CN107119066B - 一种异源表达群体感应淬灭酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶的方法。本发明通过启动子的选择优化，利用高效恒定表达启动子PgroEL，实现了来自于海洋细菌耐油具柄菌的群体感应淬灭酶基因momL在陆生菌产酶溶杆菌中的异源表达，使构建的工程菌株具有抗菌及群体感应淬灭酶双重活性。并且，本发明将产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中的酮还原酶基因作为重组载体的整合位点，通过同源重组导致黄色素基因插入失活，而使菌落呈乳白色的方法，来筛选目标重组菌株，筛选效率大大提高。

Description

一种异源表达群体感应淬灭酶的方法
技术领域
本发明属于有益微生物构建技术领域，具体涉及一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶的方法。
背景技术
产酶溶杆菌广泛生存于土壤和水环境中，能够分泌一系列胞外酶及具有抗植物真菌病原菌活性的次级代谢产物，是溶杆菌属中最具有生物防治潜力的一种革兰氏阴性菌。近年来，产酶溶杆菌作为一种新的生物防治剂被普遍用于防治由真菌引起的农作物病害，如产酶溶杆菌OH11对立枯丝核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌表现出较强的抑制活性，并且对番茄青枯病也具有很好的防治作用，其防治效果达86.4％(Borasr et al.1993)；产酶溶杆菌3.1T8对坪草腐霉枯萎病菌具有拮抗作用，其产生的脂肪酶对腐霉根冠腐病存在抑制作用(Brederode et al.1991)，此外，3.1T8也能够对立枯丝核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌、番茄枯萎菌、番茄叶霉菌、黄瓜褐斑病菌进行抑制(Folman et al.2003)；产酶溶杆菌N4-7对由夏季斑枯病菌引起的草坪夏季斑枯病具有较好的生物防治作用(Kobayashi et al.1996)；产酶溶杆菌C3可以用于防治由单孢锈菌引起的大豆锈病，平脐蠕孢菌引起的高羊茅叶斑并，并且它还可以通过几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶及HSAF等物质的抗真菌活性对小麦根腐病菌引起的离蠕孢叶枯病进行有效的防治(Zhang et al.1999，Zhang et al.2001，Palumbo et al.2005，Li et al.2008)。然而，上述实例均为产酶溶杆菌用于对植物病原真菌的抑制效果，而对植物细菌性病害的控制报道较少。为扩大产酶溶杆菌对植物致病菌的防治范围，可以构建具有新特性的产酶溶杆菌工程菌株用于植物细菌性病害的防治，MomL，一种群体感应淬灭酶，属于金属-β-内酰胺酶家族，与最相似蛋白为来自Bacillussp.240B1的AiiA，其同源性仅为24.5％，MomL具有明显的抑制病原菌致病因子及防病害能力，可作为生防蛋白进行改造利用。若将MomL在产酶溶杆菌中异源表达，则将赋予该菌更广谱的抑菌杀菌能力，但是产酶溶杆菌对多种抗性筛选使用的抗生素具有天然的抗性，增加了其遗传操作过程中转化子的筛选难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶MomL的方法，即借助所构建的带有特异性启动子的表达载体使群体感应淬灭酶MomL能够在产酶溶杆菌中稳定高效的表达；并且通过菌落黄-白颜色变化作为转化子的筛选标记，使其异源表达群体感应淬灭酶MomL，赋予产酶溶杆菌一种新的生防特性，利用构建的重组菌株产酶溶杆菌LeMomL对植物细菌性软腐病致病菌进行抑制，并应用于植物细菌性软腐病防治。
本发明首提供一种用于在产酶溶杆菌中表达群体感应淬灭酶MomL的表达载体，所述的表达载体，其中使用的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
