CN1218508A - 制备钴胺素的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备钴胺素的生物合成方法。更准确地说涉及通过重组DNA技术和/或加入一种钴胺素的新前体来提高钴胺素特别是辅酶B12生产的方法。
Description
本发明涉及一种制备钴胺素的生物合成方法。更准确地说，本发明涉及一种通过重组DNA技术和/或通过加入一种新的钴胺素前体提高钴胺素特别是辅酶B12产量的方法。本发明最后涉及制备可用于本发明钴胺素制备方法的重组菌株的方法。
维生素B12是称为钴胺素的一类分子的一部分，这类分子的结构特别示于WO91/11518中。
钴胺素几乎都是由细菌按WO91/11518中所述的复杂过程合成的。由于生物合成机制的复杂性，钴胺素特别是维生素B12的工业生产主要通过细菌脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、谢氏丙酸酐菌(Propionobacterium shermanii)和费氏丙酸酐菌(Propionobacteriumfreudenreichii)。
还已知某些微生物从下列物质合成钴胺素：氨基乙酰丙酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、钴、谷氨酰胺、R1-氨基-2-丙醇和5,6-二甲基苯并咪唑。
在上述前体中，5,6-二甲基苯并咪唑是由钴胺素的微生物生产菌合成的。看来存在两条5,6-二甲基苯并咪唑的生物合成途径。一条是需氧微生物的特征并涉及氧分子，另一条被厌氧微生物所采用。仅分离了厌氧途径中的基因，即沙门氏菌S.thyphimurium的cobT基因(Trzebiatowski等，1994)。迄今为止没有在需氧微生物中鉴定出任何合成5,6-二甲基苯并咪唑的基因。这些微生物合成的5,6-二甲基苯并咪唑的量常常是限制性的。
因而化学合成制备5,6-二甲基苯并咪唑并加入生产培养基中。因此免去向培养基中的这种加入将代表一种确定的优点。
迄今，没有任何钴胺素的工业制备方法提到要加入除钴和5,6-二甲基苯并二咪唑以外的前体。最近描述了一些只在含R1-氨基-2-丙醇的培养基中产生钴胺素的菌株(Crouzet等，1990,Grabau等，1992)。因而R1-氨基-2-丙醇应能用于提高钴胺素的生产。但其在工业发酵中的使用可能是棘手和昂贵的，因为一方面R1-氨基-2-丙醇是一种刺激性和挥发性物质，另一方面它可能抑制微生物的生长。因此发现另外的没有这些缺点的钴胺素R1-氨基-2-丙醇残基的前体将是特别有利的。为此，有人描述了在某些微生物中从L-苏氨酸经氨基丙酮生物合成R1-氨基-2-丙醇的途径。但L-苏氨酸不能与上述菌株互补。
更广义地讲，为了提高钴胺素的产量，提高培养基中其前体的量是有利的，特别当这些前体是限制性的时。这一途径可通过直接向培养基中加入限制性前体或其衍生物或类似物来实现，也可以通过使用遗传技术特别是重组DNA技术在生产菌中提高该前体的就地合成来实现。
对于钴胺素和其前体生物合成途径的认识是提高钴胺素生产的关键步骤。
因此，最近已在脱氮假单胞菌中鉴定了维生素B12生物合成途径的大部分步骤(Blanche等，1995)。已分离了不下22种参与钴胺素生物合成的cob基因，并已鉴定了这些基因编码的大部分多肽的功能。
还在其他微生物中分离了可能参与钴胺素或其前体生物合成的其他基因。但不知道这些基因的功能。只有准确测定其作用或效应才能发现它们的应用。在一种任选性光合成的细菌荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)中，最近已对带有光合成器形成中必需的至少一种基因的DNA片段测序(Pollich等，1993,Pollich等，1995a)。其中提出所分离的8种基因中的5种是钴胺素生物合成基因，因为它们与前述脱氮假单胞菌的22种cob基因中的5种高度同源。而对其余3种基因没能直接指定任何准确功能，即基因blu B、Blu E和blu F。包括其启动子序列的bluB、blu E和blu F基因已被测序并在Pollich等，1995a中描述。
