CN110144626A - 一种启动子文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种启动子文库的构建方法,所述方法包括如下步骤:构建含目标启动子和标记蛋白的质粒;根据目标启动子序列,设计每个位点的单点突变引物;以含目标启动子的质粒为模板,以各个位点的突变引物进行PCR扩增,得到含目标启动子的单点突变体;将单点突变体转入宿主细胞中,筛选阳性克隆;选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的阳性克隆,构成启动子文库。本方法可以确定容量中包含目标启动子,降低了人力物力的浪费,该方法廉价、高效、筛选工作量小,且在这个启动子框架下所有可能的强度都可以被推测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种启动子文库的构建方法。
(二)背景技术
分子水平优化细胞代谢工程(Metabolic Engineering)意义在于协调微生物细胞中基因、蛋白、代谢物以及各种信号分子之间的相互作用,从而优化复杂的动态网络。分析和调控代谢过程非常复杂和困难,而传统的基因敲除(Knockout)和过表达(Overexpression)这两种非“开”即“关”的手段又难以实现代谢网络的最优化,因而需要对基因表达进行精密的微调来研究其对细胞表型和代谢流的影响,从而解析出关键的可供改造的代谢节点。精确的“开量”式基因微调作为开展代谢工程研究的重要手段,具有非常广泛的应用空间和研究价值。
启动子(Promoter)是从转录水平调控基因表达的常用元件。尽管诱导型(Inducible) 启动子可通过诱导时间和诱导物浓度在一定程度上调控基因的表达,但这种调节的本质还是只能控制基因转录的开始和停止。而诱导物浓度效应只是增加群体中基因表达的细胞数而非各单个细胞的表达水平,不具有表达的均一性。此外,由于诱导物昂贵的价格以及细胞对诱导物的高度敏感性,使其在工业应用中的可操作性不强。鉴于组成型(Constitutive) 启动子和诱导型(Inducible)启动子都难以在一个较宽的强度范围内连续调控基因的表达强度,近些年来研究者开发了启动子文库(Promoter Library)用以作为对基因表达更为灵活和精确的调控工具。
启动子的碱基序列的改变可直接影响其调控基因转录的强度。而启动子文库就是对调控基因转录的启动子碱基序列进行突变以得到的一系列强度呈梯度分布的人工启动子集合体。一般来说,启动子文库的构建是以报告基因(Reporter Gene,如绿色荧光蛋白GFP基因、半乳糖苷酶基因LacZ等)表征启动子的转录强度,在此基础上建立高通量筛选突变的方法。目前启动子文库的构建方法主要是易错PCR、饱和突变和启动子杂合,这些策略依靠庞大的突变筛选量获得一系列具有不同调控强度的突变启动子,构成能对其下游基因实施“开量”式微调的文库。
启动子文库在代谢工程的研究中已展现了其良好的应用价值。Solem等人利用启动子文库在乳酸乳球菌(LactococculsIatis)中对糖酵解途径pfk基因和位于同一操纵子内的另外两个基因(pyk和Idh)实现了强度递增的表达调控。Keobmann等在大肠杆菌糖酵解途径的研究中,利用启动子文库调控F1-ATP合成酶表达,借助提高ATP酶活水平和ATP的水解,可使糖酵解通量提高70%,从而确定糖酵解途径的主要调控因素是ATP水平。Alper 等在研究蕃茄红素的合成时,发现在野生菌中提高dxs基因(deoxy-xylulose-p synthase,脱氧-磷酸木酮糖合成酶)的表达,只能在一定程度上提高蕃茄红素的产量,而利用启动子文库不断增强dxs基因表达能使蕃茄红素产量不断提高,说明脱氧-磷酸木酮糖合成酶活是重组菌合成途径的限制性因素。Nevoigt等在分析3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)基因GPDl对酿酒酵母甘油产率的影响时发现,通过突变启动子控制GPDH的酶比活变化不超过其野生型的2倍时,菌体的生物量和甘油产率均与GPDH活性正相关,但多拷贝基因的过表达却对细胞生长产生抑制,因此在代谢改造中需要通过启动子文库最优化基因表达水平。
由此可见,通过构建启动子文库,在代谢分析和改造中“开量”式微调基因表达是可行且有效的。此外,启动子工程除了提供不同的转录强度,还可以对目的基因引入在不同条件下的敏感反馈,为生物传感器提供改造基础。启动子文库正在成为代谢工程研究向系统分析和整体优化发展中的有效研究工具,将极大地提升该领域的研究水平,然而目前建立启动子文库主要依靠高通量方法筛选随机突变样本,对筛选得到的样本利用率较低,容易造成资源的浪费。同时,此类方法多以获得高强度的启动子为目的,而较少着眼启动子序列与强度的关联。在此基础上,理性设计构建启动子文库正受到越来越多的关注和研究。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种启动子文库的构建方法,单独突变启动子中的每个碱基,组合突变结果以获得启动子强度跨度理想的启动子文库。本方法利用启动子核心区域对启动子强度的明显影响以及序列长度较短的特性,逐一标定和研究核心区域的碱基对启动子强度的影响,建立不同序列和启动子强度的关系,在构建启动子文库的同时也为理性设计提供支持。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种启动子文库的构建方法,所述方法包括如下步骤:
