵磷为筛选压力经两次复筛得到OE::g6666转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL草铵磷的平板中，OE::g6666转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16为引物检测OE::g6666转化子的g6666基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，PCR分析的引物及扩增条件与实施例2相同，分析结果如图2所示。结果表明，草铵磷抗性基因bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。
三、OE::g6666转化子发酵
将OE::g6666转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、CaCO330g/L中发酵培养基中，然后在温度为25℃下220rpm，摇瓶发酵96小时，取样分析生物量；同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同条件下发酵，作为对照。结果显示，OE::g6666转化子生物量为21.9±0.5g/L，出芽短梗霉的生物量为22.6±1.3g/L，OE::g6666转化子聚苹果酸产量为47.7g/L，比对照株提高了17.2％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。
然后用5L发酵罐进行放大试验，结果表明OE::g6666转化子发酵60小时，聚苹果酸产量为44g/L，比对照组提高了19.6％。
实施例4、出芽短梗霉过表达g4644提高聚苹果酸产量
一、质粒构建
将实施例1克隆的g4644基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收g4644基因酶切片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPE1质粒(图1)，回收载体骨架。然后将回收的g4644基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选获得过表达g4644基因的重组表达载体pBARGPE1-g4644(简称为OE::g4644)。
二、OE::g4644转化出芽短梗霉
将OE::g4644制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/mL草铵磷为筛选压力经两次复筛得到OE::g4644转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL草铵磷的平板中，OE::g4644转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物检测OE::g4644转化子的g4644基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，PCR分析的引物及扩增条件与实施例2相同，结果如图2所示。结果表明，草铵磷抗性基因bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。
三、OE::g4644转化子发酵
将OE::g4644转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、CaCO330g/L发酵培养基中，然后在温度为25℃下220rpm，摇瓶发酵96小时，取样分析生物量；同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同条件下发酵，作为对照。结果显示，OE::g4644转化子生物量为20.4±1.1g/L，出芽短梗霉的生物量为22.6±1.3g/L，OE::g4644转化子聚苹果酸产量为45.4g/L，比对照株提高了8.8％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。
然后用5L发酵罐进行放大试验，结果表明OE::g4644转化子发酵60小时，聚苹果酸产量为42.8g/L，比对照组提高了16.3％。
实施例5、出芽短梗霉过表达g5215提高聚苹果酸产量
一、质粒构建
将实施例1克隆的g5215基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收g5215基因酶切片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPE1质粒(图1)，回收载体骨架。然后将回收的g5215基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选获得过表达g5215基因的重组表达载体pBARGPE1-g5215(简称为OE::g5215)。
二、OE::g5215转化出芽短梗霉
将OE::g5215制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/ml草铵磷为筛选压力经两次复筛得到OE::g5215转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL草铵磷的平板中，OE::g5215转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18为引物检测OE::g5215转化子的g5215基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，PCR分析的引物及扩增条件与实施例2相同，结果如图2所示。结果表明，草铵磷抗性基因bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。
三、OE::g5215转化子发酵
将OE::g5215转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、CaCO330g/L发酵培养基中，然后在温度为25℃下220rpm，摇瓶发酵96小时，取样分析生物量；同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同条件下发酵，作为对照。结果显示，OE::g5215转化子生物量为21.3±0.9g/L，出芽短梗霉的生物量为22.6±1.3g/L，OE::g5215转化子聚苹果酸产量为49.1g/L，比对照株提高了18.6％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。
然后用5L发酵罐进行放大试验，结果表明OE::g5215转化子发酵60小时，聚苹果酸产量为43.9g/L，比对照组提高了19.3％。
实施例6、出芽短梗霉过表达g6113提高聚苹果酸产量
一、质粒构建
将实施例1克隆的g6113基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收g6113基因酶切片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPE1质粒(图1)，回收载体骨架。然后将回收的g6113基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选获得过表达g6113基因的重组表达载体pBARGPE1-g6113(简称为OE::g6113)。
二、OE::g6113转化出芽短梗霉
将OE::g6113制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/mL草铵磷为筛选压力经两次复筛得到OE::g6113转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL山东维天草铵磷的平板中，OE::g6113转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20为引物检测OE::g6113转化子的g6113基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，PCR分析的引物及扩增条件与实施例2相同，结果如图2所示。结果表明，草铵磷抗性基因bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。
三、OE::g6113转化子发酵
将OE::g6113转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、CaCO330g/L发酵培养基中，然后在温度为25℃下220rpm，摇瓶发酵96小时，取样分析生物量；同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223在相同条件下发酵，作为对照。结果显示，OE::g6133转化子生物量为24.1±0.2g/L，出芽短梗霉的生物量为22.6±1.3g/L，OE::g6133转化子聚苹果酸产量为47.3g/L，比对照株提高了14.3％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。
然后用5L发酵罐进行放大试验，结果表明OE::g6133转化子发酵60小时，聚苹果酸产量为42.8g/L，比对照组提高了16.3％。
有上述实施例2～5可以看出在出芽短梗霉中过表达二羧酸转运蛋白能够提高聚苹果酸的产量。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，其特征在于：所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.编码权利要求1出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的基因，其特征在于：所述编码出芽短梗霉二羧酸转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.含有权利要求2所述编码出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pBARGPE1质粒的EcoRV和XhoI酶切位点之间连入SEQ ID NO.1所示序列而得。
5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的转化子。
6.根据权利要求5所述的转化子，其特征在于：所述转化子为出芽短梗霉。
7.权利要求1所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
8.权利要求3或4所述的重组表达载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。
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