JPS6158595A - 徴生物によるタンパク質規模生産方法 - Google Patents
徴生物によるタンパク質規模生産方法Info
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- JPS6158595A JPS6158595A JP60186759A JP18675985A JPS6158595A JP S6158595 A JPS6158595 A JP S6158595A JP 60186759 A JP60186759 A JP 60186759A JP 18675985 A JP18675985 A JP 18675985A JP S6158595 A JPS6158595 A JP S6158595A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質を大量生産するように形質転換さ
れ選別された細胞系内の遺伝物質を安定化する方法と、
その生産細胞系に関する。
れ選別された細胞系内の遺伝物質を安定化する方法と、
その生産細胞系に関する。
分子生物学的技術の進歩によりあらゆる起源の遺伝情報
をＤＮＡの形で、原核生物内でファージやプラスミドと
して複製するベクター（媒介体）内へ導入することが可
能となった。遺伝情報はよく真核生物から調製する場合
のように試験管内でｍＲＮＡから合成したＤＮＡ複製物
のこともあれば、原核生物からの調製方法として好まれ
るように遺伝子から直接単離したＤＮＡのこともあれば
、化合的に合成したＤＮＡのこともある。本方法論の応
用研究における目的は一般に、挿入した遺伝情報により
暗号化されたタンパク質、あるいは挿入した遺伝情報に
より暗号化されたタンパク質の酵素活性にその合成の一
部を依存している化合物を大量に生産することにある。
をＤＮＡの形で、原核生物内でファージやプラスミドと
して複製するベクター（媒介体）内へ導入することが可
能となった。遺伝情報はよく真核生物から調製する場合
のように試験管内でｍＲＮＡから合成したＤＮＡ複製物
のこともあれば、原核生物からの調製方法として好まれ
るように遺伝子から直接単離したＤＮＡのこともあれば
、化合的に合成したＤＮＡのこともある。本方法論の応
用研究における目的は一般に、挿入した遺伝情報により
暗号化されたタンパク質、あるいは挿入した遺伝情報に
より暗号化されたタンパク質の酵素活性にその合成の一
部を依存している化合物を大量に生産することにある。
このタンパク質生産は遺伝的処理をした微生物の大規模
発酵により達成される。
発酵により達成される。
大量のタンパク質生産もしくは遺伝子発現は実際上細胞
がその有効エネルギーを利用する際の正 ・常なあるい
は有利な方法ではない。この結果、形質転換生物に対し
て復帰させる、すなわち遺伝子工学技術により挿入した
ＤＮＡ全体またはその一部を排除しようとする強い選択
圧が作用し、復帰生物を含む発酵体は成長するにつれ形
質転換生物の割合の持続的な減少を示すはずである。こ
のため、形質転換形態を維持するための強い選択力を作
用させねばならない。小殖模のペトリ皿やフラスコの培
地を用いた実験では、ベクターの維持選択は目的とする
生産物の遺伝子に加えて、宿主が通常感受性を有する抗
生物質に対する抵抗力を与えるような遺伝子を含むベク
ターの利用により行なわれてお如、後で生育培地に抗生
゛物質を添加すると挿入遺伝子を含むプラスミドやファ
ージをもつ細胞の方が、抗生物質に対する抵抗力をもた
ぬ細胞よシも増殖が有利となる。この選択圧はベクター
を含まぬ復帰型を効果的に抑制し、はぼ純粋な形質転換
培養株を作ることができる。本方法は実験室内での形質
転換生物の選択と培養には有効かつ十分であるが、工業
的規模の発酵槽においては大半の効果的抗生物質の価格
の点からみてその利用は高価すぎるものとなる。この費
用は、発酵槽では、実験室内のフラスコ培養に比べてよ
シ高密度の微生物が生ずるため、それだけ抗生物質濃度
を高めることが必要となシしばしば増加する。目的とす
るタンパク質や化学物質を過剰生産する細胞は一般に非
形質転換細胞よシもはるかに成長が遅い。このため、抗
生物質濃度を高く維持しなければ、ベクターを失った（
したがって目的のタンパク質の生産能力も失った）細胞
が急速に成長して優勢種となシ、目的のタンパク質の生
産性低下をまねく。
がその有効エネルギーを利用する際の正 ・常なあるい
は有利な方法ではない。この結果、形質転換生物に対し
て復帰させる、すなわち遺伝子工学技術により挿入した
ＤＮＡ全体またはその一部を排除しようとする強い選択
圧が作用し、復帰生物を含む発酵体は成長するにつれ形
質転換生物の割合の持続的な減少を示すはずである。こ
のため、形質転換形態を維持するための強い選択力を作
用させねばならない。小殖模のペトリ皿やフラスコの培
地を用いた実験では、ベクターの維持選択は目的とする
生産物の遺伝子に加えて、宿主が通常感受性を有する抗
生物質に対する抵抗力を与えるような遺伝子を含むベク
ターの利用により行なわれてお如、後で生育培地に抗生
゛物質を添加すると挿入遺伝子を含むプラスミドやファ
ージをもつ細胞の方が、抗生物質に対する抵抗力をもた
ぬ細胞よシも増殖が有利となる。この選択圧はベクター