1)构建含目标启动子(优选pPG3)的质粒,并在多克隆酶切位点插入标记蛋白(优选绿色荧光蛋白),获得含目标启动子和标记蛋白的质粒;
2)根据步骤1)目标启动子序列,设计每个位点的单点突变引物,以获得该位点的所有突变结果可能产生的影响;
3)以步骤1)中含目标启动子的质粒为模板,以步骤2)设计的各个位点的突变引物进行PCR扩增,得到含目标启动子的单点突变体;
4)将步骤3)得到的含目标启动子的单点突变体转入宿主细胞(优选E.coliW3110) 中,涂布到相应抗性的平板中,筛选阳性克隆,得到目标启动子每个单位点突变序列仅存在一个碱基突变的启动子文库;
5)检测多组步骤1)未突变的含目标启动子的质粒的相对荧光值(RFU)和OD600,计算RFU/OD600标准差;检测步骤4)阳性克隆相对荧光值(RFU)和OD600,借助RFU/OD600来衡量启动子元件的强弱,其值越大,启动子强度越强,反之同理;若任意两个阳性克隆 RFU/OD600差值小于标准差,则视为相同位点的突变;选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的阳性克隆构成启动子文库。
进一步,步骤1)中的目标启动子可以是pPG3启动子或其他原核生物的启动子。
进一步,步骤1)中所述标记蛋白选自但不限于:绿色荧光蛋白(GFP)、增效的绿色荧光蛋白(EGFP)或超级折叠荧光蛋白(sfGFP)。
进一步,步骤2)中突变引物将每个位点将突变为N(N=A/T/C/G),或者将位点删除,得到该位点的缺失突变结果。
进一步,步骤4)中,在每个宿主细胞中只转入一个单点突变库,可以有效检测启动子中每个碱基突变产生的影响,而提高转入到同一个宿主细胞的单点突变库数量,则可以提高筛选效率,优选将每4个位点突变质粒共同转入同一个宿主中。所述的宿主细胞应与作为突变模板的启动子的原始宿主种类相同,可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如植物细胞。代表性例子有:酵母,大肠杆菌,动物的组织细胞,植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优先方式,所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
进一步,步骤5)中,选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的突变体,根据 RFU/OD600数值将突变体分成不同的强度梯度,每个梯度选择1个突变体构成表达强度提高的启动子文库。
本发明所述目标启动子优选为pPG3,所述启动子文库构建方法为:
(1)将启动子pPG3与绿色荧光蛋白AcGFP1连接构建重组质粒pPG3-AcGFP1;
(2)根据启动子pPG3序列设计各个碱基突变的引物,每个位点分别突变为N (A/T/C/G),得到每个位点突变的PCR产物(每个PCR产物包含4种突变);PCR反应体系为2×PhantaMax Buffer25μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、正向引物0.5μL、反向引物、 0.5μL、PhantaMax Super-Fidelity0.5μL、pPG3-AcGFP10.5μL、ddH2O补至50μL;扩增条件为95℃预变性5min,95℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸3min,30个循环,72℃延伸10min;
(3)取步骤(2)获得的PCR产物转化到E.coli W3110菌株中,涂布到含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB平板中,37℃隔夜培养后,获得转化单菌落,即每个单菌落包含4个位点的突变,每个位点包含4种碱基突变;将转化后的单菌落,接种96孔板(每个孔800μL 含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB培养基)中,37℃、180rpm培养12h后,将200μL菌液转接到另一个96孔板(每个孔中800μL含有0.1μg/mL氨苄青霉素和0.024μg/mL IPTG的 LB培养基)中,30℃、180rpm培养12h,4000×g离心10min后,去掉上清液,用pH 7.0 的PBS磷酸缓冲溶液洗涤菌体两次后加入1mL PBS磷酸缓冲液重悬菌体;取重悬的菌体溶液200μL分别在吸光度波长为600nm的条件下测量OD值;然后取重悬的菌体溶液200μL 用荧光分光光度计在激发波长为488nm,发射波长为520nm条件下测量其相对荧光值,即 RFU值;同样条件下,检测多组未突变质粒pPG3-AcGFP转化菌株的OD值和RFU值,计算未突变质粒pPG3-AcGFP的RFU/OD600标准差;若任意两个突变体的RFU/OD600差值小于标准差,则视为相同位点的突变;选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的突变体构建启动子文库;
