CN107475254A

CN107475254A - 一种水稻早熟等位基因、其分子标记及应用

Info

Publication number: CN107475254A
Application number: CN201710903550.8A
Authority: CN
Inventors: 曾生元; 龚红兵; 李闯; 杜灿灿; 景德道; 林添资; 余波; 钱华飞; 姚维成; 孙立亭; 周义文
Original assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Current assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明公开了一种水稻早熟等位基因、其分子标记及应用。水稻早熟等位基因命名为early heading date 5(ehd5)/OsphyB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的分子标记能够区分所述水稻早熟等位基因距离起始编码位点831‑832bp处TG/GT碱基的变异，引物碱基序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明涉及的早熟基因是一种新的等位基因，在两系杂交水稻制种过程中利用该等位基因有利于提升水稻制种的安全系数，采用分子标记辅助将该等位基因导入常规粳稻中则有助于选择早熟新品系。

Description

一种水稻早熟等位基因、其分子标记及应用

技术领域

本发明属于水稻遗传育种领域，具体涉及一种水稻早熟等位基因、分子标记及其应用。

背景技术

因不受恢保关系的限制，两系法杂交水稻配组更加自由，因此有更大机率选育出强优势、好品质、多抗性杂交组合。自20世纪90年代起，我国两系杂交稻发展迅猛，据农业部全国农作物主要品种推广情况的统计资料，1993年到2009年共有121个两系组合年推广面积达到或者超过6700公顷(10万亩)，累计推广面积达到2097.4万公顷(3.15亿亩)。据统计，2002-2009年的8年中，有7年是两系杂交水稻单个品种推广面积最大，有1年(2004年)是三系杂交水稻第一，两系杂交水稻位居第二。

尽管水稻两用核不育系选育和两系杂交水稻育种技术已经比较成熟，然而在生产过程中仍存在诸多影响两系杂交稻持续健康发展的问题，其中最为突出的是两系杂交稻制种不安全问题。目前生产上两系不育系的不育临界温度一般在为22.5-23.5℃，耐受低温时间一般为3d左右。在江苏、安徽等地，8月底最低温度则极有可能连续降至不育系不育起点温度以下，造成两系不育系部分可育，而当前大面积应用的两系制种父本9311(扬稻6号)等在5月上中旬播种(提早播种有可能遇上苗期持续低温)的情况下抽穗扬花期一般在8月15日至8月23日左右，一旦8月底或9月初降温，造成处于尾花的不育系部分可育，则会造成制种失败，在导致直接经济损失的同时还会影响来年用种安全。如2009年和2011年因8月下旬低温，江苏盐城有近6700公顷两系杂交制种失败，年直接经济损失超亿元，并进一步影响到来年杂交稻用种安全，间接损失无法估计。

如果在播期不提前的情况下可以将父本抽穗期提前7-10天，即在8月10日左右抽穗，则即使遇上8月底连续低温，不育系已结束抽穗，避免了部分可育的现象，即使极少数不育系可育，杂交种子也处于黄熟期，可提早收获避免不育系可育籽粒灌浆成熟，充分保障制种安全。

另一方面，随着耕作方式变化等因素的出现，目前生产上为了保证粮食周年高产，人们对早熟常规粳稻的需求日益旺盛。

发明内容

发明目的：为了解决上述两系杂交稻制种不安全问题及培育早熟常规稻新品系的问题，本发明的目的之一是提供一种水稻早熟等位基因；本发明的目的之二是提供所述水稻早熟等位基因在两系杂交稻制种中、培育早熟水稻新品系中的应用；本发明的目的之三是提供所述水稻早熟等位基因的分子标记。本发明的目的之四是提供所述水稻早熟等位基因的分子标记引物、检测方法及在分子标记辅助选择育种中的应用。

技术方案：本发明所述的水稻早熟等位基因，命名为early heading date 5(ehd5)/OsphyB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

申请人2013年利用⁶⁰Co-γ射线辐照两系恢复系镇恢832(植物品种权号：CNA20100442.0)干种子，得到3株早熟突变体，经过4代自交，发现突变体可稳定遗传，与野生型镇恢832相比，突变体抽穗期提前8-10d，单本栽插情况下单株有效穗数减少1-2个，植株高度无显著变化。等位测验分析表明这3株早熟突变体等位，遗传分析证明该突变性状受1对隐性基因控制，通过突变体与武育粳3号杂交得到的F₂及BC₂F₂群体，我们已成功地将该基因定位于第3染色体51kb的区域内，位于分子标记BLA3-24及BLA3-27之间，根据http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin网站的基因注释，定位区间内含有7个开放式阅读框(ORF)，通过测序我们发现突变体与野生型在其中一个候选基因OsPhyB(水稻B类光敏色素基因，LOC_Os03g19590)内存在2个碱基的差异，参照基因命名的通用惯例，我们将该基因命名为Early Heading Date 5(EHD5)/OsPhyB。

