CN110484481A - 一种通过改造林可链霉菌slcg_3128基因提高林可霉素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过改造林可链霉菌SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法，在林可链霉菌中，通过基因工程途径过表达Lrp家族转录调节基因SLCG_3128，获得林可霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产林可霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高林可霉素产量提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种通过改造林可链霉菌 SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法。
背景技术
链霉菌能产生丰富的次级代谢产物，并且这些次级代谢产物及其衍生物医疗 上用途广泛，诸如抗生素、抗癌药、免疫抑制剂等。目前医疗上使用的抗生素和 抗癌药，超过一半以上都是由链霉菌产生的。全基因组测序研究发现链霉菌含有 多个生物合成基因簇，但这些基因簇或是沉默的，或是生物合成能力较弱，需要 通过筛选才能获得工业生产所需的高产菌株。过去工业生产菌株主要通过物理或 化学诱变方法获得。传统的诱变技术不但耗时，且随机性较大，无法对育种提供 理论性指导。本发明目的就是通过基因工程途径定向改造基因来获得林可霉素高 产菌株，用于林可霉素或中间产物生产。
林可链霉菌NRRL2936是1962年从土壤中分离出的第一株林可霉素产生 菌。其次级代谢产物林可霉素A是重要的林可酰胺类抗生素，目前林可霉素系 列化学衍生物(盐酸林可霉素、克林霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。随着林 可霉素及其衍生物在医疗和商业上需求的日益增长，吸引了许多科学家来研究如 何提高其产量。同其它放线菌类似，林可霉素的生物合成基因也成簇地集中在一 个DNA片段上。1995年，Peschke等在林可链霉菌78-11中成功克隆了林可霉 素的生物合成基因簇，其基因簇大小为35kb，包含29个开放阅读框和13个转 录单元。到目前为止，关于林可霉素生物合成基因簇内的大部分基因的功能已被 解析，林可霉素生物合成通路已非常清晰。然而，关于林可霉素生物合成调控的 研究还比较有限，这限制了通过林可链霉菌基因调控改造提高产量。
Lrp(leucine-responsive regulatory protein)家族是一类广泛存在于细菌和古 细菌中的转录调控因子，参与调控细胞的多个生理过程，例如氨基酸代谢和转运、 新陈代谢、DNA修复和重组。Lrp同源蛋白AsnC家族调控因子能够特异性的激 活天冬酰胺合成酶的转录从而参与天冬酰胺的合成，因此也可被称为Lrp/AsnC 家族蛋白。近年来报道了放线菌多种Lrp/AsnC家族转录调控子参与抗生素产量 和形态分化，比如BkdR、SCO2140、SACE_Lrp、SCO3361、SACE_5717等， 暗示着Lrp家族调控基因在放线菌抗生素生物合成中的重要性。然而却没有关于 林可链霉菌中Lrp家族调控基因调控次级代谢的研究。
发明内容
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种通过改造林可链霉菌 SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法。
为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种通过改造林可链霉菌SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法，通过 基因工程途径使林可链霉菌中过表达Lrp家族转录调控基因SLCG_3128，获得 林可霉素高产工程菌株，用所得的菌株发酵生产林可霉素即可。
进一步的，所述的SLCG_3128基因产物可以正向调控林可霉素生物合成。
进一步的，所述的方法在工业菌株中的应用，在工业高产菌株中过表达Lrp 家族调控基因SLCG_3128，获得高产突变株，可用于林可霉素生产。
本发明的优点是：
本发明研究中筛选到了林可霉素生物合成正调控子SLCG_3128，通过基因 工程途径过表达林可链霉菌染色体上SLCG_3128基因拷贝，能够获得林可霉素 高产菌株，为工业生产提高林可霉素发酵产量提供技术支持。
林可链霉菌LCGL中过表达SLCG_3128基因时林可霉素产量提高了24％， 而ΔSLCG_3128缺失突变株林可霉素产量降低30％，表明SLCG_3128是一个参 与林可霉素生物合成的正调控因子。利用工业高产菌株LA219X作为出发菌株， 在其染色体上过表达SLCG_3128基因，使林可霉素产量提高12％，说明过表达 SLCG_3128基因提高林可霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。
附图说明
图1所示为SLCG_3128基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息。
图2所示为ΔSLCGL_3128突变体构建示意图及缺失突变株的PCR鉴定，其 中：
(A)ΔSLCGL_3128突变体构建示意图，
(B)ΔSLCGL_3128突变体的PCR鉴定：M，5000bp DNA Marker。
图3所示为SLCG_3128基因回复、过表达菌株的构建，ΔSLCGL_3128/ pSET152-3128回补、LCGL/pSET152-3128过表达菌株的PCR鉴定：PCR产物 为apr抗性基因(776bp)；M，5000bp DNA Marker，1，ΔSLCGL_3128/pSET152， 2，ΔSLCGL_3128/pSET152-3128，3，LCGL/pSET152，4，LCGL/pSET152-3128。
图4所示为出发菌株LCGL、缺失突变株ΔSLCGL_3128以及缺失回补菌株 及回补空载对照菌株、过表达菌及过表达空载对照菌株林可霉素的HPLC分析。