を含まぬ復帰型を効果的に抑制し、はぼ純粋な形質転換
培養株を作ることができる。本方法は実験室内での形質
転換生物の選択と培養には有効かつ十分であるが、工業
的規模の発酵槽においては大半の効果的抗生物質の価格
の点からみてその利用は高価すぎるものとなる。この費
用は、発酵槽では、実験室内のフラスコ培養に比べてよ
シ高密度の微生物が生ずるため、それだけ抗生物質濃度
を高めることが必要となシしばしば増加する。目的とす
るタンパク質や化学物質を過剰生産する細胞は一般に非
形質転換細胞よシもはるかに成長が遅い。このため、抗
生物質濃度を高く維持しなければ、ベクターを失った（
したがって目的のタンパク質の生産能力も失った）細胞
が急速に成長して優勢種となシ、目的のタンパク質の生
産性低下をまねく。
この問題への′一つの解決法は、誘導転写系やベクター
複製数によって細胞集団が発酵過程で十分に生育した後
はじめてタンパク質生産を開始するように挿入遺伝子の
発現を制御することであった。
複製数によって細胞集団が発酵過程で十分に生育した後
はじめてタンパク質生産を開始するように挿入遺伝子の
発現を制御することであった。
これによりベクターを失った細胞の成長における選択的
優位は誘導開始まで大巾に低下する。しかし遺伝子発現
のない場合でもベクターの維持は細胞にとってベクター
をもたない場合よシも相対的に不利となシうる。たとえ
ば、抗生物質その他の選択性をもたないＰＢＲ３２２由
来のプラスミドを含むＥ、ｅｏｔｉ（大腸菌）細胞はた
とえ高レベルの遺伝子発現がなくても一世代当シ約１俤
の割合で復帰型を生ずる。さらに、タンパク質合成の誘
導後はベクター消失細胞にとって成長が大巾に有利とな
シ潜在的に生産量が損失する。
優位は誘導開始まで大巾に低下する。しかし遺伝子発現
のない場合でもベクターの維持は細胞にとってベクター
をもたない場合よシも相対的に不利となシうる。たとえ
ば、抗生物質その他の選択性をもたないＰＢＲ３２２由
来のプラスミドを含むＥ、ｅｏｔｉ（大腸菌）細胞はた
とえ高レベルの遺伝子発現がなくても一世代当シ約１俤
の割合で復帰型を生ずる。さらに、タンパク質合成の誘
導後はベクター消失細胞にとって成長が大巾に有利とな
シ潜在的に生産量が損失する。
ベクターの安定性を助長するもう一つの方法は、分割座
を含むＤＮＡ分節の添加やすでに分割座を含むベクター
の利用により、ベクター自体の安定性や分割能力を高め
る（たとえばヨーロッパ特許出願第８３３０３１９５．
８号参照）ことである。このようなりＮＡ分節は分割後
娘細胞の両方へのプラスミドの分割あるいは転移に関与
する。この方法は復帰型の生成速度を減少させるが、一
度生成した復帰型の成長における選択的優位性に関する
問題を解消するものではない。
を含むＤＮＡ分節の添加やすでに分割座を含むベクター
の利用により、ベクター自体の安定性や分割能力を高め
る（たとえばヨーロッパ特許出願第８３３０３１９５．
８号参照）ことである。このようなりＮＡ分節は分割後
娘細胞の両方へのプラスミドの分割あるいは転移に関与
する。この方法は復帰型の生成速度を減少させるが、一
度生成した復帰型の成長における選択的優位性に関する
問題を解消するものではない。
工業的用途に適した既存のプラスミド安定化法として、
ストレプトマイシン依存性の宿主内でプラスミドを安定
化するためにプラスミド内へストレプトマイシン独立性
を与える遺伝子を配置することがある（ Ｍｉｗａら、
米国特許第４ 、３７１ 、６１５号）。
ストレプトマイシン依存性の宿主内でプラスミドを安定
化するためにプラスミド内へストレプトマイシン独立性
を与える遺伝子を配置することがある（ Ｍｉｗａら、
米国特許第４ 、３７１ 、６１５号）。
しかし、ストレプトマイシン依存性の変異株はストレプ
トマイシン独立性または感受性に復帰することが可能で
ある。また、ストレプトマイシンはりボゾーム蛋白質に
結合するので、宿主内のタンパク質合成に必要なりボゾ
ームのいくつかは欠陥を生じ、タンパク質合成効率が低
下する。このような理由から、大規模な発酵において有
効であシかつ安価に実施できるような、形質転換生物の
成長を優位にする選択圧を作用させる別の方法が必要と
なってくる。 、 本発明は、微生物の細胞内の１つ以上のｔｒｐオペロン
に突然変異を起こさせて成長もしくは生存上必要とされ
るトリプトファンの合成を不可能にさせ、発耕信号の制
御下において（、）目的とする外来タンパク質を暗号化
する遺伝子と、（ｂ）非変異型のｔｒｐ遺伝子または宿
主細胞内で変異を生じた遺伝子を運ぶ組換えベクターに
より前記の株を形質転換し、トリプトファンを分解して
あυ宿主細胞の変異遺伝子が組換えベクターの運ぶ非変
異遺伝子により補償されている場合にのみ成長可能な、
栄養培地での遺伝子発現条件のもとで、形質転換細胞を
生育することから成る、微生物による大規模なタンパク
質生産方法を開示するものである。
トマイシン独立性または感受性に復帰することが可能で
ある。また、ストレプトマイシンはりボゾーム蛋白質に
結合するので、宿主内のタンパク質合成に必要なりボゾ
ームのいくつかは欠陥を生じ、タンパク質合成効率が低
下する。このような理由から、大規模な発酵において有
