CN111019965A - 新霉素生物合成基因簇遗传改造的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供构建新霉素高产工程菌株弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的方法，所述方法包括将弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇导入野生型弗氏链霉菌中。所述方法还可以包括对要导入野生型弗氏链霉菌中的弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇进行基因工程改造，所述基因工程改造可以包括对新霉素生物合成基因簇中的负调控基因neoI进行阻断或对新霉素生物合成基因簇中的负调控基因neoI进行阻断的同时并且利用强启动子驱动关键酶编码基因neoE‑neoD共转录单元的转录。本发明还提供通过上述方法获得的高产新霉素的弗氏链霉菌。

Description

新霉素生物合成基因簇遗传改造的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物制药领域，具体涉及从一株弗氏链霉菌 (Streptomycesfradiae)中克隆了完整的新霉素生物合成基因簇，并对该基因 簇进行遗传操作而获得新霉素高产工程菌株，为医药及工业生产提供一种 提高新霉素产量的方法。

背景技术

链霉菌(Streptomyces)是一类高GC含量的革兰氏阳性土壤丝状细菌， 属于原核生物界放线菌纲链霉菌科。链霉菌具有复杂的形态分化，能够产 生丰富的次级代谢产物，目前已知的由微生物产生的抗生素中，约三分之 二源自放线菌，而其中的80％以上又来源于链霉菌，这些抗生素除了可以 抑杀菌外，还可以作为抗癌药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂等，在医 疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域发挥着重要作用。

弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae CGMCC 4.576)是新霉素(Neomycin) 的产生菌，近年来Kudo F等研究团队深入全面的揭示了新霉素生物合成 的代谢途径，对新霉素生物合成途径的结构基因进行了实验研究和功能预 测(Kudo,F.,et al.(2016).Aminoglycoside antibiotics:new insights into the biosynthetic machinery ofold drugs.Chemical Record,16(1),4-18.)，中科院 微生物所陈义华课题组对新霉素生物合成相关调控基因neoR、afsA的调控 机制进行了揭示(Meng,X.,et al.(2017).Neomycin biosynthesis is regulated positively by AfsA-g and NeoR inStreptomyces fradiae,CGMCC 4.7387. Science China Life Sciences,60(9),1-12.)。新霉素是由弗氏链霉菌产生的氨 基糖苷类抗生素，属于多组分抗生素，主要有新霉素A、新霉素B及新霉 素C三种组分，其中主要有效组分新霉素B相对于其他组分活性强，毒性 弱。新霉素主要与细菌核糖体30S亚基结合从而抑制细菌合成蛋白质，对 G⁺、G^-菌、结核杆菌等均有抑制作用，具有广谱抗菌性。此外，也有研究 表明新霉素很有可能成为一种极具开发潜力的抗肿瘤药物(Bottero V., (2013)Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-positive primary effusion lymphoma tumor formation in NOD/SCID mice isinhibited by neomycin and neamine blocking angiogenin's nucleartranslocation.Journal of Virology 87(21):11806-11820；Hu GF(2001)Neomycininhibits the angiogenic activity of fibroblast and epidermal growthfactors.Biochemical&Biophysical Research Communication 287(4):870-874.)。但由于新霉素具有一定的耳毒 性限制了它在临床上口服和注射等方面的使用，目前主要作为兽药出口外 销，少量被制成药膏应用于皮肤消炎。在兽用方面，新霉素是防治畜禽肠 道感染、白痢、伤寒及呼吸道疾病的首选药物之一，由于它也能提高饲料 利用率，促进禽畜、鱼类生长，还常被用作饲料添加剂。1994年，Rooing 和Fagerberg提交于美国FDA的新霉素在动物机体内药代动力学的报告表 明了其对于动物的高度安全性，因而也成为了国外最为常用的兽用抗生素 之一。美国普强公司是最早研制开发和生产新霉素的企业,产品效价已达 30000U/mL，目前也是世界上生产规模最大的企业，我国生产的硫酸新霉 素主要用于出口，面向欧洲、美洲等地，且有供不应求之势，然而我国新 霉素产量偏低、成本高，工业生产商采用的研究手段仍停留在上世纪80 年代所采用的随机诱变或优化培养条件上，缺乏从菌种自身进行理性改造 而提高新霉素合成能力的操作，较为落后的菌种改良技术与日益增长的供 应需求间形成了新的矛盾。因此，如何理性改造新霉素生产菌株使其产量 进一步提高，满足微生物制药市场需求是目前亟待解决的关键问题。