图5所示为SLCG_3128基因对菌株形态分化的影响及ΔSLCGL_3128突变株 生物量的测定，其中：
(A)ΔSLCGL_3128突变株和出发菌株LCGL菌株菌丝体的生物量测定；
(B)ΔSLCGL_3128突变株和出发菌株LCGL菌株的孢子生长情况。
图6所示为基因转录水平分析，其中：
(A)ΔSLCGL_3128中林可霉素生物合成基因簇的转录水平；
(B)ΔSLCGL_3128中自身SLCG_3128转录水平。
图7所示为SLCG_3128蛋白纯化表达及与相关基因启动子区EMSA分析， 其中：
(A)SLCG_3128蛋白纯化；
(B)SLCG_3128蛋白与自身间隔区和生物合成基因簇间隔区的EMSA分 析。
图8所示为林可霉素工业高产菌株ΔSLA219X_3128缺失突变株的林可霉素 产量分析。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：
实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。大肠杆菌在 37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。林可霉素产 生菌林可链霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSBY)培养基或在含 有2.2％琼脂的MGM平板上培养。
实施例使用的材料中PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋白氨基酸、硫链丝菌肽、 安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘 氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和林可链霉 菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上 海)股份有限公司完成。
表1研究中所用的菌种和质粒
表2本研究所用引物
实施例1
SLCG_3128基因缺失突变体的构建：
如图2所示，为了敲除林可链霉菌中的SLCG_3128基因，分别用 3128-L1/23128-L2和3128-R1/3128-R2为引物、林可链霉菌LCGL基因组为模板， PCR扩增SLCG_3128基因的上、下游各约2.0kb的同源片段。
同时将上述两个3128-U和3128-D上下游片段连接到pKC1139载体上，完 成构建质粒pKC1139Δ3128。利用原生质体转化技术，将pKC1139Δ3128质粒转 化到林可链霉菌原生质体中，根据安普霉素抗性筛选阳性突变株，获得 SLCG_3128基因敲除的基因工程菌株。以P3128-1和P3128-2作为鉴定引物，以 质粒pKC1139Δ3128为阳性模板，LCGL基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳 性缺失突变体命名为ΔSLCGL_3128(见图2B)。
实施例2
SLCG_3128基因回复菌株的构建：
利用设计的引物3128-P3和3128-P4扩增出SLCG_3128基因，并电泳回收， 使用NdeI和XbaI内切酶分别对回收到的SLCG_3128基因片段与pSET152进行 双酶切并回收，通过T4DNA连接酶将SLCG_3128基因片段连接到pSET152上， 成功获得质粒pSET152-3128。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将 pSET152-3128导入ΔSLCGL_3128原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安 普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为 ΔSLCGL_3128/pSET152-3128。
实施例3
出发菌株LCGL中过表达SLCG_3128基因：
pSET152-3128通过PEG介导的原生质体转化技术导入林可链霉菌LCGL原 生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得阳性菌株命 名为LCGL/pSET152-3128，如图3所示。
实施例4
林可链霉菌发酵产物HPLC检测：
林可链霉菌在斜面培养基上培养7d后，挖1cm2接种于种子培养基，在30℃ 振荡培养48小时后，转接至发酵培养基，30℃振荡培养7d，然后取2ml菌液 12000rpm离心10min；再取200ul上清加800ul甲醇混匀，12000rpm离心10分 钟；最后将上清通过有机滤膜注入检测瓶中进行产量检测，如图4所示。
实施例5
林可链霉菌菌丝体生物量检测：
以相同的接种量分别将ΔSLCG_3128突变株与LCGL接种于的液体TSBY 中，30℃摇床培养48小时后，转接到50mLYMG培养基中30℃转速240rpm摇 床培养7d，期间设置不同时间段取样，用无水乙醇清洗后烘干称量菌体干重， 每次重复取样两次，并取得平均值，测量结束后根据实验数据绘制菌体生物量曲 线，如图5所示。
实施例6
林可霉素工业高产菌株ΔSLA219X_3128菌株的构建及HPLC检测：
在林可霉素工业高产菌株LA219X中缺失SLCG_3128，验证正确菌株命名 为ΔSLA219X_3128。并将LA219X高产菌株与缺失突变株ΔSLA219X_3128的发 酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述实施例1和实 施例4的方法。
实施例7
ΔSLCGL_3128中相关基因的转录分析：
收集20h的ΔSLCGL_3128和出发菌株LCGL菌液，提取获得所需RNA，反 转成cDNA后，使用实时荧光定量PCR仪上机检测，如图6所示。
实施例8
SLCG_3128的蛋白表达以及与相关基因启动子区EMSA分析：
根据NCBI上注释信息，设计带有NdeI和HindⅢ酶切位点的蛋白表达引物 3128-pro1/2，扩增出SLCG_3128完整基因片段连接pET28a上。对挑取的单克隆 进行菌液PCR验证。
