CN114703171B

CN114703171B - 酯酰辅酶a合成酶变体及其工程化微生物

Info

Publication number: CN114703171B
Application number: CN202210627151.4A
Authority: CN
Inventors: 王高艳; 李佳佳; 尹进
Original assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN114703171A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及酯酰辅酶A合成酶变体及其工程化微生物。本发明提供的酯酰辅酶A合成酶变体能够有效促进己酸生成己酰辅酶A，显著提高大肠杆菌中己酰辅酶A的合成，为橄榄醇和橄榄醇酸的合成提供更多的前体物质。本发明提供的工程化大肠杆菌具有更强的利用己酸合成己酰辅酶A的能力，其橄榄醇和橄榄醇酸的合成能力明显增强，产量明显提升，有利于微生物合成大麻素的工业化，同时为大麻素生物合成的改造提供了有效的方法。

Description

酯酰辅酶A合成酶变体及其工程化微生物

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及酯酰辅酶A合成酶变体及其工程化微生物。

背景技术

橄榄醇酸（olivetolic acid，缩写为OA）、橄榄醇（olivetol，缩写为OL）是来源于植物的一种III型聚酮类化合物，具有抗菌、抗肿瘤和抗紫外线等活性，同时也是生物合成大麻素（cannabinoids）的关键前体。

大麻素（cannabinoids），是来源于植物大麻（Cannabis sativa）的一大类化学分子，种类超过150种。目前国际上使用较多的大麻素有大麻二酚（cannabidiol，缩写为CBD）、四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol ，缩写为THC）和大麻萜酚（cannabigerol，缩写为CBG）。CBD是植物大麻中的主要化学成分之一，是大麻素中的非成瘾性成分。THC是大麻中的主要精神活性物质，可成瘾，是世界各国严格管制的物质。CBG因其在植物大麻中含量较低，通常被归类为微量大麻素或稀有大麻素，因其为其它大麻素的共同前体，被称为“大麻素之母”。随着大麻植株的生长，大部分CBG会转化为CBD和THC，只会残留微量的CBG在植株体内，因供应严重受限，使得CBG应用的发展受到了较大的限制。

大麻素可用于临床、食品和化妆品等产品中。其中CBD在部分国家已经用于临床，主要针对的适应症有：儿童癫痫、痉挛、焦虑、恐慌症（Panic Disorder）、广场恐惧症（Agoraphobia）等。THC主要针对的适应症有：过敏、发炎、抑郁、偏头痛、焦虑等临床症状。CBG药理作用包括：抗真菌、抗昆虫、抗炎镇痛、降眼压、神经保护、抗抑郁、刺激食欲、加强癌细胞凋亡等等。CBG可以阻断瞬时受体电位M8（TRPM8），激活TRPA1、TRPV1、TRPV2通道并抑制内源性大麻素的再摄取。因此，CBG会影响生理的诸多部分，具有多种多样的效果，这些影响与CBG和内源性大麻素系统的相互作用和充当温和的CB1受体拮抗剂有关，而且这些作用均没有THC的精神活性。

在大麻素的生物合成途径中有一个共同的前体: 大麻萜酚酸（cannabigerolicacid, 缩写为CBGA）。CBGA的合成来源于两个前体：牻牛儿基二磷酸盐（geranyldiphosphate，缩写为GPP）与橄榄醇酸（olivetolic acid，缩写为OA）。GPP来源于2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成途径（MEP途径）或者甲戊二羟酸生物合成途径（mevalonate pathway，MVA途径），OA的合成从己酰辅酶A（hexanoyl-CoA）开始经聚酮合酶（PKS）生物合成途径引入3分子丙二酰辅酶A （malonyl-CoA）得到；己酰辅酶A的来源是脂肪酸从头合成的己酸（hexanoic acid），也可以来源于脂肪酸代谢的中间产物。CBGA可以转化为CBDA、THCA、CBCA等大麻素；CBGA通过加热可以脱羧基转化为CBG。

目前，从植物中提取橄榄醇（酸）少有报道。从植物中提取制备橄榄醇（酸）受诸多因素限制，例如：相比于生物合成更难获得高纯度产品、种植管制严格、产能有限、需要高昂的植物种植和下游提取的投入，生产稳定性较低等。而采用化学合成法制备橄榄醇（酸）的成本高昂，并且存在环境污染和条件苛刻等问题。相比于上述两种方法，生物合成法具有更好的应用前景。

橄榄醇酸和橄榄醇的生物合成途径如下（Synthetic Pathway for theProduction of Olivetolic Acid in Escherichia coli. Zaigao Tan, James M.Clomburg, and Ramon Gonzalez ACS Synthetic Biology 2018 7 (8), 1886-1896DOI:10.1021/acssynbio.8b00075）：乙酰辅酶A（acetyl-CoA）通过羧化生成丙二酰辅酶A（malonyl-CoA），参与该反应的酶有乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase），或者一分子malonate（malonate）通过丙二酰辅酶A合成酶（malonyl-CoA synthetase）催化合成一分子丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）。己酸（Hexanoic acid）通过酰化生成己酰辅酶A（Hexanoyl-CoA），参与该反应的酶有fadD、fadK等。一分子丙二酰辅酶A和一分子己酰辅酶A缩合形成3-氧代辛酰-CoA （3-oxooctanoyl-CoA），一分子3-氧代辛酰-CoA与丙二酰辅酶A缩合生成3,5-二氧代辛酰-CoA （3, 5-dioxodocanoyl-CoA），一分子3,5-二氧代辛酰-CoA与一分子丙二酰辅酶A缩合生成3,5,7-三氧代辛酰-CoA（3, 5 ,7-trioxododecanoyl-CoA），参与以上三步反应的酶均为橄榄醇合成酶（olivetolic acid synthase，OLS）。3, 5,7-trioxododecanoyl-CoA可以环化生产橄榄醇或橄榄醇酸，参与该反应的酶为橄榄醇酸环化酶（olivetolic acid cyclase，OAC）。

长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）对外源脂肪酸的降解起关键作用，是β-氧化中的限速步骤。该酶催化脂肪酸酯化为伴随转运的代谢活性CoA硫酯，该反应通过两步机制进行。该酶具有广泛的链长特异性，对长度在 C-12 和 C-18 之间的脂肪酸活性较高。大肠杆菌还有第二种酰基辅酶A合成酶fadK，其对中链脂肪酸（C6-C12）的活性低于长链脂肪酸，但对中链脂肪酸的绝对活性低于fadD（Ford TJ, Way JC. Enhancement of E. coli acyl-CoAsynthetase FadD activity on medium chain fatty acids. PeerJ. 2015;3:e1040.Published 2015 Jun 30. doi:10.7717/peerj.1040）。

关于橄榄醇酸和橄榄醇的生物合成，有文献通过在经多步改造的底盘菌E. coliJST10 (DE3)的基础上，过表达乙酰辅酶A羧化酶（Acc）以增加前体丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)的供应、过表达长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）以增加前体己酰辅酶A（Hexanoyl-CoA)的供应、导入橄榄醇合成酶（OLS）和橄榄醇酸环化酶（OAC）以丙二酰辅酶A和己酰辅酶A为底物合成橄榄醇酸，在500mL生物反应器中橄榄醇酸的产量为80mg/L（Tan, Z., Clomburg, J.M., and Gonzalez, R. (2018) Synthetic pathway for the production ofolivetolic acid in Escherichia coli. ACS Synth. Biol. 7, 1886−1896.）。

专利CN113502254B公开了在底盘菌BW25113基础上，通过增加酯酰辅酶A合成酶（fadD）的表达使其合成更多的己酰辅酶A、导入橄榄醇合成酶（OLS）和橄榄醇酸环化酶（OAC）合成OA、删除fabH使丙二酰辅酶A更多地流向OA途经，删除fadE使己酰辅酶A更多地流向OA途径，以24深孔板测试橄榄醇酸的产量为224.64mg/L。

目前，现有菌株改造对橄榄醇（酸）的产量提升仍十分有限，较难实现更高的水平的提升以推进橄榄醇（酸）的工业化生产，因此，仍需要开发新的基因、酶和菌株资源以促进橄榄醇（酸）的产量提升。

发明内容

本发明的目的是提供酯酰辅酶A合成酶变体、表达所述酯酰辅酶A合成酶变体的工程化微生物以及酯酰辅酶A合成酶变体和工程化微生物的应用。

为实现上述目的，本发明通过对酯酰辅酶A合成酶进行理性设计和改造，改变酯酰辅酶A合成酶的催化活性和底物选择性，显著提高了酯酰辅酶A对己酸（6碳的脂肪酸）的降解活性，由此得到的酯酰辅酶A合成酶变体具有明显增强的催化己酸生成己酰辅酶A的活性，能够显著促进OL或OA合成前体己酰辅酶A的合成，进而提升目标产物OL或OA的产量。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供酯酰辅酶A合成酶变体，所述酯酰辅酶A合成酶变体与大肠杆菌野生型酯酰辅酶A合成酶相比，含有选自以下突变中的一种：I380C、Q338P、R449Y、K454T、D456E、D456C、F463K；或者含有选自I380C、Q338P、R449Y、K454T、D456E、F463K突变中的至少两种；或者含有选自I380C、Q338P、R449Y、K454T、D456C、F463K突变中的至少两种。