传统的抗生素高产菌株选育主要是通过诱变育种来实现，虽然这种方 法简单有效，但是费时费力，而且随着诱变菌株产量的提高，进一步诱变 育种时容易产生负突变，效率会逐步下降。在过去几十年中已经开发出了 不少抗生素增产的方法或策略，在早期的实践中，人们发现提高基因簇中 关键步骤所涉及的相关结构基因的表达可有效地提高产量，但次级代谢产 物合成通路中关键步骤往往不止一个，只提高其中某一个步骤的转化效率可能会导致另外一个催化反应成为新的限速步骤。而此时高表达多个基因 甚至整个次级代谢产物生物合成基因簇就成为一种有效提高代谢产物整 体合成率的增产策略。传统突变方法获得的部分工业高产菌株中，也可以 观察到基因簇倍增的现象。例如：林可霉素工业生产菌——林肯链霉菌可 变种，正是由于林可霉素生物合成基因簇的倍增导致其产量增加(Peschke, U.,et al.(2010).Molecular characterization of the lincomycin-production gene cluster of Streptomyces lincolnensis 78-11.MolecularMicrobiology,16(6), 1137-1156.)；同样，在青霉素和卡那霉素高产工程菌株中，也观察到整个 生物合成基因簇的拷贝数增加(Yanai,K.,et al.(2006).Amplification of theentire kanamycin biosynthetic gene cluster during empirical strainimprovement of Streptomyces kanamyceticus.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,103(25),9661-9666.)。而 在出发菌株中，人为引入携带次级代谢物生物合成基因簇的整合型质粒或 者多拷贝质粒甚至用CRISPR-Cas9的基因工程法实现同一个簇的多位点 整合来倍增次级代谢产物基因簇，也同样使得抗生素产量有所提高，这种 靶向遗传操作无论从菌株的遗传稳定性上还是产量提高幅度上来说，较传 统突变方法效果更显著。基因簇倍增后既能增加结构基因的拷贝数，同时 也能增加抗性基因以及调控基因的拷贝数，进而从拷贝数、转录强度以及 抗生素转运三方面的增强来达到增产效果。本课题组廖国建博士将尼可霉 素的生物合成基因簇整合到圈卷产色链霉菌的基因组上，结果尼可霉素的 产量提高了约4倍(Liao,G.,et al.(2010).Cloning,reassembling and integration of the entire nikkomycinbiosynthetic gene cluster into Streptomyces ansochromogenes lead to animproved nikkomycin production. Microbial Cell Factories,9(1),6-6.)，杜德尧博士将放线紫红素生物合成基 因簇以及达托霉素基因簇倍增，相应产量均有显著提高(Du,D.,et al. (2013).Improvement of gougerotin and nikkomycin production byengineering their biosynthetic gene clusters.Applied Microbiology&Biotechnology,97(14), 6383-6396.)。由此可见，增加抗生素生物合成基因簇拷贝数是一种有效的 增产策略，如果再结合特定基因簇的调控特点，利用遗传手段对倍增的基 因簇进行改造，将能进一步提升抗生素产量。

随着基因组测序技术及分子生物学的发展，针对大片段克隆及编辑的 方法越来越成熟，例如：Gibson体外等温一步法DNA组装技术(Gibson,D. G.,et al.(2009).Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatureMethods,6(5),343.)及PCR targetting(Gust,B.,et al.(2003). PCR-targetedStreptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,100(4), 1541-1546.)，使得利用基因工程技术改造微生物代谢变得更加容易。

