CN102108393A - 青菜杂交种dna指纹图谱的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青菜杂交种及其亲本DNA指纹图谱的建立方法和应用。建立方法包括1)青菜DNA的提取及纯化；2)用获得的高纯度青菜DNA为模板进行RAPD、ISSR、SRAP分析；3)选择有代表性的多态性扩增条带构建供试材料DNA指纹图谱；在DNA指纹图谱中青菜杂交种及其亲本都有特异的DNA指纹，可以相互区分开来。由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并将其转换成数码表示形式，便于计算机识读和分析。本发明能从遗传本质上对青菜杂交种的种子纯度鉴定，结果准确、可靠，检测迅速。
Description
技术领域
本发明涉及青菜种子鉴定技术，具体地说是青菜杂交种DNA指纹图谱的建立方法和应用。
背景技术
目前，我国生产中推广应用的青菜(Brassic campestris L.ssp.Chinensis(L.)Makino)品种许多为杂种一代。杂种一代能综合亲本的许多优良性状，经济效益较好。
但是在制种过程中会由于管理措施不当和自交不亲和性本身的缺陷而常常产生自交种子，即假杂种，导致种子纯度下降。因此，提高杂交种纯度是杂种优势利用研究领域的重要课题。目前，品种鉴定和种子纯度分析方法大致有三种，即大田形态、生化标记和DNA指纹图谱鉴定法。传统的大田鉴定法以种子、幼苗、叶、花、果实、花粉等组织器官的颜色、形态等农艺性状作为鉴定的观测指标，在生产实践中虽然是一种较为可行的方法，但大田鉴定需要额外占用土地，周期长、花费大，不仅受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子的影响，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性。大田鉴定最大的缺陷是不能及时提供种子纯度信息，不能在种子大量交易前提供有关种子的质量信息，对种子质量不能起到预先监督的作用。生化鉴定方法包括蛋白质电泳和同工酶电泳，已得到日益广泛的应用，但不能完全显示品种间的多态性，难以对亲缘关系较近的品种进行有效的区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种青菜杂交种DNA指纹图谱的建立方法和应用，以克服现有技术存在的不足。
本发明的技术构思是这样的：
DNA指纹图谱鉴定法是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题。本发明利用ISSR、SRAP技术构建了青菜杂交种与其亲本的DNA指纹图谱，可以为青菜杂交种的鉴定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权益。
本发明的青菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，是由“1”和“0”组成的数据。使用引物S306，青菜杂交种母本、F1和父本的扩增数据分别为101111111、101101111和111110111。使用引物S334，数据分别为1011111111、1111111011和1011111010。使用引物UBC810，数据分别为1101001111、1101111111和1011011111。使用引物UBC812，数据分别为10101111111011、11010111111111和11010111111110。使用引物UBC834，数据分别为101110011101011、101110101011111和110111101010011。使用引物M1-E4，数据分别为111001011111011101101111、111101111111101111011011和111111011110011111011011。使用引物M4-GA18，数据分别为10110111111111111111111101111、10111111111111111111110111111和11111111110111111111100101011。其中所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带存在。
所说的青菜杂交种和亲本可以采用上海市农业科学院园艺研究所公开销售的产品；
青菜DNA指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
1)提取及纯化青菜基因组的DNA；
2)用获得的青菜DNA为模板进行RAPD、ISSR、SRAP分析；
3)选择有代表性的多态性扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。
其中所述青菜杂交种及其亲本都有其特异的DNA指纹，可以相互区分开来。所述RAPD、ISSR、SRAP扩增中采用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核苷酸引物。RAPD扩增采用的引物为S306：ACGCCAGAGG，S334：TCGGAGGTTC。ISSR扩增中采用的引物为UBC810：GAGAGAGAGAGAGAGAT，UBC812：GAGAGAGAGAGAGAGAA，UBC834：AGAGAGAGAGAGAGAGYT(Y＝C，T)。SRAP扩增采用的引物为M1：TGAGTCCAAACCGGATA，E4：GACTGCGTACGAATTTGA，M4：TGAGTCCAAACCGGACC，EA18：GGCTTGAACGAGTGACTGA。
本发明的DNA指纹图谱可以应用于青菜杂交种种子纯度的鉴定。
本发明具有如下优点：
1、本发明创建了青菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，公开了用DNA指纹分析技术对青菜种子鉴定的研究结果，其建立方法能从遗传本质上对青菜种子进行鉴定，因此准确、可靠。