在本发明的一些实施方式中，所述酯酰辅酶A合成酶变体与大肠杆菌野生型酯酰辅酶A合成酶相比的突变为选自I380C、Q338P、R449Y、K454T、D456E、D456C、F463K中的一种。

在本发明的一些实施方式中，所述酯酰辅酶A合成酶变体与大肠杆菌野生型酯酰辅酶A合成酶相比的突变为Q338P和D456E。

以上所述的野生型酯酰辅酶A合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

上述酯酰辅酶A合成酶变体具有明显增强的催化己酸生成己酰辅酶A的活性，能够显著促进OL或OA合成前体己酰辅酶A的合成，进而提升目标产物OL或OA的产量。

第二方面，本发明提供编码以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体的核酸分子。

上述核酸分子包括DNA或RNA。

基于上述提供的酯酰辅酶A合成酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码酯酰辅酶A合成酶变体的核酸分子的核苷酸序列，基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码产生酯酰辅酶A合成酶变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。

在本发明的一些实施方式中，野生型酯酰辅酶A合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。编码以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体的DNA可由野生型酯酰辅酶A合成酶的编码基因经突变得到。

第三方面，本发明提供包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

在本发明的一些实施方式中，含有所述核酸分子的表达盒由启动子和所述核酸分子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中还可包含终止子、增强子等其他转录、翻译调控元件。

在本发明的一些实施方式中，含有所述核酸分子的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制型载体和非复制型载体。含有所述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。

第四方面，本发明提供以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体或所述核酸分子或所述生物材料在提高微生物生产橄榄醇酸和/或橄榄醇的产量中的应用。

上述微生物包括但不限于埃希氏菌属细菌。

在本发明的一些实施方式中，所述微生物为大肠杆菌。

第五方面，本发明提供一种工程化大肠杆菌，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体。

表达以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体能够显著促进大肠杆菌中己酰辅酶A的合成，为OL或OA的合成提供更多的前体物质。

上述表达酯酰辅酶A合成酶变体可通过以下（1）和（2）中的任一种或多种方法实现：

（1）向大肠杆菌中导入包含酯酰辅酶A合成酶变体的编码基因的表达质粒；

（2）在大肠杆菌基因组中整合一个或多个拷贝的酯酰辅酶A合成酶变体的编码基因。

在本发明的一些实施方式中，表达酯酰辅酶A合成酶变体通过向大肠杆菌中导入包含酯酰辅酶A合成酶变体的编码基因的表达质粒实现。

对于表达质粒，本发明没有特殊限制，只需满足能够在大肠杆菌中复制并表达酯酰辅酶A合成酶变体即可。

在本发明的一些实施方式中，表达酯酰辅酶A合成酶变体通过将酯酰辅酶A合成酶变体的编码基因整合至大肠杆菌基因组中实现。

在本发明的一些实施方式中，在表达质粒中以Prha启动子启动酯酰辅酶A合成酶变体的编码基因的转录。Prha启动子为鼠李糖诱导启动子，优选的Prha启动子序列如SEQID NO.7所示。

若利用以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体促进橄榄醇或橄榄醇酸的合成，以上所述的工程化大肠杆菌需要具有能够合成橄榄醇或橄榄醇酸的橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶。

优选地，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶，或者，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶。

上述表达橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶可通过以下（1）和（2）中的任一种或多种方法实现：

（1）向大肠杆菌中导入包含橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶的编码基因的表达质粒；

（2）在大肠杆菌基因组中插入一个或多个拷贝的橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶的编码基因。

在本发明的一些实施方式中，表达橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶通过向大肠杆菌中导入包含橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶的编码基因的表达质粒实现。

在同时表达橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶时，橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶可通过同一个表达质粒进行表达，也可通过不同的表达质粒进行表达。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶通过同一个表达质粒进行表达。

上述酯酰辅酶A合成酶变体、橄榄醇合成酶、橄榄醇酸环化酶的表达可通过同一个表达质粒进行表达，也可通过不同的表达质粒进行表达。

在本发明的一些实施方式中，酯酰辅酶A合成酶变体与橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶通过不同的表达质粒进行表达。

本发明所述的橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶为来源于除大肠杆菌以外的其他生物的异源酶。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶来源于植物大麻（Cannabis sativa）。橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶的来源不局限于此，所有具有橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶活性的蛋白均可使用。也可通过对来源于植物大麻（Cannabissativa）的橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶进行突变获得橄榄醇合成酶变体和橄榄醇酸环化酶变体，以增强橄榄醇或橄榄醇酸的合成。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的一些实施方式中，橄榄醇酸环化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。

为进一步增强OL或OA的合成，所述工程化大肠杆菌的脂酰辅酶A脱氢酶和/或β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶失活。

通过失活β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶能够使丙二酰辅酶A更多地流向OA合成途经，通过失活脂酰辅酶A脱氢酶能够使己酰辅酶A更多地流向OA合成途经。

在本发明的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的脂酰辅酶A脱氢酶失活。

在本发明的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶失活。

在本发明的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的脂酰辅酶A脱氢酶和β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶同时失活。

以上所述的酶的失活是指工程化大肠杆菌无法表达有活性的脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶，可通过在该酶的编码基因中缺失、插入或替换一个或多个碱基使得该编码基因无法表达有活性脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶实现。

在本发明的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌中脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶的编码基因完全缺失，或被其他序列完全取代。

以上所述的脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶是大肠杆菌内源的脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶，优选为大肠杆菌基因组上的脂酰辅酶A脱氢酶、β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶的编码基因编码得到的。

在本发明的一些实施方式中，β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

在本发明的一些实施方式中，以上所述的工程化大肠杆菌以大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BL21为出发菌经上述修饰得到。

大肠杆菌BW25113（ATCC 编号: 购自美国菌种保藏中心American Type CultureCollection）来源于E. coli K-12 W1485，是K12的衍生菌株，与MG1655类似，是一种经过较少改造，比较接近于野生型的大肠杆菌工程菌株。本发明发现，以大肠杆菌BW25113为出发菌进行上述修饰，其OL或OA的产量提升效果更优。

第六方面，本发明提供所述工程化大肠杆菌的制备方法，所述方法包括：对大肠杆菌进行修饰以使其表达以上所述的酯酰辅酶A合成酶变体。

优选地，所述方法还包括对大肠杆菌进行修饰以使其表达橄榄醇合成酶，或者表达橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶的步骤。

优选地，所述方法还包括对大肠杆菌进行修饰以使其中的β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶（fabH）和/或脂酰辅酶A脱氢酶（fadE）失活的步骤。

第七方面，本发明提供以上所述的工程化大肠杆菌的以下任一种应用：

（1）在发酵生产橄榄醇酸或其衍生物、橄榄醇或其衍生物中的应用；

（2）在选育用于发酵生产橄榄醇酸或其衍生物、橄榄醇或其衍生物的菌株中的应用。

上述应用中，选育用于发酵生产橄榄醇酸或其衍生物、橄榄醇或其衍生物的菌株具体可为：以本发明提供的工程化大肠杆菌为出发菌株，采用基因工程改造、诱变或驯化方法选育用于发酵生产橄榄醇酸或其衍生物、橄榄醇或其衍生物的菌株。

第八方面，本发明提供一种发酵生产橄榄醇酸和/或橄榄醇的方法，所述方法包括：培养以上所述的工程化大肠杆菌，得到培养物，回收所述培养物中的橄榄醇酸和/或橄榄醇。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括对所述工程化大肠杆菌进行活化培养，将活化菌体接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到所述培养物。

上述培养可以选择大肠杆菌培养常用的培养基。培养基中可含有碳源、氮源及无机盐。其中，碳源包括但不限于甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、有机酸中的一种或多种的组合；氮源包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种的组合；无机盐包括但不限于磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、钙盐、硼酸盐、钴盐、铜盐、镍盐、钼酸盐、硒酸盐中的一种或多种的组合。

优选地，所述发酵培养基的碳源包括甘油和葡萄糖。发酵培养基中还添加己酸作为前体物质供体。

本发明的有益效果在于：本发明提供的酯酰辅酶A合成酶变体能够有效促进己酸生成己酰辅酶A，显著提高大肠杆菌中己酰辅酶A的合成，为OL或OA的合成提供更多的前体物质。

本发明提供的工程化大肠杆菌具有更强的利用己酸合成己酰辅酶A的能力，能够为OL或OA的合成提供更多的前体物质，其OL或OA的合成能力明显增强，OA产量明显提升。经实验验证，本发明提供的工程化大肠杆菌经深孔板培养后，OA平均浓度可达349.87 mg/L，由于深孔板培养时发酵液的细胞浓度（OD₆₀₀）仅在4-5之间，而工业化培养中细胞浓度能达到100以上，因此该工程化大肠杆菌具有强大的OL或OA工业化生产潜力，有利于微生物合成大麻素的工业化，同时为大麻素生物合成的改造提供了有效的方法。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，所用酶试剂购自Thermo Fisher公司和New England Biolabs（NEB）公司，所用的小分子标准品购自Sigma公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行。所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制，培养基中酵母提取物和蛋白胨购自英国OXID公司，其它试剂购自国药集团化学试剂公司。基因合成服务由华大基因研究院提供。