LB液体培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,溶剂为去离子水,pH 7.0,LB平板中需添加18-20g/L琼脂粉;
进一步,所述启动子文库是将任意两个RFU/OD600差值大于标准差的突变体分成不同的RFU/OD600强度梯度,每个梯度选择1个突变体接种100μL到10mL含有0.1μg/mL氨苄青霉素和0.024μg/mL IPTG的LB培养基中,30℃、180rpm培养12h,取800μL菌液4000×g 离心10min后,去掉上清液,用pH7.0的PBS磷酸缓冲溶液重悬和洗涤菌体两次;依照上述方法检测OD600和RFU值,获得RFU/OD600,任意挑选不同的RFU/OD600的突变体进行测序,选择表达强度提高的突变体,构建精选的启动子文库。
本发明所述精选启动子文库,包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列启动子。所述的启动子文库中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的启动子强度呈递增关系。
本发明构建的启动子文库用于调节目的基因的表达。各启动子启动目的基因表达的强度呈梯度分布,可实现对目的基因表达的有效提升,用于在不同强度下指导目的基因表达。启动子文库的获得可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节,实施可控基因扰动和系统分析。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上,所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列),所述目的基因的优选编码具有特定功能的蛋白,例如某些具有重要特性或功能的蛋白。例如,当用于表达强度的研究时,所述的目的基因包括但不限于:绿色荧光蛋白、增效的绿色荧光蛋白或半乳糖苷酶基因LacZ等。“绿色荧光蛋白”具有内源荧光基团,在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光,且见光不易淬灭。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白。
作为本发明的优选方式,可以从本发明的启动子文库中选择不同强度的启动子,分别将它们和待研究的目的基因可操作地连接,或将目的基因与所述的启动子可操作的连接入合适的载体中,采取适当的方式导入到宿主细胞内,从而获得其总目的基因表达量不同的一系列细胞。可通过分析这些细胞的代谢情况、表型变化、蛋白表达情况或相互作用情况、各种信号分子的变化等,来得知该目的基因的功能或用途。
本发明所述的“启动子”是指一种核酸序列,其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端),能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地,启动子提供RNA聚合酶和正确起始转录所必须的其他因子的识别位点。
“启动子文库”是指含有筛选得到的一系列启动子的核算集合。这些启动子强度呈梯度分布且覆盖一定范围。
本发明针对大肠杆菌诱导型启动子PG3的-36位点至+0位点设计点突变引物,通过PCR获得36株单个位点发生突变的质粒,转化到E.coli W3110菌株中。挑选单菌落在96 孔深板中诱导培养。以质粒上事先连接的增强绿色荧光蛋白作为报告蛋白,检测相对荧光值(RFU)和OD600,借助RFU/OD600来衡量启动子元件的强弱,获得7条不同强度梯度的启动子元件,各启动子启动目的基因表达的表达量呈现梯度分布。本发明的启动子文库可实现对目的基因表达有效提升。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:
本发明提供的启动子文库构建方法,设计一系列定点突变的引物序列对启动子序列中每个碱基定点突变,通过荧光蛋白标定,得到每个碱基序列突变结果对启动子强度的影响。在此基础上组合突变碱基序列,进一步改变启动子强度。与随机突变构建启动子文库相比,本方法可以确定容量中包含目标启动子,降低了人力物力的浪费。最终获得启动子强度跨度理想的启动子文库;该方法廉价、高效、筛选工作量小,且在这个启动子框架下所有可能的强度都可以被推测。同时该方法建立文库后还能对影响启动子强度的关键位点有明确清晰的了解。
(四)附图说明
图1、质粒pTrc99a及插入位点示意图。
图2、筛选出的启动子文库的RFU/OD600强度分布图。
图3、选用启动子文库中的启动子替换工程菌基因组上目标基于的启动子,对应的代