2、采用本发明，在对青菜种子样品进行真实检测时，用目前广泛应用的快速、微量DNA提取法提取待测样品的DNA，用提取的DNA作为模板，进行RAPD、ISSR、SRAP分析，在几个小时内就可以知道该样品的DNA指纹，因此，就能迅速判断出它的真实性。
3、由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于转换成了数码形式，便于计算机识读和分析。
附图说明：
附图为本发明建立的RAPD、ISSR、SRAP指纹图谱，其中：M为DGL2000DNA标识；4为青菜杂交种母本；5为青菜杂交种；6为青菜杂交种父本；箭头标出的为互补型特征片段。引物顺序从A～G依次为：M1-E4、M4-GA18、S306、S334、UBC810、UBC812和UBC834。
具体实施方式：
实施例1
本实施例采用SDS法提取青菜品种“新绿”及其亲本的基因组DNA，通过RAPD、ISSR、SRAP分子标记方法构建其DNA指纹图谱用于种子纯度鉴定。具体操作如下：
1、选用的试验材料：
材料为青菜杂交种“新绿”及其亲本。
2、青菜DNA的提取及纯化：
按如下程序提取各个青菜材料的基因组DNA：
取新鲜组织2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml离心管，加入8ml提取液(100mM Tris pH 8.0，50mM EDTA，500mM NaCl，1.5％SDS)，65℃情况下30分钟，不时颠倒混匀，加2.5ml 5M乙酸钾冰浴10分钟，加.5ml氯仿，颠倒混匀，10000rmp离心8分钟，取上清移入新管，加2/3体积预冷异丙醇，颠倒混匀，-20℃置1-2小时，挑出絮状白色DNA，70％乙醇洗1-2次，吹干，溶于100ul(或适量)TE中，并在1％琼脂糖凝胶上电泳，用标准λDNA作对照，估算青菜DNA样品的浓度，获得高纯度青菜DNA。
3、用获得的高纯度青菜DNA为模板进行分子标记分析：
RAPD扩增反应采用20μL的反应体系，其中25mmol/L MgCl2 2.0μl，10×PCR Buffer 2.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，5U/μl Taq E 0.2μl，0.1μmol/L引物3μl，10ng/μl模板DNA 3μl，灭菌双蒸水9.3μl。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，40个循环；72℃延伸10min后4℃保存。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳1.5h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝胶成像仪进行观察并拍照分析。
ISSR扩增反应采用20μL的反应体系，其中25mmol/L MgCl22.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，0.1μmol/L引物3.0μL，10ng/μL模板DNA 3.0μL，灭菌双蒸水9.4μL，加盖一滴矿物油进行扩增。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min后4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。PCR结果检测方法同RAPD。
SRAP扩增反应采用20μL的反应体系，其中25mmol/L MgCl22.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，0.1μmol/L引物各3.0μL，10ng/μL模板DNA 3.0μL，灭菌双蒸水6.4μL，加盖一滴矿物油进行扩增。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1.5min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min后4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。反应结束后，PCR产物使用6％聚丙烯酰胺胶电泳1.5小时，采用快速银染法染色定影后拍照。
4、引物筛选：
使用150个RAPD引物、100个ISSR引物和30对SRAP引物对样品DNA进行PCR扩增，其中有107个RAPD引物、52个ISSR引物和全部的30对SRAP引物能扩增出清晰的条带，但大多数引物的扩增结果在双亲及杂交种之间是一致的，不能起到鉴别的作用。最终筛选出3个ISSR引物(UBC810、UBC812和UBC834)和2对SRAP引物(M1-E4和M4-GA18)可扩增出双亲的互补特征带，将双亲和F1区分出来，另外还有2个RAPD引物(S306和S334)可以将“新绿”的双亲和F1区分开(见图)。其中引物组合M1-E4在约1400bp、700bp、500bp和370bp四处共扩增出4条双亲的互补特征带；引物组合M4-GA18在约1300bp、700bp和150bp处分别扩增出1条互补特征带；引物UBC810在约1400bp和800bp处扩增出2条互补带特征带；引物UBC812在约1000bp、450bp和400bp处共扩增出3条互补带特征带；引物UBC834在约1500bp和800bp两处扩增出互补带特征带，并在750bp左右扩增出1条亲本一的特异带，在约1600bp和1000bp扩增出2条亲本二的特异带，3条亲本特异带在F1中均没有出现；引物S306在600bp左右扩增出1条亲本一的特异带，在F1中也扩增出同样条带，在800bp左右同时在双亲中扩增出1条多态带，但在F1中未见扩增；引物S334在约500bp处扩增出1条亲本一的特异带，在F1中有同样的表现，另外在约600bp处仅于亲本一中扩增出1条特异带，在约1600bp处扩增出F1特异带。由此可见，7个(对)引物均能对“新绿”的双亲和F1进行有效鉴别。