以下实施例中使用的用于培养大肠杆菌的培养基配方如下：

LB培养基：5 g/L酵母提取物，10 g/L 蛋白胨, 10 g/L NaCl。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌30分钟。

SOB培养基：5 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨, 0.5 g/L NaCl，浓度为1M的KCl2.5 mL。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

ZY培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5g/L，蒸馏水溶解后，调pH至7.0。高压蒸汽灭菌30分钟。

其中，工程化大肠杆菌的发酵培养过程中通过鼠李糖诱导。

其他部分试剂配方如下：

50×M：1.25 mol/L Na₂HPO₄，1.25 mol/L KH₂PO₄，2.5 mol/L NH₄Cl，0.25 mol/LNa₂SO₄，高压蒸汽灭菌30分钟。

50×5052：25%甘油，2.5%葡萄糖，高压蒸汽灭菌30分钟。

1 M MgSO₄：称取24.6 g MgSO₄·7H₂O加H₂O溶解，定容至100 mL，然后高压蒸汽灭菌30分钟。

1000×微量元素：50 mmol/L FeCl₃，20 mmol/L CaCl₂，10 mmol/L MnCl₂，10mmol/L ZnSO₄，CoCl₂，NiCl₂，Na₂MO₄，Na₂SeO₃，H₃BO₃各2 mmol/L。

ZYM培养基：在ZY培养基中加入2 mL 50×5052，2 mL 50×M，200 μL 1M的MgSO₄，100 μL 1000×微量元素。

实施例1 产橄榄醇/酸底盘微生物的构建

为构建高效合成橄榄醇/酸等大麻素前体的底盘微生物，首先通过在大肠杆菌BW25113中删除β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶（fabH，SEQ ID NO.2）基因和脂酰辅酶A脱氢酶（fadE，SEQ ID NO.5）基因，一定程度地限制胞内己酰辅酶A和丙二酰辅酶A流向支路代谢，为橄榄醇/酸的合成提供更多的前体物质。

（一）fabH基因的敲除

首先合成序列H1-kana-H2（SEQ ID NO.1，包含元件：kanR，FRT，H1和H2，其中，kanR为筛选标记，FRT为酶识别位点，H1和H2分别为fabH基因上游和下游DNA序列），通过λ-RED同源重组的方法将SEQ ID NO.1整合至大肠杆菌BW25113的基因组的fabH基因位置处，以删除fabH基因。

λ-RED同源双交换为线环同源重组(linear-plus-circular homologousrecombination)，即线性片段两端各有一个同源臂与基因组目标序列两端同源。

根据文献（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., 2000. One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 97, 6640–6645）提供的方法将SEQ ID NO.1整合到BW25113基因组fabH基因位置处，步骤如下：

1、制备BW25113的感受态；

2、导入质粒pKD46；

3、将BW25113（pKD46）接种到3 mL含有氨苄青霉素的LB，氨苄青霉素的浓度为100μg/L，30 ℃摇床过夜培养；

4、取过夜培养的BW25113（pKD46）细胞悬液100 μL，加入到10 mL SOB培养基中，再加入浓度为1 M的阿拉伯糖100 μL和10 μL浓度为100 mg/L的氨苄青霉素；30 ℃摇床培养至OD₆₀₀=0.4-0.6；

5、4 ℃条件下，离心收集菌体，并用10 mL预冷的超纯水重悬菌体，同样的方法再洗两次菌体，最后用50 μL浓度为10%的甘油溶液重悬菌体；

6、加入50 ng的序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段，混匀后将混合液加入电击杯；

7、将电击杯放进电击仪，进行一次电击，电击条件为200 Ω、25 μF、2.5 KV；

8、加入1 mL预冷的SOB培养基，混合液转入无菌的EP管中，30 ℃摇床培养1小时；

9、将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板培养基上，30 ℃静置培养16-20 小时；

10、验证平板上长出的转化子。

将SEQ ID NO.1整合至基因组后，需要将KanR抗性基因删除，根据文献（Datsenko,K.A., Wanner, B.L., 2000, One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:6640–6645）提供的方法，具体步骤如下：

1、制备SEQ ID NO.1整合至基因组的菌株的感受态；

2、转化pCP20进入感受态，培养温度为30℃；

3、挑取单克隆至3 mL SOB培养基，30℃过夜培养；

4、取100 μL转接至10 mL SOB，30℃摇床培养 3-4 小时，OD₆₀₀= 0.4；

5、4℃条件下离心收集菌体，用冰浴的无菌水洗菌体两次；

6、重悬于50 μL-100 μL无菌水中，用于电击转化；

7、加入100 ng的pCP20，电击转化（电击仪设置：1.8 KV，5.5 ms），30℃复苏1小时；

8、均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养2-3天；

9、挑取单克隆在无抗生素的LB平板上划线，42℃培养过夜；

10、挑20-30个克隆分别至卡那霉素抗性平板和无抗平板，卡那霉素平板上不能生长，同时无抗平板上长起的克隆为目标克隆，进行PCR验证。

通过上述方法将筛选标记KanR删除，BW25113基因组删除fabH基因后在fabH位置的序列包含FRT，H1和H2，其中，FRT为酶识别位点，H1和H2为BW25113基因组序列。

（二）fadE基因的敲除

在上述删除fabH基因的菌株的基础上继续删除基因组上的fadE基因。首先合成H3-kana-H4（SEQ ID NO.3，包含的基因元件：kanR，FRT，H3和H4，其中kanR为筛选标记，FRT为酶识别位点，H3和H4分别为fadE基因上游和下游DNA序列）。将SEQ ID NO.3整合至fadE基因位置处，以删除fadE基因，在SEQ ID NO.3整合至fadE基因位置处后，将KanR抗性基因删除，具体方法参考fabH基因删除，BW25113基因组删除fadE基因后原始fadE基因处的序列如SEQ ID NO.4所示，包含FRT，H3和H4，其中，FRT为酶识别位点，H3和H4为BW25113基因组序列。由此构建得到同时删除基因组fabH和fadE基因的大肠杆菌BW25113。

（三）为了进一步增加前体己酰辅酶A，在底盘菌中导入长链酯酰辅酶A合成酶基因（fadD，SEQ ID NO.8，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示），促进转化己酸合成己酰辅酶A，增加胞内己酰辅酶A的含量，使得底盘菌积累更多的合成前体。

设计并基因合成fadD的表达质粒pL-Prha-fadD（SEQ ID NO.6），SEQ ID NO.6包含的基因元件主要如下：oriR6k-pir、addA、rhaR-rhaS、fadD，其中oriR6K-pir为复制子元件，addA为筛选标记，rhaS-rhaR为鼠李糖启动子元件（SEQ ID NO.7），fadD为长链酯酰辅酶A合成酶基因。

将pL-Prha-fadD质粒通过大肠杆菌化学转化的方式转到上述底盘菌中（大肠杆菌BW25113基因组上敲除fabH和fadE两个基因），获得积累己酰辅酶A和丙二酰辅酶A的重组菌。

（四）根据橄榄醇/酸的合成途径，还需要导入橄榄醇合成酶（OLS）以合成橄榄醇，再进一步导入橄榄醇酸环化酶（OAC）以合成橄榄醇酸。

设计并基因合成来源于植物大麻（Cannabis sativa）的OLS（编码基因序列如SEQID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示）的表达质粒p15A-Prha-OLS（SEQ IDNO.10，主要包含以下元件：p15A ori、acc(3)IV、rhaS-rhaR、OLS，其中p15A ori为复制子元件，acc(3)IV为筛选标记，rhaS-rhaR为鼠李糖启动子元件，OLS为橄榄醇合成酶）以及来源于植物大麻的OLS和OAC（编码基因序列如SEQ ID NO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示）的表达质粒p15A-Prha-OLS-OAC（SEQ ID NO.11，主要包含以下元件：p15A ori、acc(3)IV、rhaS-rhaR、OLS、OAC，其中p15A ori为复制子元件，acc(3)IV为筛选标记，rhaS-rhaR为鼠李糖启动子元件，OLS为橄榄醇合成酶，OAC为橄榄醇酸环化酶）。

利用大肠杆菌化学转化方式，将质粒p15A-Prha-OLS和p15A-Prha-OLS-OAC分别导入到底盘菌（大肠杆菌BW25113基因组删除fabH和fadE，并导入pL-Prha-fadD质粒）以及底盘菌（大肠杆菌BW25113基因组删除fabH和fadE）中，获得橄榄醇/酸合成的重组菌。

实施例2 酯酰辅酶A合成酶变体的开发和验证

（一）酯酰辅酶A合成酶变体的开发

本发明在大肠杆菌野生型酯酰辅酶A合成酶（编码基因为fadD）的基础上，结合建模和分子对接结果，人工设计了大量的突变位点以及各突变位点的不同氨基酸突变类型、不同突变位点的组合，并对得到的酯酰辅酶A合成酶变体进行性能验证和筛选，以获得底物选择性和催化活性增强的酯酰辅酶A合成酶变体。