本发明中发现了一种钴胺素的新前体。实际上，本发明能使人用含有O-磷酸-L-苏氨酸的培养基获得钴胺素产量的提高。这种迄今没有描述过的钴胺素前体与另一种已知前体R1-氨基-2-丙醇具有相似的作用。但O-磷酸-L-苏氨酸与R1-氨基-2-丙醇相比具有优点：无毒性及易操作。另外，其提高钴胺素产量的效力优于R1-氨基-2-丙醇1000倍以上。
本发明的另一目的是利用荚膜红细菌的DNA片段提高钴胺素的产量或在给定细胞中获得或提高O-磷酸-L-苏氨酸或5,6-二甲基苯并咪唑的就地合成。
本发明使人能用不含有R1-氨基-2-丙醇或O-磷酸-L-苏氨酸的培养基获得钴胺素产量的提高，其中使用特别带有荚膜红细菌bluE和bluF基因的DNA片段。
本发明最后还使人能通过引入特别带有荚膜红细菌bluB基因的DNA片段在不含有5,6-二甲基苯并咪唑的培养基中获得钴胺素产量的提高。
本发明的目的之一是，一种利用钴胺素的原核微生物生产菌发酵的钴胺素生物合成方法，其特征在于：
-使用被编码参与O-磷酸-L-苏氨酸生物合成途径的一种酶的至少一个DNA片段转化的微生物，在允许所述酶表达和钴胺素产生的条件下培养该微生物；和/或
-在所述微生物的培养基中加入O-磷酸-L-苏氨酸，或
-使用被编码参与5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的一种酶的至少一个DNA片段转化的需氧微生物，在允许所述酶表达和钴胺素产生的条件下需氧培养所述微生物。
所述微生物可以内源性地含有如上所表征的基因。这种情况下，本发明的方法可过量表达所述酶。但所述微生物也可以是内源性不含此类基因的。
从“编码参与O-磷酸-L-苏氨酸或5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的一种酶的DNA片段”，应理解所述DNA片段翻译表达为在细胞中O-磷酸-L-苏氨酸或5,6-二甲基苯并咪唑的合成，随后可能释放入培养基中。
所述培养可分批进行或连续进行，钴胺素的纯化按在工业上已使用的方法进行(Florent,1986)。
在一种实施方案中，使用被这样一种DNA片段转化的微生物，该DNA片段编码参与O-磷酸-L-苏氨酸的生物合成途径的多肽，并包括荚膜红细菌的bluE和bluF基因，或一种同源性或与所述bluE和bluF基因杂交并具有与所述基因相同的编码参与O-磷酸-L-苏氨酸生物合成途径的酶之功能的片段。
在另一实施方案中，使用被这样的DNA片段转化的微生物，该DNA片段编码参与5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的酶，并包含荚膜红细胞菌的bluB基因，或一种同源性或与所述bluB基因杂交的并具有与所述基因相同的编码参与5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的酶之功能的片段。
本发明涉及天然、合成或重组的DNA片段和同源物的应用。“片段”应理解为因遗传密码子的筒并性造成的片段或具有至少25％序列同源性并编码相同功能之多肽的片段。
以适当方式使用需氧培养的微生物，所述DNA片段编码参与5,6-二甲基苯并咪唑需氧生物合成途径的酶。
本发明的另一目的是制备钴胺素的原核微生物生产菌的重组菌株的方法，其特征在于用遗传工程技术以如上所定义的编码参与O-磷酸-L-苏氨酸或5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的酶的DNA片段转化所述微生物。
本发明还涉及按本发明的制备菌株的方法获得的重组菌株。
本发明涉及在本发明的方法中使用含有编码一种所述多肽的至少一种DNA序列的重组DNA，在其中所述一种或多种序列处于表达信号的控制之下。
