CN101305096A - 新选择体系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生重组蛋白的方法，包括使用除抗生素之外的选择方法。具体而言，本发明涉及基于pyrC基因互补的稳定宿主/载体体系，所述体系是设计用来在大肠杆菌(Escherichia coli.)中产生高水平的异源重组蛋白。本发明的表达体系能在克隆阶段迅速筛选出含有质粒的细胞，从而产生发酵阶段的高蛋白质表达。该体系选择效率强大，尤其是在诱导期，能够选出几乎同质和稳定的携有质粒的细胞群体。此外，该培养物的产率远胜出基于抗生素抗性的体系。载体稳定性的提高及其高产率满足了在大肠杆菌中工业水平生产异源性蛋白质的需求。

Description

新选择体系

发明简述

本发明涉及产生重组蛋白的方法，包括使用除抗生素之外的选择方法。具体而言，本发明涉及基于pyrC基因互补的稳定宿主/载体体系，所述体系是设计用来在大肠杆菌(Escherichia coli.)中产生高水平的异源重组蛋白。

领域现状

异源蛋白表达体系通常使用质粒来克隆及表达微生物的目的基因。当使用这些自主复制的DNA片段作为蛋白质表达载体时，其设计一贯基于i)保证自主复制的复制起点；ii)驱动目的基因转录的启动子；以及iii)帮助选择携有质粒的细胞的选择基因。

选择基因通常编码导致抗生素抗性的酶，其用于克隆步骤和培养生长中。克隆时，平板内存在的抗生素能够选出在转化过程中纳入质粒的细胞，使重组菌落形成单位(cfu)的鉴定更为简便。在液态培养生长情况下，向培养基中添加适当的抗生素，能防止质粒丢失并保持细胞群体的同质性。随着时间进展表达载体丢失，因为微生物的总体代谢负荷更偏好无质粒细胞的生长。这会降低重组蛋白的表达产量。因此，具备每一细胞均含有表达载体的同质化培养物，对于获得提高重组蛋白的产量至关重要。重组蛋白产生微生物的不断稀释会导致宿主中重组蛋白的“稀释”。如果培养是基贫乏培养基如为合成培养基，其中微生物必须合成其主要代谢物，则这一现象会更加明显。

为了防止质粒丢失，通常向培养基施加选择压力如利用抗生素产生的选择压力，其中将编码抗性的基因克隆入表达载体内。最常见的体系使用氨苄青霉素及相关的β-内酰胺酶基因，其产物能水解培养基中存在的抗生素。该类型的作用机制导致培养基中的氨苄青霉素随着培养的进行和细胞数目的增加而进行性消失。由于氨苄青霉素为制菌性药物，只要残留的抗生素浓度允许，不含质粒的细胞(即未转化的细胞)就会开始增殖。这一延迟生长的现象在平板上尤其明显，即一段时间之后，主要菌落形成单位(cfu)周围开始生长所谓的“卫星点”。

为了阻止未转化细胞的延迟生长从而获得主要培养物的同质性，可以提高预培养物中的氨苄青霉素浓度⁽¹⁾或将其更换为杀菌化合物，如卡那霉素或四环素。卡那霉素与30s核糖体复合物相互作用并阻止蛋白质翻译的起始。四环素作用于相同的靶并阻断多肽合成过程中添加新氨基酸。后一种策略效果很好，且更能稳定细胞中表达载体的存在。

令人遗憾的是，根据优良制造标准(Good ManufacturingPractice)(GMP)规定，这些稳定表达载体的方法不能用于产生人治疗所用蛋白质。例如，氨苄青霉素因过敏问题而被排除在规定之外，而对于其他抗生素需要提供纯化过程中可去除抗生素的证明⁽²⁾。另一点需考虑证明细胞传代中构建体在细胞培养期间的稳定性。因此，对质粒稳定体系而并非药物抗性仍有高度需求。

利用hoc/sok体系、通过分离后杀灭无质粒细胞的质粒稳定天然机制在文献中已有报道⁽³⁾。hok基因产物是强效的杀细胞蛋白，而sok基因则编码与hok mRNA互补的小反义RNA。这两个基因均位于质粒中，且以相反方向转录。hok mRNA极其稳定(数小时)，而sok RNA迅速衰退(少于30s)。在丢失质粒的细胞内，稳定的转录物hok mRNA保留下来，在缺乏不稳定的sok RNA时所述hok mRNA的产物通过膜去极化杀死细胞⁽⁴⁾。

很难减少缺乏选择性压力时天然的质粒丢失，因此需要符合GMP的并非基于抗生素选择压力的新载体稳定体系。

当在原核宿主如大肠杆菌中生产重组蛋白时，其中质粒保留为附加型并因此与细菌染色体相比具有独立的分离机制，则表达载体的稳定性至关重要。由于重组蛋白产生的总产量取决于质粒存在，进而也就取决于微生物保持所述质粒的能力(代谢负荷)，因此需要稳定的表达载体。在实验室水平上，可以通过向培养基中添加抗生素来克服质粒丢失的问题；所述抗生素会迫使细菌保留编码抗生素抗性的质粒从而保留目的基因。与之相反，当根据GMP生产用于人用途的蛋白质时，培养基中存在抗生素是不可取的。然而，为了从同质群体开始培养，绝对需要选择性压力来分离出含有质粒的细菌。此外，在细胞培养中，选择性压力将阻止不含质粒的细胞生长，所述细胞只产生宿主蛋白质并且被认为是不需要的“杂株”。目前为止在实现主细胞库和工作细胞库中(Master and Working cell bank)期间使用抗生素选择，而从同质群体开始细胞培养期间不使用抗生素，从而导致质粒逃逸。因此开发不基于抗生素抗性的体系以保持整个过程中的选择性压力会很方便。

发明详述

基于上述考虑，我们开发了基于宿主/载体组合的适用于GMP生产的新选择体系，其中微生物在选择性基本培养基中的生长严格取决于是否含有质粒。基本培养基对于生产人类使用的蛋白质有其优势，因为其不含多种来源的如BSE或GMO。另一优势在于这些培养基的低发泡倾向，这有利于氧输送率以及将碳源用于微生物生长的可能性。由于已经对大肠杆菌代谢进行了深度表征，有多种菌株可供使用，可根据现有或所需碳源选择其中用于此互补试验的最佳菌株。

