CN101768598A

CN101768598A - 一个定向突变及遗传改造的重组质粒及其应用

Info

Publication number: CN101768598A
Application number: CN201010101163A
Authority: CN
Inventors: 华跃进; 陆辉明; 高冠军; 黄丽芬
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2010-07-07

Abstract

本发明提供一个用于耐辐射球菌目的基因定向突变和染色体遗传改造的重组基因，具有SEQ ID №：1的核苷酸序列，是表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因的启动子PgroEL与卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段。本发明的基因片段位于质粒pRADK，该质粒可以在耐辐射球菌中正常复制并遗传，而且在大肠杆菌中也有较高的拷贝数，因而可以有较高产量，很容易得到大量质粒，进而可以从该质粒到得到SEQ ID №：1的序列，可在构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株的目的基因突变株的筛选标记中应用；也可在构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株遗传改造成工程菌的筛选标记中应用。

Description

一个定向突变及遗传改造的重组质粒及其应用

技术领域

本发明属生物技术，涉及利用位于该质粒上一段基因片段来制作耐辐射球菌基因突变株及转基因遗传改造耐辐射球菌成为工程细菌的筛选标记。

背景技术

目前，耐辐射球菌属(Deinococcaceae)已经发现八个种，D.radiodurans，D.proteolyticus，D.radiopugnans，D.grandis，D.geothermalis，D.murrayi，D.radiophilus，D.radiotolerance。尽管它们形态各异，但都有一个共同的生理特性，就是显示出极强的电离辐射抗性。其中Deinococcus radiodurans(DR)是1956年由美国科学家Anderson等从X-射线灭菌处理后的肉罐食品中发现的一种红色的非致病性球菌，最适生长温度为30℃。耐辐射球菌是最具辐射抗性的生物体之一，在5kGy的电离辐射下，对数生长期的耐辐射球菌细胞不受任何影响，它可以长期正常生长于60Gy/h高辐射背景的环境之中。稳定生长期的耐辐射球菌可以耐受15kGy的辐射剂量，是大肠杆菌的100多，是人类的1000倍。1999年D.radiodurans的基因组测序完成。该细菌除了对抗由电离辐射，对亚硝基胍、羟胺、甲基硝基亚硝基胍和氧基硝基喹啉等化学毒剂也具有相当抗性。因此，自从耐辐射球菌被发现以来，倍受微生物学家、放射生物学家和肿瘤研究人员的重视。有人已经开展研究使其成为核爆地区等高辐射污染地区的生物修复候选人，也有人研究使其某些特定基因用于生产物种的转基因改良，比如作物的抗干旱。

该菌的生物学特征是，与其他物种比较，它具有超强的耐辐射能力和DNA修复能力。该生物已经成为研究DNA损伤修复的模式生物，也有学者认为该生物DNA损伤修复方式可以为癌症的研究提供模型。基因突变尤其定向的基因敲除是研究功能基因的重要手段，利用本发明的质粒所搭载的卡那霉素抗性筛选标记来构建功能基因的突变株。另外，由于耐辐射球菌具有相当强的抗辐射、抗化学毒剂的能力，很多生物工程的研究者已经试图将该细菌改造成为在核实验基地等高辐射背景下开展生物修复的工程细菌。由美国国防部资助的项目已取得不错的进展，由该细菌改造成的工程菌可以富集铀等放射性原素。而在工程菌遗传改造过程，合适筛选标记是其中重要的因素。

研究某些特定基因时，对目标基因进行突变从而试图研究其生物学特性是常用手段，现在也有商业化的包含筛选标记的质粒。用于该细菌基因突变有特殊转座子随机插入基因，该方法是随机的，实际操作中不适于基因的定向突变。而利用筛选标记基因结合特殊启动子根据同源重组的原理进行目标基因的靶向突变和基因组遗传改造是一种重要技术。在此方法中，选择合适的筛选基因以及合适的启动子部是其中的重要环节。

发明内容

本发明的目的是提供一个定向突变及遗传改造的重组质粒，是用于耐辐射球菌目的基因定向突变和染色体遗传改造的重组基因，具有SEQ ID№：1的核苷酸序列，是表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因的启动子PgroEL与卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段。本发明中耐辐射球菌的菌株分类为Deinococcus radiodurans，保藏号为：ATCC NO.13939，菌种编号为R1，购于国家菌种保存中心；质粒名称：pRADK，筛选基因：卡那霉素抗性基因(KanR)，启动子：表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因(DR0607)启动子PgroEL。