効であシかつ安価に実施できるような、形質転換生物の
成長を優位にする選択圧を作用させる別の方法が必要と
なってくる。 、 本発明は、微生物の細胞内の１つ以上のｔｒｐオペロン
に突然変異を起こさせて成長もしくは生存上必要とされ
るトリプトファンの合成を不可能にさせ、発耕信号の制
御下において（、）目的とする外来タンパク質を暗号化
する遺伝子と、（ｂ）非変異型のｔｒｐ遺伝子または宿
主細胞内で変異を生じた遺伝子を運ぶ組換えベクターに
より前記の株を形質転換し、トリプトファンを分解して
あυ宿主細胞の変異遺伝子が組換えベクターの運ぶ非変
異遺伝子により補償されている場合にのみ成長可能な、
栄養培地での遺伝子発現条件のもとで、形質転換細胞を
生育することから成る、微生物による大規模なタンパク
質生産方法を開示するものである。
本方法は形質転換細胞に対しベクターを維持しようとす
る選択圧を作用させる、というのは非変異型のベクター
由来の遺伝子によるタンパク質産物は宿主細胞の欠損を
補償し、宿主細胞の生存と成長を可能にするからである
。そして、これＫよシやはりベクターにより暗号化され
る、目的とする外来タンパク質の発現が可能となる。
。
る選択圧を作用させる、というのは非変異型のベクター
由来の遺伝子によるタンパク質産物は宿主細胞の欠損を
補償し、宿主細胞の生存と成長を可能にするからである
。そして、これＫよシやはりベクターにより暗号化され
る、目的とする外来タンパク質の発現が可能となる。
。
本発明は生産プラスミドを含む細胞に対し選択圧を補足
することにより、大規模な微生物によるタンパク質生産
のための宿主細胞−発現ベクター系を安定化する方法に
関する。本方法は目的とする酵素、ホルモン、その他の
タンパク質を生産するように形質転換され、このため非
転換型の宿主細胞に比べて競合上不利な立場にある原核
細胞系の安定化と淘汰に適用することができる。
することにより、大規模な微生物によるタンパク質生産
のための宿主細胞−発現ベクター系を安定化する方法に
関する。本方法は目的とする酵素、ホルモン、その他の
タンパク質を生産するように形質転換され、このため非
転換型の宿主細胞に比べて競合上不利な立場にある原核
細胞系の安定化と淘汰に適用することができる。
本発明に従って宿主細胞系を選択し、トリプトファンが
細胞の成長と生存に必要な成分である細胞の、トリプト
ファン合成を暗号化する１つ以上の遺伝子内に突然変異
を起こさせる。突然変異により生じた欠陥は、翻訳Ｋ１
１ｌを生じて欠陥タンパク質産物を生ずる型の場合と、
遺伝子の転写あるいは翻訳を阻害する型の場合があるが
、いずれの型も細胞の成分生産を不能にする。トリプト
ファンが細胞の維持あるいは成長に必要である限シ、細
胞の生存は他の供給源からこの成分を獲得できるか否か
にかかつている。
細胞の成長と生存に必要な成分である細胞の、トリプト
ファン合成を暗号化する１つ以上の遺伝子内に突然変異
を起こさせる。突然変異により生じた欠陥は、翻訳Ｋ１
１ｌを生じて欠陥タンパク質産物を生ずる型の場合と、
遺伝子の転写あるいは翻訳を阻害する型の場合があるが
、いずれの型も細胞の成分生産を不能にする。トリプト
ファンが細胞の維持あるいは成長に必要である限シ、細
胞の生存は他の供給源からこの成分を獲得できるか否か
にかかつている。
遺伝子変異はその生物の性質に応じて様々の方法で導入
することができる。変異誘発方法はすでによく知られて
おシ、たとえば微生物を亜硝酸。
することができる。変異誘発方法はすでによく知られて
おシ、たとえば微生物を亜硝酸。
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン。
エチルメタンスルフォネート、５−ブロモウラシル、ヒ
ドロキシルアミン、ナイトロジョンマスタートおよびス
ルファマスタードなどのような化学的突然変異誘発物質
に曝す方法がある。紫外線。
ドロキシルアミン、ナイトロジョンマスタートおよびス
ルファマスタードなどのような化学的突然変異誘発物質
に曝す方法がある。紫外線。
Ｘ線、ｔたはガンマ線で細胞を照射してもよい。
これらの方法は一般によく知られておシ、たとえば「基
礎細菌学（Ｂａ５ｔｅ Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏｇ７ ）
Ｊ （ＬａＭａｎｎａ 、 Ｍａｌ １ｅｔｔｓ著、
メリーランド州ボルチモア在つィリアムズ・アンド・ウ
ィリアムズ社発行。
礎細菌学（Ｂａ５ｔｅ Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏｇ７ ）
Ｊ （ＬａＭａｎｎａ 、 Ｍａｌ １ｅｔｔｓ著、
メリーランド州ボルチモア在つィリアムズ・アンド・ウ
ィリアムズ社発行。
第２版、 １９５９年）の６４６〜６４９頁に記載され
ている。
ている。
可オペロン内の遺伝子または調節部位の挿入不活性化は
、本発明における栄養素要求宿主細胞の獲得にも利用で
きる。外来ＤＮＡはたとえば種々のウイルズ、形質転換
ファージ、トラスボゾンなどによ、り ｔｒｐオペロン
内へ導入することができる。
、本発明における栄養素要求宿主細胞の獲得にも利用で
きる。外来ＤＮＡはたとえば種々のウイルズ、形質転換