谢产物提升结果柱状图。
图4、pPG3启动子结构图。
图5、启动子对目的基因的表达提升效果柱状图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1、重组质粒pPG3-AcGFP1的构建和鉴定
本发明利用绿色荧光蛋白(AcGFP1)作为报告基因以描述和表征调控其表达的启动子强度。为了便于对启动子进行突变,首先需要构建含有pPG3启动子的报告基因表达载体。
具体方法如下:
(1)以pLVX-AcGFP1-N1载体为模板,用引物AcGFP-EcoRI和引物AcGFP-HindIII 扩增绿色荧光蛋白目的基因AcGFP1,扩增条件为95℃预变性5min,95℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸15min,30个循环,72℃延伸10min,获得PCR产物。
(2)通过限制性内切酶Thermo ScientificTM FastDigest EcoRI和HindIII对质粒pTrc99a 进行酶切,获得线性化的酶切产物。
(3)对步骤(1)PCR产物和步骤(2)酶切产物使用AXYGEN AxyPrepTMPCR CleanupKit试剂盒纯化后,再利用诺维赞ClonExpressTMOneStep Cloning Kit试剂盒连接两者,成功构建重组质粒pTrc99a-AcGFP1。后经DNA测序鉴定得到正确的阳性克隆转化子。
(4)以重组质粒pTrc99a-AcGFP1为模板,用引物PG3-mutation1-F和引物 PG3-mutation1-R突变质粒中trc启动子的-35到-18区域,扩增得到PCR产物,再以之为模板,用引物PG3-mutation2-F和引物PG3-mutation2-R突变启动子中的-17到-1区域,扩增得到含有pPG3启动子重组质粒pPG3-AcGFP1(Jiao,S.,et al.,In situ enhancement ofsurfactin biosynthesis in Bacillus subtilis using novel artificial induciblepromoters.Biotechnology& Bioengineering,2017.114(4):832-842.)。上述PCR扩增突变的反应体系如表1,扩增条件为 95℃预变性5min,95℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸3min,30个循环,72℃延伸10min。经DNA测序鉴定得到正确的阳性克隆转化子。
pPG3启动子序列为:TTGACATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT。
AcGFP1-EcoRI:ttcacacaggaaacagaccatggtgagcaagggcgccga;
AcGFP1-HindIII:ccgccaaaacagccaagcttcacttgtacagctcatcc;
PG3-mutation1-F:aatgagctgttgacattggaagggagatttcgtataatgtgtggaa;
PG3-mutation1-R:acacattatacgaaatctcccttccaatgtcaacagctcatttcag;
PG3-mutation2-F:acattggaagggagattctttataataagaattaattgtgagcggataa;
PG3-mutation2-R:tccgctcacaattaattcttattataaagaatctcccttccaat;
表1:PCR扩增突变的反应体系
2×Phanta Max Buffer | 25μL |
dNTP Mix(10mM each) | 1μL |
正向引物 | 0.5μL |
反向引物 | 0.5μL |
Phanta Max Super-Fidelity | 0.5μL |
pPG3-AcGFP1 | 0.5μL |
ddH<sub>2</sub>O | 补至50μL |
实施例2、启动子突变位点设计以及突变质粒
设计重组质粒pPG3-AcGFP1的单点突变引物(表2)对质粒pPG3-AcGFP1上的pPG3启动子的-35区到+1区逐个碱基进行单点突变,每个位点分别突变为N(A/T/C/G),得到 36个不同位点突变的PCR产物(每个PCR产物包含4种突变)。PCR扩增突变的反应体系如表1,扩增条件为95℃预变性5min,95℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸3min,30个循环,72℃延伸10min。为了提升筛选效率,依序每四个PCR产物使用AXYGEN AxyPrepTMPCR Cleanup Kit试剂盒纯化并浓缩至同一个PCR管中,终体积为20μL。
表2:重组质粒pPG3-AcGFP1的单点突变引物
实施例3、带有人工启动子文库的突变菌株的获得和筛选方法的确立、筛选结果
