JP2000509992A - コバラミンを製造し得る生合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コバラミンを産生し得る生合成方法に関する。より詳細には本発明は、組換えＤＮＡ技術及び／またはコバラミンの新規な前駆物質の添加によってコバラミンの産生を増加させる方法、より特定的にはＢ１２補酵素の産生を増加させる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 コバラミンを製造し得る生合成方法 本発明は、コバラミンを製造し得る生合成方法に関する。より詳細には本発明 は、組換えＤＮＡ技術及び／または新規なコバラミン前駆物質の添加によってコ バラミンの産生を増加させる方法、特にＢ１２補酵素の産生を増加させる方法に 関する。最後に本発明は、本発明のコバラミンの製造方法に有用な組換え菌株の 作製方法に関する。 ビタミンＢ１２はコバラミンと呼ばれる分子のクラスに属しており、その構造 は特に国際特許ＷＯ９１／１１５１８に開示されている。 コバラミンはほぼ例外なく、同じく国際特許ＷＯ９１／１１５１８に記載され た複合プロセスによって細菌から合成されている。生合成メカニズムが極めて複 雑であるため、工業的レベルのコバラミンの産生、特にビタミンＢ１２の産生は 主として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｒｏｐｉ ｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ 及びＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ のような細菌の大量培養によって行われている。 また、いくつかの微生物が、アミノレブリン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオ ニン、コバルト、グルタミン、Ｒ１−アミノ−２−プロパノール及び５，６−ジ メチルベンズイミダゾールの基質からコバラミンを合成することも公知である。 上記に挙げた前駆物質のうちで、５，６−ジメチルベンズイミダゾールは、コ バラミン産生性微生物によって合成される。５，６−ジメチルベンズイミダゾー ルの生合成には２つの経路が存在すると考えられる。一方の経路は、分子酸素を 利用する好気性微生物に特有の経路である。他方の経路は、嫌気性微生物によっ て使用される経路である。嫌気性経路に関与する遺伝子だけが単離されている。 この遺伝子は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉ ｕｍ）のｃｏｂＴ遺伝子である（Ｔｒｚｅｂｉａｔｏｗｓｋｉら，１９９４）。 ５，６−ジメチルベンズイミダゾールを合成する好気性微生物の遺伝子は現在ま で全く同定されていない。多くの場合、微生物によって合成される５，６−ジメ チルベンズイミダゾールの量には限界がある。 このため、５，６−ジメチルベンズイミダゾールを化学的に 製造して産生用培地に添加している。従って、培地に対するこのような添加の必 要をなくすことができれば有利になることは確かである。 従来のどのようなコバラミンの工業的製造方法も、コバルト及び５，６−ジメ チルベンズイミダゾール以外の前駆物質の添加に言及したことはない。最近にな って、培地がＲ１−アミノ−２−プロパノールを含有するときにだけコバラミン を産生するいくつかの菌株が記載された（Ｃｒｏｕｚｅｔら，１９９０、Ｇｒａ ｂａｕら，１９９２）。従って、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールもコバラミン の産生を増進するために使用し得るであろう。しかしながら、この物質は、工業 的発酵に使用できるとしても、その使用が難しく費用も高い。その理由の１つは 、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールが刺激性及び揮発性の物質であるからであり 、いま１つの理由は、この物質が微生物の増殖を阻害するからである。従って、 Ｒ１−アミノ−２−プロパノール残基以外の、上記の欠点を有していないコバラ ミンの前駆物質を見つけることが特に有益であると考えられる。この観点から、 幾つかの微生物ではＬ−トレオニンからアミノアセトンを経由してＲ１−アミノ −２−プロパノールを生合成する経路 が存在することは開示されている。しかしながら、Ｌ−トレオニンは上記に引用 した菌株を補完することができない。 より一般的に、コバラミンの産生を増進するためには、培地中のコバラミンの 前駆物質の量を増加させるのが有利であろう。コバラミンの前駆物質が制限的で ある場合には特にこのような増加が有利である。この方法は、制限的前駆物質ま たはその誘導体もしくはその類似体の１つを培地に直接添加することによって、 あるいは、遺伝子技術、特に組換えＤＮＡ技術を使用して産生性菌株中でこの前 駆物質のｉｎ ｓｉｔｕ合成を増進することによって行う。 従って、コバラミンの産生を増進するために重要な段階は、コバラミン及びそ の前駆物質の生合成経路を明らかにすることである。 最近には、ビタミンＢ１２の生合成経路の大部分の段階がＰｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ で解明された（Ｂｌａｎｃｈｅら，１９９５ ）。コバラミンの生合成に関与する２２個以上のｃｏｂ遺伝子が単離され、これ らの遺伝子によってコードされたポリペプチドの殆どについてその機能が同定さ れた。 別の微生物においても、コバラミンまたはその前駆物質の生合成に関与すると推 測される別の遺伝子が単離された。これらの遺伝子の殆どについてその機能は未 だ解明されていない。これらの遺伝子の機能またはその効果を正確に決定するこ とさえできれば、これらの遺伝子の応用が可能になるであろう。例えば、通性光 合成細菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ中で、光合成器官の形 成に必要な少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが最近になって配 列決定された（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９３、Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ） 。