发明内容

针对上述情况，为了提高弗氏链霉菌中新霉素产量，为工业生产菌株 的技术改良提供理论依据，本发明之目的在于提供一种通过基因工程手段 改造新霉素基因簇获得能够提高弗氏链霉菌中新霉素产量的方法。本发明 的工程菌可以使新霉素总产量提高35.78％。本发明所使用的弗氏链霉菌是 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝 阳区北辰西路1号院3号)提供的，其原保藏号为：CGMCC 4.576。

为了达到上述目的，本发明涉及如下技术步骤：

(1)首先通过φBT1 attB/attP-int系统(Zhang,L.,et al.(2008).Highlyefficient in vitro site-specific recombination system based on StreptomycesphageφBT1 integrase.Journal of Bacteriology,190(19),6392；Du,D.,et al.(2015).Genome engineering and direct cloning of antibiotic gene clusters viaphageφBT1 integrase-mediated site-specific recombination in Streptomyces.Scientific Reports,5,8740.)克隆了完整的新霉素生物合成基因簇。该方法需 要通过两次同源单交换将attB₆和attP₆序列及温度敏感型质粒pKC1139通 过该簇的两个同源臂引入到新霉素基因簇的两端，再导入含有φBT1整合 酶编码基因的帮助质粒pIJ10500(Gregory,M.A.,et al.(2003).Integration site for Streptomyces phageφBT1 anddevelopment of site-specific integrating vectors.Journal of Bacteriology,185(17),5320-5323.)，φBT1整合酶识别 attB₆和attP₆位点使得基因组上的新霉素生物合成基因簇与pKC1139载体 完成整合环化而获得游离型大质粒pKCZ01，将含有已克隆的完整新霉素 基因簇的载体(pKCZ01)导入到野生型菌株中，获得重组菌株Sf/pKCZ01。

(2)对克隆到的完整的新霉素生物合成基因簇进行基因工程改造。 首先通过PCRtargeting大片段编辑方法将克隆到的新霉素生物合成基因 簇中的负调控基因neoI进行阻断、另外也在该基因阻断的同时利用强启 动子P_kasO*(Wang,W.,et al.(2013).Anengineered strong promoter for Streptomycetes.Appl Environ Microbiol,79(14),4484-4492.)驱动关键酶编码 基因neoE-neoD这个共转录单元的转录，最后将改造后的基因簇导入到野 生型菌株中，分别获得重组工程菌株Sf/pKCZ02和Sf/pKCZ03(Sf/pKCZ03 即Streptomyces fradiae ZL03)。申请人对Sf/pKCZ03(ZL03)在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1 号院3号)进行了专利保藏，其保藏号为CGMCC NO.16511(分类命名： 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae))，保藏时间为2018年9月21日。

(3)经各阶段获得的重组工程菌株进行发酵、HPLC-ECD定量分析 及关键酶编码基因的转录水平分析。该方法能够显著将弗氏链霉菌新霉素 总产量提高35.78％，其中主要有效组分新霉素B提高了22.60％。

以上所述技术步骤，是本技术领域的普通专业技术人员都能理解和实 现的。本发明所涉及的重组菌株和重组质粒，均在本发明要求保护的范围 之内。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.构建高产新霉素的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的方法，所述 方法包括将弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇导入野生型弗氏链霉菌 中。

2.根据1所述的方法，所述方法还包括对要导入野生型弗氏链霉菌 中的弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇进行基因工程改造，所述基因工 程改造包括对新霉素生物合成基因簇中的负调控基因neoI进行阻断。

