CN102732621A

CN102732621A - 一种基于pcr的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法

Info

Publication number: CN102732621A
Application number: CN2012101928051A
Authority: CN
Inventors: 柳李旺; 陈志成; 龚义勤; 徐良; 包卫红
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-06-12
Also published as: CN102732621B

Abstract

本发明公开一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法。该鉴定方法为：分别利用所筛选的SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以‘海蜜2号’甜瓜亲本与F₁单株基因组DNA为模板进行PCR扩增，应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少任一亲本条带均为假杂交种。本发明的检测方法克服了常规田间纯度检测操作复杂、准确度低等缺点，不仅快速、简便，成本低，稳定可靠，且不受生长阶段与环境影响，可以成为甜瓜种子遗传纯度鉴定的重要检测方法之一。

Description

一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科一年生蔬菜。甜瓜杂交种在产量、品质、抗病性等方面具有较强的杂种优势，目前市场上对甜瓜杂交种的需求量逐年增加。多数甜瓜为雄全同株（雄花两性花同株）或雌雄同株异花植物（中国农业科学院郑州果树研究所等主编.中国西瓜甜瓜.北京：中国农业出版社，2000.2），在人工杂交制种过程中，常常由于母本去雄不及时，隔离不严或不彻底等原因，会导致甜瓜杂交种混有小部分母本自交或由其它来源不明花粉混杂所引起的‘假杂种’。另外，由于杂交种商业化程度较高，有少数的经营者对杂交种掺假导致种子遗传纯度下降，给生产者造成巨大的经济损失，严重损害了育种工作者与合法种子生产经营者的正当权益，同时也给种子供应单位带来极大的索赔风险。因此，在甜瓜杂交种子上市前，简便、快速、准确地鉴定其遗传纯度已成为育种工作者与种子生产经营者急需解决的难题。

目前，种子遗传纯度鉴定普遍采用的方法是田间形态学鉴定、同工酶鉴定，但田间鉴定方法费时费力，成本高，不能满足市场的要求，且易受季节限制和环境因素影响，准确性低。有时由于假杂交种与真杂交种形态学差异不明显，在苗期与成株期不易鉴别。同工酶分析易受环境和取材料部位的影响，特别对于一些亲本遗传差异较小的杂交品种，难以进行纯度检测与鉴定，准确度不高（柳李旺等，分子标记技术在蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中的作用.分子植物育种,2004,2(4):563～568）。近年来，随着现代生物技术的不断发展，利用SSR（SimpleSequence Repeats，简单序列重复）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，简单序列重复间序列）、RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）等分子标记技术对杂交种进行遗传纯度鉴定已有相关报道，但大部分还是单独运用某一种分子标记来进行分析，准确度偏低（Pallavi,H.M.,et al.Identification of SSR markers for hybridity and seed geneticpurity testing in sunflower(Helianthus annuus L.).Helia,2011(34):59-66）。利用SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性)、RAPD等多种分子标记同时对甜瓜F₁杂交种种子进行遗传纯度检测，可以有效克服形态学鉴定方法的缺点，不但快速简便，成本低、稳定可靠，而且不受生长阶段与环境影响，已成为甜瓜种子遗传纯度鉴定的重要检测方法之一。

‘海蜜2号’厚皮甜瓜是江苏省海门市农业科学研究所育成的海蜜系列甜瓜品种之一，具有产量高，品质优，风味独特，抗病性强等优点，适合于长江中下游多湿地区保护地春、秋两季栽培，该品种种植面积不断扩大（顾锡江,施建新,包卫红.海蜜2号厚皮甜瓜栽培技术规程及其研究与推广.中国西瓜甜瓜,2003(1):16～19）。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

甜瓜杂交种‘海蜜2号’种子遗传纯度的鉴定方法，分别利用所筛选的SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以提取的‘海蜜2号’甜瓜亲本与F₁单株基因组DNA为模板进行PCR扩增，应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少任一亲本条带均为假杂交种；所述的SRAP引物对NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列为SEQ ID NO.1，反向引物NAUSRfc8序列为SEQ ID NO.2，该引物组合能够扩增出大小为350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带；所述的RAPD引物NAURP401序列为SEQ ID NO.3，产生大小为1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带。

其中，SRAP标记PCR反应：

反应体系为：20ng基因组DNA，1.2mmol·L^-1Mg²⁺，0.15mmol·L^-1dNTPs，0.5μmol·L^-1正向引物NAUSRem6和0.5μmol·L^-1反向引物NAUSRfc8，0.75U TaqDNA聚合酶，总体系10μL。

扩增程序为：94℃3min；94℃1min，35℃1min，72℃1min 30s，5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1min30s，33个循环；72℃延伸7min。

RAPD标记PCR反应：

反应体系为：20ng基因组DNA，2.5mmol·L^-1MgCl₂,0.15mmol·L^-1dNTPs，0.4μmol·L^-1引物，0.75U TaqDNA聚合酶，总体系18μL。

