KR20080068042A

KR20080068042A - 신규 선택 시스템

Info

Publication number: KR20080068042A
Application number: KR1020087010565A
Authority: KR
Inventors: 프랭크 마틴; 스테파노 센치오니; 안토넬라 콜라그란데; 마리아 크리스티나 탈러; 마르코 마리아 디안드레아; 지안 마리아 로솔리니
Original assignee: 돔페 파르마 에스.피.에이.
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2008-07-22
Also published as: RU2415935C2; KR101461408B1; EP1945772B1; JP5415763B2; US20100216190A1; JP2009511006A; CN101305096A; ES2562664T3; IL190616A0; CA2624923A1; IL190616A; US8268594B2; EP1945772A1; CA2624923C; CN101305096B; RU2008112882A; WO2007039632A1; NZ567190A; PL1945772T3; AU2006298674A1

Abstract

본 발명은 항생 물질 이외의 선택 방법을 사용하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대장균 중 고농도의 이종 재조합 단백질을 생성하도록 디자인된 pyrC 유전자 상보성에 기초한 안정한 호스트/벡터 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 발현 시스템은 클로닝 단계 동안 플라스미드 함유 세포가 신속한 선택을 하도록 하고, 발효 동안 고 단백질 발현을 유발한다. 이 시스템은 특히 도입 단계 동안 강한 선택 효율을 가지고, 거의 동종이고 dswjd한 플라스미드 보유 세포 rocoptnm이 선택을 유발한다. 또한, 배양균의 생산성은 항생 물질 내성에 기초한 것보다 매우 우수하다. 높은 생산성과 조합된 이러한 향상된 벡터 안정성은 대장균 중 이종 단백질 생산을 위한 요구조건을 산업 수준까지 충족한다.

선택, 재조합 단백질, 벡터

Description

신규 선택 시스템{NOVEL SELECTION SYSTEM}

본 발명은 항생 물질 이외의 선택 방법을 이용하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 생성 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대장균(Escherichia coli) 중 고농도의 이종 재조합 단백질을 생성하도록 디자인된 pyrC 유전자 상보성에 기초한 안정한 호스트/벡터 시스템에 관한 것이다.

이종 단백질 발현 시스템은 미생물 중 관심있는 유전자를 클로닝하고 발현시키기 위해 통상적으로 플라스미드를 사용한다. 이러한 자가 복제 DNA 분절이 단백질 발현 벡터로서 사용되는 경우, 이들의 디자인은 항상 i) 자가 복제를 보장하는 복제 원점; ii) 관심있는 유전자의 전사를 구동하는 프로모터; 및 iii) 플라스미드 보유 세포의 선택을 용이하게 하는 선택 유전자에 기초한다.

선택 유전자는 일반적으로, 클로닝 단계 및 배양 성장 동안 사용되는 항생 물질에 내성을 부여하는 효소를 인코딩한다. 클로닝 동안 플레이트 중 항생 물질의 존재는, 변형 동안 플라스미드를 통합시켰던 세포를 선택하도록 하고, 단위(cfu)를형성하는 재조합 콜로니(colony)를 확인하는 것을 용이하게 한다. 액상 배양 성장의 경우, 배양 배지 중에 적절한 항생 물질을 첨가하는 것은 플라스미드 손실을 방지하고, 세포 번식을 균일하게 유지한다. 미생물의 전반적인 대사 변화(metabolic change)는 플라스미드 미보유 세포 성장을 선호하기 때문에, 시간이 경과하면 발현 벡터는 손실된다. 이것은 재조합 단백질 발현 수율을 감소시킨다. 따라서, 그 내부에 각 세포가 기생하는 동종 배양균을 가지는 경우, 발현 벡터는 재조합 단백질의 증가된 생산을 달성하는 데 매우 중요하다. 미생물을 생성하는 재조합 단백질의 점진적 희석은 재조합 단백질의 숙주 내로의 "희석"을 야기한다. 배양액(culture broth)이, 내부에서 미생물이 그 대사 산물의 대부분을 합성해야 하는 합성물과 같은 불량 배지(medium)인 경우 이 현상은 더욱 증폭된다.

플라스미드 손실을 방지하기 위하여, 항생 물질의 사용으로부터 유도된 것과 같은 선택적 압력(selective pressure)이 일반적으로 배양 배지에 인가되고, 여기서, 내성을 위한 유전자 코딩은 발현 벡터내로 클로닝된다. 가장 통상적인 시스템은 암피실린(ampicillin) 및 그 생성물이 배지 중에 존재하는 항생 물질을 가수 분해하는 관련 β-락타마제(lactamase)를 사용한다. 이러한 타입의 활동 메커니즘은 배양이 진행되고 세포 수가 증가함에 따라 배지 내 암피실린의 점진적 소멸을 유발한다. 암피실린이 정균(bacteriostatic) 약물이므로, 잔류 항생 물질 농도가 복제를 허용하는 한 플라스미드 미보유 세포(즉, 변형 세포)가 번성하기 시작한다. 이러한 지연된 성장 현상은, 일정 시간 경과 후 소위 "위성(satellite)"이 성장하기 시작하는 단위(cfu)를 형성하는 주요 콜로니 근처의 플레이트 상에서 특히 시인된다.

미변형된 세포의 지연된 성장을 방해하고, 이에 따라 주요 배양균의 동질성을 얻기 위하여, 암피실린 농도가 예비 배양(1) 중에 증가되거나 카나마이신 또는 테트라사이클린과 같은 살균 화합물에 의해 교체될 수 있다. 카나마이신은 30s 리보솜 착물과 상호 작용하고, 단백질 번역의 개시를 방지한다. 테트라사이클린은 동일한 타겟에 작용하여 폴리펩티드 합성 동안 신규 아미노산의 첨가를 블록킹한다. 후자의 전략이 매우 잘 작동하고, 세포 내 발현 벡터의 존재를 안정화하는 경향이 보다 크다.

불행하게도, 이들 발현 백터 안정화 접근법은, GMP(Good Manufacturing Practice)의 프로토콜에 따른 인간 치료를 위한 단백질을 생산하는 데 사용될 수 없다. 예를 들어, 암피실린은 알레르기 반응 문제 때문에 이들 프로토콜에서 배제되는 반면, 다른 항생 물질의 경우 정제 과정 동안 항생 물질의 제거를 예증하는 데 비준이 요구된다(2). 또 다른 고려 사항은 세대에 걸친 세포 배양 동안의 안정성 구축의 예증이다. 결과적으로 약물 내성 이외의 플라스미드 안정화 시스템이 여전히 매우 바람직하다.

hoc/sok 시스템에 의한 플라스미드 미보유 세포의 후속-차별적 사멸에 의한 플라스미드 안정화의 자연 메커니즘은 이미 문헌에 보고되었다(3). hok 유전자 생성물은 잠재적인 세포-사멸 단백질이고, 이에 반해 sok 유전자는 hok mRNA에 상보적인 소형 안티-센스(anti-sense) RNA를 인코딩한다. 이들 유전자 모두는 플라스미드 상에 위치하고, 반대 방향으로 전사된다. hok mRNA는 매우 안정하고(수 시간), 이에 반해 sok RNA는 매우 빠르게 소멸한다(30 s 미만). 플라스미드 미보유 세포 중에, 안정한 전사 hok mRNA는 잔류하고, 이 생성물은, 불안정한 hok RNA의 부재 중에 멤브레인 탈분극화에 의해 세포를 사멸시킨다(4).

선택적 압력 부존재 하의 천연 플라스미드 손실은 최소화하기 어렵고, 이에 따라 GMP에 순응하는 항생 물질 선택적 압력에 기초하지 않은 벡터 안정화의 신규 시스템이 요구된다.