所述质粒通过以下步骤获得：构建PgroEL启动子与卡那霉素结构基因的紧密融合，并在接合位点作了变动，PgroEL启动子核糖体结合位点(RBS)后的CACATG替换成CATATG(即NdeI酶切位点)，该酶切位点的后三个碱基ATG作为卡那霉素抗性基因起始翻译位点。利用以D.radiodurans R1基因组为模板，设计克隆GroEL启动子PgroEL的引物：上游引物P1：5’CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATA T3’，下游引物P2：5’GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3’，PCR扩增GroEL的启动子片段S1；同时以pET-29b质粒为模板，上游引物P3：5’TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGG AAACGTC 3’，下游引物P4：5’ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA TG 3’，克隆卡那霉素抗性基因S2。两段PCR产物S1与S2经NdeI酶切后连接，以连接产物作模板，P1与P4为引物进一步扩增得PCR产物S3，即为含有GroEL启动子的卡那霉素抗性基因的DNA片段。

本发明的另一个目的是提供所述的重组质粒在构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株的目的基因突变株的筛选标记中的应用。利用同源重组的原理，可以SEQ ID №：1序列替代耐辐射球菌基因组的目标基因，并利用卡那霉素对突变株进行筛选，进而得到目标基因的基因敲除突变株。

本发明的再一个目的是提供所述的重组质粒在构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株遗传改造成工程菌的筛选标记。耐辐射球菌具有抗极端环境的能力，尤其高辐射背景下可以正常生长的特性使其成为在高辐射背景下进行生物修复的良好候选生物。现在有相关文献报道利用质粒将可以重金属还原的基因转化到耐辐射球菌中进行污染环境的生物修复。然而，质粒在没有选择压力下，可能容易丢失，导致整个系统失效。因此，将修复基因整合到细菌基因组中的方法可使得重组细菌更加稳定。利用同源重组的原理，可以SEQ ID №：1序列以及生物修复基因整合到细菌基因组中，并用卡那霉素进行筛选，得到重组细菌。这种重组细菌具有很好遗传稳定性。

本发明的基因片段位于质粒pRADK，该质粒可以在耐辐射球菌中正常复制并遗传，而且在大肠感觉中也有较高的拷贝数，因而可以有较高产量，很容易得到大量质粒，进而可以从该质粒到得到SEQ ID №：1的序列，用于上述多种用途。

本发明中的目标微生物是耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)，一类广泛生活在自然界，能忍受紫外线、放射线、干旱等极端环境的原核微生物，该菌的生物学特征是，与其他物种比较，它具有超强的耐辐射能力和DNA修复能力。该生物已经成为研究DNA损伤修复的模式生物，也是成环境生物修复的工程菌的重要候选物种。借助本发明的GroEL启动子驱动下卡那霉素抗性基因，可以有效筛选基因突变株或者DNA重组工程菌。

附图说明

图1是用pRADK构建耐辐射球菌基因缺陷性突变株流程图。

图2是耐辐射球菌pprI基因功能缺陷性突变株YR1的构建。

图3是耐辐射球菌pprI基因突变株的PCR验证。

图4是基于耐辐射球菌的汞还原工程菌构建。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

一种用于耐辐射球菌目的基因定向突变和染色体遗传改造的质粒pRADK的构建。耐辐射球菌的菌株分类为Deinococcus radiodurans，保藏号为：ATCC NO.13939，菌种编号为R1，购于国家菌株保存中心；质粒名称：pRADK，筛选基因：卡那霉素抗性基因(KanR)，启动子：表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因(DR0607)启动子PgroEL。

为了卡那霉素抗性基因能够在耐辐射球菌中正常表达，我们构建了PgroEL启动子与卡那霉素结构基因的紧密融合，并在接合位点作了变动，PgroEL启动子核糖体结合位点(RBS)后的CACATG替换成CATATG(即NdeI酶切位点)，该酶切位点的后三个碱基ATG作为卡那霉素抗性基因起始翻译位点。以D.radiodurans R1基因组为模板，设计克隆GroEL启动子PgroEL的引物：上游P1：5’CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATAT3’，下游P2：5’GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3’(划线部分分别为HindIII和NdeI位点)，PCR扩增GroEL的启动子片段S1。同时以pET-29b质粒为模板，上游引物P3：5’TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTC3’，下游引物P4：5’ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG 3’(划线部分分别为NdeI和BamHI位点)，克隆卡那霉素抗性基因S2。两段PCR产物S1与S2经NdeI酶切后连接，以连接产物作模板，P1与P4为引物进一步扩增得PCR产物S3，即为含有GroEL启动子的卡那霉素抗性基因的DNA片段。上述PCR产物S3与穿梭质粒pRADZ3(pRADZ3具体信息参考文献Meira，2001)分别经HindIII和BamHI酶切后连接得到表达质粒pRADK。参见图1。