0.1g/mL氨苄青霉素母液:称取3g阿拉丁的氨苄青霉素定容到30mL无菌水中,用0.22μm无菌滤膜过滤除菌,用量为1/1000(v/v)。
0.12g/mL的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)母液:称取3.6g阿拉丁的IPTG定容到30mL无菌水中,用0.22μm无菌滤膜过滤除菌,用量为1/5000(v/v)。
LB液体培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,溶剂为去离子水,pH 7.0,LB平板中需添加18-20g/L琼脂粉。
取10μL实施例2中获得的36个突变质粒pPG3-AcGFP1分为4个一组转化到E.coliW3110菌株中,涂布到含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB平板中,37℃隔夜培养后,获得转化单菌落,即每个单菌落包含4个位点的突变,每个位点包含4种碱基突变。
筛选方法:将转化后的单菌落,接种96孔板(每个孔800μL含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB培养基)中,37℃、180rpm培养12h后,将200μL菌液转接到另一个96孔板(每个孔中800μL含有0.1μg/mL氨苄青霉素和0.024μg/mL IPTG的LB培养基)中,30℃、 180rpm培养12h。4000×g离心10min后,去掉上清液,用pH 7.0的PBS磷酸缓冲溶液洗涤菌体两次后加入1mL PBS磷酸缓冲液重悬菌体。取重悬的菌体溶液200μL分别在吸光度波长为600nm的条件下测量OD值。然后取重悬的菌体溶液200μL用荧光分光光度计在激发波长为488nm,发射波长为520nm条件下测量其相对荧光值,即RFU值。如果测量的RFU值和OD600超出仪器检测线性范围,则用RBS溶液稀释一定倍数后再次测量。最后根据RFU/OD600的比值来衡量启动子的强弱。RFU/OD600越高,代表该菌中含有的启动子强度越强,反之同理。
同样条件下,以突变前的质粒pPG3-AcGFP作为对照组,同样条件下设置8组平行组,检测RFU/OD600,去掉其中最高值和最低值,计算得到平均值为2167.6和标准差为138.56。
若突变质粒pPG3-AcGFP1测得的RFU/OD600值小于标准差138.56,则视为测量误差;若RFU/OD600值大于标准差138.56,则被视为突变获得的不同强度的启动子,由于实施例 2中对单个位点进行突变后混合了4个不同的PCR产物,可以看到每次筛选结果中样本强度多数分为16个强度梯度相差明显的组别。为提高文库构建效率,每相差3个强度梯度的组别中挑选1个样本,接种100μL到10mL含有0.1μg/mL氨苄青霉素和0.024μg/mL IPTG 的LB培养基中,30℃、180rpm培养12h,取800μL菌液4000×g离心10min后,去掉上清液,用pH7.0的PBS磷酸缓冲溶液重悬和洗涤菌体两次。依照上述方法检测OD600和RFU 值,获得RFU/OD600。
利用以上筛选方法,本发明随机检测了864株单菌落,分别测量其对应的OD600和RFU 值,通过对比RFU/OD600,挑选44株单菌落并测序,组合突变结果得到一个包含32株不同强度样本的启动子文库,具体的数据见图2。其RFU/OD600比值跨度从最低的256.3到最高的8351.2,跨度适中,满足了对下游基因的不同强度的调控。按照其强度分别分为三个等级:弱启动子,其RFU/OD600位于250-1000,该系列的启动子共有11条;中等强度启动子,其RFU/OD600位于1100-2900,该系列的启动子共有15条;强启动子,其RFU/OD600位于3500-9000,该系列的启动子共有7条;挑选不同强度等级的启动子(结合图2可知, p5和p10是从弱启动子组别中选的,p24和p27是从中等强度启动子组中选的,p28、p31 和p32是从强启动子组中选的),总共挑选7株启动子作为范例,测序结果如表3所示。
表3:7条不同强度的启动子相对应的RFU/OD600和其核心区域的碱基序列
SEQ ID NO:1 | p5 | TTGTCATTGAAAGAGAGATTTTTTATTATAAGAATT |
SEQ ID NO:2 | p10 | TTGTCATTGAAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT |
SEQ ID NO:3 | p24 | TTGACATTGGCAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT |
SEQ ID NO:4 | p27 | TTGACATAGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT |
SEQ ID NO:5 | p28 | TTGACAGTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT |
SEQ ID NO:6 | p31 | TTGACAGAGGCAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT |
SEQ ID NO:7 | p32 | TTGACAGAGGCAGGGCGACACTTTATAATAAGACTT |
实施例5、启动子文库质粒水平过表达硫通路基因提升蛋氨酸的代谢产量
发酵培养基:葡萄糖35g/L,(NH4)2SO4 16g/L,KH2PO4 2.5g/L,Na2SO4 3g/L,酵母提取物2g/L,金属离子溶液1mL/L,VB12 0.12mg/L,赖氨酸10mg/L,0.2g/L CaCO3,溶剂为去离子水,pH值自然。
金属离子溶液(mg/L):MgSO4·H2O 500,FeSO4·7H2O 5,MnSO4·8H2O 5,ZnSO4 5,溶剂为去离子水。
应用启动子文库表达目的基因,提高蛋氨酸产量(图1)。将携带SEQ ID NO:7的突变质粒p32-AcGFP1中的AcGFP1基因替换成蛋氨酸硫代谢通路中的关键基因grxA (NC_945479)、glpE(NC_947935)、cysK(NC_946877)或nrdH(基因登录号:NC_000913.3),分别得到p32-grxA、p32-glpE、p32-cysK和p32-nrdH。以上述质粒作为模板通过PCR克隆得到序列SEQ ID NO:7所示启动子开始至与其对应的终止子序列结束的目的基因序列, PCR引物序列为pUgene-F:CATAATTCGTGTCGCTCAATTGACATATGGGGAAGCAAC和 pUgene-R:TTATCCAGAACGGGAGTGCGCAAAAAGGCCATCCGTCAG。
提取E.coliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H(Huang,J.F.,et al.,Metabolicengineering of Escherichia coli for microbial production of L-methionine.Biotechnology and Bioengineering, 2017.114(4):843-851.)的质粒pTrcA*H,同时通过PCR线性化pTrcA*H中trc启动子上游, PCR引物为pA*H-up-F:GCACTCCCGTTCTGGATAATGTT和pA*H-up-R: TTGAGCGACACGAATTATGCAGT。借助诺维赞ClonExpressTMOneStep Cloning Kit试剂盒将SEQ ID NO:7表达的目的基因插入到质粒pTrcA*H上游。得到pTrcA*H-grxA、 pTrcA*H-glpE、pTrcA*H-cysK和pTrcA*H-nrdH4个重组质粒。将这些重组质粒导入到不含质粒的E.coliΔmetJΔmetIΔlysA(Huang,J.F.,etal.,Metabolic engineering of Escherichia coli for microbial production of L-methionine.Biotechnology and Bioengineering,2017.114(4): 843-851.)宿主菌细胞中。挑选单菌落接种到5mL含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB试管中。 37℃,180rpm培养12h。转接1mL菌液到20mL含0.1μg/mL氨苄青霉素发酵培养基中, 37℃,180rpm培养2h后加入终浓度为0.024μg/mL IPTG母液诱导,28℃,180rpm培养48h。取1mL发酵液离心,取100μL上清液加入100μL 0.5mol/L的NaHCO3溶液和100μL 1%(v/v) 的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液,60℃避光反应60min衍生化后加入700μL PBS磷酸缓冲液,使用高效液相色谱分析仪分别测量最终的蛋氨酸产量;沉淀使用1mL 80%(v/v)乙酸水溶液震荡混匀以去除碳酸钙,稀释20倍后测量OD600(表4)。其结果表明突变得到的启动子对目的基因的表达提升具有明显的效果(图3)。
表4质粒水平改造对菌株发酵结果:
实施例6、启动子文库基因组水平替换硫通路基因启动子提升蛋氨酸的代谢产量