플라스미드가 에피좀성(episomal)으로 잔류하고 이에 따라 박테리아성 염색체에 비해 독립적인 격리 메커니즘을 가지고, 박테리아성 재조합 단백질 생산이 대장균과 같은 원핵 생물 호스트 중에서 수행되는 경우 발현 벡터 안정성은 중요한 이슈이다. 전반적인 재조합 단백질 생산 수율이 플라스미드 존재에 의존하고, 결국 이것을 유지하는 미생물의 용량(신진대사 부하)에 의존하기 때문에 안정한 발현 벡터가 요구된다. 실험실 수준에서, 플라스미드 손실 문제는, 박테리아가 항생 물질 내성 및 결과적으로 관심 유전자를 위한 플라스미드 인코딩을 유지하도록 하는 배양 배지 중에 항생 물질을 첨가함으로써 회피할 수 있다. 반면, 인간에게 사용하기 위한 단백질 생산은 GMP에 따라 수행되어야 하는 경우, 배양 배지 중의 항생 물질의 존재는 수용될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 동종 개체(homogeneous population)로 배양을 시작하기 위하여, 박테리아를 가지는 플라스미드를 격리시키는 것이 절대적으로 요구된다. 또한, 세포 배양 동안, 선택적 압력은 플라스미드 미보유 세포의 성장을 방지할 것이다. 이것은 숙주 단백질만을 생산할 것이고, 원하지 않는 "오염물"로 고려될 수 있다. 마스터 세포은행 및 제조용 세포은행(Master and Working cell banks)이 실현되는 동안 지금까지 항생 물질 선택이 사용되었고, 동종 개체로부터 시작하여 세포 배양 동안 항생 물질이 생략되어 플라스미드가 이탈되도록 하였다. 따라서, 전체 공정 동안 선택적 압력을 유지하기 위 해 항생 물질 내성에 기초하지 않은 시스템을 발전시키는 것이 편리할 것이다.

상술한 고려 사항에 기초하여, 본 발명자들은 GMP 생산에 적합하고, 미생물 성장이 선택적 최소 배지 내 플라스미드 존재에 엄격하게 의존하는 숙주/벡터 커플에 기초한 신규 선택 시스템을 개발하였다. 최소 배지는 다양한 소스로부터 예를 들어 BSG 또는 GMO를 함유하지 않기 때문에 최소 배지는 인간이 사용하기 위한 단백질 생산에 유용하다. 다른 장점은 산소 전달율을 촉진하는 이들 배지의 낮은 발포(foaming) 성향 및 미생물 성장을 위한 탄소원 부과 가능성이다. 대장균 신진대사는 매우 깊이 특징화되어, 다양한 변종(strain)을 이용할 수 있고, 이용가능하거나 바람직한 탄소원을 고려하는 상보성 실험을 위한 최적의 변종을 이들 중에서 선택할 수 있다.

첫번째 시도에서, β-갈락토시다제(galactosidase) 효소가 단순 숙주/벡터 상보성 듀오(complementing duo)의 구축을 위한 선택 후보로서 확인되었다. 락토오즈 신진 대사 중 이러한 핵심 효소(key 효소)는 락토오즈를 글루코스 및 갈락토오즈로 가수분해시키고, 이들은 추가로 신진 대사된다. β-갈락토시다제의 N-말단부의 아미노산 잔류물은 이러한 특정 효소에 대한 활성 4차 배위를 나타내는 4합(tetramerization)에 책임이 있다. 수년 동안 발생한 다수의 돌연변이 중, M 15 β-갈락토시다제는 11 내지 41 잔기가 결실(deletion)된 것을 나타내는 절단형(truncated form)이다. M 15 돌연변이는 불활성 이합체이지만, lacZ α-펩티드를 첨가하여, 결실된 잔기를 함유하는 활성 4합체 형체로 보완되고, 다수의 클로닝 벡터 내에 존재할 수 있다(11; 12). 이 상보성은 클로닝을 위하여 수년 동안 사용되어 왔으나, XLI 대장균 변종 성장 상에 선택적 압력을 발휘하거나 이것이 플라스미드를 유지하도록 하지는 못한다. 이를 예증하기 위해 XLI 변종 및 XLl::pUCI9를 탄소 소스로서 락토오즈와 함께 최소 배지 상에 위치시켰다. β-갈락토시다제 활성이 부족한 XLI 변이된 변종 단독으로는, 플레이트 상에 존재하는 유일한 탄소원이었던 락토오즈를 신진대사하는 능력 부족에 기인하여 성장할 수 없었다. 상업적으로 이용가능한 PUC 19 플라스미드에 의해 인코딩된 lacZ α 펩티드에 의해 트랜스 상보화된 경우 또는 다른 탄소원(예; 글루코스)으로 최소 배지 상에 평판 배양된 경우, XLl 변종 성장을 복원하는 것이 가능하였다. 이러한 본래의 단순한 방법은 배양 배지에 임의의 추가 성분을 첨가하지 않고 매우 직접적인 방식으로 플라스미드 보유 세포가 선택되도록 한다. XLI 블루(블루) 변종 성장은 락토오즈가 유일하게 사용가능한 탄소원인 경우에만 제한되므로, 표준 LB 배지를 이용한 고전적인 방식으로 항체반응을 일으키는 세포를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 형질전환주(transformant)는 유일한 탄소원으로서 락토오즈를 이용하여 최소 배지 상에 이들을 플레이팅함으로써 선택될 수 있다.

합성 배지가 일상적으로 사용되는 경우, 이러한 자가 선택 숙주/벡터 커플은 미생물 중의 재조합 단백질의 GMP 생산을 위한 매우 매력적인 시스템이다.

락토오즈 동화는 산업상 이용하기에 가장 편리한 탄소원이 아닐 수 있으므로, 상이한 숙주/발현 벡터 유전자 상보성 듀오는 임의의 적당한 탄소원을 사용하도록 하기 위해 개발되었다. 대장균 pyrC 유전자는 신규 숙주/벡터 상보성 시스템의 개발을 위해 고려되었다. 유전자 및 이의 프로모터(promoter)는 박테리아성 염색체로부터 PCR 증폭되었고, 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 이 유전자는, PyrC 리보좀 결합 부위에 오버랩되고, PyrC 발현의 억제를 위하여 요구되는 PyrC 전사의 5' 말단에 헤어핀(hairpin)을 형성함에 의해 박테리아 세포질의 피리미딘 이용도에 의해 음성적으로 조절된다. 헤어핀의 형성은 CTP 및 GTP 세포간 농도에 의존한다. 피리미딘 제한 조건 하에서, pyrC 전사는 용이하게 번역되어, 고농도의 디하이드로오로타제(dihydroorotase) 합성을 유발한다.

이러한 타이트한 유전자 조절은 에너지 관점에서 유용하고 세포 신진 대사 부하를 가능한 낮게 유지하고, 불필요한 번역을 방지한다.

pyrC 유전자가 대장균 염색체 상에 존재하기 때문에, 피리미딘 합성에 연관된 유전자의 주요 부분과는 반대로 오페론의 일부로서가 아닌 분리된 유전자로서 pyrC 유전자도 선택되었다(14). 다른 가능한 후보군은 pyrD 유전자였으나, 인코딩된 단백질 위치가 멤브레인 중에 위치하였기 때문에(15), 이것의 과다-발현은 본 발명의 목적에 유해한 것이었다. pyrC 유전자 상보성을 이용한 플라스미드 안정화에 대한 데이터는 고전적인 항생 물질 내성 시스템에 비해 본 발명의 시스템에 의해 거의 동일하거나 더 나은 결과를 얻는 것이 가능하다는 것을 나타내었다. 변종의 이것은 피리미딘 염기(pyrimidic base)를 합성할 필요가 있는 경우 최소 배지 중에서 변종이 성장하는 한 변종에 인가되는 연속적인 선택적 압력에 일부 기인한다. 시스템이 DNA/RNA 합성에 영향을 미침에 따라, 변이된 대장균 세포가 발현 벡터를 잃는 경우 세포 신진 대사가 막힌다. 이 시스템은 종래 보고된 hok/sok 안정화 절차와 전혀 상이한 바, 여기서, 양 유전자는 플라스미드에 의해 인코딩되고, 플라스미드 무함유 세포 중에, 잠재적 세포 사멸 단백질에 상응하는 hok 유전자 생성물을 도입한다.