本发明还提供了所述水稻早熟等位基因在培育早熟水稻新品系中的应用。

将目的基因-水稻早熟等位基因转入到常规水稻品种如中熟或晚熟常规稻品种中，可以使水稻生育期提前，且对植株形态、主要产量性状方面基本不会造成影响。转入方法可以是通过分子生物学方法获得转基因水稻，也可以通过常规育种的方法。

所述常规育种的方法，可以是将含所述水稻早熟等位基因的水稻材料与常规水稻品种通过杂交、自交、回交等方法培育早熟化水稻品种。例如，以本申请发现的突变体为供体，粳稻品种镇稻88、武育粳3号、镇稻18号作为受体，每次回交后代选取具有目的基因的单株进行下一次回交，经一次杂交和3次回交、再自交，可获得了含有早熟等位基因ehd5的纯系，性状观测发现所有含纯合早熟等位基因的品系较受体品种生育期可提前6-10天。

本发明还提供了所述水稻早熟等位基因在两系杂交稻制种中应用。

将含所述水稻早熟等位基因的水稻材料与制种水稻材料杂交制种，由于水稻早熟等位基因可使水稻抽穗提前，可提高两系杂交稻的制种安全性。例如，本申请的突变体材料可代替其野生型镇恢832用于杂交稻制种，其与两系不育系Y58S、培矮64S分别配制的杂交稻在植株形态、生育期、主要产量性状方面均无差异。在制种过程中，由于两系不育系父本镇恢832扬花期偏迟(通常在5月10号播种的情况扬花期在8月18至8月23日)，可能会遇到8月底或9月初低温导致两系不育系部分可育，威胁制种安全。以突变体代替野生型镇恢832作为制种父本，在相同播期下，突变体扬花期可提前8-10天，所以完全可以避免上述情况，增加制种安全系数。

本发明还提供了所述的水稻早熟等位基因的分子标记，所述的分子标记能够区分所述水稻早熟等位基因距离起始编码位点831-832bp处TG/GT碱基的变异。所述的分子标记可由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列的引物对水稻基因组DNA扩增后经内切酶Mbo1酶切产生。

上述标记在水稻早熟等位基因的发现，具体包括以下步骤：

1)突变体的获得与性状测定：2013年利用⁶⁰Co-γ射线辐照两系恢复系镇恢832(植物品种权号：CNA20100442.0)，得到3株早熟突变体，经过4代自交，发现突变体可稳定遗传，与野生型镇恢832相比，突变体抽穗期提前8-10d，单本栽插情况下单株有效穗数减少1-2个，多本栽插情况下变化不明显，其它农艺性状无显著变化；

2)遗传分析及定位群体的构建：将突变体与野生型杂交，种植F₁，自交获得F₂，调查性状，遗传分析证明该突变体受1对隐性基因控制。将突变体与粳稻品种武育粳3号杂交，检测回交、自交，得到F₂及BC₂F₂群体，分别播种亲本、F₁、F₂、BC₂F2，调查主要农艺性状及获取定位群体；

3)突变体基因的遗传分析与分子标记定位：简单序列重复标记(SSR)根据McCouch构建的SSR连锁图获得，插入缺失标记(Indel)及酶切扩增多态性序列(CAPS或dCAPS)标记运用Primer5.0软件自行设计；通过对突变体/武育粳3号F₂及BC₂F₂群体隐性极端个体的标记检测，最终将该基因精细定位于水稻第3染色体上51kb的物理区间内，参照基因组注释，其中含有7个ORF。

4)参照注释，我们对基因号为LOC_Os03g19590(OsPhyB基因)的基因组全长进行了DNA序列测定，测序结果发现与野生型序列相比，突变体在候选基因OsPhyB编码区第1外显子内发生了2个碱基的替换(距起始编码位点831-832bp处)，即TG替换成GT，导致了突变体基因转录提前终止，根据这一序列差异，设计了所述的分子标记。

本发明还提供了所述水稻早熟等位基因的分子标记引物，上游引物、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种所述的水稻早熟等位基因的分子标记方法，包括:利用SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列的引物对待检测水稻基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行酶切，如果PCR产物能够完全被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻为携带所述水稻早熟等位基因的纯合子，如果PCR产物能够部分被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻为携带所述水稻早熟等位基因的杂合子，如果PCR产物不能够被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻不携带所述的水稻早熟等位基因。

PCR扩增的体系为：模板DNA 3.0μL，10×PCR的缓冲液4.0μL，2mM的dNTP 2.0μL，0.3μM的上下游引物各2.0μL，Taq酶1.0U，加ddH₂O补足50μL。