借助crispr/cas9技术应用启动子文库替换目的基因启动子,提高蛋氨酸产量。将工具质粒pCas转化到不含质粒的E.coliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H宿主菌中。以菌株E.coli k-12 MG1655的基因组为模板,使用加入p32启动子序列(SEQ ID NO:7)的引物donorDNA-pc ysKup-F和donorDNA-pcysKup-R通过PCR克隆cysK启动子上游500bp获得上游同源臂;使用加入p32启动子序列(SEQ ID NO:7)的引物donorDNA-pcysKdown-F和donorDNA-pcysKd own-R通过PCR克隆cysK启动子下游500bp获得下游同源臂。对两组同源臂进行融合PCR,获得donorDNA-pcysK,该序列包括以下特点:一段包含cysK启动子上下游500bp的序列,其原本位置的cysK原始启动子被启动子p32所替换。使用引物pTarget-pcysK-F和pTarget-R对质粒pTarget突变并线性化,限制性内切酶Thermo ScientificTMFastDigest BcuI对其单酶切并用Thermo ScientificTM T4DNA Ligase自连,使用ThermoScientificTM DpnI消化模板质粒后获得pTarget-pcysK。将该质粒和donorDNA-pcysK通过点击转化到含有pCas质粒的E.c oliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H宿主菌中,送公司测序。工具质粒pCas是温敏型质粒,可以在 37℃培养消除质粒;质粒pTarget可以通过加入4μLIPTG母液诱导培养进行消除。消除质粒后将所得无抗重组菌制备成感受态,转入pTrcA*H质粒,在含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB 平板上涂布,即得到在菌株E.coliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H的基础上用启动子p32替换cys K原始启动子,获得菌株E.coliΔmetJΔmetIΔlysA p32-cysK/pTrcA*H。
类似地,以菌株E.coli k-12MG1655的基因组为模板,使用加入p32启动子序列的引物donorDNA-pglpEup-F和donorDNA-pglpEup-R通过PCR克隆cysK启动子上游500bp获得上游同源臂;使用加入p32启动子序列的引物donorDNA-pglpEdown-F和donorDNA-pglpEdown -R通过PCR克隆glpE启动子下游500bp获得下游同源臂。对两组同源臂进行融合PCR,获得 donorDNA-pglpE,该序列包括以下特点:一段包含glpE启动子上下游500bp的序列,其原本位置的glpE原始启动子被启动子p32所替换。使用引物pTarget-pglpE-F和pTarget-R对质粒p Target突变并线性化,限制性内切酶Thermo ScientificTM FastDigestBcuI对其单酶切并用Th ermo ScientificTM T4DNA Ligase自连,使用ThermoScientificTM DpnI消化模板质粒后获得pTarget-pglpE。将该质粒和donorDNA-pglpE通过点击转化到含有pCas质粒的E.coliΔmet JΔmetIΔlysA/pTrcA*H宿主菌中,送公司测序。消除工具质粒后将所得无抗重组菌制备成感受态,转入pTrcA*H质粒,在含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB平板上涂布,即得到在菌株E. coliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H的基础上用启动子p32替换glpE原始启动子,获得菌株E.coli ΔmetJΔmetIΔlysA p32-glpE/pTrcA*H。
挑选以上两株重组菌的单菌落接种到5mL含有0.1μg/mL氨苄青霉素的LB试管中。37℃,180rpm培养12h。转接1mL菌液到20mL含0.1μg/mL氨苄青霉素发酵培养基中, 37℃,180rpm培养2h后加入4μL IPTG母液(终浓度为0.024μg/mL)诱导,28℃,180rpm 培养48h。取1mL发酵液离心,取100μL上清液加入100μL 0.5mol/L的NaHCO3溶液和 100μL 1%(v/v)的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液,60℃避光反应60min衍生化后加入700μL PBS 磷酸缓冲液,使用高效液相色谱分析仪分别测量最终的蛋氨酸产量,沉淀使用1mL 80% (v/v)乙酸水溶液震荡混匀以去除碳酸钙,稀释20倍后测量OD600(表5)。其结果表明突变得到的启动子对目的基因的表达提升具有明显的效果(图5)。
表5基因组水平改造对菌株发酵结果:
菌株名称 | 蛋氨酸产量(g/L) | 菌体生长状况(OD<sub>600</sub>) |
E.coliΔmetJΔmetIΔlysA/pTrcA*H | 1.89±0.057 | 0.417±0.015 |
E.coliΔmetJΔmetIΔlysA p32-cysK/pTrcA*H | 3.07±0.144 | 0.436±0.014 |
E.coliΔmetJΔmetIΔlysA p32-glpE/pTrcA*H | 3.00±0.149 | 0.416±0.014 |
donorDNA-pcysKup-F:CAGATACCGGGATTTTCGGTATC