3.根据2所述的方法，其中所述基因工程改造还包括在新霉素生物 合成基因簇中利用强启动子驱动关键酶编码基因neoE-neoD共转录单元 的转录。

4.根据3所述的方法，其中所述强启动子为P_kasO*启动子。

5.根据1所述的方法，其中所述新霉素生物合成基因簇的序列如 SEQ ID NO.1所示。

6.根据2所述的方法，其中所述基因工程改造的新霉素生物合成基 因簇的序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据3所述的方法，其中所述基因工程改造的新霉素生物合成基 因簇的序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据1所述的方法，其中所述野生型弗氏链霉菌为由中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏的、保藏号为： CGMCC 4.576的弗氏链霉菌。

9.通过根据1-8中任一项所述的方法构建的高产新霉素的弗氏链霉 菌。

10.根据9所述的高产新霉素的弗氏链霉菌，其被保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)并且具有保藏号CGMCC NO.16511。

11.根据9或10所述的高产新霉素的弗氏链霉菌用于生产新霉素的用 途。

附图说明

为了便于理解本发明的目的、技术方案和较好的效果，通过附图以进 一步说明。

图1A和1B分别为用于在新霉素生物合成基因簇两端引入attB₆和 attP₆序列及该簇两侧的同源臂序列的质粒构建的示意图，图1C为质粒酶 切验证图。

图2A和2B分别为新霉素生物合成基因簇的克隆示意图及重组质粒 pKCZ01的PCR验证图，图2C为重组菌株Sf/pKCZ01的PCR验证图。

图3A为新霉素生物合成基因簇中负调控基因neoI阻断的重组质粒 pKCZ02构建示意图，图3B为重组质粒pKCZ02的PCR验证图。图3C 为重组菌株Sf/pKCZ02的PCR验证图。

图4A为新霉素生物合成基因簇中负调控基因neoI被阻断，并且利用 强启动子P_kasO*驱动neoE-neoD转录的重组质粒pKCZ03构建示意图， 图4B为重组质粒pKCZ03的PCR验证图，图4C为重组菌株Sf/pKCZ03 的PCR验证图。

图5为新霉素标准品及新霉素产生菌弗氏链霉菌野生型的 HPLC-ECD分析图。

图6为新霉素高产工程菌株新霉素产量变化图。

图7为新霉素高产工程菌株关键酶编码基因转录分析图。

图8显示pIJ778质粒的图谱，质粒pIJ778包含链霉素/壮观霉素抗性 基因aadA(AC＝M60473)，RP4质粒的oriT(AC＝L27758)，FRT位点(FLP 识别位点)。

图9显示pIJ790质粒的图谱，λRED重组质粒pIJ790是将λRED重 组质粒pKD20中(E.coli Genetic Sock Center CGSC Strain#7637；Datsenko and Wanner,2000)的氨苄青霉素抗性基因bla替换为氯霉素抗性基因cat。

图10显示BT340质粒的图谱，BT340包含bla(Amp^R)，cat(Cm^R)， [repA101(ts)]，FRT位点。

图11显示pIJ10500质粒的图谱，pIJ10500包含Hyg^R，

oriT。

图12显示pKC1139质粒的图谱，pKC1139包含aac(3)IV(Apr^R)，oriT (RK2)，ori(pSG5)。

图13显示pNIK-DNI质粒的图谱，pNIK-DNI包含bla(Amp^R)，aac(3)IV (Apr^R)，其被用作模板以对连有抗性基因的DNA片段Hpa I-bla-Hpa I进行 PCR扩增。

具体实施方式

下面通过实例并结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1：新霉素生物合成基因簇的克隆

新霉素生物合成基因簇的克隆策略采用φBT1 attP-attB-int整合系统 (Zhang,L.,et al.(2008).Highly efficient in vitro site-specific recombination systembased on Streptomyces phageφBT1 integrase.Journal of Bacteriology, 190(19),6392；Du,D.,et al.(2015).Genome engineering and direct cloning of antibioticgene clusters via phageφBT1 integrase-mediated site-specific recombinationin Streptomyces.Scientific Reports,5,8740.)，首先需要通过两 次同源单交换将attB₆和attP₆序列及温度敏感型质粒pKC1139通过该簇两 侧的同源臂序列分别引入到目的基因簇两端，因此构建了两个用于同源整 合的质粒：pIJ778::attB₆neoUp和pKC1139::attP₆neoDn。