PCR扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，10℃保温。

酶切体系及条件参照内切酶说明。

本发明还提供了所述水稻早熟等位基因的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用。

值得注意的是，本发明技术方案的实现并不依赖镇恢832的突变体材料。

有益效果，与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明的水稻早熟基因是专利权人通过辐射突变自有品种权的品种镇恢832获得的一个新的等位基因，是一种新的种质资源。

(2)由于本发明所述突变体受一对隐性基因控制，与野生型相比除了熟期变早以外没有明显产量方面的缺点，可直接代替其野生型镇恢832用于杂交稻制种，而杂交稻的杂种优势不受影响；也可以利用该基因作为基因资源培育早熟常规水稻新品系。

(3)本发明针对水稻早熟等位基因ehd5设计了基因内分子标记Phy-dCAPs1，可精确判定目标个体是否携带该等位基因，特别是在回交育种中可以提高育种效率，加快育种进程。

附图说明

图1：野生型(左)为与突变体(右)抽穗期的植株形态比较；

图2：野生型(WT)为与突变体(MT)在长日照(句容正季)和短日照(冬季海南)条件下的抽穗期比较；

图3：参考基因组日本晴(NIP)、野生型(WT)与突变体(mutant)的序列差异。

图4：利用Phy-dCAPs1标记扩增野生型与突变体酶切前后的电泳图谱(其中M为上海捷瑞公司100bp-I DNA ladder Marker，1号及2号泳道为野生型及突变体酶切前产物电泳条带，3号及4号泳道为野生型及突变体酶切后电泳条带)。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明：

1、材料方法

1.1植物材料和田间试验

镇恢832是江苏丘陵地区镇江农科所选育的一个杂交中籼两用恢复系，主要用于配制两系杂交稻，用其作父本已审定杂交稻组合Y两优832(Y58S/镇恢832)，镇恢832植物品种权号为：CNA20100442.0。2013年利用⁶⁰Co-γ射线辐照镇恢832干种子，得到3株早熟突变体，经过4代自交，发现突变体可稳定遗传，与野生型镇恢832相比，突变体抽穗期提前8-10d，单本栽插情况下单株有效穗数减少1-2个，多本栽插情况下变化不明显，其它主要产量性状无显著变化。

1.2分子标记和总DNA的提取

水稻叶片总DNA的提取采用SDS法进行。

简单序列重复(SSR)标记根据McCouch等构建的SSR连锁图获得，插入缺失(InDel)标记运用Primer5.0软件自行设计。所有SSR、InDel、CAPS标记均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。用于一般标记检测的PCR反应体系和反应条件参照Panaud等方法，PCR反应体系和程序为：PCR扩增采用10μL的反应体系，其中模板DNA 2.0μL，10×PCR的缓冲液1.2μL，2mM的dNTP 0.5μL，0.3μM的上下游引物各1.0μL，Taq酶0.5U，加ddH₂O补足10μL；PCR扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55-60℃退火30s(温度因引物不同而异)，72℃延伸40s(不同长度的预期产物按1kb/min调整延伸时间)，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，10℃保温。PCR反应产物经8％垂直平板聚丙烯酰胺凝胶上电冰后0.1％硝酸银染色观测。

dCAPS标记的检测方法：PCR扩增采用50ul体系，其中模板DNA 3.0μL，10×PCR的缓冲液4.0μL，2mM的dNTP 2.0μL，0.3μM的上下游引物各2.0μL，Taq酶1.0U，加ddH₂O补足50μL，扩增程序同上。反应产物首先取10ul经3％琼脂糖电泳检测，经拍胶观察确认扩增片段的正确后，参照Mbo1酶的反应体系(NEB公司，Cut Smart酶)，即内切酶1.0ul；DNA产物15ul，Buffer 5.0ul，加水补足30ul，扩增产物37℃酶切30min后连同酶切前产物作为对照采用3％琼脂糖电泳检测拍胶。

1.3遗传分析及定位群体的构建

遗传分析群体的构建：突变体与野生型亲本正交，同时以野生型亲本与突变体反交，种植相应的F₁群体，自交获得F₂群体，根据F₁及F₂群体的性状及性状分离比例进行遗传统计分析。

定位群体的构建：用突变体与形态差异较大、生育期较长的粳稻亲本武育粳3号杂交，F₁自交获得F₂群体，从中选取30株显性正常植株和248株纯合隐性植株构成定位群体，分单株取叶片提取总DNA。

1.4EHD5的基因定位

从突变体/武育粳3号F₂群体中获得的植株中随机选取正常和突变株各10个作为正常和突变基因池，利用两亲本间具有多态的SSR标记筛选连锁标记。确定EHD5基因所在染色体片段，进一步密集标记，根据248株F₂定位单株对应的分子标记分离数据，初步定位。