将上述构建成功的蛋白表达载体pET28a-3128转入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中，在Kana抗性LB固体培养基上挑取单菌落，扩大培养后用 3128-pro1/2引物进行菌液PCR鉴定，筛选到的菌株命名为BL21/pET28a-3128。
将BL21/pET28a-3128接种于Kana抗性LB液体培养基中，37℃过夜培养； 次日按2％接种量转接，37℃培养至菌体OD600在0.4-0.6之间加IPTG(终浓度 0.4mM)，18℃180rpm下诱导表达10h；收集菌体并超声破碎，离心取上清进行 Ni-亲和层析，用不同浓度的咪唑洗脱后经SDS-PAGE检测。预测的蛋白大小为18kDa。
用生物合成基因簇间隔区及自身间隔区引物分别PCR扩增生物合成基因簇 间隔区及自身间隔区，对扩增产物进行电泳并回收获得探针。将探针分别与纯化 的SLCG_3128蛋白在30℃中进行孵育，孵育体系为20μL，10min后进行活性 PAGE检测，如图7所示。
林可霉素工业高产菌株ΔSLA219X_3128缺失突变株的林可霉素产量分析如 图8所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种通过改造林可链霉菌SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
<400> 1
aaaaagcttt acgggcagac cgaccaggaa atctagaccg atgacacggc gagacgaaag 60
gatcccgacg ctggtgatga agcaaaagaa ttcgccgtgt agaagccgga gaatggatga 120
cgttgatcgg aaaccgcccg ctgccggcgt agaaacatat gatggatgac gttgatcgga 180
aaaaatctag atgtacgggc gcgctacgcc ggtgcaatac gaatggcgaa accgctcgcc 240
agtcgattgg caaacatatg atggatgacg ttgatcggaa aaaaagcttc tacgccggca 300
gcgggcggtg aggagggtcg cggaatcgct gaagctcggc aagaagacgc ggaagggcgt 360
cagaggtcat ccgggctttg ccgaacggct gtcataagcc gacgtcccac acctgtccgc 420
aggttgccgc tttggatggt ccggatcaac ggccaaacag ctgggctcat tggcggccgc 480
cgcacgcgtg gtccggaggt ggcacgagcg aagacagaca tccgcgccgt gcgctgaagg 540
accgcgccgc gccgtgcgct gaaggaccgc gggcccgcat tggacgccag ccaatgcgcc 600
aggcctgcca gggcggcctg gatgtgggac ccggccacgt gccgcgggaa gtgcgcgtgg 660
acggtcagca ggcacgcggc cgagtggcgg taccggtgag tagagcttcg cgaaatcatg 720
gtcggctgcc gtgtcgactg tccctcgcgt cctgccgtgt cgactgtccc tcgcgtcagg 780
tccggcgtat ccagaaagat cttcaaccgc ggtgacaggg cggcccactg gccacggcgg 840
tcgcttccgt gtaggtgcag acaatactcg cgtcagccat agccatgggc accgagctcc 900
ccatgatcag cttcacgctc ctccagtgac gccgtacacc ttgcattgcg tgcggtcgtc 960
tcgaaggcgt tgagcgtctg gggccagcgg tatgtcggtg aacccaaggc ccggtctttc 1020
tttcacccac cgaccccacc ccgagaccaa cggctgtacg ggtgttcgtc gccgatgtcc 1080
gccgtgggcc ggtatctgtt acggcctgtg cgtgatgagg ctgcgtgagg acgtggatgc 1140
ccgcttgagc accgagaacg tcggcgagga cattctgcac ctcggcgtgg tgctggaacc 1200
tggtgtctgg gcgactggat cctcatggca cgtcaacacg tcagcgacag gctcaggaat 1260
cctcgccttc tcccagtacg gctcacgggt cagtacgagt agtcgggaat cgaggactgg 1320
cggcaccttg atgacgatgt tggaggcagg tgaagaagga cgccgtcgtc accaatcagc 1380
ggtgacaaga tcgcagtacc cacgccgagt tcgagcgtct accacatcgc cttctgtggt 1440
gatccactcg tcgt 1454
Claims (3)
1.一种通过改造林可链霉菌SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程途径使林可链霉菌中过表达Lrp家族转录调控基因SLCG_3128，获得林可霉素高产工程菌株，用所得的菌株发酵生产林可霉素即可。
2.根据权利要求1所述的一种通过改造林可链霉菌SLCG_3128基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于，所述的SLCG_3128基因产物可以正向调控林可霉素生物合成。
3.根据权利要求1或2所述的方法在工业菌株中的应用，其特征在于，在工业高产菌株中过表达Lrp家族调控基因SLCG_3128，获得高产突变株，可用于林可霉素生产。
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