CN107418925B - 多杀菌素高产基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

多杀菌素高产基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多杀菌素高产基因工程菌，该基因工程菌的保藏编号为CGMCC No.14193。本发明还公开了通过强化脂肪酸代谢路径构建多杀菌素高产基因工程菌的方法以及该工程菌在生产多杀菌素上的应用。本发明通过对刺糖多孢菌的脂肪酸Beta氧化路径进行表达增强，提高多杀菌素生物合成重要前体乙酰辅酶A的供给，与出发菌株相比，得到的基因工程菌株在多杀菌素的产量上显著提高。

Description

多杀菌素高产基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地，涉及一种多杀菌素高产基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
多杀菌素(spinosad)是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的大环内酯结构的杀虫剂，可有效防治多种鳞翅目害虫。对害虫的作用机理是刺激神经系统，导致非功能性肌肉收缩、衰竭，伴随颤抖和麻痹，从而引起昆虫死亡。多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性，并且低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快，且与其它杀虫剂无交互抗性，在农业和畜牧业生产上具有良好的应用价值和广阔的市场前景。
多杀菌素为浅灰白色的固体结晶,带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味。在水溶液中pH值为7.74,对金属和金属离子在28d内相对稳定。多杀菌素分子含有一个四核环，并连结着两个不同的六元糖，一个是福乐糖胺(forosamine),另一个是鼠李糖(rhamnose)，其结构式如式1。多杀菌素主要活性成份为A组分(C41H65NO10，分子量为731.98)和D组分(C42H67NO10，分子量为746)。另外，还有一些比例较小的组份，其结构列于表1。
Figure BDA0001320442450000011
表1多杀菌素各组份结构对照表
Figure BDA0001320442450000021
注：Me、Et分别为甲基、乙基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8，各基团位置见式(1)。
多杀菌素的生物合成较为复杂，其合成基因簇(spn基因簇)及合成途径目前已经被初步阐明，碳骨架合成属于聚酮合酶(PKS)I型。该基因簇包含23个基因，其中spnA、spnB、spnC、spnD和spnE编码聚酮合酶，分为1个起始装载模件和10个延伸模件，在这些模件中酶活的作用下，在丙酰基上按A-A-P-A-A-A-A-A-A-A(A：乙酰，P：丙酰)的顺序添加10个酰基，形成21碳的长碳链分子，最后在硫酯酶的作用下形成大环内酯结构。紧接着大环内酯分子在spnF、spnJ、spnL与spnM基因编码的酶活作用下在C3-C14、C4-C12及C7-C11间形成交联桥，此步骤完成了多杀菌素糖苷配基的合成，接下来是鼠李糖与福乐糖胺的连接与修饰。参与鼠李糖合成的四个基因位于染色体上3个不同位点，其中分别编码葡萄糖脱氢酶和4′酮还原酶的gdh和kre基因共同转录。葡萄糖经葡萄糖苷酶(Gtt)和葡萄糖脱氢酶(Gdh)的作用生成NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖，为鼠李糖和福乐糖胺合成的共同中间体，在3′5′差向异构酶(Epi)和4′酮还原酶(Kre)作用下合成鼠李糖。鼠李糖与糖苷配基的连接是糖苷配体转化为多杀菌素的第一步，然后是鼠李糖的甲基化修饰，甲基在鼠李糖上的连接顺序为2′-，3′-和4′-OH，这3个甲基都来自S-腺苷甲硫氨酸。而福乐糖胺则是由中间体NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖经一系列酶(由spnN、spnO、spnQ、spnR、spnS编码)的作用催化合成NDP-二甲基福乐糖胺，再由福乐糖胺转移酶(spnP编码)将NDP-二甲基福乐糖胺连接到拟糖苷配基上合成多杀菌素。