为此，可特别将启动子区放在DNA序列的5′端。这些启动子区可以与DNA的序列是同源的或异源的。特别可以使用强细菌启动子，如色氨酸操纵子的启动子Ptrp或大肠杆菌乳糖操纵子的启动子Plac,λ噬菌体的左或右启动子，细菌噬菌体的强启动子：如棒状杆菌噬菌体的，革兰氏阴性细菌的功能性启动子如大肠杆菌的Ptac启动子，TOL质粒二甲苯分解代谢基因的PxylS启动子，枯草芽孢杆菌淀粉酶的启动子Pamy。还可以举出来自酵母糖酵解基因的启动子，如编码磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乳糖酶或烯醇酶基因的启动子，当要将重组DNA导入真核宿主中时将使用这些启动子。一个核糖体固定位点也将位于DNA序列的5′部分，它可以是同源的或异源的，如λ噬菌体的cⅡ基因的核糖体固定位点。
转录终止所需信号可置于DNA序列的3′端。
用于本发明方法的重组DNA随后可直接导入一种与所选表达信号相容的宿主细胞中，或被克隆在一种质粒载体中以将目的DNA序列稳定地导入所述宿主细胞中。
本发明以已知的方式使用含有编码一种所述多肽的DNA序列的质粒。按已知的方式，这些质粒还含有功能性复制系统和选择标志。
可以使用各种类型的载体。本发明中优选使用RK2型的载体，即具有RK2复制起点的载体。作为实例，特别可提到RK2载体(Saurugger等，1986)、pXL435载体(Cameron等，1989)、pRK290载体(US4,590,163；Ditta等，1985)和pXL1635载体(WO91/16439)。特别有用的载体是pXL1635载体。在WO91/16439中描述了其他一些载体。
根据一种实施方案，使用被含有质粒pER1 6.8kb BamHⅠ片段(图1)的DNA片段转化的微生物，所述Bam HⅠ片段如下述实施例中所述并编码两种前体的合成，即磷酸O-磷酸-L-苏氨酸和5,6-二甲基苯并咪唑。
在一个特别适于一种参与O-磷酸-L-苏氨酸合成的多肽表达的实施方案中，如下文实施例中所述，使用含有质粒pER2的2.1kbEcoRⅠ/ClaⅠ片段的DNA片段(图2)。
在一个特别适用于一种参与O-磷酸-L-苏氨酸合成的多肽表达的实施方案中，如下文实施例中所述，使用含有质粒pER2的1.6kbEcoRⅠ/EcoRⅤ片段的DNA片段(图2)。
在另一特别适于一种参与5,6-二甲基苯并咪唑合成的多肽表达的实施方案中，如下文实施例中所述，使用含有质粒pER1的6.8kb BamHⅠ片段的DNA片段。
可用于本发明的原核宿主微生物特别为大肠杆菌(F.Coli)、脱氮假单胞菌、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或苜蓿根瘤菌(Rhizobium melitoti)或荚膜红细菌。WO91/11518中描述了其他细菌。
但最好使用脱氮假单胞菌或放射形土壤杆菌。
从下面的详细描述将清楚地显现出本发明的其他优点和特征。
实施例1和2描述了如何通过在脱氮假单胞菌或荚膜红细胞菌株的培养基中加入O-磷酸-L-苏氨酸来生产钴胺素。实施例2显示如何有利地用O-磷酸-L-苏氨酸在生产培养基中代替R1-氨基-2-丙醇，因为要达到钴胺素生产需要至少1000倍以上浓度的R1-氨基-2-丙醇。
实施例2还显示荚膜红细菌基因组含bluE和bluF基因的部分参与O-磷酸-L-苏氨酸的合成。实施例3描述了从荚膜红细菌的DNA片段开始构建带bluE和bluF基因的质粒。该实施例3特别显示这些质粒在最后导入其中钴胺素的产生依赖于添加R1-氨基-2-丙醇或O-磷酸-L-苏氨酸的菌株后，如何允许在不含R1-氨基-2-丙醇或O-磷酸-L-苏氨酸的培养基中获得钴胺素的生产。实施例4显示带有bluB基因的荚膜红细菌染色体区参与5,6-二甲基苯并咪唑的合成。
附图：
图1：质粒pER1的限制性图谱。
图2：质粒pER2的限制性图谱。
图3：质粒pER3的限制性图谱。
图1至3分别代表质粒pER1,pER2和pER3。
1．菌株和质粒
已从菌株37b4(DSM938)构建了荚膜红细菌的AH2和BB1株(Pollich等，1995a)。已从菌株SBL27Rifr通过插入转座子Tn5构建了脱氮假单胞菌的菌株G2650(Grouzet等，1990)。首先用带有四环素抗性基因的转座子Tn5构建了菌株G2650[Tet]。然后从菌株G2650[Tet]通过用壮观霉素抗性基因与Tn5转座子四环素抗性基因的交换构建了菌株G2650[Sp]。SBL27Rifr菌株衍生自MB580菌株(专利US 3018225)。