基于pIJ778中的一段包含抗性基因及oriT序列(Gust,B.,et al.(2003). PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,100(4), 1541-1546.)构建的pIJ778::attB₆neoUp用于在新霉素基因簇的一端引入 attB₆位点及该基因簇的上游同源臂。pIJ778::attB₆neoUp上的元件有链霉素 /壮观霉素基因aadA，来源于RK2质粒的oriT位点(帮助接合转移)，一段 3kb左右与新霉素生物合成基因簇5'端同源的序列(SEQ ID NO.4)和attB₆位点(SEQ ID NO.6)。具体构建流程为：以质粒pIJ778为模板，以778-F/attB₆-778-R为引物进行PCR扩增，得到仅含有链霉素/壮观霉素基 因aadA，来源于RK2质粒的oriT位点的一段线性片段。再用 n-attB₆-US5-F/n-778-US5-R为引物，以弗氏链霉菌基因组DNA为模板进 行PCR扩增获得含有attB₆位点的新霉素生物合成簇5'端同源的序列，用 天根琼脂糖DNA回收试剂盒(TIANGEN，Beijing)回收这两个PCR扩增 的产物，将上述回收的片段用Gibson体系进行连接，连接产物转化大肠 杆菌JM109感受态，用链霉素/壮观霉素抗性及酶切验证筛选获得含有 pIJ778::attB₆neoUp的阳性克隆(图1A和图1C)。

PCR反应体系：2×PCR Buffer for KOD FX缓冲液50μL，2mM dNTPs 20μL,DMSO 5μL，KOD FX(1U/μL)2μL(以上试剂购自TOYOBO, Japan),10μM引物各3μL,基因组模板2μL(1-50ng),ddH₂O 19μL,总反 应体积100μL。PCR循环条件：预变性：94℃，3min。变性：94℃，30sec； 退火：60℃，30sec。延伸：68℃，1kb/min，30个循环；68℃，5min， 4℃，保存。

基于pKC1139(Kieser,T.,et al.(2000)Practical Streptomyces Genetics.Norwich:The John Innes Foundation)构建的衍生质粒pKC1139::attP₆neoDn 用于在新霉素生物合成基因簇的3'端引入attP₆位点，pKC1139::attP₆neoDn 含有一段2.5kb(SEQ IDNO.5)左右与目的基因簇3'端同源的序列和attP₆位点(SEQ ID NO.7)。具体构建流程为：以弗氏链霉菌基因组DNA为模板， n-attP6-DS-F/n-1139-DS-R作为引物进行PCR扩增，PCR产物按1:100稀 释，稀释后的液体作为第二轮PCR反应的模板， 1139-attP6-DS-F/n-1139-DS-R作为引物进行第二轮PCR，回收PCR产物。 EcoRV酶切pKC1139，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收大片段，与上一步回 收的片段进行Gibson连接反应，反应产物转化大肠杆菌JM109感受态， 用安普霉素抗性及酶切验证筛选含有pKC1139::attP₆neoDn的克隆(图1B 和图1C)，PCR反应体系和循环条件同上。

通过大肠杆菌-链霉菌接合转移先后两次依次将pIJ778::attB₆neoUp和pKC1139::attP₆neoDn导入弗氏链霉菌CGMCC 4.576中得到重组菌株 Sf-neoattB₆P₆，再通过第三次接合转移将携带有φBT1整合酶编码基因的 pIJ10500质粒(Gregory,M.A.,etal.(2003).Integration site for Streptomyces phageφBT1 and development ofsite-specific integrating vectors.Journal of Bacteriology,185(17),5320-5323.)导入Sf-neoattB₆P₆菌株中，得到了菌株 Sf-MCneo。Sf-MCneo中pIJ10500表达出的φBT1整合酶识别attB₆和attP₆位点，催化这两个位点整合环化，将新霉素生物合成基因簇(SEQ IDNO.1) 克隆到高拷贝游离型载体pKC1139上(命名为pKCZ01)，基因组上留下 42bp的attL₆位点、pIJ778载体序列和pIJ10500载体(图2A)，以 neo-1139-VF/neo-neoUP-VR为引物对pKCZ01质粒进行PCR验证(图 2B)，PCR反应体系和循环条件同上。