ファージ、トラスボゾンなどによ、り ｔｒｐオペロン
内へ導入することができる。
細胞ＤＮＡ内へ外来のＤＮＡ配列を導入することのでき
るウィルス（たとえばバクテリオファージｍｕおよびｐ
ｌ）は一般に利用可能である。このようなウィルスによ
る形質導入に関する一般的考察は［微生物学（Ｍｉｃｙ
ｏｂｉｏｌｏｆ３’ ） Ｊ Ｐａ１ｃｚａｒ ＋ Ｍ
、およびＲｏＲｅｉｄ 著、マグロ−ヒル社発行第３
版、１９７２年の２２８〜２２９頁に記載されている。
るウィルス（たとえばバクテリオファージｍｕおよびｐ
ｌ）は一般に利用可能である。このようなウィルスによ
る形質導入に関する一般的考察は［微生物学（Ｍｉｃｙ
ｏｂｉｏｌｏｆ３’ ） Ｊ Ｐａ１ｃｚａｒ ＋ Ｍ
、およびＲｏＲｅｉｄ 著、マグロ−ヒル社発行第３
版、１９７２年の２２８〜２２９頁に記載されている。
転座可能な因子（トランスボゾン）は、分離した遺伝的
物質的存在のように原核細胞ゲノム上のある位置から同
ゲノム内の別の位置あるいは別のゲノム上へと動き回る
ことのできるＤＮＡ断片であ夛、これも読み取シを変え
ることができる。［細胞（Ｃａｌｌ）Ｊ第１１巻１１号
（１９７７）、Ｋｌｅｅｋｎｅｒを参照のこと。
物質的存在のように原核細胞ゲノム上のある位置から同
ゲノム内の別の位置あるいは別のゲノム上へと動き回る
ことのできるＤＮＡ断片であ夛、これも読み取シを変え
ることができる。［細胞（Ｃａｌｌ）Ｊ第１１巻１１号
（１９７７）、Ｋｌｅｅｋｎｅｒを参照のこと。
前記の突然変異誘発方法のいずれかにより修飾をうけた
生物は続いてその必須成分の生産能力により選シ分けら
れ、生産能力のないものすなわち宿主致死変異を生じた
ものはその必須成分の存在下でのみ生育することが可能
となる。
生物は続いてその必須成分の生産能力により選シ分けら
れ、生産能力のないものすなわち宿主致死変異を生じた
ものはその必須成分の存在下でのみ生育することが可能
となる。
本発明の方法では、宿主細胞はトリプトファン（辺）オ
ペロンの遺伝子の１つ以上に欠損を生ずるような突然変
異を誘発される。変異遺伝子を同定して目的の変異を伴
う細胞を選択し、次いで欠損した遺伝子の非変異型の遺
伝子をたとえばプロキモジンやセリンヒドロキシメチル
トランスフエラーゼ（ＳＨＭＴ ）のような目的とする
外来タンパク質の生産を暗号化する遺伝子を運ぶベクタ
ー内へ挿入する。υヱ遺伝子と外来タンパク質を暗号化
する遺伝子は共に、プロモーター／オペレーター。
ペロンの遺伝子の１つ以上に欠損を生ずるような突然変
異を誘発される。変異遺伝子を同定して目的の変異を伴
う細胞を選択し、次いで欠損した遺伝子の非変異型の遺
伝子をたとえばプロキモジンやセリンヒドロキシメチル
トランスフエラーゼ（ＳＨＭＴ ）のような目的とする
外来タンパク質の生産を暗号化する遺伝子を運ぶベクタ
ー内へ挿入する。υヱ遺伝子と外来タンパク質を暗号化
する遺伝子は共に、プロモーター／オペレーター。
リボゾーム結合部位、翻訳開始コドンを含む発現に必要
な信号の制御下でベクターによυ運ばれる。
な信号の制御下でベクターによυ運ばれる。
ベクターとしてはプラスミドでもファージでもよい。
次にベクターによクセ１欠損宿主細胞を形質転換し、形
質転換細胞をトリプトファン欠損培地で培養する。宿主
細胞の欠損遺伝子を補償するｔｒｐオペロンを運ぶベク
ターにより形質転換された細胞はこのようにして非転換
細胞に対して競合上有利となる。形質転換細胞は繁殖す
るが非転換細胞は全く生育することができず、目的とす
るタンパク質を大量に得ることができる。
質転換細胞をトリプトファン欠損培地で培養する。宿主
細胞の欠損遺伝子を補償するｔｒｐオペロンを運ぶベク
ターにより形質転換された細胞はこのようにして非転換
細胞に対して競合上有利となる。形質転換細胞は繁殖す
るが非転換細胞は全く生育することができず、目的とす
るタンパク質を大量に得ることができる。
本発明の方法の実施において、宿主致死遺伝子欠損は復
帰が不可能である、あるいは起こシそうもないものであ
ることが望ましい。さらに目的の物質の生産を暗号化す
る遺伝子は任意の時点で発沖をＵ＆できるような方法で
ベクターで運ばれることが望ましい。相同遺伝子の組換
えとプラスミドＤＮＡの欠損を生ずる可能性をおさえる
ため、ベクター−宿主細胞系の安定化に利用される遺伝
子はベクター上の一箇所のみに固定されることが望まし
い。
帰が不可能である、あるいは起こシそうもないものであ
ることが望ましい。さらに目的の物質の生産を暗号化す
る遺伝子は任意の時点で発沖をＵ＆できるような方法で
ベクターで運ばれることが望ましい。相同遺伝子の組換
えとプラスミドＤＮＡの欠損を生ずる可能性をおさえる
ため、ベクター−宿主細胞系の安定化に利用される遺伝
子はベクター上の一箇所のみに固定されることが望まし
い。
本発明の宿主細胞−発現ベクター系と方法には、目的の
外来タンパク質を大量に獲得するための発現ベクターを
含む細胞に対する選択圧を増そうとするこれまでの努力
と比べて、多数の有利な点がある。たとえば、本発明の
方法では細胞はトリプトファンを含まぬ培地で生育され
る。トリプトファンは比較的不安定であるため、多数の
アミノ酸を含む栄養培地において他の成分が損傷を受け
ぬ場合でも選択的に破壊することができる。この結果本