酯酰辅酶A合成酶的各轮改造涉及的部分突变位点列举如下：

第一轮改造和筛选包括将以下氨基酸位点的氨基酸突变为括号内所示的氨基酸：M335（A、E、S、T），P336（A），V337（L、I、P），Q338（G、P、R、S、N），Q339（R、A、P、G、V、W、E、K、L），N369（F、T、C、S、G），P370（D、R、F、S），Y371（D、L、N、E、G、M、P），D372（G、E、R、W、K），I373（E、P、G、K、L），D374（A、Q、V、W、E），Y375（D、E、I、P、A、N），H376（R、K、N、T、Q），S377（V、I、T、P、Q），G378（R、N、P），S379（T、A、V），I380（V、C、A、L），L448（I、V、Y、F），R449（Y、F、M、E），I450（L、V、F），V451（T、A），D452（G），K454（T、I、L、S），D456（E），M457（L、I、V），L459（K、I、V），V460（S、Y、T、R），S461（G、K、M、Q），F463（K、E、R）。在第二轮改造中，依据第一轮改造的实验结果选择以下6个氨基酸位点进行饱和突变：Q338，I380，R449，K454，D456，F463。在第三轮改造中，依据第二轮改造获得的正向突变体，通过理性设计对氨基酸突变位点进行组合，组合突变包括：Q338P-D456E、Q338P-D456C、Q338P-I380C-F463K、Q338P-I380C-D456E、Q338P-I380C-D456C、I380C-K454T、I380C-F463K、I380C-K454T-D456C、K454T-D456C、K454T-D456E等。

（二）酯酰辅酶A合成酶变体的筛选和验证

将上述构建的fadD突变库，以pL-Prha-fadD（突变）的形式分别转化到底盘菌（大肠杆菌BW25113基因组删除fabH和fadE基因，并导入p15A-rha-OLS-OAC）获得可用于合成橄榄醇酸的重组菌，重组菌分别以B（fadD的氨基酸突变位点）的形式命名，如：B（Q338P）。

同时为了验证fadD点突变是否也对OL的产量提升有同样的效果，将有效点突变表达质粒pL-Prha-fadD（突变）转化至底盘菌（BW25113基因组删除fabH和fadE基因，导入p15A-rha-OLS）获得可用于合成橄榄醇的重组菌，重组菌以A（fadD的氨基酸突变位点）的形式命名，如：A（Q338P）。

对上述构建的重组菌进行发酵实验，每个重组菌设置三个平行。

1、发酵和制样：

（1）将重组菌接种至3 mL LB液体培养基中，37℃，220 转/分钟，过夜培养，约14小时，终OD₆₀₀值达到2-3；

（2）在24深孔板中加入ZYM培养基，每个孔加入2 mL；

（3）将步骤（1）中的菌液转接至步骤（2）中的ZYM培养基，转接后OD₆₀₀为0.01；

（4）待菌液OD₆₀₀生长至0.2，加入诱导剂（添加量:鼠李糖0.2%）和前体己酸（1mM），从接种至发酵结束总共24小时；

（5）取1 mL发酵液，加入3 mL乙酸乙酯，震荡混匀10min，后离心收集上层有机相；

（6）重复步骤（5），将两次离心获得的有机相合并后约6mL转移至10mL试管中。

（7）利用真空浓缩仪将试管中的有机相全部蒸干，加入1mL甲醇重悬试管中所有样品。

（8）用0.22 μM滤器过滤步骤（7）的样品，然后转移至HPLC样品瓶中。

2、HPLC检测

利用表1所示的HPLC检测方法分析发酵液萃取物中的OL含量。

表1 OL的HPLC检测方法

利用表2所示的HPLC检测方法分析发酵液萃取物中的OA含量。

表2 OA的HPLC检测方法

第一轮fadD突变体库的部分重组菌的生长和OA产量检测结果如表3和表4所示（表3和表4中仅列举了每个突变位点经理性设计后突变为4-5个不同氨基酸类型中产量提升效果最优的一种氨基酸突变类型的发酵结果），此轮筛选到Q338，I380，R449，K454，D456，F463共计6个氨基酸位点的突变对应的重组菌的OA产量有明显提升。

表3 第一轮筛选重组菌的OD₆₀₀检测结果

注：B-OA菌株为大肠杆菌BW25113基因组删除fabH和fadE，导入p15A-Prha-OLS-OAC质粒得到的菌株（构建方法见实施例1）。

表4 第一轮筛选重组菌的OA产量检测结果

选择第一轮筛选得到的Q338，I380，R449，K454，D456，F463共计6个氨基酸位点进行饱和突变并测试，最终筛选结果仅D456位点筛选到D456C的产量高于D456E（表5，表6），其他氨基酸位点均没有筛选到较对照位点的重组菌的OA产量更高的氨基酸突变类型。

表5 第二轮筛选D456位点对应重组菌的OD₆₀₀检测结果

表6 第二轮筛选D456位点对应重组菌的OA产量检测结果

第三轮的组合突变仅筛选到Q338P-D456E变体对应重组菌的产量（349.87mg/L）相对于单点Q338P（317.32mg/L）和D456E（305.84mg/L）有明显提升（表7、表8），其他位点组合没有筛到较单点突变具有明显的产量提升。

表7 第三轮筛选各单点突变及其组合突变对应重组菌的OD₆₀₀检测结果

表8 第三轮筛选各单点突变及其组合突变对应重组菌的OA产量检测结果

此外，为测试fadD对应的突变位点对OL产量的提升效果，进一步对上述筛选得到的有效的7个单点突变和1个组合突变对OL的产量提升效果，结果如表9和表10所示。

表9 FadD有效突变体对应产OL重组菌的OD₆₀₀

注：A-(OL)菌株为大肠杆菌BW25113基因组删除fabH和fadE，导入p15A-Prha-OLS质粒得到的菌株（构建方法见实施例1）。

表10 FadD有效突变体对应产OL重组菌的OL产量

实施例3 酯酰辅酶A合成酶变体在其他出发菌株中的效果验证

为进一步验证fadD突变体的效果，将含有野生型fadD 的表达质粒pL-Prha-fadD（WT）和含有fadD突变体的表达质粒pL-Prha-fadD（突变）分别转入大肠杆菌BW25113和BL21中，同时转入p15A-Prha-OLS-OAC质粒，获得重组菌BW （WT）和BW（突变点）以及BL21（WT）和BL21（突变点），测试fadD突变体在不同出发菌株中对OA产量的提升效果。

结果如表11和表12所示，结果显示，不同突变体在两种大肠杆菌出发菌株中皆有提升OA产量的效果，且对于大肠杆菌BW25113的产量提升效果优于BL21。

表11 fadD有效突变体导入不同出发菌株的重组菌的OD₆₀₀

表12 fadD有效突变体导入不同出发菌株的重组菌的OA的产量

综上所述，本发明获得了生产OA/OL的重组菌，在此基础上，通过对fadD进行点突变，获得了在深孔板中发酵产OA的最高浓度即可达到349.87mg/L的OA合成菌，具有强大的OA/OL工业化生产潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司

<120> 酯酰辅酶A合成酶变体及其工程化微生物

<130> KHP221114786.2YS

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttctatca attatatcgg ctatcttgaa gccaatgagt tgttaactgg caagacagat 60

gtgctggttt gtgacggctt tacaggaaat gtcacattaa agacgatgga aggtgttgtc 120

aggatgttcc tttctctgct gaaatctcag ggtgaaggga aaaaacggtc gtggtggcta 180

ctgttattaa agcgttggct acaaaagagc ctgacgaggc gattcagtca cctcaacccc 240

gaccagtata acggcgcctg tctgttagga ttgcgcggca cggtgataaa aagtcatggt 300

gcagccaatc agcgagcttt tgcggtcgcg attgaacagg cagtgcaggc ggtgcagcga 360

caagttcctc agcgaattgc cgctcgcctg gaatctgtat acccagctgg ttttgagctg 420

ctggacggtg gcaaaagcgg aactctgcgg tagcaggacg ctgccagcga actcgcagtt 480

tgcaagtgac ggtatataac cgaaaagtga ctgagcgtca tgattccggg gatccgtcga 540

cctgcagttc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcggatga atgtcagcta 600

ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg 660

gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc 720

agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt 780

gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc 840

gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 900

gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 960

gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 1020

tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 1080

agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 1140

ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 1200

tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 1260

acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 1320

ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat 1380

gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 1440

ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 1500

tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 1560

ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 1620

ccttcttgac gagttcttct gagaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcgaag 1680

cagctccagc ctacatccgc gctggttcgt ttctaggata aggattaaaa catgacgcaa 1740

tttgcatttg tgttccctgg acagggttct caaaccgttg gaatgctggc tgatatggcg 1800

gcgagctatc caattgtcga agaaacgttt gctgaagctt ctgcggcgct gggctacgac 1860

ctgtgggcgc tgacccagca ggggccagct gaagaactga ataaaacctg gcaaactcag 1920

cctgcgctgt tgactgcatc tgttgcgctg tatcgcgtat ggcagcagca gggcggtaaa 1980

gcaccggcaa tgatggccgg tcacagcctg ggggaatact ccgcgctggt ttgcgctggt 2040

gtgattgatt tcgctgatgc ggtgcgtctg gttgagatgc gcggcaagtt catgcaagaa 2100

gccgtaccgg aaggcacggg cgctatggcg gcaatcatcg gtctggatga tgcgtctatt 2160

gcgaaagcgt gtgaagaagc tgcagaaggt caggtcgttt ctccggtaaa ctttaactct 2220

ccgggacagg tggttattgc cggtcataaa gaagcggttg agcgtgctgg cgctgcctgt 2280

aaagcggcgg gcgcaaaacg cgcgctgccg ttaccagtga gcgtaccgtc tcactgtgcg 2340

ctgatgaaac cagccttcta tcaattatat cggctatctt gaagccaatg agttgttaac 2400

tggcaagaca gatgtgctgg tttgtgacgg ctttacagga aatgtcacat taaagacgat 2460

ggaaggtgtt gtcaggatgt tcctttctct gctgaaatct cagggtgaag ggaaaaaacg 2520

gtcgtggtgg ctactgttat taaagcgttg gctacaaaag agcctgacga ggcgattcag 2580

tcacctcaac cccgaccagt ataacggcgc ctgtctgtta ggattgcgcg gcacggtgat 2640

aaaaagtcat ggtgcagcca atcagcgagc ttttgcggtc gcgattgaac aggcagtgca 2700

ggcggtgcag cgacaagttc ctcagcgaat tgccgctcgc ctggaatctg tatacccagc 2760

tggttttgag ctgctggacg gtggcaaaag cggaactctg cggtagcagg acgctgccag 2820

cgaactcgca gtttgcaagt gacggtatat aaccgaaaag tgactgagcg tcatgattcc 2880

ggggatccgt cgacctgcag ttcgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcgaa 2940

gcagctccag cctacatccg cgctggttcg tttctaggat aaggattaaa acatgacgca 3000

atttgcattt gtgttccctg gacagggttc tcaaaccgtt ggaatgctgg ctgatatggc 3060

ggcgagctat ccaattgtcg aagaaacgtt tgctgaagct tctgcggcgc tgggctacga 3120

cctgtgggcg ctgacccagc aggggccagc tgaagaactg aataaaacct ggcaaactca 3180

gcctgcgctg ttgactgcat ctgttgcgct gtatcgcgta tggcagcagc agggcggtaa 3240

agcaccggca atgatggccg gtcacagcct gggggaatac tccgcgctgg tttgcgctgg 3300

tgtgattgat ttcgctgatg cggtgcgtct ggttgagatg cgcggcaagt tcatgcaaga 3360

agccgtaccg gaaggcacgg gcgctatggc ggcaatcatc ggtctggatg atgcgtctat 3420

tgcgaaagcg tgtgaagaag ctgcagaagg tcaggtcgtt tctccggtaa actttaactc 3480

tccgggacag gtggttattg ccggtcataa agaagcggtt gagcgtgctg gcgctgcctg 3540

taaagcggcg ggcgcaaaac gcgcgctgcc gttaccagtg agcgtaccgt ctcactgtgc 3600

gctgatgaaa ccag 3614

<210> 2

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtatacga agattattgg tactggcagc tatctgcccg aacaagtgcg gacaaacgcc 60

gatttggaaa aaatggtgga cacctctgac gagtggattg tcactcgtac cggtatccgc 120

gaacgccaca ttgccgcgcc aaacgaaacc gtttcaacca tgggctttga agcggcgaca 180

cgcgcaattg agatggcggg cattgagaaa gaccagattg gcctgatcgt tgtggcaacg 240

acttctgcta cgcacgcttt cccgagcgca gcttgtcaga ttcaaagcat gttgggcatt 300

aaaggttgcc cggcatttga cgttgcagca gcctgcgcag gtttcaccta tgcattaagc 360

gtagccgatc aatacgtgaa atctggggcg gtgaagtatg ctctggtcgt cggttccgat 420

gtactggcgc gcacctgcga tccaaccgat cgtgggacta ttattatttt tggcgatggc 480

gcgggcgctg cggtgctggc tgcctctgaa gagccgggaa tcatttccac ccatctgcat 540

gccgacggta gttatggtga attgctgacg ctgccaaacg ccgaccgcgt gaatccagag 600

aattcaattc atctgacgat ggcgggcaac gaagtcttca aggttgcggt aacggaactg 660

gcgcacatcg ttgatgagac gctggcggcg aataatcttg accgttctca actggactgg 720

ctggttccgc atcaggctaa cctgcgtatt atcagtgcaa cggcgaaaaa actcggtatg 780

tctatggata atgtcgtggt gacgctggat cgccacggta atacctctgc ggcctctgtc 840

ccgtgcgcgc tggatgaagc tgtacgcgac gggcgcatta agccggggca gttggttctg 900

cttgaagcct ttggcggtgg attcacctgg ggctccgcgc tggttcgttt ctag 954

<210> 3

<211> 2161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcattaccga cgcaggaaat atgactaacg tcagaaatag caatcgccgg gtagcccgga 60

cggttttcac ggtagcgacc ggtcaactct tcggcaaagt gcatagcgtc gcaatgggaa 120

ccgccgttgc cgcaggaaag cactttgcca ccggctttaa agctgtctgc taacaggacc 180

gccgcgcgct gaatggcgtg aatattggcg tcatctttta aaaagttagc cagcgtttcc 240

gccgcttcgt tcagttcgtt acgaataaga tcctggtaca tgaggatatc cttcagcata 300

aatgtaatag acaaaatgca gtgtaccgga taccgccaaa agcgagaagt acgggcaggt 360

gctatgacca ggactttttg acctgaagtg cggataaaaa cagcaacaat gtgagctttg 420

ttgtaattat attgtaaaca tattgctaaa tgtttttaca tccactacaa ccatatcatc 480

acaagtggtc agacctccta caagtaaggg gcttttcgtt gaagttccta ttctctagaa 540

agtataggaa cttcggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag 600

cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 660

tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 720

gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 780

aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 840

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 900

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 960

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 1020

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 1080

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 1140

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 1200

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 1260

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 1320

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 1380

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 1440

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 1500

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 1560

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagaagttcc 1620

tattctctag aaagtatagg aacttcatga ataacggagc cgaaaggctc cgtttcttta 1680

tccgctaatt atttaaaatt aaagccatcc ggatggtttt ccaggctgcc ggtcaacgcc 1740

gcgaacaaca ccgttttacc atcaatcgaa agcgcatcgt tcacattcag ccaggtgagt 1800

ttctcttgcg acgttttctc atcaatagtc gagaacagcc ccgtcatctg attagatttc 1860

tcggaccaca tcacagcgat acgttgcgag ccacagtcat gcggtttgca cgcgctcatc 1920

acctgatacg tctcatctcc caacgttacg gtttgtgcgg gagtataagt accgcctttc 1980

atcacccagg caggcagctt atgcccttgt accatctgat taaatgcagc tttggtggtt 2040

tcgccctttg caaggctgct aatggttaaa tcatcctgcg ccattgcact ggtggcgatg 2100

accagagcgg cgactgtcgt tattgcctta aacatcattc ctcccgagct tatcctgccc 2160

a 2161

<210> 4

<211> 1015

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaagtgcat agcgtcgcaa tgggaaccgc cgttgccgca ggaaagcact ttgccaccgg 60