实施例2新霉素生物合成基因簇的改造

通过PCR targeting大片段编辑的方法对克隆到的新霉素生物合成基 因簇中负调控基因neoI(SEQ ID NO.8)进行阻断，首先以pNIK-DNI(Zhuo, J.,et al.(2017).Reconstruction of a hybrid nucleoside antibiotic gene cluster based onscarless modification of large DNA fragments.Science China Life Sciences,60(9),1-12.)作为模板，以neoItoamp-F/neoItoamp-R作为引物进行 PCR扩增,获得一个基础元件HapI-bla-HapI。neoItoampF/neoItoampR引 物两端分别带有39bp与neoI基因上下游同源的序列以便于发生λRED重 组。将上述回收的产物HapI-bla-HapI通过电转化导入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790/pKCZ01菌株(BW25113/pIJ790菌株用于利用PCR targeting方法进行基因编辑。pIJ790质粒含有λ-RED重组酶，用于同源重 组进行基因编辑。将pKCZ01导入到BW25113/pIJ790菌株中，就获得了 BW25113/pIJ790/pKCZ01，参见Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.(2000). One step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,97,6640–6645.Gust,B.,Challis,G.L.,Fowler,K.,Kieser, T.,and Chater,K.F.(2003).PCR-targeted Streptomycesgene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of thesesquiterpene odor geosmin.Proc Natl Acad Sci USA 100,1541–1546.)中，在λRED重组酶的作 用下用氨苄抗性基因bla替换neoI基因，在含有氨苄抗性的Luria-Bertani (LB)培养基平板上筛选阳性克隆，获得重组质粒pKCZ02(其中含有的基 因编辑后的新霉素基因簇序列见SEQ ID NO.2)(图3A)，以ampHapI-F/ ampHapI-R为引物对该重组质粒进行PCR验证(图3B)。

为了实现将新霉素生物合成基因簇中负调控基因neoI阻断的同时利 用强启动子P_kasO*驱动关键结构基因neoE-neoD这个共转录单元的转录。 首先以质粒pIJ778为模版，用aadA-F1/KasO-R1为引物扩增链霉素/壮观 霉素抗性基因aadA。用KasO-F2/KasO-R2为引物扩增P_kasO*强启动子(该 启动子的核酸序列见SEQ ID NO.44，Wang,W.,et al.(2013).Anengineered strong promoter for streptomycetes.Appl Environ Microbiol,79(14),4484-4492)，将上述PCR产物各取1μL作为模板，以aadA-F1/KasO-R2 为引物进行融合PCR，以扩增出强启动子P_kasO*和链霉素/壮观霉素抗性基 因aadA的融合片段，将上述产物切胶回收，通过电转化将其导入大肠杆 菌E.coli BW25113/pIJ790/pKCZ02菌株(BW25113/pIJ790菌株用于利用 PCR targeting方法进行基因编辑。pIJ790质粒含有λ-RED重组酶，用于 同源重组进行基因编辑。将pKCZ02导入到BW25113/pIJ790菌株中，就 获得了BW25113/pIJ790/pKCZ02，参见Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L. (2000).One step inactivationof chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,97,6640–6645.Gust,B.,Challis,G.L.,Fowler,K., Kieser,T.,and Chater,K.F.(2003).PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene odor geosmin.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,100,1541–1546.)中，实现将负调控基因neoI 敲除的同时利用强启动子(P_kasO*)驱动neoE-neoD转录单元，然后在安普霉素和链霉素/壮观霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆，获得的重组质粒命 名为pKCZ02::aadA-KasO*然后将pKCZ02：：aadA-KasO*导入到 DH5α/BT340(BT340是一个温度敏感的带有FLP位点特异性重组酶编码 基因的质粒，能够通过表达的FLP重组酶识别FLP位点，从而将位于FLP 位点之间的抗性基因切除，参见Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.(2000). Onestep inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America,97,6640–6645.Cherepanov PP,Wackernagel W.(1995). Gene disruptionin Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzedexcision of the antibiotic-resistance determinant. Gene,158(1):9-14.)，从而将pKCZ02::aadA-KasO*中链霉素/壮观霉素抗性 基因丢掉，最终获得重组质粒pKCZ03(其中含有的基因编辑后的新霉素基 因簇序列见SEQ ID NO.3)(图4A)，以kasO-F/kasO-R为引物对该重组质 粒进行PCR验证(图4B)。