方法は、大半の他のアミノ酸が関与する補償安定化方式
の場合のような複雑な栄養培地の利用をはばむというこ
とがない。たとえばトリプトファンはタンパク質加水分
解物中で酸加水分解によυ簡単に破壊できる。またトリ
プトファンは栄養培地中に酵素のトリプトファナーゼを
添加することにより選択的に破壊できる。
外来タンパク質を大量に獲得するための発現ベクターを
含む細胞に対する選択圧を増そうとするこれまでの努力
と比べて、多数の有利な点がある。たとえば、本発明の
方法では細胞はトリプトファンを含まぬ培地で生育され
る。トリプトファンは比較的不安定であるため、多数の
アミノ酸を含む栄養培地において他の成分が損傷を受け
ぬ場合でも選択的に破壊することができる。この結果本
方法は、大半の他のアミノ酸が関与する補償安定化方式
の場合のような複雑な栄養培地の利用をはばむというこ
とがない。たとえばトリプトファンはタンパク質加水分
解物中で酸加水分解によυ簡単に破壊できる。またトリ
プトファンは栄養培地中に酵素のトリプトファナーゼを
添加することにより選択的に破壊できる。
さらに、細胞によるトリプトファン合成は他のアミノ酸
合成の場合よりも多量のエネルギーを必要とする。この
ためトリプトファンの生合成は厳重に制御されている（
［オペロンＪ Ｍｉｌｌｅｒ 、 Ｊ、Ｈ。
合成の場合よりも多量のエネルギーを必要とする。この
ためトリプトファンの生合成は厳重に制御されている（
［オペロンＪ Ｍｉｌｌｅｒ 、 Ｊ、Ｈ。
およびｗ、 Ｆ、 Ｒｅｚｎｉｔｚｏｆｆ編集、コール
ド・スプリング・ハーバ−研究所にニーヨー１在） 発
行。
ド・スプリング・ハーバ−研究所にニーヨー１在） 発
行。
１９７８年、 ２６３〜３０２頁、 Ｐｌａｔｔ 、
Ｔ、著）。正常の制御機構が存在するならば、細胞内の
トリプトファンオペロンの遺伝子コピー数が増えてもト
リプトファンが過剰に生合成され細胞外へ放出されるよ
うなことはない。こうして本発明の方法では、組換えベ
クターを失った細胞への交叉的栄養供給という不利な現
象を生ずることがない。
Ｔ、著）。正常の制御機構が存在するならば、細胞内の
トリプトファンオペロンの遺伝子コピー数が増えてもト
リプトファンが過剰に生合成され細胞外へ放出されるよ
うなことはない。こうして本発明の方法では、組換えベ
クターを失った細胞への交叉的栄養供給という不利な現
象を生ずることがない。
最後に、本方法は目的のタンパク質を多量に発現できる
ような多種多様の宿主細胞−組換えベクター系の安定化
に利用できる。というのはトリプトファンオペロンの遺
伝子を１つ以上欠損した宿主細胞は突然変異と淘汰、あ
るいは形質導入のいずれかにより容易に単離することが
可能だからである。
ような多種多様の宿主細胞−組換えベクター系の安定化
に利用できる。というのはトリプトファンオペロンの遺
伝子を１つ以上欠損した宿主細胞は突然変異と淘汰、あ
るいは形質導入のいずれかにより容易に単離することが
可能だからである。
以下の実施例は本発明の具体例を示すことを目的とする
ものであシ、限定を意図するものではない。
ものであシ、限定を意図するものではない。
実施例Ｉ
外来タンパク質を発現する補償プラスミドの作成［ＰＧ
Ｘ２２５７ （ｔｒｐ ＥＤ 、 ｌｒｐ ＢΔ２プロ
キモジン）〕ＰＧＸ２２５７の作成方式を第１図に図示
する。大腸菌宿主株のＧＸ１６７０はプラスミドＰＧＸ
２２３１によυ形質転換され、イリノイ州ビオリアの米
国農務省農業研究施設に取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５５
７１として保管された。このプラスミドはｔｒｐ／Ａａ
ｃプロモーターの制御下で大腸菌ＩＢ遺伝子の５′断片
に後続して融合したほぼ完全なプロキモジン遺伝子（最
初の２このアミノ酸のコドンを欠除）を含む。
Ｘ２２５７ （ｔｒｐ ＥＤ 、 ｌｒｐ ＢΔ２プロ
キモジン）〕ＰＧＸ２２５７の作成方式を第１図に図示
する。大腸菌宿主株のＧＸ１６７０はプラスミドＰＧＸ
２２３１によυ形質転換され、イリノイ州ビオリアの米
国農務省農業研究施設に取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５５
７１として保管された。このプラスミドはｔｒｐ／Ａａ
ｃプロモーターの制御下で大腸菌ＩＢ遺伝子の５′断片
に後続して融合したほぼ完全なプロキモジン遺伝子（最
初の２このアミノ酸のコドンを欠除）を含む。
ｘｈｏ Ｉ感受性の制限部位は■／ Ａａｅプロモータ
ーとＪＲ断片の間に存在する。プラスミドＰＧＸ２６０
６はイリノイ州ビオリアの米国農務省農業研究施設に取
得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５５５１として大腸菌Ｋ１２
ＧＸ１１７０（λ）内に保管してあシ、ＢａｍＨＩ感受
性部位とアンピリジン抵抗性遺伝子に隣接するλＯＬ７
′ＰＲ雑種プロモーター／オペレーターを含む。
ーとＪＲ断片の間に存在する。プラスミドＰＧＸ２６０
６はイリノイ州ビオリアの米国農務省農業研究施設に取
得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５５５１として大腸菌Ｋ１２