首先，确定β-半乳糖苷酶为构建简单宿主/载体互补对的候选者。该乳糖代谢中的核心酶将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，后者进一步被代谢。β-半乳糖苷酶N-末端部分的氨基酸残基负责其四聚化，该四聚化形成该特定酶的活性四元构象。在几年来产生的多种突变体中，M15β-半乳糖苷酶为残基11-41缺失的截短形式。M15突变体系无活性的二聚体，但添加含有缺失残基且置于多种克隆载体^(11；12)中的lacZ α-肽后，能互补形成活性四聚体形式。该互补用于克隆已有数年，但从未用于对XLI大肠杆菌菌株生长施加选择性压力，以迫使其保留质粒。为证实此点，将XLI菌株和XLI::pUC19置于以乳糖为碳源的基本培养基中。缺乏β-半乳糖苷酶活性的XLI突变株不能单独生长，因其不能代谢平板中存在的唯一碳源乳糖。当利用由可购得的PUC19质粒编码的lacZ α-肽反式互补后，或当置于含有另一碳源(如葡萄糖)的基本培养基中时，可以重建XL1菌株的生长。这一原创且简便的方法能够不向培养基中添加任何其他成分，而以非常直接方式选出携有质粒的细胞。由于仅当乳糖为惟一可得碳源时XL I-蓝菌株的生长才会受限，可利用标准LB培养基通过常规途径制备感受态细胞。同样，可以通过将转化体铺板于以乳糖为惟一碳源的基本培养基中对其进行选择。

该自选择的宿主/载体组合体系，对于常规使用合成培养基的微生物中GMP生产重组蛋白而言很有吸引力。

由于乳糖同化可能并非工业应用中最方便的碳源，开发了不同的宿主/表达载体基因互补对，以能使用任意合适的碳源。因而考虑使用大肠杆菌pyrC基因开发新的宿主/载体互补体系。从细菌染色体中PCR扩增出该基因及其启动子，并将其克隆入表达载体内。该基因通过细菌胞质内的嘧啶可用性进行负性调节，所述可用性通过在pyrC转录物的5’端形成发卡结构，该结构重叠pyrC的核糖体结合位点，是抑制pyrC表达所必需。发卡结构的形成取决于CTP和GTP的胞内浓度。在嘧啶受限情况下，pyrC转录物能被容易地翻译，导致高水平的二氢乳清酸酶合成⁽¹³⁾。

该严紧的基因调控从能量角度而言具有优势，能协助保持细胞代谢负荷尽可能低，避免不必要的翻译。

之所以选择pyrC基因，也是因为它与涉及嘧啶合成的大部分基因相反，在大肠杆菌染色体上存在，是作为独立的基因，而并非操纵子的一部分⁽¹⁴⁾。另一可能的候选者为pyrD基因，但由于其所编码的蛋白质位于膜中⁽¹⁵⁾，其过量表达对于本发明目的而言将是有害的。利用pyrC基因互补实现质粒稳定的数据显示，与经典的抗生素抗性体系相比，用本发明体系可以获得几乎等效、甚至更好的结果。部分原因在于在需要合成菌株的嘧啶碱基的基本培养基中生长时，应用到所述菌株上的持续选择性压力。由于该体系作用于DNA/RNA合成，当经突变的大肠杆菌细胞丢失表达载体后，细胞代谢即被阻断。该体系与前述hok/sok稳定方法迥然不同，后者中两个基因均由质粒编码，其在不含质粒的细胞中引入hok基因产物--强效杀细胞蛋白。

pyrC体系是对天然大肠杆菌基因的反式互补，所述基因是从细菌染色体中缺失出来并克隆入质粒中，当丢失该基因时会导致菌株营养缺陷型继而生长停滞。该系统与Fiedler和Skerra⁽¹⁶⁾描述的系统有所不同，后者为基于脯氨酸合成的营养缺陷型互补体系。作者使用该类型的互补作为与氯霉素抗性联合使用的第二选择机制，以杜绝质粒的丢失并产生JM83大肠杆菌菌株。并非是有意从菌株中缺失proAB基因，因为菌株已经携有该突变(正如很多大肠杆菌菌株一样)，且将这些基因克隆入表达载体内以使菌株能在合成培养基中生长。然而尚未证实，可单独使用该体系以防止发酵过程中质粒的丢失。这可能是由于仅靠脯氨酸缺陷型尚不足以在发酵过程中选择，因为一段时间过后蛋白质聚集的培养基中微生物可能会得到一些脯氨酸。该类型的调控阻断了蛋白质合成，而pyrC影响细胞代谢中较早发生的事件即RNA或DNA合成。但即使使用氯霉素为主要的选择物质，总体产量仍不会超过20mgL^-1，低于本发明的体系。

Degryse报道了同样基于氨基酸营养缺陷型(赖氨酸)的互补体系。该作者补充了缺乏二氨基庚二酸(DAP)的大肠杆菌菌株，所述DAP为赖氨酸和细菌细胞壁的代谢前体⁽¹⁷⁾。同样，互补体系与cer基因一同使用，所述cer基因已经显示能降低多聚体的形成并提高质粒的稳定性⁽¹⁸⁾。cer基因的稳定作用优于营养缺陷型互补本身。尽管作者稳定了表达载体，他们也确实承认，矛盾之处在于在重组蛋白表达水平中并未检测到增加。

对需由高拷贝数质粒表达的其他基因互补体系也有报道^(19；28)。这些体系难以应用在发酵方法中，因为在发酵方法中高拷贝数载体对细菌菌株引发的代谢应激过高，最终会不可避免地造成细胞溶解。

因此本发明的第一方面提供了生产重组蛋白的方法，包括：

(a)用含有编码重组蛋白的基因和编码核苷酸合成所需酶的基因的载体转化缺乏编码所述酶的基因的宿主细胞；且

(b)生长所述宿主细胞。

宿主细胞优选为原核的，更优选为细菌，最优选为大肠杆菌。在一个优选实施方案中，酶为PyrC或其同源物。优选该酶的基因在野生型宿主细胞内为单个基因，而并非操纵子的一部分。