扩增程序为：94℃2min；94℃30s，37℃1min，72℃1min 30s，45个循环；72℃延伸10min。

根据所述的PCR扩增产物电泳分析，进行种子遗传纯度鉴定；只有同时具有父、母本特异标记条带的幼苗单株才鉴定为真杂交种，缺少任一亲本条带均判定为假杂交种；根据鉴定结果计算供检种子的遗传纯度：[供检种子粒数（即供检幼苗数）-假杂交种粒数（即假杂交幼苗数）]/供检种子粒数（即供检幼苗数）×100，单位为%。

有益效果

本发明筛选出能够在一代杂种中产生具有父母本特异标记条带且不受环境影响的分子标记，用于鉴定甜瓜杂交种种子的遗传纯度，可以大大提高杂交种纯度鉴定的效率，从而为其种子遗传纯度的快速鉴定建立起高效、准确的质量控制方法。该鉴定方法具有准确性高，不受环境影响，成本低，并且能够在短时间内准确地鉴定出甜瓜种子遗传纯度等优点。

附图说明

图1甜瓜‘海蜜2号’种子遗传纯度检测特异性引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8的SRAP-PCR电泳图谱。泳道1：母本；泳道2：父本；泳道3～42：‘海蜜2号’F1杂交种，泳道L：100bp的分子量标准，箭头所指为亲本特异标记。其中第12泳道只能扩增出350bp的母本特异条带，第34泳道只能扩增出370bp的父本特异条带。

图2是甜瓜‘海蜜2号’种子遗传纯度检测特异性引物NAURP401的RAPD-PCR电泳图谱。泳道1：母本；泳道2：父本；泳道3～42：‘海蜜2号’F₁杂交种，泳道L：DL2000的分子量标准，箭头所指为亲本特异标记。其中第12泳道只能扩增出1270bp的母本特异条带，第34泳道只能扩增出960bp的父本特异条带。

具体实施方案

实施例1

1DNA提取

甜瓜‘海蜜2号’种子浸种后，于28℃光照培养箱中催芽并长出幼苗；取100-150mg幼叶，用液氮研磨，加入1mL CTAB裂解液（1.4mol·L^-1NaCl，0.1mol·L^-1TrisHCl，20m mol·L^-1Na₂EDTA，2%CTAB（质量百分比），2%PVP（质量百分比），1%(V/V)巯基乙醇）转入2.0mL的离心管，65℃水浴30～50min；12000rpm离心10min；加等体积的氯仿：异戊醇（24:1，V/V），静置3～5min，12000rpm离心10min；吸上清于新2.0mL离心管中，加入0.1体积3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和1体积预冷异丙醇，于4℃或-20℃冰箱中沉淀30min；4℃，12000rpm离心10min，倒上清液，加500μl TE缓冲液（10m mol·L^-1 Tris/HCl(pH 8.0)，1m mol·L^-1EDTA(pH 8.0)）65℃水浴30min；加入800μl氯仿:异戊醇(24:1，V/V)，12000rpm离心10min，上清液转入于新1.5mL离心管中；去上清液，加入70%的预冷乙醇清洗DNA；干燥，加入50～100μl灭菌的TE缓冲液溶解DNA，放于4℃或-20℃冰箱中备用。

2分子标记分析

（1）SRAP-PCR反应：

反应体系为：20ng基因组DNA，1.2mmol·L^-1Mg²⁺，0.15mmol·L^-1dNTPs，0.5μmol·L^-1正向引物和0.5μmol·L^-1反向引物，0.75U TaqDNA聚合酶，总体系10μL。

（2）RAPD-PCR反应：

3扩增产物检测

取扩增产物2.5μL，于8%的非变性聚丙烯胺凝胶（Acr:Bic=29:1，质量比）电泳，电极缓冲液为1×TBE，恒定电压150V，具体步骤：

1)洗玻璃板，晾干后装板，保证玻璃板不漏胶；

2)8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备(45mL)：

3)凝胶溶液配好后，均匀的倒入两块玻璃板中间，将梳子垂直插入胶中(注意防止灌胶过程中产生气泡)，让其充分凝固；

4)待胶凝固好后装电泳槽，倒入1×TBE电极缓冲液，于90V稳压下预电泳30～60min;