Pyr C 시스템은 박테리아성 염색체로부터 결실되고, 플라스미드 상으로 클로닝되고, 손상된 경우 변종 영양요구성(auxotrophy) 및 후속적인 성장 정지를 유도하는 천연 대장균 유전자의 트랜스 상보성이다. 이 시스템은 프롤린 아미노산의 합성에 기초한 영양요구성 상보성 시스템인 Fiedler 및 Skerra에 의해 기재된 것과 상이하다. 이러한 타입의 상보성은, 플라스미드 손실을 제거하고 JM83 대장균 변조을 생성하기 위한 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성과 함께, 저자들에 의해 제2 선택 메커니즘으로 사용된다. 변종이 이미 (많은 대장균 변종과 함께) 돌연변이를 보유하기 때문에 프로AB 유전자는 변종으로부터 의도적으로 결실되지 않고, 발현 벡터 상으로 클로닝된 이들 유전자들은 변종이 합성 배지 내에서 성장하도록 한다. 그러나 이 시스템이 발효 동안의 플라스미드 손실을 방지하는 데 단독으로 사용될 수 있는지는 예증되지 않았다. 미생물이 일정 시간 경과 후 단백질이 축적되는 배양액 중 일부 프롤린을 발견할 수 있으므로, 이것은 발효 동안 프롤린-영양요구성 단독은 충분히 선택적이지 않을 수 있다는 사실에 기인할 수 있다. 이러한 타입의 조절은 단백질 합성을 막는 반면, pyrC는 세포 신진 대사에서 보다 먼저 일어나는 RNA 또는 DNA 합성에 영향을 준다. 그러나, 주요 선택제로서 클로람페니콜의 존재하에서도 전체 생산량은 20 mgL^-1을 초과하지 않고, 이는 본 발명의 시스템보다 낮다.

Degryse는 아미노산(리신) 영양요구성에 재기초한 상보성 시스템을 보고하였다. 저자는 박테리아 세포벽 및 리신의 신진 대사성 전구체인 디아미노피멜레이트(DAP: DiAminoPimelate)이 결핍된 대장군 변종을 심사숙고하였다(17). 또한, 상보성 시스템은 다합체 형성을 감소시키고 플라스미드 안정성을 증가시키는 것으로 나타난 cer 유전자와 병행하여 사용되었다(18). 이 cer 유전자는 영양요구성 상보성 그 자체보다 더 나은 안정화 효과를 가진다. 설령 저자가 발현 벡터를 안정화하였지만, 역설적으로 재조합 단백질 발현 레벨에서는 아무런 증가가 검출되지 않았다.

유전자 상보성의 다른 시스템들은 높은 복제수의 플라스미드로부터 발현될 필요가 있는 것으로 보고되었다(19;28). 이들 시스템은, 높은 복제수의 벡터가 박테리아 변종에 너무 높은 신진 대사 스트레스를 유발하여 세포 용해를 필연적으로 유발하는 발효 공정에서는 사용하기 어렵다.

따라서, 본 발명의 제1 태양에 있어서,

(a) 효소를 인코딩하는 유전자 및 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 뉴클레오티드를 합성하는 데 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자가 부족한 숙주 세포를 변형시키고,

(b) 상기 숙주 세포를 성장시키는 것을 포함하는 재조합 단백질 생산 방법이 제공된다.

상기 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 보다 바람직하게는 박테리아, 가장 바람직하게는 대장균이다. 보다 바람직한 실시예에 있어서, 상기 효소는 PyrC 또는 이의 동족체(homologue)이다. 상기 효소에 대한 유전자는, 오페론의 부분과 반대되는 단일 유전자로서 와일드 타입(wild type) 숙주 세포로 존재하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "동족체"는 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질로서, 예를 들어 1 이상의 첨가, 결실, 치환 등을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명에 의해 포함된다.

또한, 또다른 유사한 "타입"으로 아미노산을 치환하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어 소수성 아미노산을 다른 것으로 치환할 수 있다.

본 발명의 실시자들은 아미노산 서열을 비교하기 위하여 CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고, 적당한 어느 서열에 공간을 삽입함으로써 최적의 배열을 발견한다. 최적의 배열을 위한 아미노산 확인 또는 유사성(아미노산 형태의 확인 및 보존)을 산정할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 가장 긴 신축(stretch)으로 배열하고, 그에 적합한 값으로 할당할 것이다. 따라서, 유사한 몇몇 영역이 발견되는 비교점을 획득하는 것이 가능하지만, 각각이 상이한 점수를 가진다. 이들 두 타입의 규명 분석이 본 발명에서 모두 심사숙고되었다.

동족체 및 유도체의 경우, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질로 규명한 정도는 동족체 또는 유도체가 본래의 단백질 또는 폴리펩티드의 기능을 보유해야한다는 점 보다 덜 중요하다. 그러나, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질과 60% 이상의 유사성을 가지는 상술한 동족체 또는 유도체가 제공된다. 바람직하게는 70% 이상의 유사성을 가지는 동족체 또는 유도체, 보다 바람직하게는 80% 이상의 유사성을 가지는 동족체 또는 유도체가 제공된다. 가장 바람직하게는 90% 이상의 유사성 또는 심지어 95% 이상의 유사성을 가지는 동족체 또는 유도체가 제공된다.

이 방법은 인간 단백질, 특히 항체 또는 이의 분절, 바람직하게는 Fab 분절을 생산하는 데 사용되는 것이 바람직하다. 항체 분절은 예를 들어 Fab, F(ab')₂ 및 Fv 분절을 포함한다. Fv 분절은 단일 사슬 Fv (scFv) 분자로 알려진 합성 구조물을 생산하도록 변형될 수 있다. 이것은 분자의 안정성에 공헌하는 V_h 및 V₁ 영역을 공유결합하는 펩티드 링커를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 합성 구조물은 CDR 펩티드를 포함한다. 이들은 항원 결합 결정자(determinant)를 포함하는 합성 펩티드이다. 펩티드 모방물(mimetics)도 사용될 수 있다. 이들 분자는 일반적으로, CDR 루프의 구조를 모방하고, 항원-쌍방향(antigen-interactive) 측쇄를 포함하는 입체 제한된(conformationally restricted) 유기 고리이다.

본 발명의 제2 태양에 있어서, 뉴클레오티드 합성에 요구되는 모든 효소를 인코딩하는 유전자가 결실된 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 실시예에 있어서, 숙주 세포는 BW 25113[델타]pyrC이다. 이후, 용어 [델타]는 그리스 문자 "Δ"를 의미할 수 있다.

본 발명의 제3 실시예에 있어서, 뉴클레오티드 합성에 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 제공된다. 바람직한 실시예에 있어서, 벡터는 1 이상의 프로모터 또는 다른 조절 요소(regulatory element)를 더 포함한다. 바람직한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 폴리아데닐화 서열(polyadenylation 서열), 인핸서 요소(enhancer element), 및 전사 종결 인자(transcription terminator) 등과 같은 유전자 발현의 조절에 포함된 핵산 서열의 다른 요소를 의미한다. 적합한 서열들은 당업자에게 널리 알려져 있다. 벡터는 벡터의 복제를 위해 요구되는 서열, 예를 들어 복제 원점도 함유한다. 벡터는 복수의 클로닝 부위를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제4 태양에 있어서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 상기 재조합 단백질의 발현 방법에 사용되는 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 제4 태양은,

(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 숙주 세포; 및

(b) 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 재조합 단백질을 발현하기 위한 키트를 제공한다.

도 1은 테트 선택 내성에 기초한 DoB 0114 Fab 발현 벡터의 지도이다.

도 2는 PyrC 상보성 안정화에 기초한 DoB 0138 Fab 발현 벡터의 지도이다.

도 3은 PyrC 안정화 시스템(DoB 0138-실선) 및 테트 안정화 발현 벡터(DoB 0114- 점선)에 상응하는 2개의 발효 상등액의 SP-Sepharose Fast 유량 컬럼(Amersham Biosciences) 용출을 나타낸 것이다.

도 4는 발현 벡터는 PCR 검출을 나타낸 것이다: 도입 이후 0, 5, 및 26 시간에 발효 동안 샘플을 수확하였고, 성장을 보상하기 위하여 용액을 0.1 OD_600nm로 조정하였다. 재료 및 방법에 기재한 바와 같이 PCR을 수행하여 발현 벡터의 존재에 대하여 체크하였다.