目前提高多杀菌素的发酵产量基本上都是采用传统理化诱变方法，这种随机突变存在一定的盲目性、而且筛选工作量大，周期长且多次诱变后产量浮动不大。为了克服上述问题，通过遗传改造定向突变的方法，可以更理性的对菌株进行改造，通过加强关键合成、代谢路径，增强与多杀菌素合成紧密相关的前提物质供给，是提高发酵单位的有效手段。
因此，提供一种利用对刺糖多孢菌的脂肪酸Beta氧化路径进行表达增强，构建多杀菌素发酵单位可显著提高的基因工程菌对于提高多杀菌素的产量具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种多杀菌素高产基因工程菌。
本发明的第二个目的在于提供通过强化脂肪酸代谢路径构建多杀菌素高产基因工程菌的方法。
本发明的第三个目的在于提供上述工程菌的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明一种多杀菌素高产基因工程菌ASAGFB-Fde，已于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.14193，分类命名为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。
本发明还提供通过强化脂肪酸代谢路径构建多杀菌素高产基因工程菌的方法，包括以下步骤：
(1)对野生型刺糖多孢菌菌株进行物理和化学诱变得到刺糖多孢菌突变菌株，即出发菌株；
(2)构建含有编码脂酰辅酶A合成酶及酰基辅酶A脱氢酶的基因fadD1及fadE片段的表达质粒；
(3)将表达质粒导入到刺糖多孢菌突变菌株，即得多杀菌素高产基因工程菌ASAGFB-Fde。
本发明所述编码脂酰辅酶A合成酶及酰基辅酶A脱氢酶的基因fadD1及fadE来自于细菌，且这两个基因广泛存在于生物体中(原核、真核生物)；优选的，来自于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
进一步，所述编码脂酰辅酶A合成酶及酰基辅酶A脱氢酶的基因fadD1及fadE片段是以天蓝色链霉菌基因组DNA为模板，分别利用核苷酸序列如序列表SED ID NO.1和SED IDNO.2所示的引物和核苷酸序列如序列表SED ID NO.3和SED ID NO.4所示的引物扩增获得的。通过以上方法在fadD1基因5’端引入人工合成KasO启动子及核糖体结合位点(RBS)序列，在fadE基因上游引入同样的RBS，并在其下游引入转录终止子。
本发明所述表达质粒导入到刺糖多孢菌突变菌株的方法可以为接合转移法、原生质体转化法、电转化法等。
其中，所述接合转移法的具体步骤为：是将表达质粒先转入到大肠杆菌ET12567，得到重组大肠杆菌；重组大肠杆菌再与刺糖多孢菌突变菌株进行接合转移。
本发明用于构建表达质粒的出发载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，包括但不限于载体pRM4、载体pSET152、载体pOJ260等自杀性载体，该载体具有编码DNA转移酶基因、
Figure BDA0001320442450000041
整合位点及抗生素抗性筛选标签。
在本发明优选的实施方式中，所述大肠杆菌-链霉菌穿梭载体为载体pRM4，以载体pRM4为出发载体构建的表达质粒为pRM4-fadD1-fadE。
进一步，本发明步骤(1)所述物理和化学诱变是亚硝基胍(NTG)及60Co交替诱变。
进一步，步骤(3)中将表达质粒转化刺糖多孢菌突变菌株后，得到转化子菌株，利用核苷酸序列如序列表SED ID NO.5和SED ID NO.6所示的引物和核苷酸序列如序列表SEDID NO.7和SED ID NO.8所示的引物分别对转化子的脂酰辅酶A合成酶及酰基辅酶A脱氢酶的基因fadD1及fadE进行验证，最终得到多杀菌素高产基因工程菌ASAGFB-Fde。
本发明进一步提供了上述多杀菌素高产基因工程菌在生产多杀菌素上的应用。
本发明将多杀菌素高产基因工程菌株传代于不含抗生素的MS平板上，通过5次传代培养，确证表达质粒在染色上的稳定性。对稳定传代的菌株进行发酵培养，并与刺糖多孢菌突变菌株(出发菌株)进行比对，验证其多杀菌素高产性能。
本发明的有益效果如下：
本发明通过对刺糖多孢菌的脂肪酸Beta氧化路径进行表达增强，提高多杀菌素生物合成重要前体乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A的供给，有效提高了其对油脂的利用，并在油脂存在的条件下，与出发菌株相比，得到的基因工程菌株在生产的多杀菌素产量上显著提高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出载体pRM4的构建图谱。
