CN106778062B - 出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用，出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型的构建包括网络数据库的建立、数据库的精炼和校准、数学模型的建立和模型的验证与分析四个步骤；构建获得的出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型能够对潜在提高聚苹果酸的基因靶点进行预测，为出芽短梗霉菌株的研究和全面分析提供了指导平台，为通过代谢工程改造出芽短梗霉获得高产聚苹果酸及普鲁兰多糖等代谢产物具有重要意义。

Description

出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用

技术领域

本发明属于系统生物学领域，具体涉及出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型；还涉及出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型在预测提高出芽短梗霉代谢物产量靶点基因中的应用及相应的方法。

背景技术

随着测序技术的不断发展，测序成本也不断降低，大量基因组学信息积累。如何高效地处理利用这些数据，从整体上研究生物体的整体生命过程成为了研究热点。基因组尺度代谢网络模型是组学信息应用的重要工具，基因组尺度代谢网络模型就是以基因组序列和注释信息为基础，通过基因-蛋白质-反应相互关系将生物体内所有的生化反应整合成一个整体数学模型，在整体层面上研究所有参与代谢过程的基因、蛋白质和反应物之间的相互作用。此外利用通量平衡分析(Flux Balance Analysis，FBA)通过约束条件、决策变量和目标函数的约束，模拟生物代谢过程，挖掘细胞代谢流量变化规律，为明确代谢节点和指导代谢工程改造提供依据。

出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)是一种类酵母真菌，由于许多亚种都产生黑色素而被俗称为“黑酵母”。它广泛分布于植物、海洋、冰川中，具有很强的适应性，发酵产生聚苹果酸、葡萄糖酸、普鲁兰多糖、酶制剂等多种代谢产物，其中聚苹果酸(Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全被生物降解的聚酯型聚合物，具有良好的水溶性，生物降解性、生物相容性和可修饰性，可作为药物载体、生物医学材料，此外在食品化工领域也具有广泛的应用前景。前期筛选分离到一株高产聚苹果酸生产菌株(A.pullulansCCTCC M2012223)，并完成了全基因组测序，获得了大量序列信息和注释信息。虽然自2003年基因组尺度代谢网络得到了快速发展，大量不同物种的基因组尺度代谢网络模型被公布，但是利用注释信息和文献信息构建出芽短梗酶菌的基因组尺度代谢网络模型，并利用基因组尺度代谢网络模型预测芽短梗酶菌代谢改造节点和分析生化代谢特点的研究尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型；本发明的目的之二在于提供所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型在预测提高出芽短梗霉代谢物产量靶点基因中的应用；本发明的目的之三在于提供利用所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型预测提高出芽短梗霉聚苹果酸产量靶点基因的方法；本发明的目的之四在于提供所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型指导下获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型，按以下方法构建：

(1)网络数据库的建立：根据出芽短梗霉全基因组测序结果和GO、KEGG、Uniprot数据库收集出芽短梗霉的基因注释信息，然后用VBA程序提取需要的出芽短梗霉菌的基因注释信息，添加聚苹果酸合成的特征反应，得到网络数据库；

(2)数据库的精炼和校准：从文献和数据库提取生物量组成模拟所需组分信息，将已有的网络数据库标准化，并建立物种特异的详细反应列表，并对网络反应进行手动精炼，得到精确的出芽短梗霉菌代谢网络模型数据库；

(3)数学模型的建立：将已有的数据库文件内容转化为转换成系统生物学语言格式的文件，然后通过基于Matlab平台的COBRA工具包读取将其转化为数学模型；

(4)模型的验证与分析：以Matlab平台的COBRA工具包进行通量平衡分析，GLPK为线性解包进行模拟计算。

本发明中出芽短梗霉可以为任意的出芽短梗霉，优选使用出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CCTCC NO：M2012223，也可以使用来源于美国农业部菌种保藏中心(NRRL)，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等机构保藏或自然分离产聚苹果酸的Aureobasidium属或Physarum菌种。

其获得的模型含有637个基因，1347个反应和1133个代谢物。

2、所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型在预测提高出芽短梗霉代谢物产量靶点基因中的应用。优选的，所述代谢物为聚苹果酸。

3、利用所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型预测提高出芽短梗霉聚苹果酸产量靶点基因的方法，根据已构建的出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型，以生物量合成反应为目标函数，逐渐增大聚苹果酸分泌反应，得到多组流量数据，并通过分析不同聚苹果酸合成率状态下的碳流量分配情况，及中心代谢反应流量变化趋势，确定靶点基因对出芽短梗霉聚苹果酸产量的影响。

