CN103275993A - 一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，该方法包括以下步骤：培养三组螺旋藻，收集藻细胞，提取各组螺旋藻的全蛋白，测定蛋白样品的蛋白浓度；分离三个条件下螺旋藻的全蛋白，获得高分辨率的胶图，分析三个条件下螺旋藻的蛋白点，获得三个条件之间差异蛋白点的信息，鉴定差异蛋白的相关生物学信息；提取总RNA，反转录形成cDNA，建立基因的质粒标准品；检测分析基因的mRNA在0.02MNaCl和0.3MNaCl下的表达差异；检测差异表达基因的耐盐性。本发明提供了一种新的可用于抗盐植物、微生物基因工程育种的耐盐基因ORF1198，该基因为耐盐相关基因，可用于培育耐盐碱的转基因作物，具有良好的发展前景。
Description
技术领域
本发明属于螺旋藻耐盐基因检测领域，尤其涉及一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法。
背景技术
目前，我国沿海一带的生态环境现状并不乐观，据统计，我国现有盐碱地面积达几千万亩，新围海涂将使盐碱地面积继续扩大。
通过引种耐盐或喜盐、且具有较高经济利用价值的植物，可实现对盐荒地的利用。因此，抗重盐、抗盐碱植物的培育及其综合开发利用是农业发展的一个方向。细胞及基因工程技术的飞速发展，使抗盐碱的植物基因工程育种正走向实用化。经济作物与大田粮食作物抗盐碱品种的分子育种及利用基因工程改造盐生植物，使之成为生物反应器，将是植物基因工程育种研究的重点。
因此，筛选和克隆抗盐碱基因，进行抗盐碱植物的基因工程育种，用于改良、合理开发和利用盐碱地资源，可产生巨大的资源利用效益、环境效益和经济社会发展效益。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，在对螺旋藻进行全基因组序列分析的基础上，利用蛋白组技术，进行螺旋藻功能基因组研究，分离螺旋藻抗盐碱相关功能基因，用于抗盐碱植物基因工程育种，培育抗重盐、抗盐碱植物，旨在解决现有盐碱地资源利用不足的的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，该方法包括以下步骤：
培养三组螺旋藻，收集藻细胞，提取各组螺旋藻的全蛋白，测定蛋白样品的蛋白浓度；
分离三个条件下螺旋藻的全蛋白，获得高分辨率的胶图，分析三个条件下螺旋藻的蛋白点，获得三个条件之间差异蛋白点的信息，鉴定差异蛋白的相关生物学信息；
提取总RNA，反转录形成cDNA，建立基因的质粒标准品；
检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异；
检测差异表达基因的耐盐性。
进一步、培养螺旋藻的三个盐浓度条件为：0.02M NaCl、0.5M NaCl和1.0MNaCl。
进一步、提取螺旋藻全蛋白的方法为TCA-丙酮法，检测蛋白样品蛋白浓度的方法为Bradford法。
进一步、分离螺旋藻全蛋白采用的方法为二维电泳，分析获得螺旋藻差异蛋白点信息的方法为Image Master胶图分析软件。
进一步、鉴定差异蛋白的相关生物学信息的步骤为：
采用质谱技术对差异蛋白进行鉴定，并通过Mascot检索，初步鉴定差异蛋白的相关生物学信息。
进一步、提取总RNA的方法为使用QIAGEN试剂盒离心柱法提取总RNA。
进一步、建立基因的质粒标准品的方法为：
通过Primer5软件设计未知功能基因ORF1198的定量PCR的特异性引物，通过基因克隆方法建立基因的质粒标准品。
进一步、检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异的方法为：
应用SYBR Green定量PCR技术检测基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3MNaCl下的表达差异，根据基因编码的蛋白所属的代谢途径，从mRNA水平上进行表达调控的分析。
进一步、检测差异表达基因耐盐性的具体步骤为：
构建靶基因的敲除载体pLKR及回补载体pKW-gene::Cmr，转化集胞藻PCC6803，通过同源重组双交换得到敲除藻及回补藻，利用分光光度计测定不同盐浓度下藻的生长情况，并以此来判断差异表达基因是否为耐盐相关基因；
(1)构建靶基因的敲除载体pLKR：分别以集胞藻PCC6803的基因组DNA和含卡那霉素抗性基因的质粒pET-28a为模板进行PCR扩增获得left、right片段及卡那霉素抗性基因。然后将纯化后的PCR产物连接至pMD18-T载体上，其中kan基因连接到含MCS的pMD18-T载体，测序鉴定克隆结果，双酶切切下left、right片段连接到pMD18-kan构成pMD-L-kan、pMD-kan-R，再将right、left片段连接到上述载体上构建pMD-Left::km r::Right重组载体。
(2)回补载体pKW-gene::Cmr的构建：将螺旋藻DNA序列，加上ORF前面的300bp的启动子序列设计引物，同时设计Cm抗性基因的引物，以提取的螺旋藻基因组DNA和pKOV质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，经测序证明克隆片段正确后，用限制性内切酶进行双酶切切下目的条带，然后将含启动子的目的基因和Cm抗性基因同时连到经双酶切的pUC载体上，抗生素筛选得到重组子，PCR和测序验证。然后将目的片段gene+Cm双酶切切下，经T4DNA聚合酶补平末端后，连接到经EcoRI酶切回收后补平末端并去磷酸化的pKW1188载体上，经Cm和Amp抗性筛选得到重组子pKW-gene::Cmr。