图2示出脂肪酸代谢路径表达增强载体构建示意图。
图3示出转化子fadD及fadE的PCR验证；M：DNA marker(Takara DL2000)，fadD为基因fadD，fadE为基因fadE。
图4示出出发菌株与工程菌株在不同油脂添加情况下内源H2O2浓度。
图5示出出发菌株在不同油脂添加情况下乙酰辅酶A含量变化。
图6示出不同浓度的硫脲对多杀菌素产量的影响。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1刺糖多孢菌脂肪酸代谢路径增强菌株的构建
1、出发菌株的获得
对野生型刺糖多孢菌菌株S.spinosa ATCC49460进行NTG及60Co交替诱变，诱变获得的刺糖多孢菌突变菌株，即出发菌株；
2、PCR扩增天蓝色链霉菌脂酰辅酶A合成酶及脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因fadD1及fadE片段
2.1引物设计
根据天蓝色链霉菌中参与脂肪酸代谢的脂酰辅酶A合成酶(fadD1，GeneID:1101636)和脂酰辅酶A脱氢酶(fadE，GeneID:1098484)编码区DNA序列，设计两对引物用于分别对其进行扩增。引物合成过程中在fadD1片段上游引物引入启动子kasOp*及RBS序列，同时，在fadE编码框片段上游引入相同RBS序列及在其下游引物转录终止子序列，这两个基因在同一启动子下表达。
引物序列如下：
用于扩增长度为1.73kb的fadD1和1.35kb的fadE DNA片段引物序列：
Primer 1(FadD-F-KasO*-RBS-BamHI，正向引物，如序列表SED ID NO.1所示)：
Figure BDA0001320442450000061
Figure BDA0001320442450000062
Figure BDA0001320442450000063
(其中，下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点；黑体部分碱基为kasOp*启动子序列；小写字体部分碱基为RBS区域序列)
Primer 2(FadD-R-EcoRI，反向引物，如序列表SED ID NO.2所示)：5’-GTCAGAATTCTCAGGGGCGCGCTCCGTACCG-3’(下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)
Primer 3(FadE-F-RBS-HindIII，正向引物，如序列表SED ID NO.3所示)：5’-GTCAAAGCTTaactacgaaggggagtcagtaTTGGCCGGATCGGCTGACTTCG-3’(下划线碱基：限制性内切酶HindIII识别位点；小写字体部分碱基：RBS区域序列)
Primer 4(FadE-R-Tfd-NdeI，反向引物，如序列表SED ID NO.4所示)：
Figure BDA0001320442450000064
Figure BDA0001320442450000065
(下划线碱基：限制性内切酶NdeI识别位点；黑体部分碱基：转录终止子Tfd序列)
Primer 5(fadD-F-verif，正向引物，如序列表SED ID NO.5所示)：5’-GTCCTCGTCCAGTACGCCAC-3’
Primer 6(fadD-R-verif，反向引物，如序列表SED ID NO.6所示)：5’-CGAAGTCCGGCAGGTTCAGC-3’
Primer 7(fadE-F-verif，正向引物，如序列表SED ID NO.7所示)：5’-GTTCCCGTACGAGATCGTCC-3’
Primer 8(fadE-R-verif，反向引物，如序列表SED ID NO.8所示)：5’-CGTCGACGAGTACAGCTTCG-3’
2.2对天蓝色链霉菌fadD1及fadE基因进行PCR扩增
fadD1的扩增：以天蓝色链霉菌基因组DNA为模板，使用引物Primer 1和Primer 2、用Herculase
Figure BDA0001320442450000071
Fusion DNA聚合酶(Agilent公司)进行PCR扩增。扩增条件为：先98℃3分钟；再98℃10秒，退火68℃20秒，72℃1分钟，共29个循环；最后72℃5分钟。
fadE的扩增：使用引物Primer 3和Primer 4，方法与扩增fadD1方法基本相同，唯一区别在于扩增引物退火温度为62℃。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，分别在1.73kb和1.35kb出现预期的特异性条带，将这两个目的条带分别进行胶切回收用于后续载体构建。
