CN105063189B - 用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于作物分子标记辅助选择领域的一种用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记,该分子标记由SEQ ID No:1所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了用于扩增该分子标记的引物对和试剂盒。以及利用该分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因材料的方法。本发明分子标记与杂种弱势基因Hw3连锁紧密,为快速准确鉴定杂种弱基因Hw3的存在与否提供了有力工具;其次,本发明分子标记为共显性分子标记,可以直接对杂种弱势基因的基因型进行鉴定,准确性高,可靠性强;此外,本发明分子标记不受时间和环境条件限制,可以在早期对Hw3基因进行鉴定;还有本发明鉴定方法简单,可以对材料进行大规模鉴定,省时省力,成本低。
Description
技术领域
本发明属于作物分子标记辅助选择领域,具体涉及用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记,以及该分子标记的用途。
背景技术
杂种弱势是指表现正常的两个物种间或者同一物种不同品种间杂交能够产生正常可育的种子,但这些种子的生长发育发生了缺陷,主要表现为生长迟缓、植株矮小、叶片黄化以及组织坏死等表型。杂种弱势是生殖隔离的一种形式,在水稻中通常出现在籼粳杂交或野生稻与栽培稻的杂交中,通常受两对以上互作基因控制(Chen et al,Molecularplant,2013,6(3):716-728)。目前已经定位和克隆了10多个水稻杂种弱势相关基因,分别位于第1、4、7、10和11染色体上,且这些基因大多位于抗病基因附近或者具有抗病基因的典型结构(Tsutomu Kuboyama,Rice,2009,2:93-103;Ichitani等.Rice,2011,4:29-38;Chen等.Nature communication,2014,5:3357)。植物免疫系统的多样化可产生负面的结果,这些不同的免疫因子间的上位互作可导致杂种弱势或杂种坏死的产生(Bombiles,Botany.2009,87:1013-1022)。
广东省农业科学院水稻研究所研究发现携带抗稻瘟病基因Pi1材料与优质保持系或不育系泰丰B/A杂交时,其杂种F1代在广州气温较低的早季种植表现杂种弱势,这也是首次报道籼稻品种间杂种弱势;而当这些F1代材料在气温较高的晚季则又表现杂种优势。研究这种受温度诱导的杂种弱势现象也有助于了解杂种优势的机理,从而更好地利用杂种优势。利用抗病材料RGD-7S与泰丰B创建的群体精细定位了来自RGD-7S的、位于第11染色体上与抗稻瘟病基因Pi1连锁的杂种弱势新基因Hw3(Fu等.,PLoS one,2013,8:e73886)。
抗稻瘟病基因Pi1是目前水稻生产上应用较多的广谱抗病基因之一,该抗病基因与杂种弱势基因Hw3紧密连锁,这就增加了育种材料携带该杂种弱势基因的风险。目前,这种受温度诱导的籼稻品种间杂种弱势只能通过杂交且仅在温度较低时才出现,这就增加了杂交稻育种中出现杂种弱势的风险,降低了育种效率。因此,利用分子标记对育种材料中的杂种弱势基因进行早期筛选,是降低出现杂种弱势的风险,提高育种效率的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记。该分子标记可用于对杂交稻亲本材料中的杂种弱势基因进行筛选,以避免在杂交稻配组中出现杂种弱势,提高强优势杂交稻新组合的选配效率。
本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的PCR引物对。
本发明第三目的在于提供用于检测籼稻品种间杂种弱势基因的试剂盒。
本发明第四目的在于提供上述分子标记在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
本发明第五目的在于提供上述引物对在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
本发明第六目的在于提供利用上述分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因材料的方法。
本发明第七目的在于提供利用上述分子标记培育水稻品种的方法。
实现本发明的技术方案如下:
本发明用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记,命名为M12,所述的分子标记由SEQ ID No:1所示的核苷酸序列组成。
上述分子标记中所述的杂种弱势基因是指Hw3,该基因位于位于水稻第11染色体长臂上。
用于扩增上述分子标记的引物对,命名为ID1112,所述的引物对由SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列组成;所述的引物对为:
M12-F:5'AGAGAGAGGGGGAAGAGAGA 3'(SEQ ID No:2),
M12-R:5'GGGAATGTTTCAGGTGCGAC 3'(SEQ ID No:3)。
用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的试剂盒,包括由SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列组成的引物对。
上述分子标记在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
上述引物对在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
上述应用中所述的杂种弱势基因是指Hw3,该基因位于位于水稻第11染色体上。
利用上述分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因材料的方法,包括以被鉴定籼稻材料的总DNA为模板,以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,电泳,PCR扩增产物中具有分子标记M12的,即为带有籼稻品种间杂种弱势基因的材料。
上述方法中所述的PCR扩增,其PCR反应体系为:基因组DNA(10ng/ul)2ul,10X PCRbuffer 2.5ul,sdNTPs(2.5mM)2ul,引物(mixed)(5pM)2ul,Taq酶(5U/ul)0.2ul,ddH2017.3ul;其PCR反应程序为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,30个循环;72℃10min。
利用上述分子标记培育水稻品种的方法,包括以从杂交后代或自交后代的幼苗提取的基因组DNA为模板,以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,电泳,淘汰具有分子标记M12的材料,保留不带分子标记M12的材料进入下一代,直至育成新的不含杂种弱势基因的水稻品种。
本发明具有的优点和有益效果:(1)、本发明分子标记与杂种弱势基因Hw3紧密连锁,为共分离分子标记,为快速准确鉴定杂种弱基因Hw3的存在与否提供了有力工具。(2)、本发明分子标记为共显性分子标记,可以直接对杂种弱势基因的基因型进行鉴定,可以准确判断Hw3基因位点是杂合还是纯合,选择准确性高,可靠性强。(3)、本发明分子标记不受时间和环境条件限制,可以在早期对Hw3基因进行鉴定。(4)、本发明鉴定方法简单,可以对材料进行大规模鉴定,省时省力,成本低。
附图说明
图1.本发明以M12-F和M12-R为引物对不同材料进行PCR扩增的电泳图谱;其中1为RGD-7S,2为泰丰B。
图2.本发明以M12-F和M12-R为引物对不同材料进行PCR扩增的电泳图谱;其中1为BL122,2为RGD-7S,3为荣丰B,4为吉丰B,5为安丰B,6为155B,7为广恢998,8为T775,9为T555,10为T553,11为D638,12为D466,13为抗998,14为D618,15为R3922,16为D508,17为蜀恢527,18为V6038,19为广恢290,20为R290G,21为泰丰B。
具体实施方式
实施例1籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记的筛选
按照如下方法进行:
(1)、根据产生杂种弱势的亲本材料RGD-7S和泰丰B的全基因组重测序结果,并结合对杂种弱势基因Hw3的定位结果(Chr.11:26689171-26829741,基于日本晴序列IRGSP-1.0版本)(Fu等,PLoS one,2013,8:e73886),选择在RGD-7S和泰丰B之间在第11染色体长臂的候选区间内发生了大于10个碱基插入/缺失的位点(见表1),利用primer5软件基于基因组重测序结果设计了5对引物(见表2)。
表1基于基因组重测序结果在Hw3基因候选区间内找到的INDEL位点
染色体(标记) | 物理位置 | RGD-7S | 泰丰B | 插入/缺失的序列 |
11(M11) | 26774337 | 缺失 | -TGCTGCGGCGGC | |
11(M12) | 26788981 | 缺失 | -CTAAAATACAAAATGATTATTTA | |
11(M20) | 26781024 | 缺失 | -GTGTTCATCTCAT | |
11(M13) | 26803386 | 插入 | +CTCAAGGTCTAATATGAGTG | |
11(M16) | 26821238 | 缺失 | -GACCCTGAGCCTCATGTAAA |
表2基于表1中的INDEL位点设计的相应引物
标记 | 正向引物(F) | 反向引物(R) | 产物大小(bp) |
M11 | TCACATCACGGAGCAGGAG | AAACGGAGGAGAGGCAAGA | 141 |