単離された８個の遺伝子のうちの５個の遺伝子が、前述のＰ．ｄｅｎｉｔｒｉ ｆｉｃａｎｓ の２２個のｃｏｂ遺伝子のうちの５個の遺伝子に高度な相同性を有 するという理由でコバラミンの生合成遺伝子であると示唆された。逆に、残りの ３つの遺伝子、即ちｂｌｕＢ遺伝子、ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子に関し ては、これらの遺伝子が直接に担当する正確な機能を明らかにすることができな かった。それらのプロモーター配列を含むｂｌｕＢ遺伝子、ｂｌｕＥ遺伝子及び ｂｌｕＦ遺伝子は、Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａによってその配列が決定され 開示された。 本発明によって、コバラミンの新規な前駆物質が知見された。その結果として 本発明は、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを含有する培地によってコバラミンの産 生を増進することに成功した。これまでに記載されたことのないこのコバラミン の前駆物質は、既に公知であった別の前駆物質Ｒ１−アミノ−２−プロパノール と同等の機能を有している。しかしながら、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンは、無 毒の物質である、及び、取り扱い容易な物質である、という点でＲ１−アミノ− ２−プロパノールよりも有利である。更に、コバラミンの産生増進に対してＯ− ホスホ−Ｌ−トレオニンが示す効率は、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールが示す 効率の１，０００倍以上である。 本発明の目的はまた、コバラミンの産生増進を達成するためまたは所与の細胞 のＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンもしくは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの ｉｎ ｓｉｔｕ合成もしくはこのような合成の増進を達成するために、Ｒｈｏｄ ｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ のＤＮＡフラグメントを使用することで ある。 本発明によれば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの、特にｂ ｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含むＤＮＡフラ グメントを使用することによって、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールまたはＯ− ホスホ−Ｌ−トレオニンを含有しない培地においてコバラミンの産生を増進する ことが可能であった。 最後に、本発明によれば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの 、特にｂｌｕＢ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを導入することによって、５， ６−ジメチルベンズイミダゾールを含有しない培地においてコバラミンの産生を 増進することが可能であった。 本発明の１つの目的は、コバラミン産生性原核細胞微生物の発酵によるコバラ ミンの生合成方法を提供することである。本発明によるこの方法の特徴は、 −Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする少な くとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物を使用し、前記 酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記微生物を培養する段階、及 び／または、 −前記微生物の培養培地にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを添加する段階、また は、 −５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与 する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換さ れた好気性微生物を使用し、前記酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下 で前記好気性微生物を培養する段階、 を含むことである。 微生物は、上記に特定した遺伝子を内在的に含んでいてもよい。この場合には 、本発明方法によって酵素が超発現し得る。しかしながらまた、微生物がこの種 の遺伝子を内在的に含んでいなくてもよい。 “Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの 生合成経路に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメント”なる表現は、この ＤＮＡフラグメントの発現によってＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたは５，６− ジメチルベンズイミダゾールが細胞内で合成され、場合によってはその後に培養 培地中に遊離されることを意味する。 培養は、バッチ培養でもよく、または、連続培養でもよい。また、コバラミン の精製は既存の工業的方法によって行うことができる（Ｆｌｏｒｅｎｔ，１９８ ６）。 １つの実施態様においては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ のｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含みＯ−ホスホ− Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡフラグ メントによって形質転換されたか、または、相同フラグメント、即ち、これらの ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子とハイブリダイズし且つこれらの遺伝子と同 様にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする機能 を有しているフラグメントによって形質転換された微生物が使用される。 別の実施態様においては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの ｂｌｕＢ遺伝子を含み５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与 する酵素をコードするＤＮＡフラグメントによって形質転換されたか、または、 相同フラグメント、即ち、このｂｌｕＢ遺伝子とハイブリダイズし且つこの遺伝 子と同様に５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素を コードする機能を有しているフラグメントによって形質転換された微生物が使用 される。 本発明は、天然、合成または組換えによって得られたＤＮＡフラグメント及び 相同フラグメントの使用を含む。フラグメントなる用語は、遺伝コードの縮重性 に由来するフラグメント、 または、少なくとも２５％の配列相同性を有しており同じ機能のポリペプチドを コードするフラグメントを意味する。 好気性条件下で培養される微生物を使用し、５，６−ジメチルベンズイミダゾ ールの好気性条件下の生合成経路に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメン トを使用するのが好ましい。 本発明の目的はまた、遺伝子工学技術を用い、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンま たは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコード する少なくとも１つの上記のようなＤＮＡフラグメントによって微生物を形質転 換させることを特徴とするコバラミン産生性原核細胞微生物の組換え菌株の製造 方法を提供することである。 また、本発明の菌株の製造方法によって得られた組換え菌株を提供することも 本発明の目的の１つである。 ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含み、１つまたは複 数のこれらの配列が発現シグナルのコントロール下に配置されている組換えＤＮ Ａを本発明方法に使用することも本発明に包含される。 この観点から、特に、ＤＮＡ配列の５’にプロモーター領域を配置し得る。こ のような領域は、ＤＮＡ配列に同種 （ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の領域でもよくまたは異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕ ｓ）の領域でもよい。特に、強い細菌プロモーター、例えば、大腸菌のトリプト ファンオペロンのプロモーターＰｔｒｐもしくはラクトースオペロンのプロモー ターＰｌａｃ、ラムダバクテリオファージの左もしくは右のプロモーター、コリ ネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のような細菌のファージの 強いプロモーター、大腸菌のプロモーターＰｔａｃのようなグラム陰性菌中で機 能性のプロモーター、プラスミドＴＯＬのキシレンの異化遺伝子のプロモーターＰｘｙｌＳ 、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアミラーゼのプ ロモーターＰａｍｙを使用し得る。また、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセ ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼまたはエノラーゼをコ ードする遺伝子のプロモーターのような、酵母の解糖遺伝子に由来のプロモータ ーも例示し得る。これらのプロモーターは、組換えＤＮＡを真核細胞宿主に導入 するときに使用できる。また、ＤＮＡ配列の５’端にリボソーム結合部位を配置 してもよい。この部位は、同種部位でもよく、または、ラムダバクテリオファー ジのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位のような異種部位 でもよい。 転写の終結に必要なシグナルはＤＮＡ配列の３’に配置され得る。 本発明方法で使用される組換えＤＮＡは、選択された発現シグナルに適合性の 宿主細胞に直接導入されてもよく、または、問題のＤＮＡ配列を宿主細胞に安定 に導入できるようにプラスミドベクターにクローニングされてもよい。 本発明方法は公知の方法と同様に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含 むプラスミドの使用を包含する。更にこれらのプラスミドは公知のプラスミドと 同様に、機能性複製系と選択マーカーとを含む。 多様な種類のベクターを使用し得る。本発明の範囲内では、ＲＫ２型のベクタ ー、即ち、ＲＫ２複製起点を有するベクターを使用するのが好ましい。特定例と しては、ベクターＲＫ２（Ｓａｕｒｕｇｇｅｒら，１９８６）、ベクターｐＸＬ ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９）、ベクターｐＲＫ２９０（米国特許第４ ，５９０，１６３号、Ｄｉｔｔａら，１９８５）、及び、ベクターｐＸＬ１６３ ５（国際特許ＷＯ９１／１６４３９）を挙げることができる。特に有利なベクタ ーはベクターｐＸＬ １６３５である。その他のベクターは国際特許出願ＷＯ９１／１６４３９に記載 されている。 変形実施態様においては、後出の実施例に記載したように、２種類の前駆物質 、即ち、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及び５，６−ジメチルベンズイミダゾール の合成をコードするプラスミドｐＥＲ１（図１）の６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラ グメントから成るＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物が使用され る。 Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの合成に関与するポリペプチドの発現に特に好適 な実施態様では、後出の実施例に記載したようなプラスミドｐＥＲ２（図２）の ２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントから成るＤＮＡフラグメントが 使用される。 Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの合成に関与するポリペプチドの発現に特に好適 な実施態様では、後出の実施例に記載したようなプラスミドｐＥＲ２（図２）の １．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから成るＤＮＡフラグメント が使用される。 ５，６−ジメチルベンズイミダゾールの合成に関与するポリ ペプチドの発現に特に好適な別の実施態様では、後出の実施例に記載したような プラスミドｐＥＲ１の６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントから成るＤＮＡフラ グメントが使用される。 本発明によって使用され得る宿主原核細胞微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ 、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ 、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｔｏｔｉあるいはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅ ｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ 属の細菌である。他の細菌は国際特許ＷＯ９１／１１ ５１８に記載されている。 いずれにしても、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓまたはＡ．ｒａｄｉｏｂａ ｃｔｅｒ 属の細菌の使用が特に有利である。 本発明の別の特徴及び利点は以下の詳細な記載より明らかにされるであろう。 実施例１及び２は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓま たはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株の培養培地にＯ−ホ スホ−Ｌ−トレオニンを添加することによってコバラミンを産生させるのが可能 であることを示している。実施例２は、産生培地中のＲ１−アミノ−２ −プロパノールをＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンで代替することがどのように有利 であるかを示している。同量のコバラミンを産生するために必要なＲ１−アミノ −２−プロパノールの量はＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの１，０００倍である。 実施例２はまた、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＥ 遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含む染色体の領域が、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニン の合成に関与することを示している。実施例３は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃ ａｐｓｕｌａｔｕｓ のＤＮＡフラグメントを出発材料としたｂｌｕＥ遺伝子及び ｂｌｕＦ遺伝子を含むプラスミドの構築を記載している。この実施例３は特に、 これらのプラスミドがＲ１−アミノ−２−プロパノールまたはＯ−ホスホ−Ｌ− トレオニンの添加に依存してコバラミンを産生する菌株中に導入されたときに、 Ｒ１−アミノ−２−プラスミドまたはＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン非含有の培地 でどのようにしてコバラミンを産生し得るかを示している。実施例４は、Ｒｈｏ ｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ のｂｌｕＢ遺伝子を含む染色体の領域 が、５，６−ジメチルベンズイミダゾールの合成に関与することを示している。図面の簡単な説明 図１はプラスミドｐＥＲ１の制限地図を表す。 図２はプラスミドｐＥＲ２の制限地図を表す。 図３はプラスミドｐＥＲ３の制限地図を表す。 図１から図３は夫々、プラスミドｐＥＲ１、ｐＥＲ２及びｐＥＲ３を表す。 １．菌株及びプラスミド Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ菌のＡＨ２株及びＢＢ１株（ Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ）を、３７ｂ４株（ＤＳＭ９３８）から構築した 。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０株は、ＳＢ Ｌ ２７Ｒｉｆｒ株を出発材料とし、トランスポゾンＴｎ５の挿入によって構築 した（Ｃｒｏｕｚｅｔら，１９９０）。先ず、テトラサイクリン耐性遺伝子を含 むトランスポゾンＴｎ５を用いてＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を構築した。次に、Ｇ ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を出発材料とし、トランスポゾンＴｎ５のテトラサイクリ ン耐性遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子で置換することによってＧ２６５ ０〔Ｓｐ〕株を構築した。