도 5는 PCR 증폭 및 Fab 분절을 클로닝하기 위한 카세트 어셈블리 개략도이다.

본 발명은 이후에 설명하는 실험예들을 참조하여 상세히 설명될 것이다. 본 발명의 각 태양의 바람직한 특징은 다른 태양의 각각에 필요한 변경을 가한 것 일 수 있다. 본 명세서에 언급된 선행 기술 문헌은 법에 의해 최대 한도로 허용된 만큼 참조 인용된다.

실험예 1

미생물, 예를 들어 대장균이 세포 성장 동안 발현 벡터를 유지하도록 강제하도록 선택적 압력으로서 유전자 상보성을 사용하는 것이 가능하다는 점이 처음으로 예증되었다. 이러한 목적을 위해, 양자 모두 상업적으로 이용가능한 대장균 XLI-블루 변종(5) 및 pUC 19(6) 발현 벡터는 유전자 상보성 분석을 수행하기에 가능한 후보로 확인되었다. XLI-블루 변종은 돌연변이 [델타](lacZ)MI5를 나타내고, β-갈락토시다제 효소의 "일-분절"의 결실에 상응한다. 상기 일 분절은 pUC 19와 같은 다수의 클로닝 벡터에 의해 인코딩되고, 유전자 상보성에 의해 β-갈락토시다제 효소적 활성을 염색체 결실(chromosomal deletion) [델타](lacZ)MI5로 표현되는 대장균 변종으로 회복할 수 있다. 이 결실을 보유하는 변종은 X-gal 플레이트 상에서 성장된 경우 무색으로 나타나지만, 펩티드 상보성이 발생한 경우, 즉, 플라스미드가 존재하는 경우 동일한 변종이 블루 표현형을 전개시킬 것이다. 어느 하나의 핸드(hand) 상의 pUC 19 클로닝 벡터는 β- 락타마제 유전자에 대하여 인코딩하고, 다른 핸드 상에는 α-펩티드 내에 위치한 다중 클로닝 사이트를 소유한다. 이러한 다중 클로닝 사이트는 의도적으로 이 영역 내로 삽입되어 리게이션(ligation) 이후 DNA 분절을 삽입한 플라스미드의 스크리닝을 용이하게 하였다. α-펩티드 내에 DNA를 삽입하면 이것의 개방 해독틀(open reading frame) 또는 접힘(folding)을 파괴하거나, β-갈락토시다제 활성을 폐지하여 X-gal 플레이트 상에서 성장한 경우 무색 표현형을 유발한다.

β-갈락토시다제는 락토오즈를 글루코스 및 β-갈락토오즈로 가수분해하고, 락토오즈 동화 통로 내 주요 효소 중 하나이다. 가설을 시험하기 위해 pUC 19로 XLI-블루 변종 박테리아를 변형시키고, 세포를 LB 한천/암피실린 상에서 평판 배양하였다.

모두 발현 벡터를 함유하는 선택된 클론은 탄소원으로 글루코스 또는 락토오즈를 함유하는 M9 최소 플레이트 상으로 전달되었다. 미변형된 변종과 병행하여 동일한 배지 상에서 성장을 측정하였다(표 1).

표 1 : β-갈락토시다제 활성 및 세포 성장 간의 상호 의존
선택적 배지 상의 성장
변종/플라스미드	LB/Amp	M9/글루코스	M9/락토오즈
XL1-블루	-	+	+
XL1-블루/pCU19	+	+	-

표 1에 나타내 바와 같이, 발현 벡터를 품고 있는 세포만이 락토오즈를 신 진대사할 수 있고, 이에 따라 그것이 이용가능한 유일한 탄소원인 경우 성장할 수 있다. 이 실험은 주요 신진 대사 효소에 대한 플라스미드 및 숙주 사이의 유전자 상보성은 세포가 발현 벡터를 유지하도록 강제하는 선택적 압력으로 성공적으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 이 단순 시스템은 플라스미드 보유 세포를 선택하기 위해 배지에 어떠한 항생 물질을 첨가하는 것도 요구하지 않고, 탄소원으로서 락토오즈와 함께 한정된 배지를 사용하는 것에 의해 의해 유일하게 한정된다.

실험예 2

상기 접근이 정확하다는 것을 예증하였지만, 재조합 단백질 생산을 위한 보다 적합한 시스템이 계획되었다. 대장균 대사의 핵심 효소는 그것이 없는 경우 최소 배지 상의 성장을 방지하지만, 풍부한 배지 상에서는 성장을 방해하지 않는 것으로 확인되었다: pyrC 유전자의 생성물인 디하이드로오로타제 효소(7)가 핵심 효소이다.

디하이드로오로타제는 디하이드로오로테이트(dihydroorotate)를 오로테이트(orotate)로 전환시키고, 이는 탈카르복실화 이후 필수 피리미딘계 뉴클레오티드인 유리딜레이트(uridylate)를 생성하는 오로티딜레이트(orotidylate)로 변형된다. 인산화 이후 UMP는 결과적으로 세포에 CTP를 제공하는 UTP로 전환된다. 따라서 이 효소를 결실시킴으로써 초기 단계에 RNA 및 DNA 합성을 막는 것이 가능하다. 복합 배지 중에서 CTP 및 UTP는 배양액 중에 이미 존재하므로, 디하이드로오로타제의 부재는 풍부한 배지 중 미생물 성장에 영향이 없는 반면 최소 배지 상의 변종 성장을 억제한다.

pyrC 유전자는 대장균 BW25113 변종의 염색체로부터 완전히 결실되어 이를 보유하는 발현 벡터로 가능한 동종 재조합을 방지하였다. 본 출원을 출원하기 이전에, 부다페스트 조약에 따라 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, Paris에 신규 변종 대장균 BW25113ΔpyrC을 기탁하였으며, 이는 CNCM I-3447이라는 지정 번호를 가진다.

이와 병행하여, 전체 pyrC 유전자와 그 자신의 프로모터를 PCR 증폭하였고, pUC18로 클로닝하여 pUCI8-pyrC를 생성하였다. 최초의 접근법으로서, 상보성 시스템을 유효화하기 위하여, pUC 18-pyrC를 BW25113ΔpyrC 변종으로 변형시키고, 결과 콜로니를 몇몇 선택적 배지 상에서 평판 배양하였다(표 2).

표 2. 최소 배지 상의 BW25113ΔpyrC 및 pyrC 존재 사이의 상호 의존성
배지 (+ 카나마이신)	BW25113ΔpyrC	BW25113ΔpyrC/pUC 18-pyrC
배지 (+ 카나마이신)	BW25113ΔpyrC	+Amp	-Amp
M9 + 글루코스	-	+	+
M9 + 아라비노스	-	_	_
LB	++	++	++

+ 또는 - 부호는 미생물이 이들 매질로 팽창하는 능력을 반영한다. 아라비노스 탄소원 상의 성장 부족은 변종의 AaraBADAH33 돌연 변이에 기인한다(재료 및 방법 참조). 변종의 카나마이신 내성은 pyrC 자리의 대장균 염색체 상의 카나마이신 내성 유전자의 삽입에 기인한다. ++ 부호는 + 하나보다 고성장과 관련된다.

이들 결과는 i) pyrC 유전자에 의해 상보화되지 않은 경우라면, 변종 BW 25113[델타]pyrC 단독으로는 최소 배지 상에서 성장할 수 없었다는 점, ii) 클로닝된 pyrC 유전자의 작용기화 및 이의 박테리아성 변종 중의 올바른 결실, iii) 아라 비노스 프로모터로부터의 유전자 발현을 위한 중요한 파라미터인 탄소원으로서 아라비노스를 사용하는 변종의 부적격을 확인시켰다.

실험예 3

최소 배지 중의 플라스키드 안정성을 체크하기 위하여 밤샘 배양액의 희석액을 LB 한천 상에서 평판 배양시켰고, 그 날 이후 몇몇 cfu를 암피실린과 함께 또는 암피실린이 제거된 M9/글루코스 최소 배지 상으로 이송시켰다.