ＧＸ１１７０（λ）内に保管してあシ、ＢａｍＨＩ感受
性部位とアンピリジン抵抗性遺伝子に隣接するλＯＬ７
′ＰＲ雑種プロモーター／オペレーターを含む。
プラスミドＰＧＸ２２３１をｘｈｏ Ｉ で分解し、
粘着（性）末端はＤＮＡポリメラーゼのフレナラ（ｋｌ
ｅｎｏｗ）断片（Ｋｌａｎｏｗ、 Ｈ，ら、「欧州微生
物ジー？ −１＃ ）（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏａｈｅ
ｍ ） ）第２２巻３３７頁（１９７７）によりｄＡＴ
Ｐ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰを含む
反応溶液内で二重鎖とした。プラスミドＰＧＸ２６０６
はＢａｍＨＩで分解し粘着末端をやはシフレナラ断片で
二重鎖化シタ。２つのＤＮＡ ラフエノール−クロロホ
ルム抽出とエタノール沈殿により精製し、ＴｑＤＮＡリ
ガーゼで高ＤＮＡ濃度（約２００μｔ／ｌｉ）において
結合した。次にこの中間体をＢｆｌ Ｉ で分解し、生
じた混合溶液をフェノール−クロロホルムで抽出しエタ
ノールで沈殿させた。第２番目の結合はＴｌｌリガーゼ
により低ＤＮＡ濃度で行ないプラスミドＰＧＸ１０４９
を作成した。このプラスミドは、温度感受性リプレッサ
ータンパク質を暗号化するＣＩ ８５７変異を伴う欠陥
溶原化λを含む大腸菌株ＧＸ１２０１ を、アンピリジ
ン抵抗性を示す細胞を選択することにより形質転換する
のに使用した。アンピリジン抵抗性細胞はさらに、温度
を４２℃に移行させた後のｔｒｐＢ−Δ２プロキモジン
生産能力の有無により選別した。高温において生産が行
なわれるということはｔｙ３４ Ｂ −Ａ ２ プロ
キモジン遺伝子が（Ａ ８５７遺伝子で暗号化されるリ
プレッサータンパク質に対応スルＯＬ／ＰＲプロモータ
ーーオペレーターの制御下にあることを示す。
粘着（性）末端はＤＮＡポリメラーゼのフレナラ（ｋｌ
ｅｎｏｗ）断片（Ｋｌａｎｏｗ、 Ｈ，ら、「欧州微生
物ジー？ −１＃ ）（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏａｈｅ
ｍ ） ）第２２巻３３７頁（１９７７）によりｄＡＴ
Ｐ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰを含む
反応溶液内で二重鎖とした。プラスミドＰＧＸ２６０６
はＢａｍＨＩで分解し粘着末端をやはシフレナラ断片で
二重鎖化シタ。２つのＤＮＡ ラフエノール−クロロホ
ルム抽出とエタノール沈殿により精製し、ＴｑＤＮＡリ
ガーゼで高ＤＮＡ濃度（約２００μｔ／ｌｉ）において
結合した。次にこの中間体をＢｆｌ Ｉ で分解し、生
じた混合溶液をフェノール−クロロホルムで抽出しエタ
ノールで沈殿させた。第２番目の結合はＴｌｌリガーゼ
により低ＤＮＡ濃度で行ないプラスミドＰＧＸ１０４９
を作成した。このプラスミドは、温度感受性リプレッサ
ータンパク質を暗号化するＣＩ ８５７変異を伴う欠陥
溶原化λを含む大腸菌株ＧＸ１２０１ を、アンピリジ
ン抵抗性を示す細胞を選択することにより形質転換する
のに使用した。アンピリジン抵抗性細胞はさらに、温度
を４２℃に移行させた後のｔｒｐＢ−Δ２プロキモジン
生産能力の有無により選別した。高温において生産が行
なわれるということはｔｙ３４ Ｂ −Ａ ２ プロ
キモジン遺伝子が（Ａ ８５７遺伝子で暗号化されるリ
プレッサータンパク質に対応スルＯＬ／ＰＲプロモータ
ーーオペレーターの制御下にあることを示す。
ＧＸ １２０１ （ＰＧＸ １０４９ ）株をアンピリ
ジン含有（１００μｆ／ｄ）ＬＢ培地を入れた振盪フラ
スコ内で３０℃で生育させ、プラスミドＰＧＸ１０４９
を違法に従って単離しＮａｒ Ｉ で分解した。
ジン含有（１００μｆ／ｄ）ＬＢ培地を入れた振盪フラ
スコ内で３０℃で生育させ、プラスミドＰＧＸ１０４９
を違法に従って単離しＮａｒ Ｉ で分解した。
プラスミドＰＧＸＩＩＯは事実上ＰＥＰ１２と同一のも
゛のであＪ） （Ｅｎｇｅｔ−ｖａｌｋ ｍ Ｂ−
’Ｅ、ら、「遺伝子（ｃｅｎｅ）Ｊ第９巻６９〜１３５
頁１９８０ ） 、 ｔｒｐｃ遺伝子内にあるｅｌａＩ
感受性部位を含む２この同部位と完全なｔｒｐオペロ
ンを含む。本プラスミドをｃｌａＩで分解し、ｔｒｐＥ
Ｄ遺伝子とｔｒｐｃ遺伝子の一部とを含む４．５ｓｋｂ
（キロペース） ＤＮＡ断片を０．８５チ寒天ゲル上で
の電気泳動、電気溶出、 ＤＥＡＥセルロースによるク
ロマトグラフィー（溶出液は１．０ ＭＮＡｃＬ−１０
−２トリス、 １ｏ ＭｇｐＴ＊ｐａｓ、ｏ）、およ
びそれに続くエタノール沈殿により分離した。
゛のであＪ） （Ｅｎｇｅｔ−ｖａｌｋ ｍ Ｂ−
’Ｅ、ら、「遺伝子（ｃｅｎｅ）Ｊ第９巻６９〜１３５
頁１９８０ ） 、 ｔｒｐｃ遺伝子内にあるｅｌａＩ
感受性部位を含む２この同部位と完全なｔｒｐオペロ
ンを含む。本プラスミドをｃｌａＩで分解し、ｔｒｐＥ
Ｄ遺伝子とｔｒｐｃ遺伝子の一部とを含む４．５ｓｋｂ
（キロペース） ＤＮＡ断片を０．８５チ寒天ゲル上で
の電気泳動、電気溶出、 ＤＥＡＥセルロースによるク
ロマトグラフィー（溶出液は１．０ ＭＮＡｃＬ−１０
−２トリス、 １ｏ ＭｇｐＴ＊ｐａｓ、ｏ）、およ