4、所述出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型指导下获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉的方法，将出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因在出芽短梗霉中过表达即获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉。

优选的，克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因，然后构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体，再将重组载体利用农杆菌介导将含丙酮酸羧化酶基因的T-DNA整合入出芽短梗霉基因组中，经转录水平和发酵验证，最后获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉。

优选的，所述克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的方法如下：以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，出芽短梗霉基因组DNA为模版进行PCR扩增，获得出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因。

优选的，构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体的方法为：先将丙酮酸羧化酶基因连入真菌过表达载体pBARGPEI的Sma I和EcoR I酶切位点之间，获得重组表达载体pBARGPE1-pyc，然后以重组表达载体pBARGPE1-pyc为模板，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物连入pk2-PgpdA-hyg-TtrpC载体的EcoR I酶切位点处，得过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体。

更优选的，所述出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更优选的，所述出芽短梗霉为出芽短梗霉CCTCCM 2012223

本发明的有益效果在于：本发明首次利用基因注释信息构建了构建出芽短梗酶菌的基因组尺度代谢网络模型。并利用构建的因组尺度代谢网络模型，剖析了不同聚苹果酸转化率下代谢网络中的流量分配情况。实验证明，利用本发明的出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型预测的靶点基因，经改造得到的基因工程菌，5L发酵反应器发酵聚苹果酸产量比原始出发菌株提高了15.1％。为以后高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌株的构建、研究和分析提供了指导平台，同时对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖、黑色素、短梗霉素、酶制剂等代谢产物也具有指导意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为出芽短梗霉菌的基因组尺度代谢网络模型构建示意流程图。

图2为模型iZX637在以生物量为目的函数条件下，逐渐增加PMA输出速率丙酮酸羧化酶催化反应流量变化。

图3为pBARGPE1质粒结构图。

图4为pk2-Ptrpc-hyg-Ttrpc质粒结构图。

图5为OE::pyc转化子基因组中草铵磷抗性基因hyg检测结果。

图6为转录水平验证OE::pyc转化子pyc相对表达量

图7为5L发酵罐发酵检测结果对比图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明通过对公开号为102827778A的中国专利公开的高产聚苹果酸出芽短梗霉(A.pullulans)菌株CCTCC M2012223的全基因组测序分析，并整合基因组注释信息，构建基因组尺度代谢模型，并进行了分析，以下是具体实施例。

实施例1、出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型的构建

出芽短梗霉基因组尺度代谢模型的构建，包括网络数据库的建立、数据库的精炼和校准、数学模型的建立和模型的验证与分析四个步骤，具体如图1所示：

(1)网络数据库的建立：根据出芽短梗霉(A.pullulans)菌株CCTCC M2012223全基因组测序结果和GO、KEGG、Uniprot数据库收集出芽短梗霉的基因注释信息，然后用VBA程序提取需要的出芽短梗霉菌的基因注释信息，然后筛选出与聚苹果酸代谢相关的基因、酶和反应，并通过EC酶号进行相互关联，得到网络数据库；根据MetaCyc数据库和经验法则确定反应方向；

(2)数据库的精炼和校准：从文献和数据库提取生物量组成模拟所需组分信息，并根据出芽短梗霉菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的亲缘关系建立物种特异的详细反应列表，其中包括手性代谢物的标准化，对冗余和无效反应的剔除，大分子反应的处理，确定反应方向，添加传递反应，确定生物量合成反应以及gap填补，由此得到精确的出芽短梗霉菌代谢网络模型数据库；

(3)数学模型的建立：将已有的数据库文件内容转化为转换成系统生物学语言格式的文件，即SBML格式文档，然后通过基于Matlab平台的COBRA工具包读取将其转化为数学模型；

(4)模型的验证与分析：使用的方法是通量平衡分析(Flux Balance Analsis，FBA)以Matlab平台的COBRA工具包，GLPK为线性解包进行模拟计算。

实施例2、出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型特征：

基于上述方法，构建了出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型iZX637，模型含有637个基因，1347个反应和1133个代谢物，见表1，包含糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环，丙酮酸代谢，乙醛酸循环代谢，氨基酸合成与消耗代谢，核苷酸代谢，脂类代谢，肽聚糖合成，辅酶合成等相关反应。部分反应列举见表2。分配为八个细胞分室，所有反应依据KEGG的分类标准被分为了9个亚系统，9个亚系统又细分为59个代谢通路，模型信息列表如表1所示。然后并根据菌种特性及文献信息挖掘添加了聚苹果酸的合成及其分泌的相关反应，组成完整的聚苹果酸代谢通路，其中聚苹果酸合成途径反应列表如图3所示。