由于突变体/武育粳3号F₂群体遗传背景复杂，在取极端早熟个体时难以准确判断，所以我们根据初步定位结果利用两侧标记进行分子标记辅助选择，筛选含目标区段的杂合个体与受体亲本武育粳3号回交2次以纯化背景，之后自交得到BC₂F₂群体，在BC₂F₂群体中又获得437个极端个体。

用开发的InDel标记，对上述437个极端个体进行标记检测分析，根据单株对应的分子标记分离数据，最终完成了精细定位。

1.5生物信息学与基因测序

参照Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站对目标区段内基因进行功能的预测分析。

选择相应预测的基因，设计引物分别扩增突变体和野生型品种DNA，每个片段在1200-2600bp左右，PCR产物连到pMD18-T载体上进行测序，测序结果用Vector NTI 9.0及Cluster W软件比对分析。PCR产物回收采用TAKARA回收试剂盒，序列测定在南京金斯瑞生物有限公司完成。

1.6突变位点SNP标记的设计

根据测序结果，发现突变体与野生型存在两个SNP(单碱基核苷酸)差异，所以无法设计InDel标记(插入缺失标记)，只能开发基于SNP的CAPS或者dCAPS标记。根据dCAPs-finder 2.0网站(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)的分析，我们开发了一对dCAPS，用于检测突变体与野生型的序列差异。

1.7早熟等位基因的应用

由于本研究早熟突变体受一对隐性基因控制，且与野生型相比除了熟期变早以外没有明显的缺点，我们直接用突变体代替其野生型镇恢832用于杂交稻制种。

利用该基因作为基因资源培育早熟水稻新品系方面。根据测序结果，我们开发dCAPS用以检测突变位点并实现对早熟等位基因的定向筛选。以突变体为供体，粳稻品种镇稻88、武育粳3号、镇稻18号作为受体，每次回交后代均用分子标记选择，选取具有目的基因的的单株进行下一次回交，经一次杂交和3次回交、再自交，我们获得了含有早熟等位基因ehd5的纯系。

2结果分析

2.1突变体的表型特征

2013年正季利用⁶⁰Co-γ射线辐照两系恢复系镇恢832干种子，2013年冬季海南岛加代(M₁代)，2014年在M₂代群体得到3株早熟突变体，经过4代自交，发现突变体可稳定遗传。

将3株早熟突变体种植成株系，发现3个株系表现一致。2015年3个突变体株系的抽穗期在句容正季比镇恢832提前10d，2015年冬季海南岛条件下突变体株系的抽穗期比镇恢832提前8d；其它主要产量性状方面：单本栽插情况下单株有效穗数减少1-2个，多本栽插情况下变化不明显，其它主要产量性状无显著变化。图1为野生型(左)为与突变体(右)抽穗期的植株形态比较。图2为野生型(WT)为与突变体(MT)在长日照(句容正季)和短日照(冬季海南)条件下的抽穗期比较。

2.2突变性状的遗传分析

突变体经4代(2014年至2016年)自交确定突变体性状可稳定遗传，2015年将3个株系相互杂交，发现F₁均可表现出突变性状，因此说明这3个突变体是等位的。2015年用突变体与野生型亲本镇恢832正反交，F₁植株表现为正常，F₂可区分为差异明显的正常植株和早熟植株两组，经卡方(χ2)测验，其分离比例均符合3﹕1(1512：488)，表明该突变性状由1对隐性核基因控制。

2.3基因的分子标记定位

以突变体/武育粳3号的F₂作为初步定位群体。选用两亲本间表现出多态的178对均匀分布于水稻12条染色体上的SSR标记，分析突变体/武育粳3号F₂群体中获得的植株中随机选取正常和突变株各10个正常和突变基因池，结果发现，位于水稻第3染色体上的SSR标记RM6291、RM282与EHD5基因有连锁关系。进一步开发InDel标记，由于突变体/武育粳3号F₂群体遗传背景复杂，在取极端早熟个体时难以准确判断，所以会出现较多的矛盾个体，根据248株F₂定位单株对应的分子标记分离数据，我们只能确定EHD5基因位于InDel标记In3-14与SSR标记RM282之间的区域内，这两个标记物理距离较大，还有约2Mb。

为了精细定位EHD5基因，我们根据初步定位结果，利用两侧标记In3-14与RM282进行分子标记辅助选择，筛选含目标区段的杂合个体与受体亲本武育粳3号回交2次以纯化背景，之后自交得到BC₂F₂群体，在BC₂F₂群体中又获得437个极端个体。同时在In3-14与RM282之间开发标记，我们又获得了15对多态性InDel标记。利用这17个InDel标记对437个BC₂F₂定位群体进行扩增，结果表明，在分子标记BLA3-24和BLA3-27中各检测到1个重组单株，在BLA3-25座位上未检测到重组单株。