作为优选，所述的重组表达载体，是将外源基因整合到产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中；
作为实施例的优选，是将外源基因整合到黄色素基因簇酮还原酶合成基因内部；
本发明另一个方面提供重组产酶溶杆菌，是用于重组表达群体感应淬灭酶MomL；
本发明再一个方面提供一种筛选重组产酶溶杆菌的方法，是通过颜色变化作为筛选标记来筛选工程菌株；
本发明提供的重组产酶溶杆菌菌株作为生物防治菌株的应用。
本发明通过启动子的选择优化，选取PgroEL作为恒定高效表达启动子，实现了来自于海洋细菌耐油具柄菌Th120的外源群体感应淬灭酶基因momL在陆生菌产酶溶杆菌中实现异源表达，使构建的重组菌株具有抗菌及群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)酶双重活性，并且，本发明将产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中的关键基因-酮还原酶合成基因作为重组载体的整合位点，使工程菌落呈乳白色，筛选效率大大提高。所获得的重组菌株与植物致病菌共培养，发现除了其对致病菌的双重抑制作用及对由胡萝卜果胶杆菌引起的植物细菌性软腐病的防治作用外，工程菌在逆境下的存活率大大提高，大大增加了其作为生防菌的应用价值。
附图说明
图1：酮还原酶基因片段和PgroEL的双酶切凝胶电泳检测结果图，
图2：LeMomL菌株与野生菌株菌落颜色对比图，
图3：LeMomL菌株对C6-SHL的降解作用图，
图4：LeMomL菌株对Pcc存活率率的影响图，
图5：LeMomL菌株对由Pcc引起的大白菜软腐病的抑制效果图。
具体实施方式
之前的研究表明外源群体感应淬灭酶基因momL在陆生菌产酶溶杆菌中存在表达效率低下的问题。为了解决这一问题，申请人对陆生菌产酶溶杆菌OH11基因组和momL基因的序列组进行了分析，最终发现核苷酸序列为SEQ ID NO:1的PgroEL启动子使momL基因在产酶溶杆菌中具有很高的表达能力及稳定性，从而促成了本发明。
通过产酶溶杆菌OH11的全基因组测序及基因注释结果可知，在产酶溶杆菌基因组中基因groEL与groES反向共转录，因此推测基因groEL的启动子位于基因groES编码区的上游，通过Softberry及Berkeley Drosophila Genome Project(BDGP)对启动子进行在线预测并得到相关序列，其中启动子的序列为SED ID NO：1，具体序列如下：
CGATGCCTTTGTGCCAGATCGCCAGACCGGACCGAAAGGCGTCGGGCCTGAAAGCCCTCCCACTAGAGCCCCCAGGGTGAAGAGCCCTCCCACAACAGCTCCGGGGTCCGCGGGCTCTCCCAGCGCCGCCGGCCGGCCCCGCGGACCGACCGCTGTCACCGTTCCGATGCAGGATTCGTCGCGGCCCCCCTTGAAAGCCGTCCGAGGCGCCCTATCTCCGAACCAGTCCCGGCTTGCCGGGCGCTTTCGTCCCCGGCATTGGCACTCGCCGGGTGCGACTGCTAAAATTCCCGTTCTTTATCCACCAATTCAATTACTTACAGAGGTCGCC。
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。
实施例1：产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W的构建。
选用产酶溶杆菌中黄色素合成基因簇中的关键基因酮还原酶合成基因作为重组载体的整合位点，利用软件Primer Premier 5设计基因片段的上、下引物分别带有EcoRⅠ、KpnⅠ限制性酶酶切位点，up：5’-CGGAATTCTCCAGGGCGTGGTCAACA-3’；down：5’-GGGGTACCTCTGCTTGATCGCCTCCG-3’，利用Prime STAR G×L DNA扩增酶进行目的片段扩增。得到的扩增产物与过表达载体pEX18同时进行EcoRⅠ、KpnⅠ限制性酶酶切，将双酶切后的扩增产物与双酶切后的载体pEX18置于16℃进行过夜连接，最后构建成产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W。利用双酶切检测的方法对过表达载体pEX18-W中的目的基因进行检测，凝胶电泳结果显示目的基因的大小长度符合。凝胶电泳检测结果如附图1所示。