표3. 밤샘 비양 이후의 플라스미드 안정성. 밤샘 배양 이후 세포를 적합한 밀도로 희석시키고, LB 한천 상에 평판 배양시켰다. 이어서 선택적 배지 상으로 40개의 cfu를 이송시켜 플라스미드 존재를 결정하였다.
배지	플라스미드 가공 세포의 %
M9 + 글루코스 + Amp	100
M9 + 글루코스	100

이 실험은 LB 플레이트 상에 존재하는 cfu가 최소 배지 상에서 성장할 수 있기 때문에, 플라스미드는 심지어 밤샘 배양 이후 테스트된 모든 세포 중에 존재하였다는 점을 예증하였다.

이어서, 일반적으로 변종이 발현 벡터를 던져버리도록 자극하는 재조합 단백질의 생성 동안과 같은 미생물의 고 대사 충전의 존재 중인 경우에도, 조사된 pyrC 기초 안정화 시스템이 효율적일 수 있는 지 여부를 결정하였다. 이를 위해 bla 유전자가 하나의 테트라사이클린 내성을 위해 치환된 DoB 0114(도 1) pBAD 유도 발현 벡터(Invitrogene ^TM)가 참조 플라스미드로 사용되었다. 이러한 홈 디자인된(home designed) 바이시스트로닉(bi-cistronic) 발현 벡터를 C4 인간 Fab 분절을 대장균 페리플라즘 강(periplasmic space) 내로 발현하도록 기획하였다(9). Fab 분절이 소형이고 수용성 단백질이므로, 이것은 대장균 페리플라즘 강으로부터 배양 상등 액(culture supernatant) 내로 확산되며, 여기서, 대장균이 수집되고 용이하게 정제된다.

항생 물질 내성 유전자를 pyrC로 치환함에 따라 DoB 0138 (도 2)가 DoB 0114가 유도되었다. 발현 벡터 DoB 0114 및 DoB 0138이 각각 W3110 아라 변종(10) 및 BW 25113[델타]pyrC 변종으로 변형되었다. 변형 이후 배양균을 접종하는 cfu 보유 발현 벡터를 선택하기 위하여, W3110::DoB 0114를 LB 한천/테트라사이클린 상에 평판 배양하였고, 이에 반해 BW 25113[델타]pyrC::DoB 0138는 탄소원으로서 글루코스와 함께 M9 최소 배지 상에서 평판 배양하였다. 탄소원으로서 설탕 (및 DoB 0114의 경우 테트라사이클린)이 보충된 최소 배지 중의 10ml 세이킹 플라스크 배양액을 접종하는 데 단일 cfu를 사용하였다. 30℃에서 15시간 경과 후 10ml는 동일한 배양액90ml를 인공 수정하는 데 사용하였고, 37℃에서 13시간 동안 인공 배양하였다. 100ml 세이킹 플라스크 배양액을 사용하여 1 리터의 퍼멘터(fermenter)를 접종시켰다. OD₆₀₀이 10에 도달한 경우 12 퍼센트의 플라스미드 보유 세포가 측정되었고, 5 그람의 아라비노스를 첨가함에 따라 재조합 단백질 생산이 시작되었다(T₀). 16시간 도입한 이후, OD₆₀₀이 30(T₁₆)에 도달한 경우 발효를 중단하고, 배양 상등액 중의 재조합 Fab 분절 및 단백질을 측정하였다(표 4).

표 4. 변형된 세포의 백분율 및 관련 재조합 단백질 수율의 측정
DoB	선택	% 변형 세포(T₀)	T₁₆에서의 단백질 농도(mg/L)
DoB	선택	% 변형 세포(T₀)	Fab	합계
0114	테트라사이클린*	96	1.8	464±133
0138	PyrC	98	6.6	614±95

RP-HPLC를 이용하여 Fab 농도를 측정하였으나, Bradford 분석에 의해 총 단 백질 농도를 측정하였다.

* 접종물 배양액 중에 테트라사이클린을 첨가하였으나 발효 중에 첨가하지는 않았다.

이 실험 결과는, 도입 순간에서조차 변형된 세포의 수가 양 벡터에 대하여 균일하고, 배양이 종결될 때 전반적인 DoB 0138의 생산 수율은 DoB 0114의 3배 이상인 반면 배양액 상등액에 존재하는 총 단백질 농도는 거의 변화하지 않고 잔존한다는 점을 예증한다. 이러한 결과는 도입 배양기 동안 DoB 0114에 대한 것보다 높은 DoB 0138 플라스미드 안정성에 의해 설명될 수 있다. 변형된 세포의 백분율은 이전에 기재한 바와 같이 측정하였다. 세포는 먼저 LB 한천 상에서 평판 배양하였고, 이어서 선택적 배지 상(LB 한천 + DoB 0114의 경우 테트(tet) 또는 DoB 0138의 경우 M9 글루코스)으로 이동하였다. 이 방법이 도입 이전에 완벽하게 작동하는 경우 도입된 미생물의 높은 신진 대사 충전은 그러한 극적인 방식으로 그 성장을 늦추어 플레이트 상에서 어떠한 콜로니가 성장하는 것도 거의 관찰할 수 없게 되었다. 이 가설은 LB 플레이트로부터 M9 및 M9/아라비노스 플레이트 상으로 비유도된 cfu를 평판 배양함으로써 확인하였다. M9 최소 배지 상에서 관찰된 모든 성장은 M9/아라비노스까지 확장될 수 없다. 도입된 미생물의 신진 대사 충전 향상에 기인한 이와 같이 매우 느린 성장은 도입기 동안 벡터 유지 백분율을 결정하기 위해 개개의 세포가 분리되는 것을 방해한다.

실험예 4

유전자 상보성화에 의해 안정화 시스템을 예증한 것은 고전적인 시스템보다 나은 결과를 생성하였는바, 이 번의 유가 배양(fed batch) 시스템을 포함하는 10리터 스케일 상에서 발효를 수행하여 방법 확장성(scalability)을 조사하였다. 기판 농도는 60 g/l까지 상승하였고, 퍼멘터(7.2 리터에서 시작)를 800ml의 예비 배양액으로 접종하였다. 약 17 시간의 뱃치(batch) 주기가 경과한 후, 탄소원으로써 설탕 용액 및 도입기로서 아라비노스를 공급하기 시작했다. 유가 배양 조작은 용존 산소(DO: Dissolved Oxygen) 값으로 설정되었고, 이는 50%값을 초과하는 경우 공급 펌프를 개방한다. 유가 배양을 20시간 경과한 후, 배양 OD600는 150-160에 도달하고 Fab를 함유하는 상등액이 수확된다(표 5).

표 5. 유가 배양 발효 이후 관련 재조합 단백질 수율 및 플라스미드 보유 세포의 백분율의 결정
DoB	선택	% 변형된 세포(T₀)	T₂₀에서의 단백질 농도(mg/L)
DoB	선택	% 변형된 세포(T₀)	Fab	합계
0114	테트(Tet)	100	40.2	1884 ± 180
0138	PyrC	100	84.6	1202 ± 130

이러한 결과는 이 방법의 확장성, 및 보다 많은 세대수가 경과한 이후 발현 벡터 안정성은 여전히 기대를 충족하고 있다는 점을 예증하였다. 이 경우, 유가 배양 시스템에 따라 전반적인 Fab 수율은 1리터 뱃치 배양보다 10배 우수하지만, PyrC 상보성 시스템은 여전히 DoB 0114 "고전적" 벡터의 양의 2배를 생산하고 있다.

실험예 5

Fab 생산 중의 관찰된 차이점은 변종 의존적이지 않다는 점을 예증하기 위해(즉, W3110 대 BW25113), 본 발명자들은 궁극적인 실험을 계획하였으며, 이 실험에서 2개의 발현 벡터가 BW25113 중에 변형되었다. 발효 프로토콜은 매우 조금 변 형되었으며, 도입 단계는 추가 6시간 더 연장되었다.