donorDNA-pcysKup-R:AAGTCTTATTATAAAGTGTCGCCCTGCCTCTGTCAATATATACAGAAGGGAAATAATG
donorDNA-pcysKdown-F:TTGACAGAGGCAGGGCGACACTTTATAATAAGACTTGTATGCTACCTGTTGTATCCCAA
donorDNA-pcysKdown-R:AGGGTTTGCCGGATTGCTGAATT
donorDNA-pglpEup-F:AACACTGAATTTGCGCCAAAACGC
donorDNA-pglpEup-R:AAGTCTTATTATAAAGTGTCGCCCTGCCTCTGTCAATACATATCACTCTAAAATGT
donorDNA-pglpEdown-F:TTGACAGAGGCAGGGCGACACTTTATAATAAGACTTTTGTTTGTAAAGAAAGAGAGAC
donorDNA-pglpEdown-R:GCTTTGGTTATGTTGTTGAATCG
pTarget-pcysK-F:ATACTAGTCTTCCGCATATTCTCTGAGCGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC
pTarget-pglpE-F: ATACTAGTCTTCGACGTAAACTGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种启动子文库的构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgtcattga aagagagatt ttttattata agaatt 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ttgtcattga aagggagatt ctttataata agaatt 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ttgacattgg cagggagatt ctttataata agaatt 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ttgacatagg aagggagatt ctttataata agaatt 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ttgacagtgg aagggagatt ctttataata agaatt 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
ttgacagagg cagggagatt ctttataata agaatt 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
ttgacagagg cagggcgaca ctttataata agactt 36
Claims (7)
1.一种启动子文库的构建方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
1)构建含目标启动子和标记蛋白的质粒;
2)根据目标启动子序列,设计每个位点的单点突变引物;
3)以步骤1)中含目标启动子的质粒为模板,以步骤2)设计的各个位点的突变引物进行PCR扩增,得到含目标启动子的单点突变体;
4)将步骤3)得到的含目标启动子的单点突变体转入宿主细胞中,筛选阳性克隆;
5)检测多组步骤1)未突变的含目标启动子的质粒的相对荧光值RFU和OD600,计算未突变目标启动子的RFU/OD600标准差;检测步骤4)阳性克隆的相对荧光值RFU和OD600,若任意两个阳性克隆的RFU/OD600差值小于标准差,则视为相同位点的突变;选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的阳性克隆,构成启动子文库。
2.如权利要求1所述启动子文库的构建方法,其特征在于步骤1)中的目标启动子为pPG3启动子。
3.如权利要求1所述启动子文库的构建方法,其特征在于步骤1)中所述标记蛋白选自绿色荧光蛋白GFP、增效的绿色荧光蛋白EGFP或超级折叠荧光蛋白sfGFP。
4.如权利要求1所述启动子文库的构建方法,其特征在于步骤2)中突变引物将每个位点突变为N,其中N=A/T/C/G,或者将单位点删除。
5.如权利要求1所述启动子文库的构建方法,其特征在于步骤4)中,将每4个位点突变质粒共同转入同一个宿主中。
6.如权利要求1所述启动子文库的构建方法,其特征在于步骤5)中,选择任意两个RFU/OD600差值大于标准差的突变体,将RFU/OD600数值分成不同的强度梯度,每个梯度选择1个突变体构成表达强度提高的启动子文库。
7.如权利要求2所述启动子文库的构建方法,其特征在于启动子文库由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列组成。
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