此处所用的术语“同源物”涉及具有相似氨基酸序列的蛋白质，例如包括一个或多个添加、缺失、取代等的蛋白质或多肽包括于本发明内。此外，也可以用相似“类型”的另一氨基酸替换某一氨基酸。例如用另一亲水氨基酸取代原亲水氨基酸。

可以使用程序如CLUSTAL程序来比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列并通过在任一序列中适当添加空白而发现最优比对。可以计算氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型保守性)用于最优比对。如BLASTx的程序会排列出最长段的相似序列，并对该匹配分配数值。因而在发现若干各具有不同得分的相似性区域时可以进行比较。这两种同一性分析在本发明中均有涉及。

对于同源物和衍生物而言，与此处所述的蛋白质或多肽的同一性程度，不如同源物或衍生物能保留原蛋白质或多肽的功能重要。然而，适当地，提供与此处所述蛋白质或多肽具有至少为60％相似性(如上讨论)的同源物或衍生物。优选提供具有为至少70％相似性、更优选至少80％相似性的同源物或衍生物。最优选提供具有至少为90％或甚至95％相似性的同源物或衍生物。

该方法优选用于生产人蛋白质，具体而言为抗体或其片段，优选Fab片段。抗体片段包括如Fab、F(ab’)₂及Fv片段。可以修饰Fv片段以产生已知为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这包括共价连接V_h和V_l区域的肽接头，所述接头有助于分子的稳定性。其他可用的合成构建体包括CDR肽。这些均为含有抗原结合决定簇的合成肽。也可使用肽模拟物。这些分子通常为模拟CDR环结构并含有抗原相互作用侧链的构象限制性有机环。

本发明的第二方面提供宿主细胞，其中编码核苷酸合成所需任意酶的基因缺失。在一个优选实施方案中，宿主细胞为BW 25113[delta]pyrC。以下词语[delta]以希腊符号“Δ”表示。

本发明的第三方面提供了含有编码核苷酸合成所需酶的基因的载体。在一个优选实施方案中，该载体还含有一个或多个启动子，或其他调控元件。合适的启动子为本领域技术人员公知。此处所用的术语“调控元件”是指核酸序列中涉及基因表达调控的其他元件，如聚腺苷化序列、增强子元件、转录终止子等。合适的序列为本领域技术人员公知。该载体还应含有载体复制所需的序列，例如复制起点。载体优选含有多克隆位点。

本发明的另一方面提供此处定义的载体在表达重组蛋白方法中的用途。

本发明的第四方面提供了表达重组蛋白的试剂盒，包括：

(a)如此处定义的宿主细胞；以及

(b)此处定义的载体。

现在通过参考以下实施例描述详细描述本发明。本发明每一方面的优选特征也在做必要变更后用于其他每一方面。此处提及的现有技术文献均以法律允许的最全程度引用。

实施例1

首先证实，可以使用基因互补作为选择性压力以使微生物如大肠杆菌在细胞生长的过程中保留表达载体。为此，鉴定可购买的大肠杆菌XLI-蓝菌株⁽⁵⁾及pUC19⁽⁶⁾表达载体为实施基因互补测定的可能候选者。XLI-蓝菌株具有突变[Δ](lacZ)MI5，对应于β-半乳糖苷酶“α片段”的缺失。多个克隆载体如pUC19均编码α片段，且可通过基因互补恢复具有染色体缺失[Δ](lacZ)MI5的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶活性。携带此缺失的菌株生长于X-gal(5-溴-4-氯-吲哚-β-D-半乳糖苷)平板上时呈现为无色，但若发生α肽互补(即存在质粒)，同一菌株会呈现为蓝色表型。pUC19克隆载体一方面编码β-半乳糖苷酶基因，另一方面具有位于α肽上的多克隆位点。有意将该多克隆位点插入此区域以帮助筛查连接后插入DNA片段的质粒。α肽中插入DNA破坏了其可读框或折叠，且消除了β-半乳糖苷酶活性，从而导致生长于X-gal平板上时出现无色表型。

β-半乳糖苷酶将乳糖水解为葡萄糖和β-半乳糖，是乳糖同化途径中关键的酶之一。为测试假说，用pUC19转化XLI-蓝菌株细菌，并将细胞铺板于LB琼脂/氨苄青霉素上。

然后，将选定的均含有表达载体的克隆转移至含有葡萄糖或乳糖为碳源的M9基本平板上。与之平行测试未转化的菌株在相同培养基中的生长(表I)。

如表I所示，仅有具表达载体的细胞能够代谢乳糖，因而能在以乳糖为惟一可用碳源的情况下生长。该实验显示，质粒和宿主间对某一关键性代谢酶的基因互补性可成功用作选择压力，以驱使细胞保留表达载体。该简单体系不需要向培养基中添加任何抗生素来选择携有质粒的细胞，仅受到以乳糖为碳源的限定培养基使用的限制。

实施例2

证实了该方法的正确性后，设计更为合适的体系用于生产重组蛋白。鉴定大肠杆菌代谢中的关键酶，该酶的缺失会阻断在基本培养基中的生长但不会阻断其在丰富培养基中的生长：pyrC基因的产物二氢乳清酸酶⁽⁷⁾。

二氢乳清酸酶将二氢乳清酸转化为乳清酸，所述乳清酸继而转化为乳清苷酸，其在脱羧后产生尿苷酸或UMP，为重要的嘧啶核苷酸。磷酸化后，UMP被转化为UTP，后者进而向细胞提供CTP。因此，通过缺失该酶可以阻断在其早期步骤中RNA和DNA的合成。在复合培养基中培养基内已经存在CTP和UTP，因此二氢乳清酸酶的缺失在丰富培养基中对微生物的生长并无作用，但却会妨碍基本培养基中的菌株生长。

从大肠杆菌BW25113菌株的染色体中完全缺失pyrC基因⁽⁸⁾，以防止其与携有该基因的表达载体间可能的同源重组。在本申请递交之前这一新菌株大肠杆菌BW25113ΔpyrC已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)，储藏在法国微生物保藏中心(CNCM)(Collection National de Cultures deMicroorganismes)，Institut Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，Paris，标识号为CNCM I-3447。