实施例3新霉素高产工程菌株的构建

接合转移具体操作流程如下：

首先将上述构建好的质粒(pKCZ01、pKCZ02、pKCZ03)转化进入 E.coli ET12567/pUZ8002(参见Paget,M.S.,Chamberlin,L.,Atrih,A.,Foster, S.J.and Buttner,M.J.(1999).Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor sigma^E isrequired for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2).JBacteriol 181,204–211.)，挑取含有重组质粒的克隆于液 体LB培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0) 培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6(培养时添加100μg/mL卡那霉素、100μg/mL安 普霉素和25μg/mL氯霉素)。收集菌体用新鲜无抗生素的LB培养基洗涤 两次，等体积重悬于2×YT培养基(胰蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0)中备用。弗氏链霉菌(CGMCC 4.576)培养于MS培养基 (甘露醇20g/L，大豆粉20g/L，琼脂粉20g/L)，28℃培养4～5天，待 其产孢后将弗氏链霉菌的孢子用2×YT培养基洗涤两次并重悬于2×YT 培养基中，50℃水浴锅中热激10分钟，冷却至室温待用。取500μL含有 重组质粒的E.coli ET12567/pUZ8002和500μL经热激的弗氏链霉菌孢子 悬浮液充分混合，最后涂布至MS固体培养基平板上。28℃倒置培养16～ 18小时后，每板加终浓度25μg/mL的萘啶酮酸和相应抗生素(安普霉素： 终浓度为20μg/mL)，28℃继续培养3-5天。待长出接合子后，挑取数个 菌落转接于MS平板(含终浓度25μg/mL萘啶酮酸和20μg/mL的安普霉 素)，经过抗性筛选及PCR验证获得正确的接合子。

将pKCZ01、pKCZ02、pKCZ03通过转化导入到E.coli ET12567/pUZ8002中，经过大肠杆菌-链霉菌接合转移将上述质粒转移到 弗氏链霉菌野生型中，以安普霉素为筛选标记筛选转化子并进行PCR验 证，分别获得验证正确的重组菌株Sf/pKCZ01、Sf/pKCZ02和Sf/pKCZ03 (相应的接合子的PCR验证如图2C、图3C及图4C)。

分别对野生型和上述一系列重组菌株进行液体发酵，将发酵液离心过 滤后进行离子色谱定量(HPLC-ECD)分析(新霉素标准品及野生型发酵 HPLC-ECD分析如图5)。

发酵具体流程如下：

种子培养基配方：TSB 30g/L，pH自然，121℃，30min灭菌。

发酵培养基配方：可溶性淀粉20g/L，豆粉15g/L，葡萄糖5g/L， 酵母提取物2.5g/L，氯化钙1g/L，海盐35g/L，pH自然，121℃，30min 灭菌。

将上述菌株接种在TSB液体培养基中，培养48h后，分别转接10％ 的菌体到50mL(500mL三角瓶)发酵培养基，28℃，发酵7天，然后过 滤菌体，取上清液进行HPLC-ECD分析。