M12 | AGAGAGAGGGGGAAGAGAGA | GGGAATGTTTCAGGTGCGAC | 202 |
M13 | CCTGAAGTTCCCGAAGATTT | ACGAGCATTGGAACTCAGAT | 138 |
M16 | TAATAGTCGTGTCCGAGATGG | CAACCCGAAAGCAAGAACT | 156 |
M20 | TCCTTGTGGTGGTGCCTCA | GGTCTCGTCATCTGCTTCAA | 429 |
(2)、以RGD-7S和泰丰B的基因组DNA为模板,以设计的这5个分子标记的相应引物(见表2)进行PCR扩增。其中PCR反应体系为:基因组DNA模板(10ng/ul)2ul,10X PCR buffer2.5ul,sdNTPs(2.5mM)2ul,引物(mixed)(5pM)2ul,Taq酶(5U/ul)0.2ul,ddH2017.3ul;其反应程序为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃,30sec,30个循环;72℃10min。PCR扩增完毕后加入2.5ul上样缓冲液,用3%的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳1小时,用凝胶成像系统收集PCR扩增结果,判断这些分子标记在RGD-7S和泰丰B中的多态性。
结果(见图1)仅有M12标记在RGD-7S和泰丰B之间表现为共显性;同时测序结果也证明了在泰丰B基因组的候选区间内存在大片段的缺失,且Hw3的候选基因LOC_Os11g44310(物理位置Chr.11:26777812-26783973)在泰丰B中是缺失的(Fu等.,PLoS one,2013,8:e73886)。分子标记M12距离Hw3的候选基因的物理距离仅为5kb。因此,与杂种弱势基因Hw3紧密连锁的M12可作为筛选Hw3的分子标记。
实施例2:利用分子标记M12对杂种弱势基因Hw3进行鉴定的验证试验
按照如下方法进行:
(1)、2011年10月在广州,以携带有Hw3基因的RGD-7S为母本,以泰丰B为父本进行人工杂交,得杂种F1代。
(2)、2012年3月将RGD-7S、泰丰B及其杂种F1在广州种植,杂种F1植株表现杂种弱势,并以泰丰B为父本进行了回交,获得了BC1F1代。同年7月份种植BC1F1代,11月收获得BC1F2代。
(3)、2013年3月将收获的BC1F2种成群体,插秧后15天随机选取292个单株调查表型。同时取这些的单株的叶片提取基因组DNA,以基因组DNA为模板,以M12-F和M12-R为引物进行PCR扩增,所述的引物序列为:
M12-F:5'AGAGAGAGGGGGAAGAGAGA 3'(SEQ ID No:2),
M12-R:5'GGGAATGTTTCAGGTGCGAC 3'(SEQ ID No:3)。
其中PCR反应体系为:基因组DNA模板(10ng/ul)2ul,10X PCR buffer2.5ul,sdNTPs(2.5mM)2ul,引物(mixed)(5pM)2ul,Taq酶(5U/ul)0.2ul,ddH2017.3ul;其PCR反应程序为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,30个循环;72℃10min。PCR扩增完毕后加入上样缓冲液2.5ul,用3%的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳1小时,用凝胶成像系统收集PCR扩增结果,根据是否有分子标记M12判断Hw3的基因型。
(4)根据该类杂种弱势的主要表型特点(长势弱,叶片颜色淡,叶片上出现斑点状退绿)对具有与RGD-7S一致带型(分子标记M12)的单株进行田间调查,观察这些单株是否表型杂种弱势。
结果在所检测的292个单株中,检出与分子标记M12在RGD-7S带型一致的纯合单株共74株,同时表现出RGD-7S和泰丰B的杂合带型的单株共147株。表型调查发现,这些检测出带有分子标记M12的单株均表现出不同程度的杂种弱势表型。说明本发明分子标记M12可用作鉴定杂种弱势基因Hw3的分子标记。
实施例3利用籼稻品种间弱势基因的分子标记M12对带有杂种弱势基因的育种材料的鉴定筛选试验
(一)、试验地点:广州市广东省农科院水稻所铁路南试验基地。
(二)、试验材料:抗病基因供体材料BL122、RGD-7S、荣丰B、吉丰B、安丰B、155B、广恢998及其改良系T775、T555、T553、D638、D466、恢复系3922及其改良系D508、蜀恢527及其后代材料V6038、广恢290及其后代材料290G、V8214以及泰丰B。
(三)、试验方法
(1)、以泰丰A/B为母本,分别与BL122、RGD-7S、荣丰B、吉丰B、安丰B、155B、广恢998及其改良系T775、T555、T553、D638、D466、抗998、D618、恢复系3922及其改良系D508、蜀恢527及其后代材料V6038、广恢290及其后代材料290G和RGD-7S(见表3)进行杂交,收获,得杂种F1代。