同时，将完整的pyrC基因及其自身启动子进行PCR扩增并克隆入pUC18，以产生pUC18-pyrC。作为第一次尝试，也为证明互补体系的正确性，将pUC 18-pyrC转化入BW25113ΔpyrC菌株，并将产生的菌落铺板于若干选择性培养基内(表II)。

+或-符号表示微生物能在这些培养基中扩展的能力。在阿拉伯糖碳源中不能生长是由于菌株的AaraBADAH33突变(见材料&方法)。菌株的卡那霉素抗性是由于在大肠杆菌染色体上的pyrC基因座中插入了卡那霉素抗性基因。++符号表示生长大于用+表示者。

这些结果确定i)如果没有pyrC基因的互补，菌株BW 25113[Δ]pyrC不能在基本培养基中单独生长；ii)克隆的pyrC基因的功能性及其在细菌菌株中的正确缺失；iii)该菌株不能使用阿拉伯糖作为碳源，这对从阿拉伯糖启动子的基因表达是重要参数(见下)。

实施例3

为检查质粒的稳定性，将基本培养基中的过夜培养物稀释，铺板于LB琼脂上，第二天时将一些cfu转移至含或不含氨苄青霉素的M9/葡萄糖基本培养基中(表III)。

该试验证实即使过夜培养后所有测试细胞中仍含有质粒，因为LB平板中的cfu仍能在基本培养基中生长。

接下来确定所讨论的基于pyrC的稳定体系，是否即使在微生物高代谢负荷如产生重组蛋白时仍然有效，所述产生重组蛋白往往会刺激菌株丢弃表达载体。为此，使用pBAD衍生表达载体DoB 0114(图1)(英杰生命技术公司(Invitrogene^TM))作为参照质粒，其中bla基因已被四环素抗性基因所取代。改造该自行设计的双顺反子表达载体使其将C4⁽⁹⁾人Fab片段表达进大肠杆菌周质间隙中。由于Fab片段为小而可溶的蛋白质，其会从大肠杆菌周质间隙扩散至培养上清液中，可从上清液中收集该片段并容易地纯化。

DoB 0138(图2)来自DoB 0114，是通过用pyrC取代抗生素抗性基因而得到。分别将表达载体DoB 0114和DoB 0138转化进W3110 ara^-菌株⁽¹⁰⁾和BW 25113[Δ]pyrC菌株。转化后，为选出携有表达载体的一个cfu来接种培养物，将W3110::DoB 0114铺板于LB琼脂/四环素上，而将BW25113[Δ]pyrC::DoB 0138铺板于以葡萄糖为碳源的M9基本培养基中。使用单个cfu接种10ml振荡烧瓶培养物，其中含有补充糖为碳源的基本培养基(对于DoB 0114还有四环素)。30℃下15小时后用这10ml接种90ml相同培养基，并在37℃中孵育13小时。使用该100ml振荡烧瓶培养物接种1升发酵罐。当OD₆₀₀达10-12时，确定携有质粒细胞的百分比，并添加5克阿拉伯糖启动重组蛋白的生产(T₀)。诱导16小时后，当OD₆₀₀达30(T₁₆)时，终止发酵并确定培养上清液中重组Fab片段及蛋白质的量(表IV)。

通过RP-HPLC确定Fab浓度，而总蛋白质浓度通过Bradford分析评估。

^＊仅在接种培养物中添加四环素，发酵时不添加。

该试验结果证实，即使在诱导阶段两种载体的转化细胞数目相当，培养结束时DoB 0138的总体产量却令人惊异地为DoB 0114产量的三倍以上，而培养物上清液中的总蛋白质浓度几乎不变。这些结果可能被解释为诱导培养阶段DoB 0138中质粒稳定性高于DoB 0114所致。如前所述确定转化细胞的百分比：首先将细胞铺板于LB琼脂上，然后转移至选择性培养基(LB琼脂+tet(DoB 0114)或M9葡萄糖(DoB 0138))。如果诱导前该方法确实运行良好，经诱导微生物的高代谢负荷以显著的方式减慢了其生长，以致于在平板上几乎不可能观察到任何菌落形成。通过将来自LB平板的未诱导cfu铺板于M9及M9/阿拉伯糖平板上，证实这一假说。M9基本培养基中出现的任何生长都无法在M9/阿拉伯糖培养基内扩展。这一由于经诱导微生物代谢负荷增加而导致的极端缓慢的生长，阻止了单个细胞的分离，从而能确定诱导阶段的载体维持百分比。

实施例4

表明了基因互补的稳定体系效果好于经典体系后，实施了10升规模的发酵，这次包括补料分批系统以研究该方法的规模性。底物浓度提升至60g/l，并用800ml预培养物接种发酵罐(起始为7.2升)。批量间隔约17小时后开始送料，其中使用糖溶液为碳源、阿拉伯糖为诱导物。根据溶解氧(DO)值设定补料分批调控，当其值超过50％时启动送料泵。经20小时分批补料后，培养物的OD₆₀₀达到150-160，并收集含有Fab的上清液(表V)。

这些结果证实了该方法的规模性，而且即使经过更多次传代，该表达载体稳定性依然满足要求。此次，由于补料分批系统，总Fab产量为1升批次培养物的10倍多，但PyrC互补体系仍然产生DoB 0114“经典”载体的量的两倍。

实施例5

为了证实所观测到Fab产量的区别并非菌株依赖性(即W3110对BW25113)，设计了最后的试验，其中将两种表达载体均转化入BW25113。对发酵程序稍加修改，并再将诱导阶段延长6小时。

在发酵结束时酸化上清液至pH6，并通过SP-琼脂糖高流速(SP-Sepharose Fast)柱(阿默海姆生物科学公司(Amersham Biosciences))。由于Fab的等电点提高，在该情况及该pH值下Fab几乎是被树脂滞留的唯一蛋白质，并在第一峰值时洗脱出来，所述第一峰占蛋白质的80％以上。吸附和洗涤后，洗脱树脂并收集对应于Fab的级分。该实验的结果见图3。PyrC体系的Fab总产量估计为每升约100mg(DoB 0138-实线)，而对于TET稳定性表达载体获得的产量低于50％(DoB 0114-虚线)。