根据BC₂F₂定位群体的突变性状和分子标记的分离数据，我们将EHD5基因限定在BLA3-24和BLA3-27之间(表1)。这2个标记所在克隆分别为AC134769和AC137071，据此我们构建了覆盖EHD5基因的物理图谱，成功地将EHD5基因限定在约51kb的范围内。

表1本研究的部分多态标记

2.4候选基因的初步确定

参照Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站分析，发现定位区间内存在7个开放式阅读框(ORF)，其中LOC_Os03g19590编码OsPhyB基因(水稻B类光敏色素基因)，根据已有报道，其功能与生育期调控存在紧密相关性。

由于OsPhyB基因全长有近8500bp(参考基因组日本晴序列，转录起始位点至终止位点为7368bp)，所以我们设计了4对引物分别扩增突变体和野生型品种DNA，片段长度在1256-2665bp之间(表2)，PCR产物回收采用TAKARA试剂盒回收后连到pMD18-T载体上进行测序，序列测定在南京金斯瑞生物有限公司完成。测序结果用Vector NTI 9.0及Cluster W软件比对分析。

根据比对结果，我们发现突变体与野生型在OsPhyB基因第一个外显子内存在两个SNP(单碱基核苷酸)差异，即由TG突变为GT，导致了突变体基因转录提前终止。基于这一序列差异，结合dCAPS-finder 2.0网站的分析，我们开发了一对dCAPS标记Phy-dCAPs1，所用的内切酶为Mbo1，用Phy-dCAPs1分别扩增野生型与突变体，对产物再用内切酶Mbo1酶切，发现突变体可以切开，而野生型无法切开，从而验证了测序结果的准确性。图3为参考基因组日本晴(NIP)、野生型(WT)与突变体(mutant)的基因及编码产物的序列差异。图4为采用Phy-dCAPs1标记扩增野生型与突变体酶切前后的电泳图谱(其中M为上海捷瑞公司100bp-IDNA ladder Marker，1号及2号泳道为野生型及突变体酶切前产物电泳条带，3号及4号泳道为野生型及突变体酶切后电泳条带)。

表2本研究的基因测序标记及基因内筛选标记

2.4基因的育种利用

本研究早熟突变体受一对隐性基因控制，且与野生型相比除了熟期变早以外没有明显的缺点，我们直接用突变体代替其野生型镇恢832用于杂交稻制种。对杂交种F₁的性状观测显示：用突变体、野生型亲本镇恢832与两系不育系Y58S、培矮64S分别配制的杂交稻在植株形态、生育期、主要产量性状方面均无差异，突变体播始历期在92-96天，2016年5月10日播种突变体8月10号左右抽穗，而同时期情况下镇恢832在8月19日左右抽穗。

利用该基因作为基因资源培育早熟水稻新品系方面：用Phy-dCAPs1标记检测突变位点并实现对早熟等位基因的定向筛选。以突变体为供体，粳稻品种镇稻88、武育粳3号、镇稻18号作为受体，每次回交后代均用分子标记选择，选取具有目的基因的单株进行下一次回交，经一次杂交和3次回交、再自交，我们获得了含有早熟等位基因ehd5的3个不同遗传背景的纯系，性状观测发现所有含纯合早熟等位基因的品系较受体品种生育期可提前6-10天，可作为早熟化育种的基因资源。

本发明仅列举了一个实施例作为专利实施的具体案例，显而易见，所有利用该基因资源或其相应筛选标记的遗传改造及育种利用均可落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所

<120> 一种水稻早熟等位基因、其分子标记及应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7368

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcctcgg gtagccgcgc cacgcccacg cgctccccct cctccgcgcg gcccgcggcg 60