3、脂肪酸代谢路径增强表达质粒的构建
脂肪酸代谢路径增强表达载体如图2所示，具体方法为：用BamHI和EcoRI对fadD1的PCR产物进行双酶切，并对载体pRM4(在载体pSET152基础上改造后获得的载体pRM4，该质粒在多克隆位点上游整合了红霉素抗性基因启动子(ermE)，并优化了酶切位点，该载体的图谱如图1所示)进行同样酶切处理，将酶切产物进行胶回收，回收产物通过T4DNA连接酶(Promega公司)进行过夜连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有20mg/mLX-Gal、200mg/mL IPTG和100μg/mL安普霉素的LB(酵母膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，加水至1升，调节pH至7.2)平板上于37℃过夜培养，挑取白色单菌落，用上述引物Primer 1和Primer 2及扩增条件PCR验证质粒构建正确性，该质粒命名为pRM4-fadD1。
将质粒pRM4-fadD1与fadE的PCR产物分别进行HindIII与NdeI双酶切，将酶切产物进行胶回收，并进行连接。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子并提取质粒，用引物Primer 3和Primer 4验证该插入片段。同时，用限制性内切酶BamHI与NdeI对质粒进行酶切验证，可得到3.08kb(插入片段)和6.07kb(载体)的片段，进一步确定了质粒构建的正确性，该质粒命名为pRM4-fadD1-fadE，即表达质粒pRM4-fadD1-fadE。
4、刺糖多孢菌脂肪酸代谢路径增强菌株的获得
质粒pRM4-fadD1-fadE转化E.coli ET12567，涂布于并在含有100μg/mL安普霉素、50μg/mL卡纳霉素、25μg/mL氯霉素和12.5μg/mL四环素的LB平板培养基上，挑取转化子提取质粒，进行酶切验证，完成供体菌E.coli ET12567pRM4-fadD1-fadE的构建。
接合转移方法参照供体菌E.coli ET12567pRM4-fadD1-fadE在含有上述四种抗生素的LB液体培养基中培养至OD600＝0.4～0.6。同时，取受体菌即新鲜的刺糖多孢菌突变菌株的孢子于YEME(1％葡萄糖，34％蔗糖，0.3％酵母提取物，0.5％蛋白胨，0.3％麦芽提取物，灭菌后添加2mL/L 2.5M MgCl2·6H2O)培养基中，在50℃热激10分钟后冷却至室温。将供体菌与受体菌分别离心，弃上清，用预冷的新鲜LB液体培养基进行洗涤三次，最后用预冷LB培养基悬浮。通过不同体积比例(供体菌：受体菌的比例为1:2、1:3、1:5)将供体菌及受体菌进行混合，置于常温或冰上进行孵育10分钟。将混合液涂布于接合转移固体培养基(MS培养基：20g黄豆饼粉，5g甘露醇，琼脂20g，pH7.2±0.1)，在28℃培养16～20h后，将1mL含有1500μg安普霉素和750μg萘啶酮酸的无菌水均匀涂布在平板上，继续培养14天，长出的菌落即为含有pRM4-fadD1-fadE的转化子。
5、转化子菌株的PCR验证
选取产孢丰富的转化子传代于含有100μg/mL安普霉素的新鲜固体培养基中，培养7天左右即可获得孢子，将长好的孢子继续传代于不含抗生素的固体培养基中，连续传代五次。将获得的孢子进行全基因组DNA提取，并进行PCR验证，确定转化子在无抗传代过程中并没有丢失质粒。具体步骤如下：
以提取的转化子DNA为模板，并用质粒pRM4-fadD1-fadE作为阳性参照，对整合的两个基因fadD、fadE进行PCR扩增，验证菌株构建的正确性。Primer5和Primer 6用于基因fadD一段序列的扩增，Primer 7和Primer 8用于基因fadE中一段序列的扩增，大小分别为628bp和883bp(图3)。证明转化子传代后遗传上是稳定的，即得到多杀菌素高产基因工程菌ASAGFB-Fde，并已于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.14193，分类命名为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。
实施例2脂肪酸代谢路径加强菌株(工程菌株)与出发菌株的摇瓶发酵比对
1、出发菌株及工程菌株的摇瓶发酵