发酵中我们观察到DoB 0114的生长更快，其在诱导后22小时消耗完2升补料溶液，而相同时间内DoB 0138仅消耗了1.35升。该快速生长率确实与该微生物的较低代谢产量、相对较低的重组蛋白产出及宿主细胞蛋白质的高产出正确相关。实际上，用DoB 0114的Fab在上清液中存在的蛋白质中所占的百分比远低于DoB 0138。后一种情形中较高的重组蛋白总产量提供了更易于纯化的材料，因为估计占可溶蛋白10％的重组蛋白已经是10％“纯净”。

由于这两个体系间的唯一差别在于选择压力，其在pyrC情形中是连续的，我们建立了PCR方法以检查发酵过程中表达载体的存在。使用对应于Fab重链羧基端部分的一对引物，直接从培养基中PCR扩增表达载体，其中将所述培养物适当标准化至0.1 OD_600nm以补偿细胞(因此为模板)增殖。如图4所示，对应于DoB 0138的信号在发酵期间保持稳定，而DoB 0114的信号在诱导后26小时后即消退为微弱不可检测的条带。

材料和方法

培养基

于121℃原位高压灭菌矿物盐培养基成分和水20分钟。起初通过0.22μm过滤单独灭菌糖，并将其添加至生物反应器内使其浓度为40.0g/l，以在补料阶段开始前建立小的批量阶段。通过无菌过滤将10毫升的痕量元素溶液和维生素加入已经无菌的生物反应器内。痕量元素溶液的组成为(g每升)：C₆H₅Na₃0₇＊2H₂O，100.0；I CaCl₂＊2H₂O，3.40；ZnSO₄＊7H₂O，2.40；MnSO₄＊2H₂O，1.50；CuSO₄＊5H₂O，0.50；CoCl₂＊6H₂O；FeC1₃＊6H₂O，9.70；H₃BO₃，0.03；Na₂MoO₄＊2H₂O，0.02；KCl，74.5。补料中含有70％糖溶液。补料诱导溶液的组分为：糖70％；维生素和阿拉伯糖。当需要控制泡沫时加入消泡剂204。

培养

将细胞生长在含有25ml生物反应器培养基(只是其中糖浓度为5.0g/L)的100ml振荡烧瓶中，制备初级种子培养物。该培养物于37℃及245rpm下生长15小时。使用16ml初级种子培养物作为接种物接种两个含400ml相同培养基的2升带隔板烧瓶，于相同条件下生长。将二级种子培养物转移至工作容积为10L的CF3000(凯姆迈普公司(Chemap))15-1生物反应器中。发酵罐装备有空气喷布器，在开始时设置气流为8l/分钟，并在补料开始后逐步升至10l/分钟。批量阶段将搅拌器的速度由800提升至1200rpm，补料分批部分期间降至1000rpm。使用极谱氧电极设置溶解氧(DO)。发酵器还装备有pH滴定装置，以通过添加30％(w/w)的氨溶液保持pH为6.95。控制温度为37℃。当耗净起始添加糖后DO增高时，开始送料。在补料分批的第一阶段，利用DO-STAT控制(氧浓度设定点固定为50％饱和)，加入230ml糖补料溶液。将换为含阿拉伯糖为诱导物的补料溶液而开始蛋白质表达阶段，保持相同的DO-STAT策略30小时。

取样

培养全程中每小时取样。

分析

蛋白质浓度的测定：利用Bio-Rad蛋白质测定确定蛋白质浓度。该测定于96/孔微量培养板中进行。包括递增量的BSA(从每孔0.25至8μg)创建参照蛋白质浓度标准曲线。于每孔内将50μl染液与150μl样品混合，然后在Model 450 Microplate Reader(伯乐公司(Bio-Rad))中读取A₅₉₅值。

重组蛋白的表达(凝胶电泳与Western印迹)

根据Laemmeli(21)稍加修改，将样品置于Mini-Protean II装置(伯乐公司(Bio-Rad))的非还原性15％SDS-PAGE上。某些实验中，在还原条件下对凝胶进行电泳。使用宽分子量范围标准品(伯乐公司(Bio-Rad))以确定电泳条带的表观分子量。在50I mA下用1.0mm厚度的微型凝胶电泳1h，于在40％CH₃OH、10％CH₃COOH制得的0.02％Phast Gel Blue R(法玛西娅公司(Pharmacia))溶液中过夜染色，并在20％CH₃OH、5％CH₃COOH中脱色。

根据Towbin等人(22)稍加修改实施Western印迹分析。在MultiphorII半干装置(法玛西娅公司(Pharmacia))中、1mA/cm²下90分钟，将15％SDS-PAGE中电泳的样品转移至0.45μm硝化纤维素膜上。膜经丽春红S(Ponceau-S)溶液(西格玛公司(Sigma)，U.S.A.)染色。标记相对分子量标准品，并于20mM Tris-HCl，pH 7.40，150mM NaCl(TBS)中漂洗来实现完全脱色。使膜用TBS(BT)中的2％BSA溶液的饱和过夜，然后用1∶2000稀释的过氧化物酶-缀合的兔抗人λ轻链(DAKO)在含0.05％Tween20(BTT)的BT中孵育1小时。然后洗涤膜，在BTT中10分钟一次、用含0.25％Tween20的TBS一次、以及TBS中若干次。所有孵育均在室温摇动平台上进行。通过SuperSignal West Fico化学发光底物(皮尔斯公司(PIERCE))显示过氧化酶活性。

HPLC分析

在17000×g离心15分钟进行的澄清步骤后，利用装备有Diphenyl219TP54，250×4.6mmID，

柱VYDAC和荧光检测器(激发λ：285nm；发射λ＝360nm；增益1000)的HPLC定量发酵培养基中的可溶性Fab。此外，利用装有PL Hi-Plex H8μm，300×7.7mm，8μm或等效柱以及折射率检测器的HPLC分析同一上清液等分试样中的糖、醋酸和阿拉伯糖。