ctttaaagct gtctgctaac aggaccgccg cgcgctgaat ggcgtgaata ttggcgtcat 120

cttttaaaaa gttagccagc gtttccgccg cttcgttcag ttcgttacga ataagatcct 180

ggtacatgag gatatccttc agcataaatg taatagacaa aatgcagtgt accggatacc 240

gccaaaagcg agaagtacgg gcaggtgcta tgaccaggac tttttgacct gaagtgcgga 300

taaaaacagc aacaatgtga gctttgttgt aattatattg taaacatatt gctaaatgtt 360

tttacatcca ctacaaccat atcatcacaa gtggtcagac ctcctacaag taaggggctt 420

ttcgttaccg tttaaataat gccaattatt taaagttagc ggccgcgaag ttcctattct 480

ctagaaagta taggaacttc atgaataacg gagccgaaag gctccgtttc tttatccgct 540

aattatttaa aattaaagcc atccggatgg ttttccaggc tgccggtcaa cgccgcgaac 600

aacaccgttt taccatcaat cgaaagcgca tcgttcacat tcagccaggt gagtttctct 660

tgcgacgttt tctcatcaat agtcgagaac agccccgtca tctgattaga tttctcggac 720

cacatcacag cgatacgttg cgagccacag tcatgcggtt tgcacgcgct catcacctga 780

tacgtctcat ctcccaacgt tacggtttgt gcgggagtat aagtaccgcc tttcatcacc 840

caggcaggca gcttatgccc ttgtaccatc tgattaaatg cagctttggt ggtttcgccc 900

tttgcaaggc tgctaatggt taaatcatcc tgcgccattg cactggtggc gatgaccaga 960

gcggcgactg tcgttattgc cttaaacatc attcctcccg agcttatcct gccca 1015

<210> 5

<211> 2445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt ctatcaccgc 60

gtgagcttat ttatcagcag tctgattttg ctcgcctgga cagccgccct cggcgttgct 120

ggtctgtggt cggcgtgggt actggtgcct ctggccatta tcctcgtgcc atttaacttt 180

gcgcctatgc gtaagtcgat gatttccgcg ccggtatttc gcggtttccg taaggtgatg 240

ccgccgatgt cgcgcactga gaaagaagcg attgatgcgg gcaccacctg gtgggagggc 300

gacttgttcc agggcaagcc ggactggaaa aagctgcata actatccgca gccgcgcctg 360

accgccgaag agcaagcgtt tctcgacggc ccggtagaag aagcctgccg gatggcgaat 420

gatttccaga tcacccatga gctggcggat ctgccgccgg agttgtgggc gtaccttaaa 480

gagcatcgtt tcttcgcgat gatcatcaaa aaagagtacg gcgggctgga gttctcggct 540

tatgcccagt ctcgcgtgct gcaaaaactc tccggcgtga gcgggatcct ggcgattacc 600

gtcggcgtgc caaactcatt aggcccgggc gaactgttgc aacattacgg cactgacgag 660

cagaaagatc actatctgcc gcgtctggcg cgtggtcagg agatcccctg ctttgcactg 720

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acgctggcac cgattgcgac cgtgcttggg ctggcgttta aactctccga cccggaaaaa 900

ttactcggcg gtgcagaaga tttaggcatt acctgtgcgc tgatcccaac caccacgccg 960

ggcgtggaaa ttggtcgtcg ccacttcccg ctgaacgtac cgttccagaa cggaccgacg 1020

cgcggtaaag atgtcttcgt gccgatcgat tacatcatcg gcgggccgaa aatggccggg 1080

caaggctggc ggatgctggt ggagtgcctc tcggtaggcc gcggcatcac cctgccttcc 1140

aactcaaccg gcggcgtgaa atcggtagcg ctggcaaccg gcgcgtatgc tcacattcgc 1200

cgtcagttca aaatctctat tggtaagatg gaagggattg aagagccgct ggcgcgtatt 1260

gccggtaatg cctacgtgat ggatgctgcg gcatcgctga ttacctacgg cattatgctc 1320

ggcgaaaaac ctgccgtgct gtcggctatc gttaagtatc actgtaccca ccgcgggcag 1380

cagtcgatta ttgatgcgat ggatattacc ggcggtaaag gcattatgct cgggcaaagc 1440

aacttcctgg cgcgtgctta ccagggcgca ccgattgcca tcaccgttga aggggctaac 1500

attctgaccc gcagcatgat gatcttcgga caaggagcga ttcgttgcca tccgtacgtg 1560

ctggaagaga tggaagcggc gaagaacaat gacgtcaacg cgttcgataa actgttgttc 1620

aaacatatcg gtcacgtcgg tagcaacaaa gttcgcagct tctggctggg cctgacgcgc 1680

ggtttaacca gcagcacgcc aaccggcgat gccactaaac gctactatca gcacctgaac 1740

cgcctgagcg ccaacctcgc cctgctttct gatgtctcga tggcagtgct gggcggcagc 1800

ctgaaacgtc gcgagcgcat ctcggcccgt ctgggggata ttttaagcca gctctacctc 1860

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caaaacttcc cgaaccgcgt ggttgccggg ctgctgaatg tggtgatctt cccgaccgga 2040

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ccggtaaagt tgccggagaa agtgcggaaa gttgaagccg cgtaa 2445

<210> 6

<211> 6563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgtcgacct aattcccatg tcagccgtta agtgttcctg tgtcactcaa aattgctttg 60

agaggctcta agggcttctc agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa 120

ccttaaaagc tttaaaagcc ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag 180

aggctattta agttgctgat ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg 240

tgaaacatga gagcttagta cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt 300

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gctaaaacat gagataaaaa ttgactctca tgttattggc gttaagatat acagaatgat 480

gaggtttttt tatgagactc aaggtcatga tggacgtgaa caaaaaaacg aaaattcgcc 540

accgaaacga gctaaatcac accctggctc aacttccttt gcccgcaaag cgagtgatgt 600

atatggcgct tgctcccatt gatagcaagg aacctcttga acgagggcga gttttcaaaa 660

ttagggctga agaccttgca gcgctcgcca aaatcacccc atcgcttgct tatcgacaat 720

taaaagaggg tggtaagtta cttggtgcca gcaaaatttc gctaagaggg gatgatatca 780

ttgcttcagc taaagagctt aacctgctct ttactgctaa agactcccct gaagagttag 840

atcttaacat tattgagtgg atagcttatt caaatgatga aggatacttg tctttaaaat 900

tcaccagaac catagaacca tatatctcta gccttattgg gaaaaaaaat aaattcacaa 960

cgcaattgtt aacggcaagc ttacgcttaa gtagccagta ttcatcttct ctttatcaac 1020

ttatcaggaa gcattactct aattttaaga agaaaaatta ttttattatt tccgttgatg 1080

agttaaagga agagttaata gcttatactt ttgataaaga tggaagtatt gagtacaaat 1140

accctgactt tcctattttt aaaagggatg tattaaataa agccattgct gaaattaaaa 1200

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gtaagctgaa gttcgaattt gtcgttgatg aagatgaatt ttctggcgat aaagatgatg 1320

aagctttttt tatgaattta tctgaagcta atgcagcttt tctcaaggta tttgatgaaa 1380

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accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca 1800

cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc 1860

tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc 1920

tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg tggcgttatc cagctaagcg 1980

cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc 2040

cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt 2100

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gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa 2220

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ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact 2340

tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca 2400

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ggcgtcatcc cggtttcccg ggtaaacacc accgaaaaat agttactatc ttcaaagcca 2820

cattcggtcg aaatatcact gattaacagg cggctatgct ggagaagata ttgcgcatga 2880

cacactctga cctgtcgcag atattgattg atggtcattc cagtctgctg gcgaaattgc 2940

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tgattattcg caatatggcg tacaaatacg ttgagaagat tcgcgttatt gcagaaagcc 3660

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gttgagacgt gatgcgctgt tttccaggtt ctcctgcaaa ctgcttttac gcagcaagag 4020

cagtaattgc ataaacaaga tctcgcgact ggcggtcgag ggtaaatcat tttccccttc 4080

ctgctgttcc atctgtgcaa ccagctgtcg cacctgctgc aatacgctgt ggttaacgcg 4140

ccagtgagac ggatactgcc catccagctc ttgtggcagc aactgattca gcccggcgag 4200

aaactgaaat cgatccggcg agcgatacag cacattggtc agacacagat tatcggtatg 4260

ttcatacaga tgccgatcat gatcgcgtac gaaacagacc gtgccaccgg tgatggtata 4320

gggctgccca ttaaacacat gaatacccgt gccatgttcg acaatcacaa tttcatgaaa 4380

atcatgatga tgttcaggaa aatccgcctg cgggagccgg ggttctatcg ccacggacgc 4440

gttaccagac ggaaaaaaat ccacactatg taatacggtc atactggcct cctgatgtcg 4500

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ccacgtaaaa aacgtcgatt tttcaagata cagcgtgaat tttcaggaaa tgcggtgagc 4620

atcacatcac cacaattcag caaattgtga acatcatcac gttcatcttt ccctggttgc 4680

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gtcgtaatga aattcaacta gtgctctgca ggagctgtca ccggatgtgc tttccggtct 4800

gatgagtccg tgaggacgaa acagcctcta caaataattt tgtttaagag ttactagaga 4860

aagaggagaa atactagttg aagaaggttt ggcttaaccg ttatcccgcg gacgttccga 4920

cggagatcaa ccctgaccgt tatcaatctc tggtagatat gtttgagcag tcggtcgcgc 4980

gctacgccga tcaacctgcg tttgtgaata tgggggaggt aatgaccttc cgcaagctgg 5040

aagaacgcag tcgcgcgttt gccgcttatt tgcaacaagg gttggggctg aagaaaggcg 5100

atcgcgttgc gttgatgatg cctaatttat tgcaatatcc ggtggcgctg tttggcattt 5160

tgcgtgccgg gatgatcgtc gtaaacgtta acccgttgta taccccgcgt gagcttgagc 5220

atcagcttaa cgatagcggc gcatcggcga ttgttatcgt gtctaacttt gctcacacac 5280

tggaaaaagt ggttgataaa accgccgttc agcacgtaat tctgacccgt atgggcgatc 5340

agctatctac ggcaaaaggc acggtagtca atttcgttgt taaatacatc aagcgtttgg 5400

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tggaacaggt taacgcgacc tatggtccgc tgttgcatcc gggcaaagag ctggtggtga 5640