ＳＢＬ ２７ Ｒｉｆｒ株はＭＢ５８０株に由来する （米国特許ＵＳ３，０１８，２２５）。 プラスミドｐＢＢＷ１（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ）をＲｈｏｄｏｂａｃ ｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ のＤＮＡフラグメントから構築した。プラスミド ｐＢＢＷ１からプラスミドｐＡＨＷ２５（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９ ９５ａ）を構築した。 ２．分子技術 ＤＮＡ操作の汎用技術に関しては実験概論書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９ ）を参考として使用する。 酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの研究所から入手し、製作者の指示通りに使用する。 使用した技術は本質的に以下の２段階から成る。 −制限酵素による消化、及び、 −Ｔ４バクテリオファージのリガーゼによるＤＮＡ分子の結合。 ３．形質転換技術 大腸菌の形質転換を電気穿孔によって行う（Ｄｏｗｅｒら，１９８８）。 ４．結合技術 大腸菌Ｓ１７−１株とＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの種々の菌株との結合 は、Ｓｉｍｏｎらによって記載されたプロトコル（Ｓｉｍｏｎら，１９８６）を 応用して行う。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌株の形質転換は遺伝子工学の他の任 意の技術によって行う。 ５．コバラミン産生培地の調整 Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの菌株によるコバラミンの産生に使用した培 地は、Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９、によって記載されたＰＳ４培地である。 Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株によるコバラミンの産 生に使用した培地は、Ｐｏｌｌｉｃｈ，１９９５ｂ、によって記載されたＲＡ培 地である。 ６．産生されたコバラミンの定量アッセイ 産生されたコバラミンの量を、微生物学的アッセイまたは高性能液体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定する。 −微生物学的アッセイ ビタミンＢ１２要求性の大腸菌指示株１１３−３（Ｄａｖｉｓ ＆ Ｍｉｎｇ ｉｏｌｉ，１９５０）を用い、半定量的方法 によってコバラミンの産生量を測定する。 この指示株は、Ｂ１２依存性のホモシステインメチルトランスフェラーゼ（Ｅ Ｃ２．１．１．１３）だけを有している大腸菌のｍｅｔＥ変異株である。この菌 株が最小培地中で増殖するためにはビタミンＢ１２の存在だけが必要である。（ この菌株の増殖に必要なビタミンＢ１２が欠乏した）ゲル状のＭ９最少培地（Ｍ ｉｌｌｅｒ，１９７２）の上層にこの菌株が含まれているときにビタミンＢ１２ を定量することが可能である。即ち、上層の表面にビタミンＢ１２を含む溶液の サンプルを滴下し、３７℃で１６時間インキュベーション後、滴下した箇所に円 形増殖斑が出現する。サンプルに含まれているビタミンＢ１２が拡散して、寒天 に含まれている細菌を増殖させ得るからである。円形増殖斑の直径はサンプル中 のビタミンＢ１２の濃度に比例する。 サンプルは以下のプロトコルで細胞を溶解させることによって得られる。 ２４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を 含む０．１ｍｌの溶液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ＝８、２０ｍＭのＥ ＤＴＡ、２００ｇ／リット ルのショ糖）を、０．５ｍｌの定量すべき細胞培養物と混合する。３７℃で３０ 分間インキユベーション後、３０ｇ／リットルの濃度のドデシル硫酸ナトリウム の溶液を６０μｌ添加し、混合物の渦流を数秒間維持する。得られた１０μｌの 細胞溶解液、あるいはこれを任意に１／５０に希釈した液を、上層の表面に導入 する。 −ＨＰＬＣアッセイ 高性能液体クロマトグラフィーによるコバラミンの定量方法としては、Ｂｌａ ｎｃｈｅら，１９９０、に記載された方法を使用する。実施例１ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの菌株によるコバラミン の産生に対するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの効果 １００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを用い、２μｇ／ｍｌのテトラサイク リンを含む２５ｍｌのＰＳ４培地でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ 菌Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を培養する。撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３ ０℃で２４時間発酵後、１０ｇ／リットルのＯ−ホスホ−Ｌ−トレオ ニンの溶液を、０．１６ｍｌ、０．３２ｍｌまたは１．５ｍｌの量で培地に添加 する。これらは夫々、６６ｍｇ／リットル、１３２ｍｇ／リットル及び６００ｍ ｇ／リットルの最終濃度に対応する。これらの各条件下で産生されたコバラミン の量を、１４８時間発酵後にＨＰＬＣによって定量する。結果（表１）は、Ｇ２ ６５０ＣＴｅｔ〕株がＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生しないことを示す。 これに反して、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンが培地中に存在すると、同じこの菌 株によってＢ１２が産生される。