实施例2：产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W-P的构建。
用已报道的产酶溶杆菌本源启动子进行momL异源表达，均不能达到蛋白的稳定高效表达。利用前期转录组学数据，筛选到启动子PgroEL。将其与已报到的本源启动子进行对比，发现PgroEL能够实现momL的稳定高量表达(表1)。具体方法如下：选取产酶溶杆菌本源groEL基因前端的启动子作为外源基因前端紧密连接的启动子，利用软件Primer Premier5设计分别带有KpnⅠ、BamHⅠ限制性酶酶切位点的上、下引物，
up：5’-GGGGTACCCGATGCCTTTGTGCCAG-3’；
down：5’-CGGGATCCGGCGACCTCTGTAAGTAATTG-3’，利用Prime STAR DNA扩增酶进行启动子片段扩增。得到的扩增产物同过表达载体pEX18-W一起，同时进行KpnⅠ、BamHⅠ限制性酶酶切，双酶切后的扩增产物与双酶切后的载体pEX18-W在16℃条件下过夜连接，构建过表达载体pEX18-W-P。将连接产物通过42℃热击转化的方法转入到E.coli S17-1感受态细胞中，并通过加有25μg/mL Gen的LB平板筛选阳性单克隆。利用双酶切检测的方法对阳性克隆进行目的基因的检测，凝胶电泳结果显示目的基因的大小与启动子片段长度符合。凝胶电泳检测结果如附图1所示。
实施例3：产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W-P-momL的构建。
采用氛氯仿法提取耐油具柄菌Th120基因组作为模板，利用软件Primer Premier5设计momL基因对应的分别带有BamH I及Xba I酶切位点的上、下引物，up：5’-
CGGGATCCAAAAAGGAAGCTGCAGAATCG-3’，down：5’-GCTCTAGATTGTAAATAGTTGGGTGCCTGG-3’，利用Prime STAR DNA扩增酶进行PCR扩增。随后，使用BamH I和Xba I两种限制性内切酶对纯化后的扩增产物及产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W-P进行双酶切，并将带有粘性末端的目的片段及线性载体16℃过夜连接，获得产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W-P-momL。
实施例4：工程菌株LeMomL的构建。
将实施例2中得到的连接产物通过42℃热击转化的方法转入到E.coli S17-1感受态细胞中，并通过加有25μg/mL Gen的LB平板筛选阳性单克隆，获得供体菌株S17-1-pEX18-W-P-momL，并接于含25μg/mL Gen的LB培养基中培养。与此同时，将受体菌株产酶溶杆菌单克隆接于含50μg/mL Kan的1/10TSB培养基中培养，当两种菌液OD值均达到0.7左右时，13200rpm离心菌体2分钟，弃上清后菌体均用100μL的LB培养基重悬，并将产酶溶杆菌菌悬液与S17-1-pEX18-W-P-momL菌悬液混合，30℃培养4小时后将菌液涂布于含100μg/mL Gen,25μg/mL Kan的LB平板上，将平板置于30℃培养箱培养2-4天，待长出单菌落后，挑取足够数量的单克隆进行平板划线，通过黄-白颜色变化作为筛选标记，最终获得白色重组菌株LeMomL，菌落黄-白颜色变化如附图2所示。
实施例5：启动子PgroEL表达效率的检测