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tgggtgggca gaacctgctt atcactaacc cgcgcgatat tccagggttg gtaaaagagt 5760

tagcgaaata tccgtttacc gctatcacgg gcgttaacac cttgttcaat gcgttgctga 5820

acaataaaga gttccagcag ctggatttct ccagtctgca tctttccgca ggcggtggga 5880

tgccagtgca gcaagtggtg gcagagcgtt gggtgaaact gaccggacag tatctgctgg 5940

aaggctatgg ccttaccgag tgtgcgccgc tggtcagcgt taacccatat gatattgatt 6000

atcatagtgg tagcatcggt ttgccggtgc cgtcgacgga agccaaactg gtggatgatg 6060

atgataatga agtaccacca ggtcaaccgg gtgagctttg tgtcaaagga ccgcaggtga 6120

tgctgggtta ctggcagcgt cccgatgcta ccgatgaaat catcaaaaat ggctggttac 6180

acaccggcga catcgcggta atggatgaag aaggattcct gcgcattgtc gatcgtaaaa 6240

aagacatgat tctggtttcc ggttttaacg tctatcccaa cgagattgaa gatgtcgtca 6300

tgcagcatcc tggcgtacag gaagtcgcgg ctgttggcgt accttccggc tccagtggtg 6360

aagcggtgaa aatcttcgta gtgaaaaaag atccatcgct taccgaagag tcactggtga 6420

ctttttgccg ccgtcagctc acgggataca aagtaccgaa gctggtggag tttcgtgatg 6480

agttaccgaa atctaacgtc ggaaaaattt tgcgacgaga attacgtgac gaagcgcgcg 6540

gcaaagtgga caataaagcc tga 6563

<210> 7

<211> 1759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaatctttc tgcgaattga gatgacgcca ctggctgggc gtcatcccgg tttcccgggt 60

aaacaccacc gaaaaatagt tactatcttc aaagccacat tcggtcgaaa tatcactgat 120

taacaggcgg ctatgctgga gaagatattg cgcatgacac actctgacct gtcgcagata 180

ttgattgatg gtcattccag tctgctggcg aaattgctga cgcaaaacgc gctcactgca 240

cgatgcctca tcacaaaatt tatccagcgc aaagggactt ttcaggctag ccgccagccg 300

ggtaatcagc ttatccagca acgtttcgct ggatgttggc ggcaacgaat cactggtgta 360

acgatggcga ttcagcaaca tcaccaactg cccgaacagc aactcagcca tttcgttagc 420

aaacggcaca tgctgactac tttcatgctc aagctgaccg ataacctgcc gcgcctgcgc 480

catccccatg ctacctaagc gccagtgtgg ttgccctgcg ctggcgttaa atcccggaat 540

cgccccctgc cagtcaagat tcagcttcag acgctccggg caataaataa tattctgcaa 600

aaccagatcg ttaacggaag cgtaggagtg tttatcgtca gcatgaatgt aaaagagatc 660

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aatcaccagc tcacaaaaat catgtgtatg ttcagcaaag acatcttgcg gataacggtc 780

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tcatcagtcg caggcggttc aggtatcgct gaggcgtcag tcccgtttgc tgcttaagct 1140

gccgatgtag cgtacgcagt gaaagagaaa attgatccgc cacggcatcc caattcacct 1200

catcggcaaa atggtcctcc agccaggcca gaagcaagtt gagacgtgat gcgctgtttt 1260

ccaggttctc ctgcaaactg cttttacgca gcaagagcag taattgcata aacaagatct 1320

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ccagctcttg tggcagcaac tgattcagcc cggcgagaaa ctgaaatcga tccggcgagc 1500

gatacagcac attggtcaga cacagattat cggtatgttc atacagatgc cgatcatgat 1560

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ccgcctgcgg gagccggggt tctatcgcca cggacgcgtt accagacgga aaaaaatcca 1740

cactatgtaa tacggtcat 1759

<210> 8

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgaagaagg tttggcttaa ccgttatccc gcggacgttc cgacggagat caaccctgac 60

cgttatcaat ctctggtaga tatgtttgag cagtcggtcg cgcgctacgc cgatcaacct 120

gcgtttgtga atatggggga ggtaatgacc ttccgcaagc tggaagaacg cagtcgcgcg 180

tttgccgctt atttgcaaca agggttgggg ctgaagaaag gcgatcgcgt tgcgttgatg 240

atgcctaatt tattgcaata tccggtggcg ctgtttggca ttttgcgtgc cgggatgatc 300

gtcgtaaacg ttaacccgtt gtataccccg cgtgagcttg agcatcagct taacgatagc 360

ggcgcatcgg cgattgttat cgtgtctaac tttgctcaca cactggaaaa agtggttgat 420

aaaaccgccg ttcagcacgt aattctgacc cgtatgggcg atcagctatc tacggcaaaa 480

ggcacggtag tcaatttcgt tgttaaatac atcaagcgtt tggtgccgaa ataccatctg 540

ccagatgcca tttcatttcg tagcgcactg cataacggct accggatgca gtacgtcaaa 600

cccgaactgg tgccggaaga tttagctttt ctgcaataca ccggcggcac cactggtgtg 660

gcgaaaggcg cgatgctgac tcaccgcaat atgctggcga acctggaaca ggttaacgcg 720

acctatggtc cgctgttgca tccgggcaaa gagctggtgg tgacggcgct gccgctgtat 780

cacatttttg ccctgaccat taactgcctg ctgtttatcg aactgggtgg gcagaacctg 840

cttatcacta acccgcgcga tattccaggg ttggtaaaag agttagcgaa atatccgttt 900

accgctatca cgggcgttaa caccttgttc aatgcgttgc tgaacaataa agagttccag 960

cagctggatt tctccagtct gcatctttcc gcaggcggtg ggatgccagt gcagcaagtg 1020

gtggcagagc gttgggtgaa actgaccgga cagtatctgc tggaaggcta tggccttacc 1080

gagtgtgcgc cgctggtcag cgttaaccca tatgatattg attatcatag tggtagcatc 1140

ggtttgccgg tgccgtcgac ggaagccaaa ctggtggatg atgatgataa tgaagtacca 1200

ccaggtcaac cgggtgagct ttgtgtcaaa ggaccgcagg tgatgctggg ttactggcag 1260

cgtcccgatg ctaccgatga aatcatcaaa aatggctggt tacacaccgg cgacatcgcg 1320

gtaatggatg aagaaggatt cctgcgcatt gtcgatcgta aaaaagacat gattctggtt 1380

tccggtttta acgtctatcc caacgagatt gaagatgtcg tcatgcagca tcctggcgta 1440

caggaagtcg cggctgttgg cgtaccttcc ggctccagtg gtgaagcggt gaaaatcttc 1500

gtagtgaaaa aagatccatc gcttaccgaa gagtcactgg tgactttttg ccgccgtcag 1560

ctcacgggat acaaagtacc gaagctggtg gagtttcgtg atgagttacc gaaatctaac 1620

gtcggaaaaa ttttgcgacg agaattacgt gacgaagcgc gcggcaaagt ggacaataaa 1680

gcctga 1686

<210> 9

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Leu Lys Lys Val Trp Leu Asn Arg Tyr Pro Ala Asp Val Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Gln Ser Leu Val Asp Met Phe Glu Gln Ser

20 25 30

Val Ala Arg Tyr Ala Asp Gln Pro Ala Phe Val Asn Met Gly Glu Val

35 40 45

Met Thr Phe Arg Lys Leu Glu Glu Arg Ser Arg Ala Phe Ala Ala Tyr

50 55 60

Leu Gln Gln Gly Leu Gly Leu Lys Lys Gly Asp Arg Val Ala Leu Met

65 70 75 80

Met Pro Asn Leu Leu Gln Tyr Pro Val Ala Leu Phe Gly Ile Leu Arg

85 90 95

Ala Gly Met Ile Val Val Asn Val Asn Pro Leu Tyr Thr Pro Arg Glu

100 105 110

Leu Glu His Gln Leu Asn Asp Ser Gly Ala Ser Ala Ile Val Ile Val

115 120 125

Ser Asn Phe Ala His Thr Leu Glu Lys Val Val Asp Lys Thr Ala Val

130 135 140

Gln His Val Ile Leu Thr Arg Met Gly Asp Gln Leu Ser Thr Ala Lys

145 150 155 160

Gly Thr Val Val Asn Phe Val Val Lys Tyr Ile Lys Arg Leu Val Pro

165 170 175

Lys Tyr His Leu Pro Asp Ala Ile Ser Phe Arg Ser Ala Leu His Asn

180 185 190

Gly Tyr Arg Met Gln Tyr Val Lys Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp Leu

195 200 205

Ala Phe Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Val Ala Lys Gly Ala

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Met Leu Thr His Arg Asn Met Leu Ala Asn Leu Glu Gln Val Asn Ala

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Thr Tyr Gly Pro Leu Leu His Pro Gly Lys Glu Leu Val Val Thr Ala

245 250 255

Leu Pro Leu Tyr His Ile Phe Ala Leu Thr Ile Asn Cys Leu Leu Phe

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Ile Glu Leu Gly Gly Gln Asn Leu Leu Ile Thr Asn Pro Arg Asp Ile

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Pro Gly Leu Val Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Thr

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Gly Val Asn Thr Leu Phe Asn Ala Leu Leu Asn Asn Lys Glu Phe Gln