발효의 최종 단계에서, 상등액을 pH6으로 산성화하고, SP-Sepharose Fast 유량 컬럼에 통과시켰다(Amersham Biosciences). Fab 상승된 등전위점에 따라, 이러한 조건 및 이러한 pH에서, Fab는 수지에 의해 보유되고, 단백질의 80% 이상을 대표하는 제1 피크에서 용출하는 거의 유일한 단백질이다. 흡착 및 세척 이후 수지는 용출되었고, Fab에 상응하는 분절을 수확하였다. 실험 결과는 도 3에 보고하였다. 전반적인 Fab 생산을 PyrC 시스템에 대하여 약 100mg/리터로 평가하였고(DoB 0138-실선), TET 안정화 발현 벡터에 대하여 50% 미만의 수율을 수득하였다(DoB 0114- 점선).

발효 동안 본 발명자들은 도입 22시간 이후 공급 용액 2리터를 종결시키는 DoB 0114에 대한 보다 빠른 성장을 관찰하였으나, 반면, 같은 시간 동안 DoB 0138만이 1.35 리터를 소비하였다. 이와같이 빠른 성장률은 미생물의 보다 낮은 신진 대사 수율과 정확하게 상관하고, 상대적으로 느린 재조합 단백질의 생산 및 숙주 세포 단백질의 높은 생산과 상관한다. DoB 0114와 관련하여 사실상, FaB는 DoB 0138에 비해 상등액 중 존재하는 단백질의 현저히 낮은 백분율을 나타낸다. 2번째 경우에 있어서, 용해성 단백질의 10%로 산정되는 재조합 단백질이 이미 10% "순수한" 것이기 때문에 보다 높은 전체 재조합 단백질 수율을 가지는 것은 정제하기 용이한 물질을 제공한다.

2개의 시스템의 차이점은 pyrC의 경우 연속적인 선택적 압력이고, 본 발명자들은 발효 동안 발현 벡터의 존재에 대하여 체크하기 위하여 PCR 프로토콜을 설정 하였다. 세포 증식을 보상(이에 따라 주형하고)하기 위해 0.1 OD_600nm 까지 적절하게 표준화한 배양액으로부터 직접 발현 벡터를 PCR 증폭하기 위하여, Fab 중쇄(heavey chain)의 카르복시 말단 부분에 상응하는 한 쌍의 프라이머를 사용하였다. 도 4에 나타낸 것처럼 DoB 0138에 상응하는 부호는 발효 시간 동안 안정하지만, DoB 0113의 경우 도입 26시간 이후 희미한 인지할 수 없는 밴드까지 감소하였다.

재료 및 방법

배지

미네랄 염 배지 성분은 물과 함께 실험실 내에서 20분 동안 121℃에서 압력 살균하였다. 초기 설탕은 0.22 ㎛ 여과에 의해 분리하여 여과시키고, 생반응기에 첨가하여 40.0 g/l의 농도를 생성하고 공급기가 시작하기 이전에 작은 뱃치기(batch phase)를 생성하였다. 미리 멸균된 생반응기에 10 미리리터의 소량 원소 용액 및 비타민을 멸균 여과에 의해 첨가하였다. 흔적 요소 용액의 조성물은 다음과 같았다(g/리터): C₆H₅Na₃O₇*H₂O, 100.0; I CaCl₂*2H₂O, 3.40; ZnSO₄*7H₂O, 2.40; MnSO₄*2H₂O, 1.50; CuSO₄*5H₂O, 0.50; CoCl₂*6H₂O; FeCl₃*6H₂O, 9.70; H₃BO₃, 0.03; Na₂MoO₄*2H₂O, 0.02; KCl, 74.5. 상기 공급물은 70%의 설탕 용액을 함유하였다. 공급 도입 용액의 조성물은 설탕 70%, 비타민 및 아라비노스 였다. 거품 제어를 위하여 필요한 경우 Antifoam 204를 첨가하였다.

배양

설탕 농도 5.0 g/l를 제외하고 생반응기 배지 25 ml를 함유하는 100ml의 세 이킹 플라스크 중의 성장 세포에 의해 프라이머리 씨드 배양균(primary seed culture)을 준비하였다. 이 배양균을 15시간 동안 245rpm 및 37℃에서 배양시켰다. 프라이머리 씨드 배양균 16 ml를 400mldml 동일한 배지를 수용하는 2개의 2리터 짜리 배플 플라스크(baffled flask)에 대한 접종액으로 사용하였고, 동일한 조건에서 성장시켰다. 2차 씨드 배양균을 작동 체적 10L인 CF 3000 (Chemap) 15-1 생반응기에 전달하였다. 퍼멘터는 공기취입장치(air sparger)가 구비되어 있고, 기류는 최초 8 l/분으로 설정하였으며, 공급 시작 이후 10 l/분 까지 점차 상승시켰다. 뱃치 기간 동안 교반기 속도는 800 내지 1200 rpm까지 증가시켰고, 공급-뱃치부 동안 100 rpm까지 감소시켰다. 폴라로그래픽(polarographic) 산소 전극을 사용하여 용존 산소를 기록하였다. 퍼멘터는 pH 적정기를 구비하고, 30%(w/w) 암모니아 용액을 첨가하여 pH 6.95를유지하였다. 온도는 37℃에서 조절하였다. 공급은 초기에 첨가된 설탕을 배출한 이후 DO가 증가할 때 공급을 시작하였다. 50% 포화로 설정점이 고정된 산소 농도를 가지는 DO-STAT 조절기를 사용하여 최초 공급-뱃치기 동안 230 ml의 설탕 공급 용액을 첨가하였다. 30분 동안 동일한 DO-STAT 전략을 유지하면서, 도입제로서 아라비노스를 함유하는 공급 용액으로 시프트함에 의해 단백질 발현기를 시작하였다.

샘플링

모든 배양에 걸쳐 매시간 샘플링을 수행하였다.

분석

단백질 농도 측정: Bio-Rad 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 96/웰 마이크로플레이트 중에서 분석을 수행하였다. 점차 증가하는 량(0.25 내지 8 ㎍)의 BSA 를 포함하여 표준 단백질 농도 표준 커브를 생성하였다. 각각의 웰에 50 ㎕ 염료 용액을 150 ㎕ 샘플로 혼합하였고, 이어서, A₅₉₅는 Model 450 Microplate Reader(Bio-Rad)로 읽었다.

재조합 단백질 발현(겔 전기 이동 및 웨스턴 블롯(Western blot))

샘플은 Mini-Protean II 장치(Bio-Rad) 내에서 미세한 수정을 가하면서, Laemmeli (21)에 따라 비환원(non reducing) 15% SDS-PAGE에 놓아 두었다. 몇몇 실험에 있어서, 겔을 환원 조건 하에서 동작시켰다. 광포 분자량 표준(Bio-Rad)을 이용하여 전기영동 밴드의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 측정하였다. 1.0 mm 두께의 미니겔을 1시간 동안 50 I mA의 상태에 두고, 40% CH₃OH, 10% CH₃COOH 중에 제조된 0.02% Phast Gel Blue R (Pharmacia) 용액 중에 밤샘 착색시키고(stain), 20% CH₃OH, 5% CH₃COOH 중에 탈색시켰다(de-stain).

미세한 수정과 함께 Towbin et al(22)에 따라, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 15%의 SDS-PAGE에 놓여진 샘플을 Multiphor II 반건조 장치(Pharmacia) 중에 90분 동안 1 mA/cm²의 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 Ponceau-S 용액(Sigma, U.S.A.)으로 착색처리하였다. 관련 분자량 표준을 표시하고, 20 mM의 트리스-HCl 및 pH 7.40, 150 mM NaCl (TBS) 중에 린스함으로써 완전한 탈색 처리를 수행하였다. 멤브레인을 TBS (BT) 중에 2% BSA 밤샘 포화시키고, 이어서 BT 함유 0.05% Tween 20(BTT) 중에 Peroxidase- Conjugated Rabbit Anti-Human lambda Light Chains (DAKO)의 1:2000 희석액으로 배양하였다. 이후, 멤브레인을 BTT 중에서 10분 동안 1회, TBS 중에서 0.25% Tween 20으로 1회, TBS 중에서 수회 세척하였다. 모든 배양은 실온의 세이킹 플랫폼에서 수행하였다. 페록시다제 활성(peroxidase activity)은 SuperSignal West Fico Chemiluminescent Substrate(PIERCE)에의해 드러났다.