分子生物学

大肠杆菌BW25113，ΔpyrC菌株的构建。

根据Datsenko和Wanner，得到允许大肠杆菌染色体中限定缺失的pyrC突变体。所选菌株为BW25113(lacI^q、rrnB_T14、ΔlacZ_WJI6、hsdR514、ΔaraBA-D_AH33、ΔrhaBAD_LD78)。将包括其自身启动子在内的整个基因移除以避免与质粒拷贝发生同源重组。用于缺失基因的引物：

dispyrC-f：SEQ ID NO：1：5’-AATTGTCATT CCATTTACTGATTAATCACG AGGGCGCATT GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3’以及

dispyrC-r：SEQ ID NO：2：5’-ACAGGTAAAA TAACCTAATGACAACAGGAA GCTACGATTT ATTCCGGGGA TCCGTCGACC-3’。

并未从菌株染色体中移除卡那霉素抗性基因，以作为菌株自身的潜在阳性选择。

PUC18-pyrC：

使用以下引物从大肠杆菌染色体中PCR找回pyrC基因：

pyrC-正向：SEQ ID NO：3：5’-ATATACCATG GCGCGCCCTTTATTTTTCGT GC-3’；

pyrC-反向：SEQ ID NO：4：5’-GTT AACCA TG GTT A TTGTTTAACGGACCAG CGT AC-3’，并将其克隆入pUC18的SmaI位点，得到的载体记作pUC-pyrC。

DoB 0114的构建：

用PBR322的四环素基因取代氨苄青霉素基因，来从pBAD/Myc-HisA、B、C载体(英杰生命技术公司(Invitrogen))获得DoB 0114载体。利用以下寡核苷酸和pHEN1表达载体⁽⁹⁾作为模板组装C4表达盒：

″PI C4″SEQ ID NO：5：5′-AAA AAA AAC ATC GCA TTC CTG CTGGCA TCT ATG TTC GTT TTC TCT ATC GCA ACC AAC GCA TACGCA CAG TCT GCC CTG ACT CAG CCT-3′；

″P2 C4″SEQ ID NO：6：5′-GGT TAA TTT CTC CTT CTA TGA ACATTC TGT AGG GG-3′；

″P3 C4″SEQ ID NO：7：5′-TCA TAG AAG GAG AAA TTA ACC ATGAAA AAA AAC ATC GCT TTC CTG CTG GCT TCC ATG TTC GTTTTC TCC A TC GCT ACC AAC GCT T AC GCT CAG GTG CAG CTGGTG GAG TCT-3；

″P4 C4″SEQ ID NO：8：5′-TCA GGA GGT TTT GTC GCA GGA TTTGGG CTC AAC T-3′；

″P5 C4″SEQ ID NO：9：5′-AAA AAA AAC ATC GCA TTC CTG CTGGCA-3′，

″P6 C4″SEQ ID NO：10：5′-CCC GCT CGA GTC AGG AGG TTT TGTCGC AGG A-3′.

引物PI和P2用于第一次PCR以扩增Fab轻链并在框架内添加StII前导序列。进行第二次PCR以独立扩增Fab重链并添加StII前导序列及基因间序列。由于这两个序列重叠(见图)，将先两次扩增的PCR产物在第三轮延伸反应中混合在一起，进行10个循环，其中不再添加引物。延伸步骤后向PCR中加入引物P5及P6，并如图5所示扩增全长表达盒。

用Xhol限制性酶消化最终的PCR产物，并将其克隆入用Ncol(克列诺(klenow))Xhol打开的pBAD载体。用PCR筛查Cfu，并对其中阳性克隆的整个Fab表达盒进行测序。带有预期序列的克隆命名为DoB 0114(图1)。

DoB 0138的构建：

用EcoRI/克列诺-HindIII消化pUC-pyrC质粒而得到的pyrC基因，取代编码四环素抗性的DoB 0114 HindIII-NruI DNA片段，得到该表达载体(图2)。

表达载体的PCR检测

为检测/扩增表达载体，在稀释至0.1OD600nm而使细胞数目标准化的培养基样品上实施PCR。如下表设置PCR循环。

引物：

247CH正义PCN 5’SEQ ID NO：11：-GGAGTGGGTCTCATCCATT-3’

Tm＝61.4

248 CH AS PCN5’SEQ ID NO：12：-GACCTTGGTGTTGCTGGG-3’

Tm＝64.3

Fab重链的PCR产物为约500bp。

本发明的表达体系能在克隆阶段迅速筛选出含有质粒的细胞，产生发酵阶段的高蛋白质表达。该体系选择效率强大，尤其是在诱导阶段，能够选出几乎均质的携有质粒细胞群体。此外，其培养物的产率远胜于基于抗生素抗性的体系。载体稳定性的这一提高及其高产率满足了在大肠杆菌中工业水平生产异源性蛋白质的需求。此外还证实该改造的菌株用于Fab生产优于经典的W3110，且其ΔpyrC衍生物适用于高细胞密度补料分批发酵，因此具有工业开发价值。