びそれに続くエタノール沈殿により分離した。
線状化したＰＧＸ１０４９とｔｒｐＥＤＣＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより高ＤＮＡ濃度におｈて結合し
た（ＮａｒＩとす土工は同じ粘着末端を生ずるので他の
前処理は不要であった）。環状プラスミドの再生は、ま
ずＭｌｕＩによる分解でｔｒｐ Ｃ内とＰＧＸ１０４９
由来のＤＮＡの非重要部位内の箇所を切断し、フェノー
ル−クロロホルム抽出とエタノール沈殿によυ精製した
後、ＴＩＩリガーゼにより低ＤＮＡ濃度（１〜１０μり
ｈＯにおいて再び結合させて完了した。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより高ＤＮＡ濃度におｈて結合し
た（ＮａｒＩとす土工は同じ粘着末端を生ずるので他の
前処理は不要であった）。環状プラスミドの再生は、ま
ずＭｌｕＩによる分解でｔｒｐ Ｃ内とＰＧＸ１０４９
由来のＤＮＡの非重要部位内の箇所を切断し、フェノー
ル−クロロホルム抽出とエタノール沈殿によυ精製した
後、ＴＩＩリガーゼにより低ＤＮＡ濃度（１〜１０μり
ｈＯにおいて再び結合させて完了した。
結合反応物でｔｒｐＥＤ １０２変異（Ｅ、 Ｎ、 Ｊ
ａｅｋｓｏｎおよびＣ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ著、「分子生
物学ジャーナル（Ｊ。
ａｅｋｓｏｎおよびＣ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ著、「分子生
物学ジャーナル（Ｊ。
Ｍｏｔｅｃｕｔａｒ Ｂｉｏ、 ） Ｊ第７１巻１４９
頁（１９７２） ）を含む大腸菌株を形質転換した。大
腸菌ＧＸ１７３１株の構造は実施例■に記載する。形質
転換細胞はアンピリジン抵抗性と外来トリプトファン不
在下での生育能力により同定した。プロキモジン生産は
温度転移誘導後実証され、違法に従って分離したプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼ分解によ如確認された。
頁（１９７２） ）を含む大腸菌株を形質転換した。大
腸菌ＧＸ１７３１株の構造は実施例■に記載する。形質
転換細胞はアンピリジン抵抗性と外来トリプトファン不
在下での生育能力により同定した。プロキモジン生産は
温度転移誘導後実証され、違法に従って分離したプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼ分解によ如確認された。
本プラスミドをＰＧＸ２２５７と命名した。
本プラスミドにより形質転換した大腸菌株ＧＸ１７３１
（ＰＧＸ２２５７ ）は、イリノイ州ビオリアの米国農
務省農業研究施設にＮＲＲＬ ＮＣＩ Ｂ−１５７７１
として保管した。
（ＰＧＸ２２５７ ）は、イリノイ州ビオリアの米国農
務省農業研究施設にＮＲＲＬ ＮＣＩ Ｂ−１５７７１
として保管した。
実施例■
ＰＩ形質導入を利用したＧＸ１７３１株の作成Ｍｉｌｌ
ｅｒ （Ｊ、 Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ著「分子遺伝学におけ
る実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ＭｏｔｅｅｕＬ
ａｒ Ｇｅｎ＠ｔ１ｃｍ ） Ｊ ’：ｙ−ルドスブリ
ングハーバー研究所、 １９７２年）忙よ）記載された
ファージＰＩ形質導入を使用した。
ｅｒ （Ｊ、 Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ著「分子遺伝学におけ
る実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ＭｏｔｅｅｕＬ
ａｒ Ｇｅｎ＠ｔ１ｃｍ ） Ｊ ’：ｙ−ルドスブリ
ングハーバー研究所、 １９７２年）忙よ）記載された
ファージＰＩ形質導入を使用した。
大腸菌ａｐ３３８ （Ｆ−、１１ＥＤ１０２． ｔｈｒ
、 ａｎｄ２ ） 。
、 ａｎｄ２ ） 。
（Ｒｅａｄｅｒおよび５ｏｒｎｅｒｖｉｌｌｅ著「分子
および一般遺伝学（Ｍｏｔｅｃｕｔａｒ ａｎｄ Ｇｅ
ｎｒｒａｔＧｅｎｅｔｉｃｍ ） Ｊ第１７６巻３６１
〜３６８頁（１９７９） ）は米国農務省北部地域研究
センターから取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−４５６９で入手で
きる。５ｐ３３８の培養株を０．１ ＭＭｇＳＯｑと０
．Ｏ５ＭＣ凰ｃｔ２を含むＬＢ培地でＡ３１１ｏが０．
３となるまで生育させた。
および一般遺伝学（Ｍｏｔｅｃｕｔａｒ ａｎｄ Ｇｅ
ｎｒｒａｔＧｅｎｅｔｉｃｍ ） Ｊ第１７６巻３６１
〜３６８頁（１９７９） ）は米国農務省北部地域研究
センターから取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−４５６９で入手で
きる。５ｐ３３８の培養株を０．１ ＭＭｇＳＯｑと０
．Ｏ５ＭＣ凰ｃｔ２を含むＬＢ培地でＡ３１１ｏが０．
３となるまで生育させた。
次いで大腸菌ＧＸ １２１３ （Ｆ−、［λ蛙８５７Δ
勝ΔＨＩ）。
勝ΔＨＩ）。