ccgcggcacc agcaccacca ctcgcagtcc tcgggcggga gcacgtcccg cgcgggaggg 120

ggtggcgggg gcgggggagg gggagggggc ggcgcggccg ccgcggagtc ggtgtccaag 180

gccgtggcgc agtacaccct ggacgcgcgc ctccacgccg tgttcgagca gtcgggcgcg 240

tcgggccgca gcttcgacta cacgcagtcg ctgcgtgcgt cgcccacccc gtcctccgag 300

cagcagatcg ccgcctacct ctcccgcatc cagcgcggcg ggcacataca gcccttcggc 360

tgcacgctcg ccgtcgccga cgactcctcc ttccgcctcc tcgcctactc cgagaacacc 420

gccgacctgc tcgacctgtc gccccaccac tccgtcccct cgctcgactc ctccgcggtg 480

cctccccccg tctcgctcgg cgcagacgcg cgcctccttt tcgccccctc gtccgccgtc 540

ctcctcgagc gcgccttcgc cgcgcgcgag atctcgctgc tcaacccgct ctggatccac 600

tccagggtct cctctaaacc cttctacgcc atcctccacc gcatcgatgt cggcgtcgtc 660

atcgacctcg agcccgcccg caccgaggat cctgcactct ccatcgctgg cgcagtccag 720

tctcagaagc tcgcggtccg tgccatctcc cgcctccagg cgcttcccgg cggtgacgtc 780

aagctccttt gcgacaccgt tgttgagtat gttagagagc tcacaggtta gtaccgcgtt 840

atggtgtaca ggttccatga ggatgagcat ggagaagtcg ttgccgagag ccggcgcaat 900

aaccttgagc cctacatcgg gttgcattat cctgctacag atatcccaca ggcatcacgc 960

ttcctgttcc ggcagaaccg tgtgcggatg attgctgatt gccatgctgc gccggtgagg 1020

gtcatccagg atcctgcact aacacagccg ctgtgcttgg ttgggtccac gctgcgttcg 1080

ccgcatggtt gccatgcgca gtatatggcg aacatgggtt ccattgcatc tcttgttatg 1140

gcagtgatca ttagtagtgg tggggatgat gatcataaca tttcacgggg cagcatcccg 1200

tcggcgatga agttgtgggg gttggtagta tgccaccaca catctccacg gtgcatccct 1260

ttcccactac ggtatgcatg cgagttcctc atgcaagcct ttgggttgca gctcaacatg 1320

gagttgcagc ttgcacacca actgtcagag aaacacattc tgcggacgca gacactgctg 1380

tgtgatatgc tactccggga ttcaccaact ggcattgtca cacaaagccc cagcatcatg 1440

gaccttgtga agtgtgatgg tgctgctctg tattaccatg ggaagtacta ccctcttggt 1500

gtcactccca cagaagttca gattaaggac atcatcgagt ggttgactat gtgccatgga 1560

gactccacag ggctcagcac agatagcctt gctgatgcag gctaccctgg tgctgctgca 1620

ctaggagatg cagtgagtgg aatggcggta gcatatatca cgccaagtga ttatttgttt 1680

tggttccggt cacacacagc taaggagata aagtggggtg gtgcaaagca tcatccagag 1740

gataaggatg atggacaacg aatgcatcca cgatcatcgt tcaaggcatt tcttgaagtt 1800

gtgaagagta ggagcttacc atgggagaat gcggagatgg atgcaataca ttccttgcag 1860

ctcatattgc gggactcttt cagagattct gcagagggca caagtaactc aaaagccata 1920

gtgaatggcc aggttcagct tggggagcta gaattacggg gaatagatga gcttagctcg 1980

gtagcaaggg agatggttcg gttgatcgag acagcaacag tacccatctt tgcagtagat 2040

actgatggat gtataaatgg ttggaatgca aaggttgctg agctgacagg cctctctgtt 2100

gaggaagcaa tgggcaaatc attggtaaat gatctcatct tcaaggaatc tgaggaaaca 2160

gtaaacaagc tactctcacg agctttaaga ggtacctctc ttgtcatgct aattggttgt 2220

tcttgccttt catgttttct tttgcgaata tacacaatac tgtttactcg atattcttta 2280

attacttgga tccctaacct gtaatgctaa tttggttcct cttgcctttc atgtttcata 2340

tggatagtgc acacaatact gtttactcga tattctttaa tgacttgaca tttagacaca 2400

tttgataatt tacaacagtg cccaaaactg acaaagtata ttgagctcat tcagtaggta 2460

catgtaaggc tggaatacta gttatattat tctaaattac ttattcaata caccacagtg 2520

agtttatgtt ttcactaagg ggaagtggta ggactgggtt catgatttgt taatttgttg 2580

ctcatgcagg tgatgaagac aaaaatgtag agataaagtt gaagacattc gggccagaac 2640

aatctaaagg accaatattc gttattgtga atgcttgttc tagcagggat tacactaaaa 2700

atattgttgg tgtttgtttt gttggccaag atgtcacagg acaaaaggtg gtcatggata 2760

aatttatcaa catacaaggg gattacaagg ctatcgtaca caaccctaat cctctcatac 2820

ccccaatatt tgcttcagat gagaatactt gttgttcgga gtggaacaca gcaatggaaa 2880

aactcacagg atggtcaaga ggggaagttg ttggtaagct tctggtcggt gaggtctttg 2940

gtaattgttg tcgactcaag ggcccagatg cattaacgaa attcatgatt gtcctacaca 3000

acgctatagg aggacaggat tgtgaaaagt tccccttttc attttttgac aagaatggga 3060

aatacgtgca ggccttattg actgcaaaca cgaggagcag aatggatggt gaggccatag 3120