本发明提供的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法简便、快捷、准确，本发明提供了一种新的可用于抗盐植物、微生物基因工程育种的耐盐基因ORF1198，该基因为耐盐相关基因，可用于培育耐盐碱的转基因作物，可用于耐盐植物基因工程育种和抗盐性增强的螺旋藻新品种的培育，进行抗盐碱植物的基因工程育种，用于改良、合理开发和利用盐碱地资源，可产生巨大的资源利用效益、环境效益和经济社会发展效益。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的正常组(0.02NaCl)二维电泳胶图(左)和1.0M组二维电泳胶图(右)；
图3是本发明实施例提供的q-PCR验证结果的直方图；
图4是本发明实施例提供的1198敲除藻的结构图；
图5是本发明实施例提供的1.0M NaCl盐浓度下野生藻与敲除藻的生长曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
本发明的实施例提供的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，该方法包括以下步骤：
培养三组螺旋藻，收集藻细胞，提取各组螺旋藻的全蛋白，测定蛋白样品的蛋白浓度；
分离三个条件下螺旋藻的全蛋白，获得高分辨率的胶图，分析三个条件下螺旋藻的蛋白点，获得三个条件之间差异蛋白点的信息，鉴定差异蛋白的相关生物学信息；
提取总RNA，反转录形成cDNA，建立基因的质粒标准品；
检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异；
检测差异表达基因的耐盐性。
作为本发明实施例的一优化方案，培养螺旋藻的三个盐浓度条件为：0.02MNaCl、0.5M NaCl和1.0M NaCl。
作为本发明实施例的一优化方案，提取螺旋藻全蛋白的方法为TCA-丙酮法，检测蛋白样品蛋白浓度的方法为Bradford法。
作为本发明实施例的一优化方案，分离螺旋藻全蛋白采用的方法为二维电泳，分析获得螺旋藻差异蛋白点信息的方法为Image Master胶图分析软件。
作为本发明实施例的一优化方案，鉴定差异蛋白的相关生物学信息的步骤为：
采用质谱技术对差异蛋白进行鉴定，并通过Mascot检索，初步鉴定差异蛋白的相关生物学信息。
作为本发明实施例的一优化方案，提取总RNA的方法为使用QIAGEN试剂盒离心柱法提取总RNA。
作为本发明实施例的一优化方案，建立基因的质粒标准品的方法为：
通过Primer5软件设计未知功能基因ORF1198的定量PCR的特异性引物，通过基因克隆方法建立基因的质粒标准品。
作为本发明实施例的一优化方案，检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异的方法为：
应用SYBR Green定量PCR技术检测基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3MNaCl下的表达差异，根据基因编码的蛋白所属的代谢途径，从mRNA水平上进行表达调控的分析。
作为本发明实施例的一优化方案，检测差异表达基因耐盐性的具体步骤为：
构建靶基因的敲除载体pLKR及回补载体pKW-gene::Cmr，转化集胞藻PCC6803，通过同源重组双交换得到敲除藻及回补藻，利用分光光度计测定不同盐浓度下藻的生长情况，并以此来判断差异表达基因是否为耐盐相关基因；
(1)构建靶基因的敲除载体pLKR：分别以集胞藻PCC6803的基因组DNA和含卡那霉素抗性基因的质粒pET-28a为模板进行PCR扩增获得left、right片段及卡那霉素抗性基因。然后将纯化后的PCR产物连接至pMD18-T载体上，其中kan基因连接到含MCS的pMD18-T载体，测序鉴定克隆结果，双酶切切下left、right片段连接到pMD18-kan构成pMD-L-kan、pMD-kan-R，再将right、left片段连接到上述载体上构建pMD-Left::km r::Right重组载体。
(2)回补载体pKW-gene::Cmr的构建：将螺旋藻DNA序列，加上ORF前面的300bp的启动子序列设计引物，同时设计Cm抗性基因的引物，以提取的螺旋藻基因组DNA和pKOV质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，经测序证明克隆片段正确后，用限制性内切酶进行双酶切切下目的条带，然后将含启动子的目的基因和Cm抗性基因同时连到经双酶切的pUC载体上，抗生素筛选得到重组子，PCR和测序验证。然后将目的片段gene+Cm双酶切切下，经T4DNA聚合酶补平末端后，连接到经EcoRI酶切回收后补平末端并去磷酸化的pKW1188载体上，经Cm和Amp抗性筛选得到重组子pKW-gene::Cmr。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例提供的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法包括以下步骤：
S101：培养三组螺旋藻，收集藻细胞，提取各组螺旋藻的全蛋白，测定蛋白样品的蛋白浓度；
S102：分离三个条件下螺旋藻的全蛋白，获得高分辨率的胶图，分析三个条件下螺旋藻的蛋白点，获得三个条件之间差异蛋白点的信息，鉴定差异蛋白的相关生物学信息；
S103：提取总RNA，反转录形成cDNA，建立基因的质粒标准品；
S104：检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异；