表1、模型信息列表

表2、部分核心反应列表

表3、聚苹果酸合成途径反应列表

实施例3、出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型应用及靶点筛选

利用已经构建的出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型iZX637，以生物量合成反应(反应ID：biomass)为目的函数，逐渐增大聚苹果酸分泌反应(反应ID：EXC117e)，将模拟的代谢流量统一保存，得到多组流量分配数据，筛选出随聚苹果酸分泌反应变化趋势一致和趋势相反的反应。然后分别以biomass和EXC117e反应为目的函数做单一反应删除模拟，统计删除后扰动结果。最后结果显示在高PMA合成率条件下，大量碳流汇集于丙酮酸(PYR)代谢物，并通过丙酮酸羧化酶催化进入还原性TCA循环，形成PMA聚合前体苹果酸。模拟结果显示丙酮酸催化反应随着PMA合成率增加，其流量逐渐增大。最后结合生物学意义，确定丙酮酸羧化酶基因(pyc)活性对聚苹果酸合成速率有显著影响，模拟结果如图2。

实施例4、利用出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型提高聚苹果酸产量验证

1、构建pyc的过表达载体

以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因组为模板，以Sma I-pyc-S和Mun I-pyc-A为引物扩增出pyc基因序列(SEQ ID NO.1)，Sma I-pyc-S和Mun I-pyc-A的引物序列如下所示：

Sma I-pyc-S：5’-atgcccgggatgatgtcggacattgaagctct-3’(SEQ ID NO.2)，下划线表示Sma I酶切位点；

Mun I-pyc-A：5’-gcgcaattggcgctatttgacgatcttgcaaatgagg-3’(SEQ ID NO.3)，下划线表示EcoR I同尾酶MunI酶切位点；

扩增获得含Sma I和Mun I酶切位点的pyc，命名为Sma I-pyc-Mun I；然后对并对PCR产物Sma I-pyc-Mun I和真菌过表达载体pBARGPEI分别进行Sma I、Mun I和Sma I、EcoRI双酶切，真菌过表达载体pBARGPEI结构如图3所示。然后回收pyc基因酶切片段和回收pBARGPEI载体骨架，最后然后将回收的pyc基因酶切片段与pBARGPE1质粒的载体骨架连接，获得重组表达载体pBARGPE1-pyc，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌株，保存，备用。

然后以pBARGPEI-pyc为模板，以PgpdA.pyc.TtrpC-S和PgpdA.pyc.TtrpC-A引物扩增出含有构巢曲霉PgpdA强启动子和TtrpC终止子的pyc表达框，命名为PgpdA-pyc-TtrpC。其中，PgpdA.pyc.TtrpC-S和PgpdA.pyc.TtrpC-A引物具体如下：

PgpdA.pyc.TtrpC-S：5’-attacgaattccccgggggatctggtgcactctcagtacaatc-3’(SEQ ID NO.4)；

PgpdA.pyc.TtrpC-A：5’-ggagcatacccaacactagtggatccccatctcataaataacgtcatg-3’(SEQ ID NO.5)。

使用EcoR I内切酶对pk2-PgpdA-hyg-TtrpC载体(简称pk2-hyg)进行单酶切，pk2-hyg图谱结构如图4所示，然后回收载体骨架，并将扩增获得的PgpdA-pyc-TtrpC连接入pk2-hyg载体的EcoR I酶切位点处，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子PCR验证并测序无误，即成功构建pyc的过表达载体，命名为pk2-hyg-PgpdA-pyc-TtrpC。

接着将构建好的过表达载体pk2-hyg-PgpdA-pyc-TtrpC转化根癌农杆菌(A.tumefaciens AGL-1)感受态细胞，以获得含有过表达载体pk2-hyg-PgpdA-pyc-TtrpC的AGL-1农杆菌。