gagccttctg tttcttgcag attgcaagtc ctgaattaca gcaagccttt gagattcaga 3180

gacaccatga aaagaagtgt tatgcaagga tgaaggaatt ggcttacatt taccaggaaa 3240

taaagaatcc tctcaacggt atccgattta caaactcgtt attggagatg actgatctaa 3300

aggatgacca gaggcagttt cttgaaacca gcactgcttg tgagaaacag atgtccaaaa 3360

ttgttaagga tgctagcctc caaagtattg aggatgggtt agtattctga acttaccttt 3420

ttctttaact ttaatgaata ctgatccaca ctaatgtctc tgtgtttggg ataacatctg 3480

agaatggcat atgatatccc gttgtgctct tgaaaaaatg tatgttttgt gatcctctcc 3540

tttctttacc ttgtgctaag actaggtgtt gtttggtgtt tcagttggca ctaaccgtta 3600

acctaagcat ggatggaaaa taaggaatta gagaagtccg tcagactgac agctctggtt 3660

cactgtattc atttatctga aaagttctct tgccatgtaa attttatcct tttttagatt 3720

aatgcctgta ttctgtgcat gtgggccttt tatgggaatt tagtttactg tcagaaccct 3780

tcttgtcatt gcagaaatga actaaaacta gttgcccaag tgtagatatc aagcataaaa 3840

ttcatgctaa tatctatatt gctagtatcc taagtacatt gccgtcctca acagcttaac 3900

cttttggcca aaatggttgt tgcatgaaag tcgacatcaa gcagcttact ctaaaaatgc 3960

cattgccacc ctttactctt gtttcataaa tatggtaact atttcttgta aatgctgctg 4020

tacactttac ttgtttgaaa ttttggagat cattctggtt tccttgcatc acttgatcaa 4080

ttcctctcag ctgcatttat tgacaatgaa tgtgcaatgc ttttatcctg aggaagtcac 4140

tactccctct ggttccataa ttcttggtgt tttggacaat gacacggtct ccgaaatata 4200

tctttgagta tatttttcta ttataatact tcctccgtcc caaattaagt taatatagta 4260

cgggatgtga catatcctag tagtaccaaa gtccaagcat agcctaatct agcatagttc 4320

caaataggaa ctcatggctc tgtgatgtat ttttcttgtg tcatttactt ggtgtaattt 4380

cattctaggt agaagcattg tgtgactttt tcgtgtgctg agacatttga actcactgct 4440

aaatttgacg ccttattagt attttaacaa atgattagct gaaagcttat ttgttttttg 4500

tgtttattaa gcagctcttt ggtgcttgag aaaggtgaat tttcactagg tagtgttatg 4560

aatgctgttg tcagccaagt gatgatacag ttgagagaaa gagatttaca acttattcga 4620

gatatccctg atgaaattaa agaagcctca gcatatggtg accaatatag aattcaacaa 4680

gttttatgtg actttttgct aagcatggtg aggtttgctc cagctgaaaa tggctgggtg 4740

gagatacagg tcagaccaaa tataaaacaa aattctgatg gaacagacac aatgcttttc 4800

ctcttcaggt tagctattta tcttcatttt caataccaga aggcaataca tattctcacg 4860

caggaatttc ttgtgttgaa tttggtagag gacaagttaa atatttggtt aaatttatat 4920

tcgttggtca tatttgctgt agcactctag gtaatatttg tgtttatcct gaactattga 4980

tgctctacct acagacacta caaaaaatag attatcctaa ataagatctc ctacatatca 5040

aacatatgta ttatccctgt acatatctga tagactgaag accccaccta tttaagtata 5100

aatatatgca aaatatatgt gtcatgggtt ggctggtcac tctctttgag taaatttgga 5160

agataataaa atacacttgg tttattttct ttgagtaagt gacataaaac gctaggtttt 5220

ggggccttag taacacaaac ccccaagttt tgcaatttgt gtcaaagaac ccaaggcttt 5280

gaggcaaaat gctttataaa gccctagatt tatatacaaa acacttacac gccattataa 5340

tgaaccaaat ttcaactgta tacttacata gatacgcatt cctaatccta ccgtgtagtc 5400

tatttccttc cccactctcc tactgaatga atacacaatg gcaaactcca gttacaaaga 5460

ccagggccgt ctccaggata tgggggcccc agaacaaaat gcaaattgag accctaaatt 5520

tttaaaaaat aatgtgtcat tttcagttat tatataactt taatatgtgt tatttcgtat 5580

gatatttagt acttcctccg tttcaggtta taagactttc tagcattgcc cacattcata 5640

aatatgttaa tgaatctaga catatatata tgtcaagatt cattaacata tatatgaata 5700

tgggcaatgc tagaaagtct tataacctaa aacggaggta gtaatatatt ttcaaatatt 5760

aatggtacaa gagtaaaggt agtactaacc ttatgttcca gtgtaaagca tcatctgctg 5820

aggatttgag gacttcctgt tttataaaaa gggagaagac gttcacatta cttttgattc 5880

gataattatc aatccaatgg aatgatggat cattcaaaat actgtaacag tgtaacttca 5940

ttagccttga ttcaaattag taatcagtaa attatcgatt ccgagtacca actagagcta 6000

ggcctcgcag cctcgtcgcc gctcgccgtt cccattgctc cgcttggcaa catcggcgtt 6060

gtgctgcctg ctgccgtgag gcgtaatgct gtcgctgccg cctgctgtgc tgcacacacg 6120