表1菌株和质粒

表2引物序列

实施例4新霉素系列高产工程菌株中新霉素产量的定量检测及合成 途径中关键酶编码基因的转录水平分析

HPLC-ECD检测条件如下：采用Agilent zorbax-SB C18(5μm,4.6×250 mm)色谱柱；流动相为25mL TFA+6mL NaOH(50％,W/W)定容到1000 mL，流速为0.7mL·min^-1，柱后衍生液为0.5M NaOH溶液，柱后衍生液 流速0.5mL·min^-1，柱温30℃，进样量20μL，电化学采用脉冲安培检测 模式：E₁＝+0.1V，E₂＝+0.8V，E₃＝-0.6V，t₁＝290ms，t₂＝150ms， t₃＝60ms，t_s＝180ms，t_总＝500ms。HPLC-ECD分析后，经数据统计发现， 相对于野生型，新霉素高产工程菌株Sf/pKCZ03能够将新霉素总产量提高 35.78％，其中主要有效组分新霉素B组分产量提高22.60％；Sf/pKCZ02 和Sf/pKCZ01也分别能够将新霉素总产量提高28.63％和9.97％，如图6 所示。综上，通过倍增经过基因工程改造后的新霉素基因簇对于新霉素产 量提高而言是一种行之有效的实验策略。

在基因工程菌株中，通过倍增次级代谢产物生物合成基因簇以及经过 改造后的基因簇来实现基因表达量的上调对于抗生素产量的提高至关重 要，尤其是那些合成途径中限速步骤所涉及的关键结构基因或者是受调控 基因调控的关键结构基因及调控基因本身的上调更为重要。目前我们已获 得了多个重组菌株，那么这些菌株中所涉及的新霉素生物合成途径中关键 结构基因的表达与出发菌株相比是怎样的呢？这是我们想进一步探知的， 因此我们通过荧光定量PCR实验对新霉素生物合成基因簇中关键酶编码 基因neoE、neoR、aacC8、neoH、neoB和neoL进行转录水平分析。结果 显示，相对于野生型，高产工程菌株Sf/pKCZ03中相应基因的转录水平提 高最为显著，调控基因neoR和neoH的转录水平在24h时分别提高了约 37倍和11倍；而负责新霉素核心骨架2-脱氧链霉胺(2DOS)合成的脱氢酶编码基因neoE在48h转录水平提高了约3倍；负责氨基转移酶编码基 因neoB在24h转录水平也提高了约6倍。此外，抗性基因aacC8以及核 糖磷酸转移酶编码基因neoL的转录水平在相应时间段也具有一定程度的 提高。而在Sf/pKCZ01和Sf/pKCZ02中各基因的转录水平也有不同程度的 提高，如调控基因neoR的转录水平在24h分别提高了约10倍和16倍； neoH的转录水平在24h也相应的提高了约5倍和7倍，如图7所示。

Claims (11)

1.构建高产新霉素的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的方法，所述方法包括将弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇导入野生型弗氏链霉菌中。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括对要导入野生型弗氏链霉菌中的弗氏链霉菌的新霉素生物合成基因簇进行基因工程改造，所述基因工程改造包括对新霉素生物合成基因簇中的负调控基因neoI进行阻断。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程改造还包括在新霉素生物合成基因簇中利用强启动子驱动关键酶编码基因neoE-neoD共转录单元的转录。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述强启动子为P_kasO*启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述新霉素生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因工程改造的新霉素生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因工程改造的新霉素生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述野生型弗氏链霉菌为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏的、保藏号为：CGMCC 4.576的弗氏链霉菌。

9.通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法构建的高产新霉素的弗氏链霉菌。

10.根据权利要求9所述的高产新霉素的弗氏链霉菌，其被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)并且具有保藏号CGMCC NO.16511。

11.根据权利要求9或10所述的高产新霉素的弗氏链霉菌用于生产新霉素的用途。

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