实施例2：用pRADK构建耐辐射球菌DR0167基因缺陷性突变株

参见图2，以耐辐射球菌基因组为模板，设计引物P5：5’CAGGGCAGCGCGGGCGACGTGGACGG3’，P6：5’ATGATGGATCCGGAGGCTT CAGCTTTAGCTTTTGGCC 3’(划线部分为BamHI位点)；扩增产物PCR1；引物P7：5’CATCTAAGCTTTGCCCGGACGCGACACCCACAGCC 3’(划线部分为HindIII位点)，P8：5’GGGCACGTAGCTTTCCTCGCGCACTTCC 3’，扩增产物PCR2，PCR1与PCR2分别经Bam HI和HindIII双酶切后与同样双酶切的上述pRADK片段连接，以此三段连接产物为模板，P5与P8引物扩增得到PCR产物S4，通过同源重组方法将PCR产物S4重组进入耐辐射球菌R1基因组中，以30μg/ml卡那霉素筛选得到pprI基因功能完全破坏的突变株YR1。以耐辐射球菌野生株R1和pprI突变株YR1的基因组为模板，用引物P5和P8进行PCR扩增。PCR产物分别经1％琼脂糖电泳进行分离并溴化乙锭染色后在凝胶成像系统拍照。结果发现，来自突变株YR1的产物要比来自野生株R1的产物大1100bp左右(图3)，表明pprI基因被SEQ ID№：1DNA片段所替代，进而被成功敲除突变。

实施例3用pRADK构建耐辐射球菌遗传改造成工程菌

参见图4，用PCR方法将汞还原操纵子mer克隆，然后与从pRADK质粒切下来到PgroEL-KanR融合DNA片段连接，之后，用PCR分别从耐辐射球菌基因组DNA中克隆要将mer插入位置上下游各1000碱基对，酶切后分别连接到mer操纵子上游和PgroEL-KanR融合DNA片段下游，最后将该重组DNA片段转化到耐辐射球菌细胞，用30μg/mL的卡那霉素进行筛选。

本发明涉及的序列

<120>一个定向突变及遗传改造的重组质粒及应用

<160>9

<210>1

<211>1231

<212>DNA

<213>耐辐射球菌属(Deinococcaceae)

<220>groEL、kanamycin resistance

<400>1

CACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGCGAGGCCTCGAGATCTATCGATTC

ACAAAAAATAGGCACACGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATGCCATGGTACCCGG

GAGCTCGAATTCTAGAAGCTTCTGCAGACGCGTCATCTGCAGAATTCGGCTTGGAAGCACGTAT

TGTCGCCCTACATATATACGTTAAAGCTAACAGCTGGCAAGGGGATACCCCCATTCCCCGTCCCA

GCGCCCCTTGAGCGTCATAGACTCAGATTGTCAGCTTCGGTCAGTTGACATTTTTCTTATCGGCG

CTCTACCATCCGTGACGGATTGAAGGCGCTGGGCGGGAAAAAGCTCGCCGGCACGACTCTCCG

CCATTCCATCTCACTCACAGGAGGACCCCATATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCT

AGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGT

CGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTG

AAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTG

ACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTC

ACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAA

ATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTT

TTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGAT

GCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCAT

AAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATT

TTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACC

AGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTT

CAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTT

TTCTAA

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>2

CATAGAAGCT TCGTATTGTC GCCCTACATA T

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>3

GATCAAGCAT ATGGGGTCCT CCTGTG

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>4

TCATCACATA TGAGCCATAT TCAACGGGAA ACGTC

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>5

ACAGACGGAT CCTAGAAAAA CTCATCGAGC ATCAAATG

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>6

CAGGGCAGCGCGGGCGACGT GGACGG

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>7

ATGATGGATC CGGAGGCTTC AGCTTTAGCT TTTGGCC

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>8

CATCTAAGCT TTGCCCGGAC GCGACACCCA CAGCC

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)

<400>9

GGGCACGTAG CTTTCCTCGC GCACTTCC

Claims

1.一个定向突变及遗传改造的重组质粒，其特征在于，具有SEQ ID No：1的核苷酸序列，是表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因的启动子PgroEL与卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段，通过以下步骤获得：构建PgroEL启动子与卡那霉素结构基因的紧密融合，并在接合位点作了变动，PgroEL启动子核糖体结合位点(RBS)后的CACATG替换成CATATG(即NdeI酶切位点)，该酶切位点的后三个碱基ATG作为卡那霉素抗性基因起始翻译位点。

2.根据权利要求1所述的一个定向突变及遗传改造的重组质粒，其特征在于，设计克隆GroEL启动子PgroEL的引物：

上游引物P1：5’CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATA T3’，

下游引物P2：5’GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3’，

PCR扩增GroEL的启动子片段S1，同时以pET-29b质粒为模板，

上游引物P3：5’TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGG AAACGTC 3’，

下游引物P4：5’ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG 3’，克隆卡那霉素抗性基因S2。

3.根据权利要求1所述的一个定向突变及遗传改造的重组质粒在作为构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株的目的基因突变株的筛选标记中的应用。

4.根据权利要求1所述的一个定向突变及遗传改造的重组质粒在作为构建耐辐射球菌以及耐辐射球菌属其它菌株遗传改造成工程菌的筛选标记中的应用。