5、数字指纹的建立：
根据上述三种分子标记指纹图谱，以1和0分别代表某个等位基因位点扩增DNA条带的有无，按照从上到下即由大片段向小片段的读带方向，将分子标记指纹图谱转换为由1和0组成的字符串，即构成数字指纹，是由“1”和“0”组成的数据。使用引物S306，“新绿”青菜的母本、杂交种和父本的扩增数据分别为101111111、101101111和111110111。使用引物S334，数据分别为1011111111、1111111011和1011111010。使用引物UBC810，数据分别为1101001111、1101111111和1011011111。使用引物UBC812，数据分别为10101111111011、11010111111111和11010111111110。使用引物UBC834，数据分别为101110011101011、101110101011111和110111101010011。使用引物M1-E4，数据分别为111001011111011101101111、111101111111101111011011和111111011110011111011011。使用引物M4-GA18，数据分别为10110111111111111111111101111、10111111111111111111110111111和11111111110111111111100101011。
实施例2
本发明的DNA指纹图谱用于“新绿”种子纯度的鉴定：
从制种基地生产的“新绿”杂交种中随机抽取50-80个单株，用微量DNA提取法提取各单株样品的DNA，用提取的DNA作为模板，用相应的引物对其进行PCR扩增和电泳分析。如利用UBC812引物分析查出的单株DNA指纹是“11010111111111”即为“新绿”真杂种株，DNA指纹是“10101111111011”或“11010111111110”即为“新绿”亲本自交株，也就是假杂种株。再如利用M1-E4引物分析查出的单株DNA指纹是“111101111111101111011011”即为“新绿”真杂种株，DNA指纹是“111001011111011101101111”或“111111011110011111011011”即为“新绿”亲本自交株，也就是假杂种株。然后用假杂种株数除以总分析的株数，即可获得制种基地生产的青菜杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为这些青菜杂交种子的销售及时提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于85％，就不能够作为种子进行销售，以避免假种子伤农事件的发生。如果鉴定的种子纯度高于95％以上，就可以作为精品种子销售，优质优价，使农民和种子经销商均获得好的经济效益。
Claims (4)
1.青菜DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取及纯化青菜基因组的DNA；
2)用获得的青菜DNA为模板进行RAPD、ISSR、SRAP分析；
3)选择有代表性的多态性扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，青菜杂交种及其亲本的DNA指纹图谱，是由“1”和“0”组成的数据，使用引物S306，青菜杂交种母本、杂交种和父本的扩增数据分别为101111111、101101111和111110111。使用引物S334，数据分别为1011111111、1111111011和1011111010。使用引物UBC810，数据分别为1101001111、1101111111和1011011111。使用引物UBC812，数据分别为10101111111011、11010111111111和11010111111110。使用引物UBC834，数据分别为101110011101011、101110101011111和110111101010011。使用引物M1-E4，数据分别为111001011111011101101111、111101111111101111011011和111111011110011111011011。使用引物M4-GA18，数据分别为10110111111111111111111101111、10111111111111111111110111111和11111111110111111111100101011。其中所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增条带存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD扩增采用的引物为S306：ACGCCAGAGG，S334：TCGGAGGTTC。ISSR扩增中采用的引物为UBC810：GAGAGAGAGAGAGAGAT，UBC812：GAGAGAGAGAGAGAGAA，UBC834：AGAGAGAGAGAGAGAGYT(Y＝C，T)。SRAP扩增采用的引物为M1：TGAGTCCAAACCGGATA，E4：GACTGCGTACGAATTTGA，M4：TGAGTCCAAACCGGACC，EA18：GGCTTGAACGAGTGACTGA。
4.权利要求2所述的方法建立的DNA指纹图谱的应用，其特征在于，用于青菜杂交种种子纯度的鉴定。
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2009
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