将刺糖多孢菌出发菌株及工程菌株孢子涂布于固体培养基上(葡萄糖4g，酵母提取物10g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂15g，去离子水补充到1升)。在28℃培养培养168h后，用30％的无菌甘油挂取孢子，制备孢子悬液，保藏于-80℃，用于后续实验。
刺糖多孢菌种子培养：将刺糖多孢菌孢子悬液按1％接种于装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，在28℃，240rpm条件下培养45-48h，得到刺糖多孢菌种子液。其中，种子培养基为：4g酵母提取物，4g蛋白胨，4g酪蛋白水解物，10g葡萄糖，1.36g K2HPO4，0.5gMgSO4，去离子水补充到1升，pH 7.2±0.1。
刺糖多孢菌发酵培养：种子液按1％接种量接种到装有40mL发酵培养基的300mL摇瓶中，于28℃，240rpm条件下培养45-48h培养168h。其中，发酵培养基为：10g胨化牛奶，20g棉籽蛋白，20g糊精，1g氯化钠，0.5g硫酸镁，0.5g磷酸二氢钾，3g碳酸钙，10g酵母提取物，60g葡萄糖,去离子水补充到1升，pH 7.2±0.1。由于工程菌中加强了脂肪酸的代谢，实验中在培养基中添加不同的油脂，旨在提高脂肪酸供给，本实验中油脂为豆油(Soybean oil)、山茶油(Camellia oil)和草莓籽油(Strawberry seed oil)，添加量为3％。
出发菌株和工程菌株发酵培养过程中不同时间点(0、24、48、72、96、120，144、166h)进行取样，每株菌在每个取样点设计三个摇瓶重复。发酵168h后对多杀菌素的HPLC、生物量和残油量等发酵参数进行检测，具体检测方法如下：
多杀菌素的HPLC检测：取2mL发酵液，加入4mL甲醇，剧烈震荡后年浸泡1h以上，4000rpm离心15分钟，收集上清液，并在14000rpm下离心10分钟，取上清液进样分析。使用安捷伦C18反相柱，柱长150mm，内径4.6mm，柱温25℃，流动相为甲醇-乙腈-水(45:45:10)，流动相中含有10％6mM醋酸铵，流速1.0mL/min，进样体积10μL，波长为244nm，仪器为Waterse2695高效液相色谱。
生物量检测：取10mL离心管，称空管重量，取8mL发酵液，在4000rpm下离心10分钟，去掉上清液，计算总湿重，同时取0h发酵液计算不溶物重量。总湿重减去不溶物重量得出菌体生物量，再除以总湿重得出相对生物量(％)。
残油量检测：将1mL发酵液4000rpm离心15min后，取400uL上清，加入800μL 0.5MKOH，在金属浴中80度12000rpm震荡水解50min。取600ul水解液，加入600μL 3M HCL和600ul异辛烷，震荡混匀，12000rpm离心1min。取上层清液400μL，加入400uL显色剂(称取5.00g硫酸铜，加入90mL蒸馏水，过滤，滤液用吡啶调节pH到6.10～6.15，定容到100ml，移入棕色试剂瓶备用)，震荡混匀，12000rpm离心1min。取250μL上层显绿色的清液，转入酶标板中，715nm比色。以异辛烷为溶剂将油酸稀释成10、7.5、5、2.5和1mg/mL的溶液，取400uL加入400uL显色剂,振荡后，715nm比色，作回归方程，得出标准曲线。横坐标为油酸的浓度(mg/mL)，纵坐标为吸光度。
检测结果如表1所示。出发菌株与工程菌株在不添加任何油脂的情况下多杀菌素产量与生物量接近，但在添加油脂的实验组，多杀菌素与生物量均有不同程度的提高。总体上，工程菌株发酵液中残油量明显少于出发菌株，推断脂肪酸代谢路径的增强，有效促进了菌株对油脂的利用。结果表明，与对照组相比油脂的添加有明显促进生物量和多杀菌素产量的效果。山茶油与草莓籽油实验组结果优于豆油实验组，不同油脂中脂肪酸组成存在差异，可能是刺糖多孢菌对某种脂肪酸具有“偏好性”，引起不同油脂间发酵结果有所差别。但无论何种情况下，工程菌株的生物量与多杀菌素产量都优于出发菌株，且有较大幅度的提高。表明脂肪酸代谢路径的增强对多杀菌素产量提高起到关键作用。
表1出发菌株与工程菌株在不同油脂添加下发酵参数
Figure BDA0001320442450000101
实施例3脂肪酸代谢路径的增强引起响氧胁迫条件变化进而影响多杀菌素产量
1、工程菌与出发菌发酵过程中H2O2的产量检测
由于饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸在β氧化过程中产生的还原型黄素二核苷酸(FADH2)的量不同，同时，脂酰辅酶脱氢酶(FadE)与氧传递黄素蛋白是生物体内形成内源双氧水(H2O2)的因素，而H2O2对放线菌次级代谢合成也起到刺激作用。因此，对刺糖多孢菌发酵过程的H2O2进行检测。