添加するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの量の増 加に伴って産生されるビタミンＢ１２の量が増加する。 実施例２ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株によるコバラミンの産生 に対するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及びＲ１−アミノ−２−プロパノールの効 果の比較 １００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを用い、１０μｇ／ｍｌのカナマイシ ンと種々の濃度のＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及びＲ１−アミノ−２−プロパノ ールを存在させた７０ｍｌのＲＡ培地でＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌ ａｔｕｓ 菌ＡＨ２株を培養する。撹拌下（１００ｒｐｍ）、３０℃で２４〜４８ 時間発酵後、種々の条件下のコバラミンの産生量を微生物学的アッセイによって 測定する。 結果を表２に示す。表中の、“−”は、指示株の円形増殖斑が存在しないこと を表し、“＋”は円形増殖斑が存在することを表し、“＋”の数が多いほど増殖 斑の直径が大きいことを表している。これらの結果は、ＲＡ培地で培養したＲ． ｃａｐsｕｌａｔｕｓ 菌ＡＨ２株がビタミンＢ１２を産生しないことを示す。こ れに反して、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたはＲ１−アミノ−２−プロパノー ルの存在下では、この菌株がビタミンＢ１２を産生し得る。これらの結果はまた 、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールによってＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンと同じ 結果を得るためには約６×１０３の添加量が必要であることを示している。 実施例３ コバラミン産生性でないＧ２６５０株中のプラスミド ＢＢＷ１に由来のＤＮＡ フラグメントの存在の効果 ３．１．プラスミドｐＥＲ１の構築（図１） ベクターｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９）のＢａｍＨＩ部位に、 プラスミドｐＢＢＷ１（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９９５）から精製し た６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをクローニングすることによっ て、１７．４ｋｂのプラスミドｐＥＲ１を構築した。３．２．Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０株へのプラスミドｐＥＲ １の導入 第一段階で、大腸菌Ｓ１７−１株にプラスミドｐＥＲ１を電気穿孔によって導 入し、第二段階で、プラスミドｐＥＲ１を含む大腸菌Ｓ１７−１株に結合させる ことによって、プラスミド ｐＥＲ１をＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株に導入し た。５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び１００μｇ／ｌのリビドマイシンに耐 性のトランスコンジュガントを選択した。分析した９個のクローンがプラスミド ｐＥＲ１を含んでいた。 同様の手順で、ベクターｐＸＬ４３５だけを含む対照Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株 を構築した。３．３．プラスミドｐＥＲ１を含むＧ２６５０株によるコバラミンの産生 プラスミドｐＥＲ１を含むタローンＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕とプラスミドｐＸＬ ４３５を含む２つのクローンとを、ＰＳ４培地中、リファンピシン、テトラサイ クリン及びリビドマイシンの存在下で培養した。撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３０ ℃で１４０時間発酵後、微生物学的アッセイ及びＨＰＬＣによってコバラミンの 産生量を測定した。結果を表３に示す。 Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株及びプラスミドｐＸＬ４３５を含む菌株の双方がＰＳ ４培地中でビタミンＢ１２を産生しないが、ｐＥＲ１を含む同じ菌株はＢ１２を 約３．５ｍｇ／リットルの濃度で産生し得る。プラスミドｐＸＬ４３５を含むＧ ２６５０〔Ｔｅｔ〕株、即ちプラスミドｐＥＲ１の構築に使用されるクローニン グベクターだけを含むＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株はＢ１２を産生しない。従って、 Ｂ１２が産生される理由は、プラスミドｐＢＢＷ１に由来の６．８ｋｂのＤＮＡ フラグメントの存在であることが判明する。 即ち、プラスミドｐＢＢＷ１から精製された６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡ フラグメントは、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔ＣＴｅｔ〕株 に、ＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生する能力を与える。３．４．サブクローニング ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含む６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフ ラグメントの領域を、クローニングベクターｐＸＬ４３５にサブクローニングし てプラスミドを作製し、中間構築物に基づいてプラスミドｐＥＲ２及びｐＥＲ３ と命名した。 １２．９ｋｂのプラスミドｐＥＲ２（図２）は、プラスミドｐＢＢＷ１から精 製されベクターｐＸＬ４３５にクローニングされた２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｃ ｌａＩフラグメントを含む。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ 部位に予めクローニングされ、次いでこの組換えプラスミドからＢａｍＨＩ／Ｓ ａｌＩ ＤＮＡフラグメントの形態で精製されてベクターｐＸＬ４３５にクロー ニングできるようにしたものである。 １１．９ｋｂのプラスミドｐＥＲ３（図３）は、プラスミドｐＢＢＷ１から精 製されベクターｐＸＬ４３５にクローニングされた１．２ｋｂのＰＳｔＩフラグ メントを含む。このフラグメントは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋のＰＳｔＩ部位に予めクローニングされ、次いでこの組換えプラスミド からＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントの形態で精製されてベクターｐＸＬ ４３５にクローニングできるようにしたものである。 プラスミドｐＡＨＷ２５（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９９５ａ）は、 プラスミドｐＢＢＷ１から精製され、ベクターｐＲＫ４１５（Ｋｅｅｎら，１９ ８８）にクローニングされた１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメント を含む。ｂｌｕＥ遺伝子はベクターのｌａｃプロモーターから転写される。 プラスミドｐＥＲ２またはｐＥＲ３を、これらのプラスミドを含む大腸菌Ｓ１ ７−１株に結合させることによってＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５ ０〔Ｔｅｔ〕株に導入した。プラスミドｐＥＲ２、ｐＥＲ３またはｐＸＬ４３５ を含むＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株のクローンを、５ｍｌのＰＳ４培地中、リ ファンピシン、テトラサイクリン及びリビドマイシンの存在下で培養した。プラ スミドｐＡＨＷ２５及びｐＲＫ４１５を、これらのプラスミドを含む大腸菌Ｓ１ ７−１株に結合させることによってＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５ ０〔Ｓｐ〕株に導入した。プラスミドｐＡＨＷ２５またはｐＲＫ４１５を含むＧ ２６５０〔Ｓｐ〕株のクローンを２５ｍｌのＰＳ４培地中、リファンピシン、リ ビドマイシン及びスペクチノマイシンの存在下で培養した。撹拌下（２５０ｒｐ ｍ）、３０℃で１４０時間発酵後、コバラミンの産生量を微生物学的アッセイ及 びＨＰＬＣによって測定する。 表４に示した結果は、プラスミドｐＥＲ２またはｐＡＨＷ２５を含むＧ２６５ ０株のクローンだけがＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生し得ることを示す。 実施例４ ｂｌｕＢ遺伝子は、Ｂ１２の既知の前駆物質である５，６−ジメチルベンズイミ ダゾール（ＤＢＩ）の生合成に関与する。 Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓは、ｂｌｕＢ遺伝子にインタ ーポゾンを挿入することによって得られた突然変異株である。この株はｂｌｕＢ −である（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５）。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラ スコを用い、７０ｍｌのＲＡ培地中、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び種々の 濃度のＤＢＩの存在下でＢＢＩ株を培養する。種々の条件下でこの菌株によって 産生されるコバラミンの量を、撹拌下（１００ｒｐｍ）、３０℃で２４〜４８時 間発酵後に、微生物学的アッセイによって測定する。表５にまとめた結果は、突 然変異株ＢＢ１がＲＡ単独培地中ではＢ１２産生性でないが、培地中に１４ｎＭ 以上のＤＢＩが存在するときにはこの分子を合成することを示す。従って、ｂｌ ｕＢ遺伝子は５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成に関与する。 ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ 1.Davis B.D.et E.Mingioli(1950),J.Bacteriol.60:17-28 2.Dower W.J.,J.F.Miller et C.W.Ragsdale(1988)Nucl.Acids Res.16:612 7-6145RefＭ9 3．Sambrook J.，E.F．Fritsch et T．Maniatis(1989)Molecular cloning ，a laboratory manual,second edition Enzymology 118:640-659 5.Blanche F.,D.Thibaut,M.Couder,et J.C.Muller(1990),Anal.Biochem. ，189：24-29 6．Blanche F.，B．Cameron，J．Crouzet，L．Debussche，D．Thibaut，M .Vuilhorgne,FJ.Leeper,et A.R.Battersby(1995)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34 ：383-411 7.Cameron B.，K．Briggs，S．Pridmore，G．Brefort,et J．Crouzet(198 9)J.Bacteriol.,171：547-557 8．Crouzet J.，L．Cauchois，F．B1anche，L．Debussche，D．Thibaut,M .C.Rouyez，S．Rigault,J.F.Mayaux,et B．