从荚膜红细菌的DNA片段构建了质粒pBBW1(Pollich等，1995a)。从质粒pBBW1构建了质粒pAHW25(Pollich和Klug,1995a)。
按微生物学定量法或按高效液相色谱(HPLC)测定所产生的钴胺素的量。
-微生物学定量法：
通过用大肠杆菌指示菌株113-3(维生素B12营养缺陷型)(Davis和Mingioli,1950)的定量方法测定产物钴胺素的量。
该指示菌株是大肠杆菌的metE突变体，因此它只有一种B12依赖性高半脱氨酸甲基转移酶(EC 2.1.1.13)。在基本培养基上，该菌株只要求存在维生素B12就可生长。当该菌株含于琼脂化基本培养基M9(Miller,1972)的上层(其中为该菌株的生长仅缺乏维生素B12)中时，就可能对维生素B12定量。实际上，如果在该上层的表面放置含维生素B12溶液的样品，在37℃培养16小时后在放置的位置可见生长晕圈。含于样品中的维生素B12扩散并使含于琼脂中的细菌生长。生长晕圈的直径与样品中B12的浓度成比例。
通过按下述方式裂解细胞获得样品：
将含有24mg/ml溶菌酶(Boehringer Mannheim)的0.1ml溶液(Tris-HCl pH=8100mM,EDTA 20mM，蔗糖200g/l)与0.5ml待测细胞培养液混合。37℃培养30分钟后，加入60μl 30g/l的十二烷基硫酸钠溶液并将混合物涡旋几秒钟。将10μl所得细胞裂解液或1/50的稀释液置于上层的表面上。
-HPLC测定：
所用的高效液相层析法测定钴胺素的方法是Blanche等，1990描述的方法。
实施例1:O-磷酸-L-苏氨酸对脱氮假单胞菌株生产钴胺素的影响
在100ml锥形烧瓶中含2μg/ml四环素的25ml PS4培养基中培养脱氮假单胞菌的G2650[Tet]菌株。30℃搅拌(250rpm)下发酵24小时后，向培养基中加入0.16、0.32或1.5ml 10g/l的O-磷酸-L-苏氨酸的溶液(相当于66、132和600mg/l的终浓度)。在发酵148小时后采用HPLC定量测定在每种条件下产生的钴胺素的量。结果(表1)显示G2650[Tet]菌株在PS4培养基中不产生维生素B12。相反，在培养基中存在O-磷酸-L-苏氨酸时，允许相同菌株产生B12。所产维生素B12的量随着所加入的O-磷酸-L-苏氨酸量的增加而增加。
表1
| 加入培养基中的O-磷-L-苏氨酸(mg/l) | 0 | 66 | 132 | 600 | 600(在0时间加入) |
| 产生的B12(mg/l) | 0 | 1.8 | 2.5 | 4.2 | 3.8 |
实施例2:O-磷酸-L-苏氨酸和R1-氨基-2-丙醇对荚膜红细菌菌株钴胺素生产的比较影响
在100ml锥形烧瓶中70ml RA培养基中在10μg/ml卡那霉素和不同浓度的O-磷酸-L-苏氨酸和R1-氨基-2-丙醇存在下培养荚膜红细菌的AH2菌株。30℃搅拌(100rpm)下发酵24-48小时后，用微生物定量测定法测定这些条件下产生的钴胺素的量。
结果示于表2中，其中“-”指不存在指示菌株的生产晕圈，“+”指存在生长晕圈且其直径随着“+”的数目增加。这些结果表明，在RA培养基中培养的荚膜红细菌的AH2菌株不产生维生素B12。而存在O-磷酸或R1-氨基-2-丙醇时，该菌株能够产生维生素B12。这些结果还表明，要加入6×103倍的R1-氨基-2-丙醇才能得到与O-磷酸-L-苏氨酸的相同结果。
表2
| 培养基中O-磷酸-L-苏氨酸的浓度 | 10nM | 25nM | 50nM | 100nM | 250nM |
| B12的产生 | - | + | ++ | +++ | ++++ |
| 培养基中R1-氨基-2-丙醇的浓度 | 6μM | 30μM | 150μM | 1.2mM |
| B12的产生 | - | - | - | + |
实施例3：非钴胺素生产菌株G2650中存在来自质粒pBBW1的DNA片段的影响
3.1质粒pER1的构建(图1)
通过在载体pXL435(Cameron等，1989)的Bam HⅠ位点克隆从质粒pBBW1(Pollich和Klug,1995)纯化的6.8kb Bam HⅠ DNA片段构建了17.4kb的质粒pER1。