为检测启动子PgroEL表达效率的水平，本发明将PgroEL对基因momL启动转录的水平与目前已报道的产酶溶杆菌本源启动子中表达最强的启动子PHSAF、已报道的高表达启动子Pclp及另一待检测启动子Pqsec进行比较。具体实施方法为将过表达载体pEX18-W-P-momL中启动子PgroEL的基因片段序列分别被启动子PHSAF、Pclp及Pqsec的序列取代，随后将带有不同启动子的过表达载体分别通过结合转化整合到产酶溶杆菌OH11的基因组中，通过“黄-白”颜色筛选法筛选出目的转化子，利用实时荧光定量PCR的方法，对这些重组产酶溶杆菌菌株在不同时间点momL的转录水平进行检测，实验结果如表1所示。相比于其他检测的启动子，PgroEL在12小时时已激发基因momL进行转录，且表达水平远高于其他启动子；在60小时时，启动子PgroEL依然保持着相对较高的启动转录水平，而此时启动子Pclp和Pqsec启动的基因已检测不到转录水平，因此相比于其他启动子PgroEL具有较高表达效率，是启动外源基因表达的效果最佳的启动子。
表1：启动子表达效率表
Figure BDA0001287974110000061
实施例6：LeMomL工程菌QQ酶活性检测
以紫色色杆菌突变株CV026为报告菌株，通过平板法检测QQ酶活性。首先，野生型产酶溶杆菌、重组菌株LeMomL和报告菌CV026分别接于LB培养基中活化。随后，取1mL活化好的CV026菌液接于15mL LB半固体培养基中，混匀倒入空平板，待培养基凝固后打孔。与此同时，将稀释后的C6-SHL加于将产酶溶杆菌及LeMomL菌株的液体培养基中反应3小时。最后，取40μL产酶溶杆菌及LeMomL菌株菌液加于孔中，以等量稀释的C6-SHL为对照，将平板置于28℃培养24小时，观察紫色色素圈直径的大小推知的LeMomL菌株对C6-SHL的降解情况，另外，本发明对紫色色素圈直径大小与C6-SHL浓度之间的关系进行了相关实验。实验结果如表2及图3所示，说明重组菌株LeMomL产生的QQ酶MomL能够降解信号分子C6-SHL，实验样品周围的CV026因缺失诱导产生紫色色素的信号分子C6-SHL含量较少，从而使实验样品周围产生的紫色色素圈小于野生菌株产酶溶杆菌及对照组。
表2 C6-SHL浓度与色素圈大小
Figure BDA0001287974110000071
实施例7：LeMomL菌株对胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum,Pcc)存活率的影响。
将野生型产酶溶杆菌及LeMomL菌株分别接于LB培养基中培养，当菌液达到同一OD值(0.8-1.0)后，按10:1的比例分别与处于对数生长期的Pcc共培养，以Pcc单菌培养作为对照，在28℃摇床培养6小时后，将实验组与对照组的菌液均稀释105倍进行涂板，将平板置于28℃培养24小时后，对平板上的Pcc单菌落进行查数，计算出实验组与对照组中Pcc的存活率并比较研究。实验结果表明，Pcc与产酶溶杆菌及LeMomL菌株共培养后，如附图4所示，Pcc的存活率均有所下降，但后者下降趋势更明显。
实施例8：LeMomL菌株对Pcc表达致病因子的抑制作用。
Pcc是植物细菌性软腐病主要的病原菌，其中，胞外水解酶类是最主要的致病因子，包括果胶酶、蛋白酶和纤维素酶等，而果胶酶又是胞外水解酶中最为重要的致病因子，本实施例以果胶酶为例进行说明。将野生型产酶溶杆菌及LeMomL菌株分别接于LB培养基中培养，当菌液达到同一OD值(0.8-1.0)后，按10:1的比例分别与处于对数生长期的Pcc共培养，以Pcc单菌培养作为对照，在28℃摇床培养6小时后，按实施例5的方法对实验组与对照组中Pcc单菌落进行计数。与此同时，将培养后的菌液13000×g，4℃离心10min，取上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，得到粗酶液用于果胶酶的DNS法检测。取0.2g多聚半乳糖醛酸和0.41g无水乙酸钠溶于100mL去离子水中，配成多聚半乳糖醛酸溶液，pH调至5.2待用。将50μL粗酶液加入到450μL多聚半乳糖醛酸溶液中立即混匀，25℃水浴中反应20min，反应结束后时，立即将反应物取出，放碎冰中冷却以终止反应。在500μL反应体系中，加入500μL DNS试剂，煮沸5min显色，冷却至室温后，在4℃,10,000rpm的条件下离心1分钟以去除不容物。将样品稀释三倍至3mL，分别测定实验组与对照组OD540的值，相对果胶酶活性以OD540与Pcc菌落个数的比值表示。PgroEL