HPLC 분석

형광 검출기(예, λ:285nm; em λ=360nm; 이득(gain) 1000) 및 300Å 컬럼 VYDAC, Diphenyl 219TP54, 250x4.6mmID를 구비한 HPLC에 의해 15분 동안 17000xg에서 원심분리에 의한 정화 단계 이후, 발효 배양액 중의 용해성 Fab의 정량화를 수행하였다. 또한, PL Hi-Plex H 8㎛, 300 x 7.7 mm, 8 ㎛ 또는 동일한 컬럼 및 굴절률 디텍터를 구비한 HPLC를 이용하여 설탕, 아세테이트 및 아라비노스에 대하여 동일한 상등액 분취액을 분석하였다.

분자 생물학

대장균 BW25113 , Δ pyrC 변종의 구축

대장균 염색체에 한정된 결실이 이루어지도록 하는 Datsenko and Wanner에 따라 , pyrC 돌연변이가 인식되었다. BW25113(lacl^q, rrnB_T14, ΔlacZ_WJI6, hsdR514, ΔaraBA-D_AH33, ΔrhaBAD_LD78)를 선택하였다. 전체 단백질과 이의 프로모터를 제거하여 플라스미드 카피와의 동종 재조합을 회피하였다. 유전자를 결실시키는데 사용된 프라이머는 다음과 같다:

dispyrC-f: 서열 번호:1:

및 dispyrC-r: 서열 번호:2:

카나마이신 내성 유전자는, 변종 그 자체에 대한 잠재적인 양성 선택으로서 작용하는 변종 염색체로부터 제거되지 않았다.

PUC18 - pyrC :

PyrC 유전자는 후술하는 프라이머를 사용하여 대장균 염색체로부터 PCR 회복되었다.

pyrC-fwd: 서열 번호:3:

pyrC-rev: 서열 번호:4:

또한, pUC18 의 SmaI 부위에 클로닝되고 결과 벡터는 pUC-pyrC로 불렀다.

DoB 0114의 구축:

암피실린 유전자를 PBR322 중 하나인 테트라사이클린에 의해 치환함으로써 pBAD/Myc-His A,B,C 벡터(Invitrogen)로부터 벡터 DoB 0114를 수득하였다. 후술하 는 올리고뉴클레오티드 및 pHENl 발현 벡터(9)를 주형으로 사용하여 C4 발현 카세트를 조립하였다.

"PIC4" 서열 번호:5:

"P2 C4" 서열 번호:6:

"P3 C4" 서열 번호:7:

"P4C4" 서열 번호:8:

"P5 C4" 서열 번호:9:

"P6C4" 서열 번호:10:

제1 PCR 중에 프라이머 PI 및 P2를 사용하여 Fab 경쇄(light chain)를 중폭하고, 프레임 중에 StII 리더 서열을 추가하였다. 제2 PCR은 Fab 중쇄(heavy chain)를 별도로 증폭시키도록 작동되었고, StII 리더 서열 및 인터제닉 서열(intergenic sequence)을 추가하였다. 2개의 서열이 중첩되기 때문에(카툰 참조), 2개의 증폭물로부터 기인한 PCR 생성물은 제3 신장 반응에서 10 사이클 동안 혼합되며, 프라이머는 첨가되지 않는다. 신장 단계 이후, 프라이머 P5 및 P6는 PCR 에 첨가되었고, 도 5에 보고된 바와 같이 총 길이 발현 카세트가 증폭되었다.

최종 PCR 생성물이 Xhol 제한 효소로 소화되었고, Ncol (klenow) Xhol로 개방된 pBAD 벡터로 클로닝되었다. Cfu는 PCR에 의해 스크리닝되었고, 양성 클론 서열인 전체 Fab 발현 카세트에 대해 스크리닝되었다. 예상되는 서열을 나타내는 클론은 DoB 0114 (도 1)로 명명하였다.

DoB 0138의 구축:

테트라사이클린 내성을 코딩하는 DoB 0114의 Hindlll-Nrul DNA 분절을, pUC-pyrC 플라스미드를 EcoRl/klenow-Hindlll 소화에 의해 수득한 pyrC 유전자로 치환함으로써 발현 벡터를 수득하였다(도 2).

발현 벡터의 PCR 검출

세포수를 평균으로 하기 위해(normalize) 0.1 OD600nm로 희석된 배양액 샘플 상에서 발현 벡터를 검출하고/증폭하기 위해 PCR을 작동시켰다. PCR 사이클을 다음 표에 보고한 바와 같이 설정하였다.

단계	온도	시간	사이클
1	94℃	4분	1
2	94℃	1분	30
3	60℃	1분
4	72℃	1분
5	72℃	10분	1

프라이머 :

247 CH 센스 PCN 5' 서열 번호:11:

Tm = 61.4℃

248 CH AS PCN 5' 서열 번호:12:

Tm = 64.3℃

PCR 생성물은 Fab 중쇄에 대하여 약 500bp이었다.

본 발명의 발현 시스템은 클로닝 단계 동안 플라스미드 보유 세포의 신속한 선택을 가능하게 하고, 발효 동안 고 단백질 발현을 유발한다. 이 시스템은 특히, 도입기 동안 강한 선택 효율을 가지며, 거의 모든 동종 플라스미드 보유 세포 개체의 선택을 유발한다. 더구나, 배양균의 생산성은 항생 물질 내성에 기초한 것보다 훨씬 양호하였다. 이와같이 고 생산성과 연관된 향상된 벡터 안정성은 대장균의 이종 단백질 생산의 필요조건을 산업 수준까지 충족한다. 가공된 변종은 고전적인 W3110보다 Fab 생산에 대한 보다 나은 변종이라는 점을 추가로 예증하였고, pyrC 유도체가 고 세포 밀도 공급 뱃치 발효에 적합하고, 이에 따라 산업적 이용에 노출되어 있다는 점을 예증하였다.

서열 번호:13: pUC18 클로닝 벡터에 삽입된 바와 같은 PyrC 유전자의 서열

참조 문헌

1 B. Hoffman; J. A. Broadwater,; P. Johnson; J. Harper; B. G. Fox and W. R. Kenealy. Proto Exp. Punf. 6, 646-654 (1995). Lactose fed-btach overexpression of recombinant metalloproteins in Escherichia coli BL21(DE3): process control yielding high levels of metal- incorporated, soluble protein.

2 Murphy ,D.B. and Epstein,S.L. (1998) Guidance for Industry. Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy. Food and Drug Administration, Rockville, MD.

3 Gerdes K, Helin K, Christensen OW, Lobner-Olesen A. / MoI Bioi 1988 Sep 5;203(l): 119-29. Translational control and differential RNA decay are key elements regulating postsegregational expression of the killer protein encoded by the parB locus of plasmid Rl.

4 Pecota DC, Osapay G, Selsted ME, Wood TK. J Biotechnol 2003 Jan 9;100(l):l- 12. Antimicrobial properties of the Escherichia coli Rl plasmid host killing peptide.

5 Bullock, W.O., J. M. Fernandez, and J. M. Short. 1987. XII-Blue, a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta galactosidase selection. Focus 5:376-378.

6 Yanisch- Perron C; Vieira J and Messing J. Gene. 1985;33(l):103- 19. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC 19 vectors.

7 Backstrom D, Sjoberg RM, Lundberg LG. Eur J Biochem 1986 Oct l;160(l):77-82 Nucleotide sequence of the structural gene for dihydroorotase of Escherichia coli K12.

8 Datsenko KA, Wanner BL. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products.

9 Figini M, Obici L, Mezzanzanica D, Griffiths A, Colnaghi MI, Winter G, Canevari S. Cancer Res. 1998 Mar l;58(5):991-6. Panning phage antibody libraries on cells: isolation of human Fab fragments against ovarian carcinoma using guided selection.