如图4所示，在不添加油脂情况下，出发菌株与工程菌株中所测得的H2O2没有区别，在添加油脂情况下，H2O2产量明显提高。添加豆油实验组的H2O2量明显高于其它油脂实验组，而出发菌株在山茶油和草莓籽油添加的情况下，产生H2O2的量没有明显差异，但在工程菌株中，山茶油实验组中的H2O2浓度略高于草莓籽油。在微生物代谢油脂过程中，脂肪酸饱和度越高，越易于H2O2的产生。而H2O2作为氧胁迫条件，一定浓度时有利于刺激次级代谢产物的合成，但过量可对微生物造成伤害，不利于发酵及产物合成。
2、工程菌中氧胁迫条件的抑制促进多杀菌素产量提高
在添加油脂的情况下，多杀菌素在出发菌株中的产量均有提高，通过分析，出发菌株对三种油脂利用过程中所产生的参与多杀菌素合成的前体乙酰辅酶A产量有所区别。其中，在含有山茶油与草莓籽油的条件下发酵的出发菌株菌丝体中乙酰辅酶A含量明显高于含有豆油的情况，而后者较对照组菌丝体中乙酰辅酶A含量也有大幅提高(图5)。这是菌株在不同油脂中多杀菌素产量不同的原因之一。
而油脂的添加产生的氧胁迫条件也会影响菌丝体生长及发酵产量。硫脲作为还原剂，可清除氧胁迫分子。在出发菌株摇瓶中加入不同浓度的硫脲比较对多杀菌素产量的影响(如图6所示)。从图6中可以看出：在豆油添加情况下0.05mM的硫脲最有助于多杀菌素合成，而在其它两种油添存在的情况下，硫脲的添加对多杀菌素的发酵有抑制作用(图6A)。而在工程菌株中，由于脂肪酸代谢路径的增强，H2O2浓度提高，所需要更多硫脲对抗氧胁迫条件。工程菌株在加豆油时，需要0.1mM的硫脲效果最为明显，而在山茶油与草莓籽油添加的情况下则需要0.01mM和0.001mM硫脲，此时最有利于多杀菌素的合成(图6B)。而添加过高浓度的硫脲反而不利于多杀菌素的合成，可能由于过量的还原剂减弱了适量氧胁迫条件对次级代谢的刺激作用。
综上所述，工程菌株中由于刺糖多孢菌脂肪酸代谢路径的增强，可有效提高其对油脂的利用，并在油脂存在的条件下可显著提高多杀菌素产量。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家粮食局科学研究院
<120> 多杀菌素高产基因工程菌及其构建方法和应用
<130> JLC17I0244E
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工合成Primer 1
<400> 1
gtcaggatcc tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt 60
aaagtcgtgg ccaaactacg aaggggagtc agtagtgacc gcacccgcgc cccag 115
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成Primer 2
<400> 2
gtcagaattc tcaggggcgc gctccgtacc g 31
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成Primer 3
<400> 3
gtcaaagctt aactacgaag gggagtcagt attggccgga tcggctgact tcg 53
<210> 4
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工合成Primer 4
<400> 4
gtcacatatg cgaaagcaag ctgataaacc gatacaatta aaggctcctt ttggagcctt 60
tttttttgga gattttcaac gtgaaaaaat cctaacctca gatcttgtcc ag 112
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成Primer 8
<400> 8
cgtcgacgag tacagcttcg 20

Claims (2)

1.一种多杀菌素高产基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ASAGFB-Fde，其保藏编号为CGMCC No.14193。
2.一种权利要求1所述多杀菌素高产基因工程菌在生产多杀菌素上的应用。
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