2、农杆菌转化出芽短梗霉

利用农杆菌介导T-DNA插入方法将pk2-hyg-PgpdA-pyc-TtrpC的AGL-1农杆菌转化出芽短梗霉，转化后以100μg/mL潮霉素为筛选压力经两次复筛得到转化子，命名为OE::pyc，连续传5代后接种于含有100μg/mL潮霉素的平板中，OE::pyc转化子表现出潮霉素抗性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析，以hyg-S和hyg-A为引物，退火温度为52℃，检测OE::pyc转化子的hyg基因，其中hyg-S和hyg-A引物序列如下：

hyg-S：5’-gaaaaagcctgaactcaccgc-3’(SEQ ID NO.6)；

hyg-A：5’-ctatttctttgccctcggacg-3’(SEQ ID NO.7)；

检测结果如图5所示，结果显示T-DNA已经整合进入宿主基因组。

3、转录水平验证OE::pyc转化子pyc基因相对表达水平

通过对OE::pyc转化子提取总RNA，并反转录得到cDNA通过RT-qPCR分析，以β-Actin为内参基因，以act-S和act-A为内参基因引物，以pyc-S和pyc-A为pyc基因引物，退火温度为均为52℃，检测结果如图6所示，结果显示OE::pyc转化子pyc基因相对表达水平较对照组提高了9.6倍，差异极显著，过表达转化成功。

act-S：5’-gaagtgcgatgtcgatgtcaga-3’(SEQ ID NO.8)；

act-A：5’-ggagcaagggcggtgatt-3’(SEQ ID NO.9)；

pyc-S：5’-cagtgggcacagacaaagaagg-3’(SEQ ID NO.10)；

pyc-A：5’-accctcgaagaactcaaggacag-3’(SEQ ID NO.11)；

4、OE::pyc转化子5L发酵罐发酵验证

挑取PDA上活化好的菌种接种于含有葡萄糖60g/L、氯化铵2g/L、KH2PO4 0.2g/L、ZnSO4 0.15g/L、MgSO4 0.2g/L、CaCO3 30g/L种子培养基中，180rpm 25℃培养48h。接种300mL于5L发酵罐，装3L含葡萄糖90g/L、氯化铵2g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、ZnSO₄ 0.15g/L、MgSO₄0.2g/L、CaCO₃ 30g/L发酵培养基中，在温度为25℃下搅拌转速400-600rpm，通气量1.3vvm，发酵68小时，取样分析生物量、聚苹果酸浓度和残糖量，同时以出芽短梗霉CCTCC M2012223为对照，结果如图7所示。结果显示，OE::pyc转化子聚苹果酸产量为36.2g/L，比对照株提高了15.1％，并且在发酵上清液中未检测到游离的苹果酸。结果可以看出，在出芽短梗霉菌中过表达pyc能够提高聚苹果酸的产量，实验结果与模型分析结果一致，验证了出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型对代谢工程改造靶点的进行预测的准确性。

因此，可以利用本发明构建的出芽短梗霉菌基因组尺度代谢网络模型作为高产聚苹果酸菌株研究和分析平台。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 西南大学；安徽雪郎生物科技有限公司