3.2在脱氮假单胞菌G2650菌株中引入质粒pER1
在第一时间将质粒pER1通过电穿孔导入大肠杆菌S17-1菌株中，在第二时间，通过与含有质粒pER1的大肠杆菌S17-1株接合导入脱氮假单胞菌的G2650[Tet]株中。选择了抗50μg/ml利福平和100μg/ml青紫霉素的转接合子(trausconjugant)。所分析的9个克隆含有质粒pER1。
同样构建了仅含有载体pXL 435的对照菌株G2650[Tet]。
3.3含质粒pER1的G2650菌株产生钴胺素
在利福平、四环素和青紫霉素存在下在PS4培养基中培养了含质粒pER1的G2650[Tet]克隆及含质粒pXL435的两个克隆。30℃搅拌(250rpm)下发酵140小时后，通过微生物定量测定法和HPLC测定产生的钴胺素的量。结果表示于表3中。
表3
| B12的微生物定量测定 | B12的HPLC(mg/l) | ||
| 含质粒pER1的菌株G2650[Tet] | 123456789 | ++++++++++++++++++ | 33.53.43.22.93.93.63.33.9 |
| 含质粒pXL435的菌株G2650[Tet] | 12 | -- | 00 |
| 菌株G2650[Tet] | - | 0 |
G2650[Tet]菌株和含有pXL435质粒的该菌株在PS4培养基中都不产生维生素B12，而含有质粒pER1的相同菌株则能产生约3.5mg/l浓度的B12。含质粒pXL435的G2650[Tet]菌株(即只有克隆载体用于质粒pER1的构建)不产生B12：因而来自质粒pBBW1的6.8kb DNA片段的存在是产生B12的原因。
因此，从质粒pBBW1纯化的6.8kb BamHⅠ DNA片段赋予脱氮假单胞菌G2650[Tet]菌株以在PS4培养基中生产维生素B12的能力。
3.4亚克隆
借助中间构建物，将含bluE和bluF基因的6.8kb BamHⅠ DNA片段的不同区域亚克隆到克隆载体pXL435中，产生了质粒pER2和pER3。
12.9kb的质粒pER2(图2)含有从质粒pBBW1纯化的已克隆在载体pXL435中的2.1kb EcoRⅠ/ClaⅠ片段。该DNA片段已预先克隆在质粒pBluescript Ⅱ SK+(Stratagene)的EcoRⅠ/ClaⅠ位点，然后从该重组质粒以BamHⅠ/SalⅠ DNA片段的形式纯化，用于克隆至载体pXL435中。
11.9kb的质粒pER3(图3)含有从质粒pBBW1纯化并克隆至载体pXL435中的1.2kb PstⅠ片段。该片段已预先克隆至质粒pBluescript ⅡSK+的PstⅠ位点，然后从该重组质粒以BamHⅠ/SalⅠ限制片段的形式纯化，用于克隆至载体pXL435中。
质粒pAHW25(Pollich和Klug,1995a)含有从质粒pBBW1纯化的并克隆至载体pRK415(keen等，1988)中的1.6kb EcoRⅠ/EcoRⅤ片段：基因bluE在该载体的lac启动子控制下转录。
通过与含有质粒pER2或pER3的大肠杆菌株S17-1接合将这些质粒导入脱氮假单胞菌G2650[Tet]菌株中。在利福平、四环素和青紫霉素存在下，将含有质粒pER2、pER3或pXL435的G2650[Tet]克隆在5ml PS4培养基中培养。质粒pAHW25和pRK415通过与含有这些质粒的大肠杆菌S17-1株接合被导入了脱氮假单胞菌G2650[Tet]株中。含质粒pAHW25或pRK415的G2650[Sp]株的克隆在利福霉素、青紫霉素和壮观霉素存在下在25ml PS4培养基中培养。30℃搅拌(250rpm)下发酵140小时后，用微生物测定法和HPLC测定产生的钴胺素的量。
如表4中所示结果表明，只有含质粒pER2或pAHW25的G2650株的克隆能够在PS4培养基中产生维生素B12。
表4
| B12的微生物定量测定 | B12的HPLC(mg/l) | ||
| 菌株G2650[Tet] | - | 0 | |
| 菌株G2650[Sp] | - | 0 | |
| 含质粒pXL435的菌株G2650[Tet] | 123 | --- | 000 |