S105：检测差异表达基因的耐盐性。
本发明提供了一种螺旋藻抗盐新基因序列ORF1198，该基因在数据库的注释结果为peroxiredoxin，putative[Arthrospira platensis str.Paraca]＞dbj|BAI9309499％，说明该基因以前尚未有报道其与抗盐性有关。
进行q-PCR验证：ORF1198基因mRNA表达量在较高盐浓度条件(0.3MNaCl)下比在较低盐浓度(0.02M NaCl)下上调9倍以上，说明ORF1198基因与盐胁迫表达调控相关。
构建敲除载体ORF1198-pLKR，转化野生集胞藻6803得到靶基因ORF1198敲除的突变体藻，它在1.0M NaCl下不能生长，推测该基因为耐盐相关基因。
敲除藻采用Km(10mg/ml)抗性筛选，7-10天左右长出转化子，约10天后ORF1198(pMD-Left::kmr::Right)敲除藻的转化平板：对照野生型的集胞藻没有卡那抗性不能在该平板生长，下面两块醋酸纤维素薄膜长出了新的绿色的单藻落，就是ORF1198敲除藻。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
培养三组螺旋藻，收集藻细胞，提取各组螺旋藻的全蛋白，测定蛋白样品的蛋白浓度；
分离三个条件下螺旋藻的全蛋白，获得高分辨率的胶图，分析三个条件下螺旋藻的蛋白点，获得三个条件之间差异蛋白点的信息，鉴定差异蛋白的相关生物学信息；
提取总RNA，反转录形成cDNA，建立基因的质粒标准品；
检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异；
检测差异表达基因的耐盐性。
2.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，培养螺旋藻的三个盐浓度条件为：0.02M NaCl、0.5M NaCl和1.0M NaCl。
3.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，提取螺旋藻全蛋白的方法为TCA-丙酮法，检测蛋白样品蛋白浓度的方法为Bradford法。
4.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，分离螺旋藻全蛋白采用的方法为二维电泳，分析获得螺旋藻差异蛋白点信息的方法为Image Master胶图分析软件。
5.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，鉴定差异蛋白的相关生物学信息的步骤为：
采用质谱技术对差异蛋白进行鉴定，并通过Mascot检索，初步鉴定差异蛋白的相关生物学信息。
6.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，提取总RNA的方法为使用QIAGEN试剂盒离心柱法提取总RNA。
7.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，建立基因的质粒标准品的方法为：
通过Primer5软件设计未知功能基因ORF1198的定量PCR的特异性引物，通过基因克隆方法建立基因的质粒标准品。
8.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，检测分析基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3M NaCl下的表达差异的方法为：
应用SYBR Green定量PCR技术检测基因的mRNA在0.02M NaCl和0.3MNaCl下的表达差异，根据基因编码的蛋白所属的代谢途径，从mRNA水平上进行表达调控的分析。
9.如权利要求1所述的利用蛋白组技术获得钝顶螺旋藻耐盐功能基因的方法，其特征在于，检测差异表达基因耐盐性的具体步骤为：
构建靶基因的敲除载体pLKR及回补载体pKW-gene::Cmr，转化集胞藻PCC6803，通过同源重组双交换得到敲除藻及回补藻，利用分光光度计测定不同盐浓度下藻的生长情况，并以此来判断差异表达基因是否为耐盐相关基因；
(1)构建靶基因的敲除载体pLKR：分别以集胞藻PCC6803的基因组DNA和含卡那霉素抗性基因的质粒pET-28a为模板进行PCR扩增获得left、right片段及卡那霉素抗性基因；然后将纯化后的PCR产物连接至pMD18-T载体上，其中kan基因连接到含MCS的pMD18-T载体，测序鉴定克隆结果，双酶切切下left、right片段连接到pMD18-kan构成pMD-L-kan、pMD-kan-R，再将right、left片段连接到上述载体上构建pMD-Left::km r::Right重组载体；
(2)回补载体pKW-gene::Cmr的构建：将螺旋藻DNA序列，加上ORF前面的300bp的启动子序列设计引物，同时设计Cm抗性基因的引物，以提取的螺旋藻基因组DNA和pKOV质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，经测序证明克隆片段正确后，用限制性内切酶进行双酶切切下目的条带，然后将含启动子的目的基因和Cm抗性基因同时连到经双酶切的pUC载体上，抗生素筛选得到重组子，PCR和测序验证；然后将目的片段gene+Cm双酶切切下，经T4DNA聚合酶补平末端后，连接到经EcoRI酶切回收后补平末端并去磷酸化的pKW1188载体上，经Cm和Amp抗性筛选得到重组子pKW-gene::Cmr。
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