SEQ ID NO：13：插入pUC18克隆载体的PyrC基因序列：

  1 ATATACCATG GCGCGCCCTT TATTTTTCGT GCAAAGGAAA ACGTTTCCGC

    TATATGGTAC CGCGCGGGAA ATAAAAAGCA CGTTTCCTTT TGCAAAGGCG

 51 TTATCCTTTG TGTCCGGCAA AAACATCCCT TCAGCCGGAG CATAGAGATT

    AATAGGAAAC ACAGGCCGTT TTTGTAGGGA AGTCGGCCTC GTATCTCTAA

      M  T  A   P  S  Q  V   L  K  I   R  R  P   D  D  W  H  ·

101 AATGACTGCA CCATCCCAGG TATTAAAGAT CCGCCGCCCA GACGACTGGC

    TTACTGACGT GGTAGGGTCC ATAATTTCTA GGCGGCGGGT CTGCTGACCG

    · L  H  L   R  D  G   D  M  L  K   T  V  V   P  Y  T

151 ACCTTCACCT CCGCGATGGC GACATGTTAA AAACTGTCGT GCCATATACC

    TGGAAGTGGA GGCGCTACCG CTGTACAATT TTTGACAGCA CGGTATATGG

     S  E  I  Y   G  R  A   I  V  M   P  N  L  A   P  P  V  ·

201 AGCGAAATTT ATGGACGGGC TATCGTAATG CCCAATCTGG CTCCGCCCGT

    TCGCTTTAAA TACCTGCCCG ATAGCATTAC GGGTTAGACC GAGGCGGGCA

  · T  T  V   E  A  A  V   A  Y  R   Q  R  I   L  D  A  V  ·

251 GACCACCGTT GAGGCTGCCG TGGCGTATCG CCAGCGTATT CTTGACGCCG

    CTGGTGGCAA CTCCGACGGC ACCGCATAGC GGTCGCATAA GAACTGCGGC

    · P  A  G   H  D  F   T  P  L  M   T  C  Y   L  T  D

301 TACCTGCCGG GCACGATTTC ACCCCATTGA TGACCTGTTA TTTAACAGAT

    ATGGACGGCC CGTGCTAAAG TGGGGTAACT ACTGGACAAT AAATTGTCTA

     S  L  D  P   N  E  L   E  R  G   F  N  E  G   V  F  T  ·

351 TCGCTGGATC CTAATGAGCT GGAGCGCGGA TTTAACGAAG GCGTGTTCAC

    AGCGACCTAG GATTACTCGA CCTCGCGCCT AAATTGCTTC CGCACAAGTG

    ·A  A  K   L  Y  P  A   N  A  T   T  N  S   S  H  G  V  ·

401 CGCTGCAAAA CTTTACCCGG CAAACGCAAC CACTAACTCC AGCCACGGCG

    GCGACGTTTT GAAATGGGCC GTTTGCGTTG GTGATTGAGG TCGGTGCCGC

    · T  S  I   D  A  I   M  P  V  L   E  R  M   E  K  I

451 TGACGTCAAT TGACGCAATC ATGCCGGTAC TTGAGCGCAT GGAAAAAATC

    ACTGCAGTTA ACTGCGTTAG TACGGCCATG AACTCGCGTA CCTTTTTTAG

     G  M  P  L   L  A  H   G  E  V   T  H  A  D   I  D  I  ·

501 GGTATGCCGC TACTGGCGCA TGGTGAAGTG ACACATGCAG ATATCGACAT

    CCATACGGCG ATGACCGCGT ACCACTTCAC TGTGTACGTC TATAGCTGTA

    ·F  D  R   E  A  R  F   I  E  S   V  M  E   P  L  R  Q  ·

551 TTTTGATCGT GAAGCGCGCT TTATAGAAAG CGTGATGGAA CCTCTGCGCC

    AAAACTAGCA CTTCGCGCGA AATATCTTTC GCACTACCTT GGAGACGCGG

    · R  L  T   A  L  K   V  V  F  E   H  I  T   T  K  D

601 AGCGCCTGAC TGCGCTGAAA GTCGTTTTTG AGCACATCAC CACCAAAGAT

    TCGCGGACTG ACGCGACTTT CAGCAAAAAC TCGTGTAGTG GTGGTTTCTA

     A  A  D  Y   V  R  D   G  N  E   R  L  A  A   T  I  T  ·

651 GCTGCCGACT ATGTCCGTGA CGGAAATGAA CGGCTGGCTG CCACCATCAC

    CGACGGCTGA TACACGCACT GCCTTTACTT GCCGACCGAC GGTGGTAGTG

     ·P  Q  H   L  M  F  N   R  N  H   M  L  V    G  G  V  R  ·

 701 TCCGCAGCAT CTGATGTTTA ACCGCAACCA TATGCTGGTT GGAGGCGTGC

     AGGCGTCGTA GACTACAAAT TGGCGTTGGT ATACGACCAA CCTCCGCACG

     · P  H  L   Y  C  L   P  I  L  K   R  N  I   H  Q  Q

 751 GTCCGCACCT GTATTGTCTA CCCATCCTCA AACGTAATAT TCACCAACAG

     CAGGCGTGGA CATAACAGAT GGGTAGGAGT TTGCATTATA AGTGGTTGTC

      A  L  R  E   L  V  A   S  G  F   N  R  V  F   L  G  T  ·

 801 GCATTGCGTG AACTGGTCGC CAGCGGTTTT AATCGAGTAT TCCTCGGTAC

     CGTAACGCAC TTGACCAGCG GTCGCCAAAA TTAGCTCATA AGGAGCCATG

     ·D  S  A   P  H  A  R   H  R  K   E  S  S   C  G  C  A  ·

 851 GGATTCTGCG CCACATGCAC GTCATCGCAA AGAGAGCAGT TGCGGCTGCG

     CCTAAGACGC GGTGTACGTG CAGTAGCGTT TCTCTCGTCA ACGCCGACGC

     · G  C  F   N  A  P   T  A  L  G   S  Y  A   T  V  F

 901 CGGGCTGCTT CAACGCCCCA ACCGCGCTGG GCAGTTACGC TACCGTCTTT

     GCCCGACGAA GTTGCGGGGT TGGCGCGACC CGTCAATGCG ATGGCAGAAA

      E  E  M  N   A  L  Q   H  F  E   A  F  C  S   V  N  G  ·

 951 GAAGAAATGA ATGCTTTGCA GCACTTTGAA GCATTCTGTT CTGTAAACGG

     CTTCTTTACT TACGAAACGT CGTGAAACTT CGTAAGACAA GACATTTGCC

     ·P  Q  F   Y  G  L  P   V  N  D   T  F  I   E  L  V  R  ·

1001 CCCGCAGTTC TATGGGTTGC CGGTCAACGA CACATTCATC GAACTGGTAC

     GGGCGTCAAG ATACCCAACG GCCAGTTGCT GTGTAAGTAG CTTGACCATG

     · E  E  Q   Q  V  A   E  S  I  A   L  T  D   D  T  L

1051 GTGAAGAGCA ACAGGTTGCT GAAAGCATCG CACTGACTGA TGACACGCTG

     CACTTCTCGT TGTCCAACGA CTTTCGTAGC GTGACTGACT ACTGTGCGAC

      V  P  F  L   A  G  E   T  V  R   W  S  V  K   Q

1101 GTGCCATTCC TCGCCGGGGA AACGGTACGC TGGTCCGTTA AACAATAACC

     CACGGTAAGG AGCGGCCCCT TTGCCATGCG ACCAGGCAAT TTGTTATTGG

1151 ATGGTTAAC

     TACCAATTG

参考文献

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22Towbin，R.，Staehelin，T.和Gordon，J.(1979)Electrophoretictransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4350-4354.

