CN103497996B - 一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel 587 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel？587，本发明提供的分子标记InDel？587位于第6染色体10484756-10484985bp处，与抗稻瘟病基因Pigm(t)的定位区间10367733-1042226bp相距65.2kb，紧密连锁，而且标记InDel？587多态率高，87.2％的受体亲本与供体亲本谷梅4号之间存在多态；InDel？587的PCR产物差异大，能快速检测出材料的标记基因型。通过用分子标记检测待检材料，可以判断其是否携带抗病基因Pigm(t)。

Description

一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel 587
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel587。
背景技术
抗稻瘟病基因Pigm(t)文献(TheorApplGenet，2006，113：705-713)中公布的分子标记大多为CAPS标记，不适合分子标记辅助选择，还有SSR和InDel标记主要是用于遗传定位的，在育种中存在多态率较低，差异较小的缺点。传统的水稻抗病育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。
稻瘟病是危害我国水稻生产的三大主要病害之一，通过分子标记辅助选择抗病基因是培育抗病品种的有效途径之一。谷梅4号具有广谱稻瘟病抗性，Pigm(t)定位于第6染色体分子标记C5483和C0428之间约70kb的范围内，文献中公布的用于遗传定位的分子标记，不太适用于标记辅助育种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel587。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子标记InDel587，上游引物为5’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物为5’-GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’。
本发明提供的分子标记InDel587位于第6染色体10484756-10484985bp处，与抗稻瘟病基因Pigm(t)的的定位区间10367733-1042226bp相距65.2kb，紧密连锁，而且标记InDel587多态率高，87.2％的受体亲本与供体亲本谷梅4号之间存在多态；InDel587的PCR产物差异大，能快速检测出材料的标记基因型。通过用分子标记检测待检材料，可以判断其是否携带抗病基因Pigm(t)。
附图说明
图1为标记InDel587检测谷梅4号和46个水稻亲本的电泳图。
图2为标记InDel587检测扬稻6号//扬稻6号/谷梅4号杂交后代的电泳图；
图3为标记InDel587检测徐稻3号//徐稻3号/谷梅4号杂交后代的电泳图；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
在基因Pigm(t)定位区间附近找到日本晴BACAP005659，在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST程序将AP005659与籼稻品种93-11的序列进行比对，结果发现在AP005659在133714-133742bp与93-11存在差异，以AP005659在133714-133742bp为中心，向上下游各取500bp的序列，用软件Primer5.0进行引物设计，得到了一对引物序列，上游引物为5’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物为5’-GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’，将这对引物进行标记多态性检测，发现大多数品种在此位点与谷梅4号存在多态性，将此引物命名为InDel587。
InDel587：上游引物为5’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物为5’-GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’。
扩增日本晴的PCR产物大小为230bp，扩增序列为：
5’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTGCCGTACATACCACGTGACAGAAACATGACAAATCGCCTTGAAAGAGGAAAAAAACAATTGGGGGGGGGGGGGGGGTTCTAGATCTTTTGAGATAGAGATTGGTACATTACTGTGATGTAAGGTCTGATTGTCATATGCTGATCACATGTATAAACATCTTTTTCTTGCTATTGTGATTTATTTGGTATAAGCCTGAAAAGTACGAACTC-3’。
DNA的提取采用常规的CTAB法(Murray&Thompson，1980Rapidisolationofhigh-molecular-weightplantDNA.NucleicAcidsRes8：4321-4325)。
PCR反应在EPPENDORF梯度PCR仪(型号：MastercyclerPro)上进行，扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙淀(EB)染色后，BIO-RAD凝胶成像仪(型号：GelDocXR)紫外灯下扫描拍照和分析。
所述PCR扩增体系(20ul)为：0.2μmolL-1的正、反向引物各1.5μL，200μmolL-1的dNTPs2μL，10×PCRbuffer2μL，50～100ng的DNA模板2μL，1UμL-1的Tag酶0.3μL，ddH2O10.7μL。
所述PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，58℃复性45秒，72℃延伸1分钟，32个循环，72℃延伸5分钟。
于幼苗期取47个亲本材料的少量嫩叶(47个亲本材料，编号为1：谷梅4号，2：K17B，3：中健2号，4：珍珠糯，5：鄂中4号，6：广超921，7：广超922，8：粤抗924，9：农香18，10：农香21，11：玉针香，12：培矮64，13：美雅占，14：协青早B，15：珍汕97B，16：天丰B，17：广占63S，18：丰源B，19：II-32B，20：明恢63，21：明恢86，22：R527，23：R838，24：特青，25：R13，26：扬稻4号，27：扬稻6号，28：扬稻8号，29：津稻1007，30：圣稻15，31：-圣稻16，32：新稻20号，33：宁粳4号，34：苏秀10号，35：徐稻6号，36：华粳7号，37：武运粳21，38：镇稻88，39：镇稻99，40：武运粳24，41：淮稻5号，42：淮稻13，43：扬粳4038，44：扬粳4227，45：镇稻15号，46：镇稻16号，47：武香粳14，48：谷梅4号。以上材料由江苏里下河地区农业科学研究所提供)，利用CTAB法提取基因组DNA；按顺序取47个亲本材料的DNA2uL，依次加入0.2μmolL-1的InDel587正、反向引物各1.5μL，200μmolL-1的dNTPs2μL，10×PCRbuffer2μL，1UμL-1的Tag酶0.3μL，ddH2O10.7μL；放入PCR仪中进行扩增反应，反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，58℃复性45秒，72℃延伸1分钟，32个循环，72℃延伸5分钟；PCR反应结束后，按顺序取10uL产物进行2％的琼脂糖凝胶中电泳分离，120V恒定电压下电泳30分钟，关闭电泳仪电源，将凝胶在BIO-RAD凝胶成像仪(型号：GelDocXR)紫外灯下扫描拍照和分析，参考图1。
取扬稻6号//扬稻6号/谷梅4号群体20个单株叶片用InDel587进行检测，实验过程同上。顺序为1：谷梅4号，2：扬稻6号，3-22为20个回交单株后代，其中5、6、9、11、14、16、19、22携带基因Pigm(t)，结果如图2。
取徐稻3号//徐稻3号/谷梅4号群体23个单株叶片用InDel587进行检测。实验过程同上。顺序为1：谷梅4号，2：徐稻3号，3-25为23个回交单株后代，其中5、6、10、12、14、17、20、21、25携带基因Pigm(t)，结果如图3。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种用于检测谷梅4号抗稻瘟病基因Pigm(t)的引物，上游引物为5’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物为5’-GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’，引物的分子标记为InDel587，位于第6染色体10484756-10484985bp处，与抗稻瘟病基因Pigm(t)的定位区间10367733-1042226bp相距65.2kb。
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