Cameron(1990)J．Bacteriol.，172： 5968-5979 9.Grabau C.,et J.R.Roth(1992)J.Bacteriol.,174：2138-2144 10.Pollich M.,S.Jock,et G.Klug(1993)Mol.Microbiol.,10：749-757 11.Pollich M.,et G.Klug(1995a)J.Bacteriol.,177：4481-4487 13．Florent J.，(1986)，Vitamins，Biotechnology，vol．4，VCH Verl agsgesellschaft mbH,Weinheim,In H.-J.Rehm and G.Reed(ed.),115-158 14.Ditta G.,Schmidhauser T.,Yakobson E.,Lu P.,Liang X.W.,Flnlay D. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 クルーゼ，ジヨエル フランス国、エフ―92330・ソー、リユ・ ミシエル・ボワザン、12 (72)発明者 ドウビユツシユ，ロラン フランス国、エフ―91200・アテイス・モ ンス、アブニユ・ジヤン・ジヨレス、112 (72)発明者 テイボー，ドウニ フランス国、エフ―75013・パリ、リユ・ ジヤン・コリ、28 (72)発明者 レミ，エリザベト フランス国、エフ―75005・パリ、ブルバ ール・サン・マルセル、38・ビス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コバラミン産生性原核細胞微生物の発酵によるコバラミンの生合成方法であ って、 Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする少なく とも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物を使用し、前記酵 素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記微生物を培養する段階、及び ／または、 前記微生物の培養培地にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを添加する段階、または、 ５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードす る少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された好気性微生物を 使用し、前記酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記好気性微生物 を培養する段階、 から成ることを特徴とするコバラミンの生合成方法。 ２．Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌ ｕＦ 遺伝子を含みＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与するポリペプ チドをコードするＤＮＡフ ラグメントによって形質転換されるか、または、相同フラグメント、及び／また は、前記ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子とハイブリダイズし且つＯ−ホスホ −Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする機能を有しているフ ラグメントによって形質転換された微生物を使用することを特徴とする請求項１ に記載の方法。 ３．Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＢ遺伝子を含み５ ，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードするＤ ＮＡフラグメントによって形質転換されるか、または、相同フラグメント、及び ／または、前記ｂｌｕＢ遺伝子とハイブリダイズし且つ前記遺伝子と同様に５， ６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードする機能 を有しているフラグメントによって形質転換された微生物を使用することを特徴 とする請求項１に記載の方法。 ４．前記ＤＮＡフラグメントが、プラスミドｐＥＲ１の６．８ｋｂのＢａｍＨＩ フラグメントから成ることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。 ５．前記ＤＮＡフラグメントが、プラスミドｐＥＲ２の２．１ ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントから成ることを特徴とする請求項２に 記載の方法。 ６．前記ＤＮＡフラグメントが、プラスミドｐＡＨＷ２５またはプラスミドｐＥ Ｒ２の１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから成ることを特徴と する請求項２に記載の方法。 ７．請求項１から５のいずれか一項に記載のビタミンＢ１２の製造方法。 ８．前記微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ の菌株であることを特徴 とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 ９．遺伝子工学技術を用い、請求項１から６のいずれか一項に記載のＯ−ホスホ −Ｌ−トレオニンまたは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関 与する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって微生物を 形質転換させることを特徴とするコバラミン産生性原核細胞微生物の組換え菌株 の製造方法。 １０．請求項９に記載の方法によって得られた組換え微生物。 １１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの菌株であること を特徴とする請求項１０に記載の微生物。