序列表

<110>冬姆佩法尔玛有限公司(DOMPE PHA.R.MA S.P.A.)

<120>新选择体系

<130>EP/180

<160>13

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>1

aattgtcatt ccatttactg attaatcacg agggcgcatt gtgtaggctg gagctgcttc    60

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>2

acaggtaaaa taacctaatg acaacaggaa gctacgattt attccgggga tccgtcgacc    60

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>3

atataccatg gcgcgccctt tatttttcgt gc                                  32

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>4

gttaaccatg gttattgttt aacggaccag cgtac                               35

<210>5

<211>87

<212>DNA

<213>人

<400>5

aaaaaaaaca tcgcattcct gctggcatct atgttcgttt tctctatcgc aaccaacgca    60

tacgcacagt ctgccctgac tcagcct                                        87

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人

<400>6

ggttaatttc tccttctatg aacattctgt agggg                               35

<210>7

<211>111

<212>DNA

<213>人

<400>7

tcatagaagg agaaattaac catgaaaaaa aacatcgctt tcctgctggc ttccatgttc    60

gttttctcca tcgctaccaa cgcttacgct caggtgcagc tggtggagtc t             111

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人

<400>8

tcaggaggtt ttgtcgcagg atttgggctc aact                                34

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人

<400>9

aaaaaaaaca tcgcattcct gctggca                                      27

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人

<400>10

cccgctcgag tcaggaggtt ttgtcgcagg a                                 31

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人

<400>11

ggagtgggtc tcatccatt                                               19

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人

<400>12

gaccttggtg ttgctggg                                                18

<210>13

<211>1159

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>13

atataccatg gcgcgccctt tatttttcgt gcaaaggaaa acgtttccgc ttatcctttg  60

tgtccggcaa aaacatccct tcagccggag catagagatt aatgactgca ccatcccagg  120

tattaaagat ccgccgccca gacgactggc accttcacct ccgcgatggc gacatgttaa  180

aaactgtcgt gccatatacc agcgaaattt atggacgggc tatcgtaatg cccaatctgg    240

ctccgcccgt gaccaccgtt gaggctgccg tggcgtatcg ccagcgtatt cttgacgccg    300

tacctgccgg gcacgatttc accccattga tgacctgtta tttaacagat tcgctggatc    360

ctaatgagct ggagcgcgga tttaacgaag gcgtgttcac cgctgcaaaa ctttacccgg    420

caaacgcaac cactaactcc agccacggcg tgacgtcaat tgacgcaatc atgccggtac    480

ttgagcgcat ggaaaaaatc ggtatgccgc tactggcgca tggtgaagtg acacatgcag    540

atatcgacat ttttgatcgt gaagcgcgct ttatagaaag cgtgatggaa cctctgcgcc    600

agcgcctgac tgcgctgaaa gtcgtttttg agcacatcac caccaaagat gctgccgact    660

atgtccgtga cggaaatgaa cggctggctg ccaccatcac tccgcagcat ctgatgttta    720

accgcaacca tatgctggtt ggaggcgtgc gtccgcacct gtattgtcta cccatcctca    780

aacgtaatat tcaccaacag gcattgcgtg aactggtcgc cagcggtttt aatcgagtat    840

tcctcggtac ggattctgcg ccacatgcac gtcatcgcaa agagagcagt tgcggctgcg    900

cgggctgctt caacgcccca accgcgctgg gcagttacgc taccgtcttt gaagaaatga    960

atgctttgca gcactttgaa gcattctgtt ctgtaaacgg cccgcagttc tatgggttgc    1020

cggtcaacga cacattcatc gaactggtac gtgaagagca acaggttgct gaaagcatcg    1080

cactgactga tgacacgctg gtgccattcc tcgccgggga aacggtacgc tggtccgtta    1140

aacaataacc atggttaac                                                 1159

Claims (22)

1.生产重组蛋白的方法，其包括：

(a)用含有编码重组蛋白的基因和编码核苷酸合成所需酶的基因的载体转化缺乏编码所述酶的基因的宿主细胞；且

(b)生长所述宿主细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞为原核的。

3.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。

4.权利要求1至3的任一项中所述的方法，其中所述酶为pyrC或其同源物。

5.权利要求1至4的任一项中所述的方法，其中所述重组蛋白为人蛋白质。

6.权利要求1至5的任一项中所述的方法，其中所述重组蛋白为抗体或其片段。

7.权利要求6中所述的方法，其中所述抗体片段为Fab片段。

8.编码核苷酸合成所需酶的基因已经缺失的宿主细胞。

9.权利要求8中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。

10.权利要求9中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。

11.权利要求8至10的任一项中所述的宿主细胞，其中所述酶为pyrC。

12.权利要求11中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为BW25113[Δ]pyrC。

13.权利要求12中所述的宿主细胞，其具有标识号为CNCM I-3447。

14.含有编码核苷酸合成所需酶的基因的载体。

15.权利要求13中所述的载体，其还包含启动子、增强子或其他调控元件。

16.权利要求13或权利要求14中所述的载体，其中所述基因为pyrC或其同源物。

17.权利要求15中所述的载体，其中所述载体为pUC18-pyrC。

18.权利要求13至16的任一项中所述的载体，其还含有所需重组蛋白的基因。

19.权利要求17中所述的载体，其中所述所需重组蛋白为抗体或其片段。

20.权利要求18中所述的载体，其中所述载体为DoB 0318或DoB0126。

21.权利要求13至19中任一项所述载体在生产重组蛋白的方法中的用途。

22.表达重组蛋白的试剂盒，其包括：

(a)权利要求8至12的任一项中定义的宿主细胞；以及

(b)权利要求13至19的任一项中所定义的载体。

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