5)扩增产物加3μL溴酚蓝缓冲液，混匀，每加样孔上样量3.5μL；

6)150V稳压下电泳2.5h左右；

7)电泳完毕后将玻璃板从电泳槽中取出，剥下凝胶；

8)固定：固定液(10%乙醇，0.5%乙酸)固定15～20min，蒸馏水洗1～2次；

9)染色：银染液(0.2%AgNO₃),银染15～20min，蒸馏水快速洗2次；

10)显色：显色液(1.5%NaOH,0.4%甲醛，0.00025%Na₂S₂O₃),显至条带清晰；

11)记录结果并照相。

4有效特征引物的筛选

有效特征引物指在一代杂种F₁单株中扩增时能够产生亲本特异标记条带的PCR引物，可以用于种子遗传纯度的分子检测。利用RAPD和SRAP引物对甜瓜品种‘海蜜2号’及其亲本进行扩增。筛选96个SRAP引物组合和144个RAPD引物，结果选出2个有效特征引物（组合），包括1个SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8与1个RAPD引物NAURP401。SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列为SEQ ID NO.1，反向引物NAUSRfc8序列为SEQ ID NO.2；RAPD引物NAURP401序列为SEQ ID NO.3。利用这2个有效特征引物（组合）对‘海蜜2号’甜瓜所有F₁单株进行遗传纯度检测。

该SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8能够扩增出大小为350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带；所述的RAPD引物NAURP401序列为SEQ ID NO.3，产生大小为1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带。

5杂种种子遗传纯度的鉴定及计算

应用已经筛选到的SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8和RAPD引物NAURP401分别对40株甜瓜品种‘海蜜2号’幼苗基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物电泳分析进行种子遗传纯度鉴定。只有同时具有父、母本特异标记条带的幼苗单株才鉴定为真杂交种，缺少任一亲本条带均判定为假杂交种。根据分子标记有效特征引物的PCR标记分析结果，计算供检种子的遗传纯度（%）：[供检种子粒数（即供检幼苗数）-假杂交种粒数（即假杂交幼苗数）]/供检种子粒数（即供检幼苗数）×100。

如图1所示，SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8产生大小为350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带；40株甜瓜品种‘海蜜2号’幼苗中，有38株能够同时扩增出350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带，为真杂交种；有2株（第12泳道和第34泳道）则只能扩增出其中一条，为假杂交种；按照上述公式计算得遗传纯度为95%。

如图2所示，RAPD引物NAURP401产生大小为1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带；40株甜瓜品种‘海蜜2号’幼苗中，有38株能够同时扩增出1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带，为真杂交种；有2株（第12泳道和第34泳道）则只能扩增出其中一条，为假杂交种；按照上述公式计算得遗传纯度为95%。

其中SRAP引物代号NAUSRem6，其含义为：‘NAU’代表‘南京农业大学’；‘SR’代表‘SRAP引物’，‘em6’代表‘实验室SRAP引物编号’；SRAP引物代号NAUSRfc8，其含义为：‘NAU’代表‘南京农业大学’；‘SR’代表‘SRAP引物’，‘fc8’代表‘实验室SRAP引物编号’；RAPD引物NAURP401，其含义为：‘NAU’代表‘南京农业大学’；‘RP’代表‘RAPD引物’，‘401’代表‘实验室RAPD随机引物编号’。

Claims

1.甜瓜杂交种‘海蜜2号’种子遗传纯度的鉴定方法，其特征在于：分别利用SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以‘海蜜2号’甜瓜亲本与F₁单株基因组DNA为模板进行PCR扩增，应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少任一亲本条带均为假杂交种；所述的SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列为SEQ ID NO.1，反向引物NAUSRfc8序列为SEQ ID NO.2，该引物组合能够扩增出大小为350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带；所述的RAPD引物NAURP401序列为SEQ ID NO.3，产生大小为1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带。

2.根据权利要求1所述的甜瓜杂交种‘海蜜2号’种子遗传纯度的鉴定方法，其特征在于提取‘海蜜2号’甜瓜亲本幼苗与F₁单株幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增：（1）SRAP标记PCR反应，反应体系为：20ng基因组DNA，1.2mmol·L^-1Mg²⁺，0.15mmol·L^-1dNTPs，0.5μmol·L^-1正向引物NAUSRem6和0.5μmol·L^-1反向引物NAUSRfc8，0.75U TaqDNA聚合酶，总体系10μL；扩增程序为：94℃3min；94℃1min，35℃1min，72℃1min 30s，5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1min30s，33个循环；72℃延伸7min；（2）RAPD标记PCR反应，反应体系为：20ng基因组DNA，2.5mmol·L^-1MgCl₂,0.15mmol·L^-1dNTPs，0.4μmol·L^-1引物NAURP401，0.75U TaqDNA聚合酶，总体系18μL；扩增程序为：94℃2min；94℃30s，37℃1min，72℃1min 30s，45个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的甜瓜杂交种‘海蜜2号’种子遗传纯度的鉴定方法，其特征在于根据所述的PCR扩增产物电泳分析，进行种子遗传纯度鉴定；只有同时具有父、母本特异标记条带的幼苗单株才鉴定为真杂交种，缺少任一亲本条带均判定为假杂交种；根据鉴定结果计算供检种子的遗传纯度：[供检种子粒数-假杂交种粒数]/供检种子粒数×100，单位为%。