| 含质粒pER2的菌株G2650[Tet] | 1234567 | ++++++++++++++ | 7.45.37.93.55.26.87.2 |
| 含质粒pER3的菌株G2650[Tet] | 12345678 | -------- | 00000000 |
| 含质粒pRK415的菌株G2650[Sp] | 1234 | ---- | 0000 |
| 含质粒pAHW25的 | 1 | ++ | 3.0 |
| 菌株G2650[Sp] | 2345678 | ++++++++++++++ | 2.23.02.92.93.33.12.4 |
实施例4:blu B基因参与5,6-二甲基苯并咪唑(DBI，一种B12的已知前体)的生物合成
荚膜红细菌BB1株是通过在bluB基因中插入一种插入子(inperposon)而获得的突变菌株：这是一种bluB-株(Pollich等，1995)。在100ml锥形烧瓶中70ml RA培养基中10μg/ml卡那霉素和不同浓度的DBI存在下培养BB1菌株。30℃搅拌(100rpm)下发酵24-48小时后，用微生物测定法测定在不同条件下该菌株产生的钴胺素的量。表5中概括的结果表明，非B12生产菌BB1突变株在RA培养基中只有当其中存在至少14nM DBI时才合成B12。因而bluB基因参与5,6-二甲基苯并咪唑的生物合成。
表5
| 培养基中DBI的浓度，nM | 0 | 7 | 14 | 35 | 70 | 140 | 350 |
| 产生B12 | - | - | + | ++ | +++ | ++++ | +++++ |
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Claims (11)
1．一种利用钴胺素的原核微生物产生菌发酵的钴胺素生物合成方法，其特征在于：
-使用被编码参与O-磷酸-L-苏氨酸生物合成途径的一种酶的至少一个DNA片段转化的微生物，在允许所述酶表达和钴胺素产生的条件下培养该微生物；和/或
-在所述微生物的培养基中加入O-磷酸-L-苏氨酸，或
-使用被编码参与5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径的一种酶的至少一个DNA片段转化的需氧微生物，在允许所述酶表达和钴胺素产生的条件下需氧培养所述微生物。
2．根据权利要求1的方法，其中使用被一种DNA片段转化的微生物，该DNA片段编码参与O-磷酸-L-苏氨酸的生物合成途径的多肽，并含有荚膜红细菌的bluE和bluF基因，或与所述bluE和bluF基因同源的和/或杂交的并具有编码一种参与O-磷酸-L-苏氨酸生物合成途径之酶功能的片段。
3．根据权利要求1的方法，其中使用被一种DNA片段转化的微生物，该DNA片段编码参与5,6-二甲基苯并咪唑的生物合成途径的一种酶，并含有荚膜红细菌的bluB基因，或与所述bluB基因同源的和/或杂交的并具有编码一种参与5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径之酶功能的片段。
4．根据权利要求2或3的方法，其特征在于所述DNA片段包含质粒pER1的6.8kb BamHⅠ片段。
5．根据权利要求2的方法，其特征在于所述DNA片段包含质粒pER2的2.1kb EcoRⅠ/ClaⅠ片段。
6．根据权利要求2的方法，其特征在于所述DNA片段包含质粒pAHW25或质粒pER2的1.6kb EcoRⅠ/EcoRⅤ片段。
7．根据权利要求1-5之一的方法，其用于制备维生素B12。
8．根据权利要求1-7之一的方法，其特征在于所述微生物是一种脱氮假单胞菌或放射状土壤杆菌的菌株。
9．一种制备钴胺素原核微生物生产菌的重组菌株的方法，其特征在于用遗传工程技术以权利要求1-6中定义的编码一种参与O-磷酸-L-苏氨酸或5,6-二甲基苯并咪唑生物合成途径之酶的DNA的至少一个片段转化所述微生物。
10．按权利要求9的方法获得的重组微生物。
11．根据权利要求10的微生物，其特征在于它是一种脱氮假单胞菌或放射状土壤杆菌的菌株。
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