(2)、分别在2012、2013和2014年3月份将收获的杂种F1代在广州种植,插秧后15天观察这些杂种F1表型。调查这些杂种F1材料是否表现杂种弱势。
(3)、提取步骤(1)所述亲本材料的叶片基因组DNA,以M12-F和M12-R为引物进行PCR扩增,其中引物M12-F和M12-R的序列为:
M12-F:5'AGAGAGAGGGGGAAGAGAGA 3'(SEQ ID No:2),
M12-R:5'GGGAATGTTTCAGGTGCGAC 3'(SEQ ID No:3)。
上述PCR的反应体系为:基因组DNA模板(10ng/ul)2ul,10X PCR buffer2.5ul,sdNTPs(2.5mM)2ul,引物(mixed)(5pM)2ul,Taq酶(5U/ul)0.2ul,ddH2017.3ul;其反应程序为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,30个循环;72℃10min。PCR扩增完毕后加入2.5ul上样缓冲液,用3%的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳1小时,用凝胶成像系统收集PCR扩增结果,依据分子标记M12判断Hw3的基因型。
结果(见图2)荣丰B、广恢998、3922、蜀恢527以及广恢290与泰丰A的杂交F1代表现正常,这些亲本材料中不存在分子标记M12,其带型与泰丰A/B的带型一致;其他材料与泰丰A的杂交F1代均表现为杂种弱势,这些材料中具有分子标记M12,其带型与RGD-7S的带型一致,鉴定的准确性到达100%。说明本发明分子标记M12能准确鉴定杂种弱势基因Hw3,可用于对杂种弱势基因Hw3的鉴定。
表3用于检测的水稻材料及其杂种F1在早季的表型结果
序号 | 材料 | 与泰丰A/B的杂交F1代在早季表型 |
1 | BL122 | 杂种弱势 |
2 | RGD-7S | 杂种弱势 |
3 | 荣丰B | 正常 |
4 | 吉丰B | 杂种弱势 |
5 | 安丰B | 杂种弱势 |
6 | 155B | 杂种弱势 |
7 | 广恢998 | 正常 |
8 | T775 | 杂种弱势 |
9 | T555 | 杂种弱势 |
10 | T553 | 杂种弱势 |
11 | D638 | 杂种弱势 |
12 | D466 | 杂种弱势 |
13 | 抗998 | 杂种弱势 |
14 | D618 | 杂种弱势 |
15 | R3922 | 正常 |
16 | D508 | 杂种弱势 |
17 | 蜀恢527 | 正常 |
18 | V6038 | 杂种弱势 |
19 | 广恢290 | 正常 |
20 | R290G | 杂种弱势 |
21 | 泰丰B | CK |
Claims (7)
1.用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记,其特征在于所述的分子标记由SEQID No:1所示的核苷酸序列组成;其中所述的杂种弱势基因是指Hw3。
2.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物对,其特征在于所述的引物对由SEQ IDNo:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列组成。
3.用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的试剂盒,其特征在于包括由SEQ ID No:2和SEQID No:3所示的核苷酸序列组成的引物对。
4.权利要求1所述的分子标记在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用;其中所述的杂种弱势基因是指Hw3。
5.权利要求2所述的引物对在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用;其中所述的杂种弱势基因是指Hw3。
6.利用权利要求1所述的分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因材料的方法,其特征在于包括以被鉴定籼稻材料的总DNA为模板,以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,电泳,PCR扩增产物中具有权利要求1所述分子标记的,即为带有籼稻品种间杂种弱势基因的材料。
7.利用权利要求1所述的分子标记培育水稻品种的方法,其特征在于包括以从杂交后代或自交后代的幼苗提取的基因组DNA为模板,以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增,电泳,淘汰具有权利要求1所述分子标记的材料,保留不带权利要求1所述分子标记的材料进入下一代,直至育成新的不含杂种弱势基因的水稻品种。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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