10 Duenas M, et al. Biotechniques 1994 Mar; 16(3):476- 7,480-3. Intra- and extracellular expression of an scFv antibody fragment in E. coli: effect of bacterial strains and pathway engineering using GroES/L chaperonins.

11 Gallagher CN, Huber RE. J Protein Chern 1998 Feb; 17(2): 131-41 Studies of the M15 beta- galactosidase complementation process.

12 Langley KE, Zabin I. Biochemistry 1976 Nov 2;15(22):4866-75: beta- Galactosidase alpha complementation: properties of the complemented enzyme and mechanism of the complementation reaction.

13 Wilson HR, Archer CD, Liu JK, Turnbough CL Jr. J Bacterioll992 Jan;174(2):514-24; Translational control of pyrC expression mediated by nucleotide- sensitive selection of transcriptional start sites in Escherichia coli.

14 Sato T, Ohki M, Yura T, Ito K. J Bacterioll979 May;138(2):305-13; Genetic studies ofan Escherichia coli K- 12 temperature- sensitive mutant defective in membrane protein synthesis.

15 Larsen IN, Jensen KF. Eur J Biochem 1985 Aug 15;151(l):59-65; Nucleotide sequence of the pyrD gene of Escherichia coli and characterization of the flavoprotein dihydroorotate dehydrogenase.

16 Fiedler M, Skerra A. Gene. 2001 Aug 22;274(l-2): 111-8; proBA complementation of an auxotrophic E. coli strain improves plasmid stability and expression yield during fermenter production of a recombinant antibody fragment.

17 Degryse E. J Biotechnol. 1991 Apr; 18(l-2):29-39. "Stability ofa host- vector system based on complementation of an essential gene in Escherichia coli."

18 Summers DK, Sherratt DJ. Cell. 1984 Apr;36(4): 1097- 103. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: CoIE 1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability.

19 Porter RD, Black S. J Bacteriol. 1991 Apr;173(8):2720-3. The single- stranded- DNA-binding protein encoded by the Escherichia coli F factor can complement a deletion of the chromosomal ssb gene.

20 Rocky M. Cranenburgh, Julian A. J. Hanak, Steven G. Williams and David J. Sherratt; Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No.5 e26; 2001 Escherichia coli strains that allow antibiotic -free plasmid selection and maintenance by repressor titration.

21 Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277,680-685.

22 Towbin, R., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. P roc. Natl. Acad. ScL USA

<110> DOMPE PHA.R.MA s.p.a. <120> Novel selection system <130> EP/180 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 aattgtcatt ccatttactg attaatcacg agggcgcatt gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 acaggtaaaa taacctaatg acaacaggaa gctacgattt attccgggga tccgtcgacc 60 60 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atataccatg gcgcgccctt tatttttcgt gc 32 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 gttaaccatg gttattgttt aacggaccag cgtac 35 <210> 5 <211> 87 <212> DNA <213> Human <400> 5 aaaaaaaaca tcgcattcct gctggcatct atgttcgttt tctctatcgc aaccaacgca 60 tacgcacagt ctgccctgac tcagcct 87 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Human <400> 6 ggttaatttc tccttctatg aacattctgt agggg 35 <210> 7 <211> 111 <212> DNA <213> Human <400> 7 tcatagaagg agaaattaac catgaaaaaa aacatcgctt tcctgctggc ttccatgttc 60 gttttctcca tcgctaccaa cgcttacgct caggtgcagc tggtggagtc t 111 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Human <400> 8 tcaggaggtt ttgtcgcagg atttgggctc aact 34 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Human <400> 9 aaaaaaaaca tcgcattcct gctggca 27 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Human <400> 10 cccgctcgag tcaggaggtt ttgtcgcagg a 31 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Human <400> 11 ggagtgggtc tcatccatt 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Human <400> 12 gaccttggtg ttgctggg 18 <210> 13 <211> 1159 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 atataccatg gcgcgccctt tatttttcgt gcaaaggaaa acgtttccgc ttatcctttg 60 tgtccggcaa aaacatccct tcagccggag catagagatt aatgactgca ccatcccagg 120 tattaaagat ccgccgccca gacgactggc accttcacct ccgcgatggc gacatgttaa 180 aaactgtcgt gccatatacc agcgaaattt atggacgggc tatcgtaatg cccaatctgg 240 ctccgcccgt gaccaccgtt gaggctgccg tggcgtatcg ccagcgtatt cttgacgccg 300 tacctgccgg gcacgatttc accccattga tgacctgtta tttaacagat tcgctggatc 360 ctaatgagct ggagcgcgga tttaacgaag gcgtgttcac cgctgcaaaa ctttacccgg 420 caaacgcaac cactaactcc agccacggcg tgacgtcaat tgacgcaatc atgccggtac 480 ttgagcgcat ggaaaaaatc ggtatgccgc tactggcgca tggtgaagtg acacatgcag 540 atatcgacat ttttgatcgt gaagcgcgct ttatagaaag cgtgatggaa cctctgcgcc 600 agcgcctgac tgcgctgaaa gtcgtttttg agcacatcac caccaaagat gctgccgact 660 atgtccgtga cggaaatgaa cggctggctg ccaccatcac tccgcagcat ctgatgttta 720 accgcaacca tatgctggtt ggaggcgtgc gtccgcacct gtattgtcta cccatcctca 780 aacgtaatat tcaccaacag gcattgcgtg aactggtcgc cagcggtttt aatcgagtat 840 tcctcggtac ggattctgcg ccacatgcac gtcatcgcaa agagagcagt tgcggctgcg 900 cgggctgctt caacgcccca accgcgctgg gcagttacgc taccgtcttt gaagaaatga 960 atgctttgca gcactttgaa gcattctgtt ctgtaaacgg cccgcagttc tatgggttgc 1020 cggtcaacga cacattcatc gaactggtac gtgaagagca acaggttgct gaaagcatcg 1080 cactgactga tgacacgctg gtgccattcc tcgccgggga aacggtacgc tggtccgtta 1140 aacaataacc atggttaac 1159

Claims

(a) 효소를 인코딩하는 유전자 및 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 뉴클레오티드를 합성하는 데 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자가 부족한 숙주 세포를 변형시키고,

(b) 상기 숙주 세포를 성장시키는 것을 포함하는 재조합 단백질 생산 방법.
제1 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 원핵 세포인 재조합 단백질 생산 방법.
제2 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 대장균인 재조합 단백질 생산 방법.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 PyrC 또는 이의 동족체인 재조합 단백질 생산 방법.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 재조합 단백질은 인간 단백질인 재조합 단백질 생산 방법.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 재조합 단백질은 항체 또는 이의 분절인 재조합 단백질 생산 방법.
제6 항에 있어서,

상기 항체 분절은 Fab 분절인 재조합 단백질 생산 방법.
뉴클레오티드 합성에 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자가 결실된 숙주 세포.
제8 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 원핵 세포인 숙주 세포.
제9 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 대장균인 숙주 세포.
제8 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효소는 PyrC인 숙주 세포.
제11 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 BW 25113[델타]pyrC인 숙주 세포.
제12 항에 있어서,

상기 숙주 세포는 지정 번호 CNCM I-3447을 가지는 숙주 세포.
뉴클레오티드 합성에 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
제13 항에 있어서,

프로모터, 인핸서 또는 다른 조절 요소를 더 포함하는 벡터.
제13 항 또는 제14 항에 있어서,

상기 유전자는 PyrC 또는 이의 동족체인 벡터.
제15 항에 있어서,

상기 벡터는 pUC18-pyrC인 벡터.
제13 항 또는 제16 항 중 어느 한 항에 있어서,

소정의 재조합 단백질용 유전자를 더 포함하는 벡터.
제17 항에 있어서,

상기 소정의 재조합 단백질은 항체 또는 이의 분절인 벡터.
제18 항에 있어서,

상기 벡터는 DoB 0138 또는 DoB0126인 벡터.
재조합 단백질의 생산 방법에서의 제13 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 의한 벡터의 용도.
(a) 제8 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 정의된 숙주 세포; 및

(b) 제13 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 포함하는 재조합 단백질을 발현하기 위한 키트.