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Gln Leu Asp Phe Ser Ser Leu His Leu Ser Ala Gly Gly Gly Met Pro

325 330 335

Val Gln Gln Val Val Ala Glu Arg Trp Val Lys Leu Thr Gly Gln Tyr

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Leu Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Cys Ala Pro Leu Val Ser Val

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Asn Pro Tyr Asp Ile Asp Tyr His Ser Gly Ser Ile Gly Leu Pro Val

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Pro Ser Thr Glu Ala Lys Leu Val Asp Asp Asp Asp Asn Glu Val Pro

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Pro Gly Gln Pro Gly Glu Leu Cys Val Lys Gly Pro Gln Val Met Leu

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Gly Tyr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Thr Asp Glu Ile Ile Lys Asn Gly

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Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Ala Val Met Asp Glu Glu Gly Phe Leu

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Arg Ile Val Asp Arg Lys Lys Asp Met Ile Leu Val Ser Gly Phe Asn

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Val Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Val Val Met Gln His Pro Gly Val

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Val Lys Ile Phe Val Val Lys Lys Asp Pro Ser Leu Thr Glu Glu Ser

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Leu Val Thr Phe Cys Arg Arg Gln Leu Thr Gly Tyr Lys Val Pro Lys

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Leu Val Glu Phe Arg Asp Glu Leu Pro Lys Ser Asn Val Gly Lys Ile

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Leu Arg Arg Glu Leu Arg Asp Glu Ala Arg Gly Lys Val Asp Asn Lys

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Ala

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<210> 12

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaaccatc tgcgtgcgga aggccctgcg agcgttttag cgattggcac cgcgaatccg 60

gaaaacattc tgctgcagga tgaatttccg gattattatt ttcgcgtgac caaaagcgaa 120

catatgaccc agctgaaaga aaaatttcgc aaaatttgcg acaagagcat gattcgcaaa 180

cgcaactgct ttctgaacga agaacatctg aaacagaacc cgcgcctggt ggaacatgaa 240

atgcagaccc tggatgcgcg ccaggatatg ctggtggtgg aagtgccgaa actgggcaaa 300

gatgcgtgcg cgaaagcgat taaagaatgg ggccagccga aaagcaaaat tacccatctg 360

atttttacca gcgcgagcac caccgatatg ccgggcgcag attatcattg cgcgaaactg 420

ctgggcctga gcccgagcgt taaacgcgtg atgatgtatc agctgggctg ctatggcggc 480

ggcaccgttt tacgtattgc gaaagatatt gcggaaaaca acaaaggcgc gcgcgtgctg 540

gcggtgtgtt gtgatattat ggcgtgcctg tttcgcggcc cgagcgaaag cgatctggaa 600

ctgttagtgg gccaggcgat ttttggcgat ggcgcggcgg cggtgattgt gggtgcagaa 660

cctgatgaaa gcgtgggcga acgccctatt tttgaactgg tgagcaccgg ccagaccatt 720

ctgccgaata gcgaaggcac cattggcggc catattcgcg aagcgggcct gatttttgat 780

ctgcataaag atgtgccgat gctgattagc aacaacattg aaaaatgcct gattgaggcg 840

tttaccccga ttggcattag cgattggaac agcatctttt ggattaccca tccgggcggc 900

aaagcgattc tggataaagt ggaagaaaaa ctgcatctga aaagcgataa attcgtggat 960

agccgccatg tgctgagcga acatggcaac atgagcagca gcaccgtgct gtttgtgatg 1020

gatgaactgc gcaaacgcag cctggaagaa ggcaaaagca ccaccggcga tggctttgaa 1080

tggggcgtgc tgtttggctt tggcccgggc ttaaccgtgg aacgcgttgt ggttcgtagc 1140

gtgcctatta aatattaa 1158

<210> 13

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Asn His Leu Arg Ala Glu Gly Pro Ala Ser Val Leu Ala Ile Gly

1 5 10 15

Thr Ala Asn Pro Glu Asn Ile Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Asp Tyr

20 25 30

Tyr Phe Arg Val Thr Lys Ser Glu His Met Thr Gln Leu Lys Glu Lys

35 40 45

Phe Arg Lys Ile Cys Asp Lys Ser Met Ile Arg Lys Arg Asn Cys Phe

50 55 60

Leu Asn Glu Glu His Leu Lys Gln Asn Pro Arg Leu Val Glu His Glu

65 70 75 80

Met Gln Thr Leu Asp Ala Arg Gln Asp Met Leu Val Val Glu Val Pro

85 90 95

Lys Leu Gly Lys Asp Ala Cys Ala Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile Phe Thr Ser Ala Ser Thr Thr

115 120 125

Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr His Cys Ala Lys Leu Leu Gly Leu Ser

130 135 140

Pro Ser Val Lys Arg Val Met Met Tyr Gln Leu Gly Cys Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Gly Thr Val Leu Arg Ile Ala Lys Asp Ile Ala Glu Asn Asn Lys Gly

165 170 175

Ala Arg Val Leu Ala Val Cys Cys Asp Ile Met Ala Cys Leu Phe Arg

180 185 190

Gly Pro Ser Glu Ser Asp Leu Glu Leu Leu Val Gly Gln Ala Ile Phe

195 200 205

Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Ala Glu Pro Asp Glu Ser

210 215 220

Val Gly Glu Arg Pro Ile Phe Glu Leu Val Ser Thr Gly Gln Thr Ile

225 230 235 240

Leu Pro Asn Ser Glu Gly Thr Ile Gly Gly His Ile Arg Glu Ala Gly

245 250 255

Leu Ile Phe Asp Leu His Lys Asp Val Pro Met Leu Ile Ser Asn Asn

260 265 270

Ile Glu Lys Cys Leu Ile Glu Ala Phe Thr Pro Ile Gly Ile Ser Asp

275 280 285

Trp Asn Ser Ile Phe Trp Ile Thr His Pro Gly Gly Lys Ala Ile Leu

290 295 300

Asp Lys Val Glu Glu Lys Leu His Leu Lys Ser Asp Lys Phe Val Asp

305 310 315 320

Ser Arg His Val Leu Ser Glu His Gly Asn Met Ser Ser Ser Thr Val

325 330 335

Leu Phe Val Met Asp Glu Leu Arg Lys Arg Ser Leu Glu Glu Gly Lys

340 345 350

Ser Thr Thr Gly Asp Gly Phe Glu Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly

355 360 365

Pro Gly Leu Thr Val Glu Arg Val Val Val Arg Ser Val Pro Ile Lys

370 375 380

Tyr

385

<210> 14

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggcggtga aacatctgat tgtgctgaaa tttaaagacg agatcaccga ggcgcagaaa 60

gaggaatttt tcaaaaccta tgtgaacctg gtgaacatca tcccggcgat gaaagatgtg 120

tattggggca aagatgtgac ccagaaaaac aaagaagaag gctataccca tattgtggaa 180

gtgacctttg aaagcgtgga aaccattcag gattatatta ttcacccggc gcatgtgggc 240

tttggcgatg tgtatcgcag cttttgggaa aaactgctga tttttgatta caccccgcgc 300

aaataa 306

<210> 15

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Ala Val Lys His Leu Ile Val Leu Lys Phe Lys Asp Glu Ile Thr

1 5 10 15

Glu Ala Gln Lys Glu Glu Phe Phe Lys Thr Tyr Val Asn Leu Val Asn

20 25 30

Ile Ile Pro Ala Met Lys Asp Val Tyr Trp Gly Lys Asp Val Thr Gln

35 40 45

Lys Asn Lys Glu Glu Gly Tyr Thr His Ile Val Glu Val Thr Phe Glu

50 55 60

Ser Val Glu Thr Ile Gln Asp Tyr Ile Ile His Pro Ala His Val Gly

65 70 75 80

Phe Gly Asp Val Tyr Arg Ser Phe Trp Glu Lys Leu Leu Ile Phe Asp

85 90 95

Tyr Thr Pro Arg Lys

100

Claims

1.酯酰辅酶A合成酶变体，其特征在于，所述酯酰辅酶A合成酶变体与氨基酸序列如SEQID NO.9所示的大肠杆菌野生型酯酰辅酶A合成酶相比的突变为选自以下突变中的一种：I380C、Q338P、R449Y、K454T、D456E、D456C、F463K，或者为Q338P和D456E，或者为K454T和D456E。

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的酯酰辅酶A合成酶变体。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求2所述的核酸分子或表达权利要求1所述的酯酰辅酶A合成酶变体；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

4.一种工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达权利要求1所述的酯酰辅酶A合成酶变体。

5.根据权利要求4所述的工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶，或者，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶。

6.根据权利要求5所述的工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌的脂酰辅酶A脱氢酶和/或β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶失活。

7.权利要求4~6任一项所述的工程化大肠杆菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：对大肠杆菌进行修饰以使其表达权利要求1所述的酯酰辅酶A合成酶变体。

8.一种发酵生产橄榄醇酸和/或橄榄醇的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求5~6任一项所述的工程化大肠杆菌，得到培养物，回收所述培养物中的橄榄醇酸和/或橄榄醇。