<120> 出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型及其应用

<160> 11

<210> 1

<211> 3748

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）

<400> 1

atgtcggaca ttgaagctct caagagcttg aaggcctcca accccaacga ggaggccatt 60

gaagatggcg tcgacacaca ctcgcagaac acagtgcacg cccgtctgcg cgccaactcg 120

acagtcatga aggccaagaa gatcttgggt ataccatcac tcgatccgcg tcattcccaa 180

cacttgctga tctcatgata gtcgccaacc gtggtgagat ccccattcgt atcttccgta 240

ccgcacacga gctctcgcta caaacggtag ccgtgtacag tcacgaggac cgtctgtcca 300

tgcacagaca gaaggccgat gaagcctatg tcattggcaa gagaggagag tacacaccag 360

ttgctgctta cctcgcaatc gacgagattg tcaagatcgc caaggcacac aatgttaacc 420

tcattcaccc tggttatggt ttcttgagtg aaaacgccga gtttgctcgc aaggtcgagg 480

atgccggcat gatcgtaagt taggcagtct ctacaagccc cacgagacgg tcacattgac 540

accttatagt tcgttggtcc tacacctgaa accatcaccg ctcttggtga caaggtctct 600

gcccgtgagc tcgccatcaa gtgcaaggtt cccgtcgttc ccggtaccga cggccctgtc 660

gagaaatttg aagaagtcaa gagcttcacc gaccagcacg gattccccat catcatcaaa 720

gcagcctttg gtggtggtgg tcgtggtatg agagtcgtct ggaagcaaga ggagctcaag 780

gaggcctttg agcgtgccac atccgaggcc aagtctgcct tcggtaacgg taccgttttc 840

gtcgagcgct tcttgtaccg ccccaaacac attgaagtcc aacttctggg tgacagccac 900

ggtaacgttg ttcaccttta cgagcgtgac tgcagtgtcc aaagacgtca ccagaaggtt 960

gtcgagcttg ccccagcaaa ggacttgccc gaggagactc gccaggccat tttggacgac 1020

gctgtcaggt tggccaagtc ggtcaactac cgcaacgctg gtactgcaga gttcttggtt 1080

gaccagcaga accgccacta cttcattgag atcaacccta gaattcaggt cgagcatacc 1140

atcactgagg agattactgg catcgacatt gtcgctgctc aaatccatat cgccgcaggt 1200

gcatcgcttg agcagctggg tctcacccag gaccgcatct ccgtccgtgg tttcgccttc 1260

cagtgccgta tcaccaccga ggatcctgcc aagggtttcc aacccgacac tggcagaatc 1320

gaggtctacc gctccgctgg tggtaatgga gttcggtaag ttttcttgac actataccac 1380

gagtacctat gctgacttat ttcgaagttt ggacggaggc aacggctttg ctggcgctgt 1440

cattactcct cactacgata gcatgcttgt caagtgctcg tgccgtggct cgacctacga 1500

aatcgtccgc agaaagatgc ttcgtgcctt ggtcgagttc agaatccgtg gtgtcaagac 1560

caacattccc ttcttggcat ctctgctcac ccaccccacc ttcattgccg gcgagtgctg 1620

gactactttc atcgatgata cccctgagtt gttcgctctg gtcaacagtc agaaccgtgc 1680

ccagaagttg ctcgcctacc ttggtgacct cgccgtgaac ggcagtcaga tcaagggtca 1740

gattggtgag cctaagttca agggcgacat catcatccct accctgcacg acgagcagga 1800

caaggtcatt gatgtttcag aaccttgcaa gaagggttgg agaaacatta tcgtggagca 1861

gggtcccgca gctttcgcca aagccgtcag agccaacaag ggctgcttga tcatggatac 1920

cacatggaga gatgctcacc agtctcttct tgccaccaga gtccgtaccg tcgacttcct 1980

caacatcgcc aaggagacca gctatgctct cagcaacgcc tgggcccttg agtgctgggg 2040

tggtgctact ttcgatgttg ccatgcgctt cctttacgag gacccctggg acagactgcg 2100

caagatgaga aagcttgtgc ccaacattcc tttccagatg ctgctccgtg gtgccaacgg 2160

tgttgcttac tcatccttgc ctgacaatgc catcacccac ttctgtgagc aagcaaagaa 2220

gaacggtgtc gatattttcc gcgtctttga tgccttgaac gatgttgagc agcttgaggt 2280

cggtgtcaag gccgtcttga aggcaggtgg tgttgctgag ggtaccgtct gttactctgg 2340

cgacatgctc aaccccaaca agaagtacaa cctcgagtac tgcatgagcg ttgttgagaa 2400

gatcgtcaac atgggcgctc acatccttgg tatcaaggat atggctggtg ttctcaagcc 2460

caaggctgcc actatgttgg ttggtgctat cagaaagaag taccctgacc tgcctattca 2520

cgtgcacact cacgattccg ctggtactgg tgttgcttcg atggttgctt gtgcccaggc 2580

tggtgctgat gccgttgacg ctgccaccga cagcatgtct ggtatgacct ctcagcccag 2640

catcggtgct ctcgttgcat cccttgaggg tagtgaattt gaccctggtc tcaacgctca 2700

ccacctcaga atgattgacc actactgggc tcagctgcgt ctcctctact cacccttcga 2760

ggctggtctt actggccctg accctgaagt ctacgagcac gagatccctg gtggtcaact 2820

taccaacctc atcttccagg cctctcagca aggtctcggt gagcagtggg cacagacaaa 2880

gaaggcctac gaacaagcca acgacgtgct cggcgacatt gtcaaggtta ctcctacctc 2940