cagcaagtcg cgtctctcca cgagtgaaca ctaaaaagta aacagttaag acggagcgac 6180

atatgtcttc cgcctgggca cctagcgtag ctcctgatct agggccaggc tgcaggccta 6240

ctccgaggcg ggggccccca aaaatagggg gccttgtgcg gccgccgtgc tcgcacatgg 6300

ccttagacgg ccctgacaaa gacatgttaa ctgggtacat aaatgcacaa acagtcatgc 6360

cgtcaacatc gatacttgtc gagtaggcgg ctaatgcaca aacagtcaag gtactactga 6420

aaaaactacc acatactatt ttgtacagct attatgcata aattccatag ctagctggtt 6480

gatgttgaca caaaatgggg ttctgtgaaa catttgggcc caaaacctgg gttagttgaa 6540

ataaattgca aaatctgggt tcttatgtta ctagtaccac actaccacta aaactgcaga 6600

tttatgaaat ctaccttatg tataattaag cctcctaggc tcttaggaac tgctgctaac 6660

aaaatagtag agatatgata ggattttgac aataggtaac aaatactaag aacaaggaaa 6720

ctagagatgg tatgatcaat taaacttggt ccttatctgt tgaagatggt gttggaactt 6780

tatcttagtg atgccagcta ggaagccctc atacctgctg ctaggtgcta cagtacgcta 6840

ctgttcaccg gtgtccatgg ctagcacacc ctcatggttc cccccccctc caaaaaaaaa 6900

aaagattagt tattacagca tgtaccttcg ttgtaatggt gttgtaaata ataaaatatc 6960

aacaattatt tcttggtgtt ggagtattaa acgtgtgaca ctggtcacca aggtgaatga 7020

tgcttaaaat ttggaatttt ttaattgtct gcactagttc gtgttgttac ttatagtata 7080

gagaacctaa tgactcggca gggaggacca caaactgatc gcttaccatc tatctggttc 7140

tgcaggtttg cctgtcctgg cgaaggcctt cccccagaga ttgttcaaga catgtttagt 7200

aactcccgct ggacaaccca agagggtatt ggcctaagca tatgcaggaa gatcctaaaa 7260

ttgatgggtg gcgaggtcca atatataagg gagtcggagc ggagtttctt ccatatcgta 7320

cttgagctgc cccagcctca gcaagcagca agtaggggga caagctga 7368

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgcagtcca gtctcagaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctgtacacc ataacgcgat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatagcggac tggccaaact 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccacccatgt catcttccat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaggaaaag gatctgaaaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatattgaaa gcttggttcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcaaaaag tttctacatg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttctgcagg aaggagatg 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtatggtgag accgtgagat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtttctcct ctccgtttat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccgttact ccgttagggt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatgggtact gttgctgtct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagaatgcg gagatggatg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaggctatg cttggacttt gg 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagtcactac tccctctggt t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctggcatca ctaagataaa g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaacagtcat gccgtcaaca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agaacaacat cgtccaaagc 20

Claims

1.一种水稻早熟等位基因，其特征在于，命名为early heading date 5(ehd5)/OsphyB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻早熟等位基因在培育早熟水稻新品系中的应用。

3.根据权利要求1所述的水稻早熟等位基因在两系杂交稻制种中应用。

4.根据权利要求1所述的水稻早熟等位基因的分子标记，其特征在于，所述的分子标记能够区分所述水稻早熟等位基因距离起始编码位点831-832bp处TG/GT碱基的变异。

5.根据权利要求4所述的水稻早熟等位基因的分子标记引物，其特征在于，上游引物、下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求4所述的水稻早熟等位基因的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用。

7.一种根据权利要求1所述的水稻早熟等位基因的分子标记方法，其特征在于，包括:利用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列的引物对待检测水稻基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行酶切，如果PCR产物能够完全被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻为携带所述水稻早熟等位基因的纯合子，如果PCR产物能够部分被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻为携带所述水稻早熟等位基因的杂合子，如果PCR产物不能够被内切酶Mbo1切开，则待检测水稻不携带所述的水稻早熟等位基因。