实施例9：LeMomL菌株对Pcc植物侵染力的影响
Pcc可侵染多种寄主，包括十字花科、茄科、豆科、葫芦科等多种蔬菜，造成经济农作物损失。本实施例以Pcc侵染白菜为例，研究LeMomL菌株对Pcc植物侵染力的影响。首先，将产酶溶杆菌及LeMomL菌株分别接于LB培养基中培养，当菌液达到同一OD值(0.8-1.0)时，对菌液进行稀释，使细菌群体为108cfu mL-1。与此同时，将Pcc接于LB培养基中进行培养，当达到对数生长期时，对菌液进行稀释，使细菌群体为106cfu mL-1。将稀释过的野生型产酶溶杆菌和LeMomL菌株菌液分别与稀释后的Pcc菌液按照1:1的比例混合，待用。然后，挑选同一白菜形态、大小、生长发育状况相近的叶片进行清洗，置于超净工作台中自然晾干，并喷洒70％乙醇进行杀菌。待乙醇完全挥发后，用无菌刀片在叶片中央割出1cm的伤口，将10μL混合菌液注入伤口，以Pcc单菌培养液为对照。最后，将无菌滤纸片用10mL无菌水打湿，与接过病原菌的白菜叶片一同放于保鲜袋中进行密封，28℃培养48小时后，观察白菜叶片被侵染的情况。结果如附图5所示，Pcc与产酶溶杆菌及LeMomL菌株共培养后侵染白菜叶片，Pcc的侵染能力均有所下降，但与后者共培养时侵染能力下降比前者明显。
为了验证本发明方法的可重复性及广泛性，分别进行三次平行实验，每次挑取5个单克隆，结果显示所有挑选的重组菌株都与实施例的LeMomL重组菌株具有类似的效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种异源表达群体感应淬灭酶的方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 331
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
cgatgccttt gtgccagatc gccagaccgg accgaaaggc gtcgggcctg aaagccctcc 60
cactagagcc cccagggtga agagccctcc cacaacagct ccggggtccg cgggctctcc 120
cagcgccgcc ggccggcccc gcggaccgac cgctgtcacc gttccgatgc aggattcgtc 180
gcggcccccc ttgaaagccg tccgaggcgc cctatctccg aaccagtccc ggcttgccgg 240
gcgctttcgt ccccggcatt ggcactcgcc gggtgcgact gctaaaattc ccgttcttta 300
tccaccaatt caattactta cagaggtcgc c 331

Claims (5)

1.一种重组表达载体的用途，其特征在于，所述的用途是重组表达载体在产酶溶杆菌中重组表达外源基因的应用，所述的重组表达载体，其中使用的启动子的核苷酸序列为SEQID NO:1。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的外源基因为群体感应淬灭酶MomL。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的群体感应淬灭酶MomL整合到产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的群体感应淬灭酶MomL整合到黄色素合成基因簇中酮基还原酶基因内部。
5.一种工程产酶溶杆菌，其特征在于，所述的工程产酶溶杆菌是用于重组表达群体感应淬灭酶MomL；所述的工程产酶溶杆菌是通过重组表达载体将群体感应淬灭酶MomL整合到产酶溶杆菌的黄色素合成基因簇中构建的；其中重组表达载体，其中使用的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
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