caaggttgtt ggtgatctcg cccagttcat ggtcagcaac aagctgagct acaacgatgt 3000

tcttgagaag gccgagcagc tcgacttccc ctcatctgtc cttgagttct tcgagggtct 3060

catgggtcag ccctacggtg gattccccga gcctctccgt accaaggctc ttcgtgagcg 3120

cagaaagatg aacaagcgac ctggtcccta cctcgagccc gtcaactttg acgaggttcg 3180

caacaagctc aaggagcagt tcggtggata caccgagacc gacgttgctt cgtacgtcat 3240

gtaccccaag gtgttcgagg atttcaagaa gtggacacag aagttcggtg acctttcagt 3300

tttgcctacc aagtacttct tggccaagcc tgagattggc gaggagttcc acgttgagct 3360

tgagaagggt aaggtgctca tcatcaagct tctggctatt gggccccttt ccgagcagac 3420

tggtcagaga gaggtctctt acgagatgaa cggtgaagtt cgtcaagtca ctgttgacga 3480

ccaacacgcc gctgttgaga acaagtcccg tagaaaggcc gacttgggtg acagcagcca 3540

ggtcggtgca cccatgagtg gtgtcgtggt cgagcttaga gtcaaggagg gcagcgaggt 3600

caacaagggt gatcctattg ccattctgag cgccatgaag atggagatgg tcatcagtgc 3660

acctcactct ggtaaggttg gcgagctcag tgtcaaggag tcggactctg tagacggcca 3720

ggacctcatt tgcaagatcg tcaaatag 3748

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Sma I-pyc-S

<400> 2

atgcccgggatgatgtcggacattgaagctct 32

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Mun I-pyc-A

<400> 3

gcgcaattggcgctatttgacgatcttgcaaatgagg 37

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PgpdA.pyc.TtrpC-S

<400> 4

attacgaattccccgggggatctggtgcactctcagtacaatc 43

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PgpdA.pyc.TtrpC-A

<400> 5

ggagcatacccaacactagtggatccccatctcataaataacgtcatg 48

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物hyg-S

<400> 6

gaaaaagcctgaactcaccgc 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物hyg-A

<400> 7

ctatttctttgccctcggacg 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物act-S

<400> 8

gaagtgcgat gtcgatgtca ga 22

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物act-A

<400> 9

ggagcaaggg cggtgatt 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pyc-S

<400> 10

cagtgggcac agacaaagaa gg 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pyc-A

<400> 11

accctcgaag aactcaagga cag 23

Claims (7)

1.获得高产聚苹果酸的出芽短梗霉的方法，其特征在于：克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因，然后构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体，再将重组载体利用农杆菌介导将含丙酮酸羧化酶基因的T-DNA整合入出芽短梗霉基因组中，并通过RT-qPCR验证丙酮酸羧化酶基因转录水平上调，进一步经发酵罐发酵验证得到高产聚苹果酸的出芽短梗霉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的方法如下：以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，出芽短梗霉基因组DNA为模版进行PCR扩增，获得出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体的方法为：先将丙酮酸羧化酶基因连入真菌过表达载体pBARGPEI的SmaI和EcoR I酶切位点之间，获得重组表达载体pBARGPE1- pyc，然后以重组表达载体pBARGPE1- pyc为模板，SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物连入pk2- PgpdA-hyg-TtrpC载体的EcoR I酶切位点处，得过表达丙酮酸羧化酶基因的重组载体。

4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于：所述出芽短梗霉丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于：所述出芽短梗霉为出芽短梗霉CCTCCM 2012223。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：获得高产聚苹果酸的丙酮酸羧化酶基因由出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型预测，出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型构建包括如下步骤：

（1）网络数据库的建立：根据出芽短梗霉全基因组测序结果和GO、KEGG、Uniprot数据库收集出芽短梗霉的基因注释信息，然后用VBA程序提取需要的出芽短梗霉菌的基因注释信息，添加聚苹果酸合成的特征反应，得到网络数据库；

（2）数据库的精炼和校准：从文献和数据库提取生物量组成模拟所需组分信息，将已有的网络数据库标准化并建立物种特异的详细反应列表，并对网络反应进行手动精炼，得到精确的出芽短梗霉菌代谢网络模型数据库；

（3）数学模型的建立：将已有的数据库文件内容转化为转换成系统生物学语言格式的文件，然后通过基于Matlab平台的COBRA工具包读取将其转化为数学模型；

（4）模型的验证与分析：以Matlab平台的COBRA工具包进行通量平衡分析，GLPK为线性解包进行模拟计算。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：利用出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型预测获得高产聚苹果酸的丙酮酸羧化酶基因方法如下：根据已构建的出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型，以生物量合成反应为目标函数，逐渐增大聚苹果酸分泌反应，得到多组流量数据，并通过分析不同聚苹果酸合成率状态下的碳流量分配情况，再利用鲁棒性分析方法，确定靶点基因对出芽短梗霉聚苹果酸产量的影响。