ル司Ａ：：ガ１０．垣Ｊｄｋ、Δ〔吐ｐ−匝１〕）の感
染により調製したｐｌｋｃ溶菌物の１０倍および１００
倍希釈液を０．１ｍ／ずつｓｐ ３３８細胞０．１ｍｌ
に添加し、３７℃で３０分間保温した。その後細胞を遠
心分離して沈殿させ、約０．１−のＬＢ培地に再び懸濁
し、テトラサイクリン２５μｆ／ｌｄを含むＬＢ寒天平
板上にまいた。平板は３０℃で保温した。テトラサイク
リン抵抗性形質導入細胞を採取しテトラサイクリン２５
μｆ／ｌＲ１を含むＬＢ培地で３０℃で生育させた。
染により調製したｐｌｋｃ溶菌物の１０倍および１００
倍希釈液を０．１ｍ／ずつｓｐ ３３８細胞０．１ｍｌ
に添加し、３７℃で３０分間保温した。その後細胞を遠
心分離して沈殿させ、約０．１−のＬＢ培地に再び懸濁
し、テトラサイクリン２５μｆ／ｌｄを含むＬＢ寒天平
板上にまいた。平板は３０℃で保温した。テトラサイク
リン抵抗性形質導入細胞を採取しテトラサイクリン２５
μｆ／ｌＲ１を含むＬＢ培地で３０℃で生育させた。
培養物を７１Ｍ寒天平板上に線状接種し、λファージと
λｖｉｒファージ（Ａ、 Ｄ、 Ｈｅｒｉｈｅ７編集「
バクテリオファージ・ラムダ（Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ）Ｊ ＊２２１〜２４５頁
Ｍ、 Ｐｔａａｈｎｅ著、コールドスプリングハーバ−
研究所発行１９７１年）の溶菌物をスポットした。平板
を各希釈度について２枚ずつ用意し、そのうち１枚を３
０℃で残シ１枚を４２℃で保温した。３０℃ではλ抵抗
性だが４２℃では非抵抗性であシ、しかも両温度におい
てλｖｉｒで溶菌されｒ９１） る株１種類を分離選択した。３０℃ではλ抵抗性があシ
４２℃では溶菌されるということは染色体中に温度感受
性態」５７ラムダリブレツサーが存在することを示す。
λｖｉｒファージ（Ａ、 Ｄ、 Ｈｅｒｉｈｅ７編集「
バクテリオファージ・ラムダ（Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ）Ｊ ＊２２１〜２４５頁
Ｍ、 Ｐｔａａｈｎｅ著、コールドスプリングハーバ−
研究所発行１９７１年）の溶菌物をスポットした。平板
を各希釈度について２枚ずつ用意し、そのうち１枚を３
０℃で残シ１枚を４２℃で保温した。３０℃ではλ抵抗
性だが４２℃では非抵抗性であシ、しかも両温度におい
てλｖｉｒで溶菌されｒ９１） る株１種類を分離選択した。３０℃ではλ抵抗性があシ
４２℃では溶菌されるということは染色体中に温度感受
性態」５７ラムダリブレツサーが存在することを示す。
λｖｉｒ（リプレッサーに対して抵抗性をもつ）による
溶菌は、λ抵抗性が旺遺伝子産物に無関係な機構により
与えられているのではないことを確認するための補助的
検査手段である。
溶菌は、λ抵抗性が旺遺伝子産物に無関係な機構により
与えられているのではないことを確認するための補助的
検査手段である。
トリプトファンおよびスレオニン変異は、３０℃におけ
る２０μｍ／−のトリプトファンとスレオニンの存在下
と不存在下でのＭｉｎＡ １ ％グルコース寒天平板上
での生育反応を分析することにより確認した。得られた
株をＧＸ １７２９ （Ｆ″″、町ＥＤ１０２．臣。
る２０μｍ／−のトリプトファンとスレオニンの存在下
と不存在下でのＭｉｎＡ １ ％グルコース寒天平板上
での生育反応を分析することにより確認した。得られた
株をＧＸ １７２９ （Ｆ″″、町ＥＤ１０２．臣。
１ｈＪＬ２．〔λ旦８５７Δｌ圃ΔＨＩ：ｌ、Δ〔部−
〃ｐ〕。
〃ｐ〕。
１ｄ人： ニー１０ ）と命名した。
（注） ＴＢＭ培地組成
１チトリプトン 最小人寒天 １．５％０．５％Ｎａ
ＣｔＫ２ＨＰＯ１１１０，’４ ｆ／１１．５％寒天
ＫＨ２ＰＯ４４，５ｔ／１０．２％マルトース（
ＮＨｌｌ）２ＳＯ＋１ １．０ ｆ／１１０ｍＭ Ｍ
ｇ８０４ クエン酸ナトリウＡ ・２Ｈ２００
，５１７１Ｍｇ５Ｏ１１０，２ｔ／ｌ 次に、ＧＸ１７２９に、大腸菌アメリカン・タイプカル
チャー・コレクションＮａ ２７３２５ （野性株）ニ
感染させることにより調製したＰｉｋｅ溶菌物を利用し
て前記のような方法で形質導入した。沈殿した細胞を０
．９チＮａＣ１で一度洗浄し、最小量の０．９ＮａＣ１
に懸濁した後、２０μｆ／−のトリプトファンを含みか
つスレオニンを含まぬＭｉｎＡ １ ％グルコース平板
にまいた。平板を３０℃で保温した。得られた分離物は
検査により、ＧＸ１７２９と同一のλ感染発現型とトリ
プトファン要求性をもちかつスレオニン要求性をもたぬ
ことが確認された。得られた分離物をＧＸ １７３１
（Ｆ−、υＩＥＤ １０２ 、 ｔｎａ ２ 、 ［λ
旦８５７ΔＢａｍΔＨ１〕、Δ［ｃｈｌＤ−ｐｇｌ：Ｉ
、 ｎａｄＡ： ：ＴｎｌＯ）と命名した。
ＣｔＫ２ＨＰＯ１１１０，’４ ｆ／１１．５％寒天
ＫＨ２ＰＯ４４，５ｔ／１０．２％マルトース（
ＮＨｌｌ）２ＳＯ＋１ １．０ ｆ／１１０ｍＭ Ｍ
ｇ８０４ クエン酸ナトリウＡ ・２Ｈ２００
，５１７１Ｍｇ５Ｏ１１０，２ｔ／ｌ 次に、ＧＸ１７２９に、大腸菌アメリカン・タイプカル
チャー・コレクションＮａ ２７３２５ （野性株）ニ
感染させることにより調製したＰｉｋｅ溶菌物を利用し
て前記のような方法で形質導入した。沈殿した細胞を０
．９チＮａＣ１で一度洗浄し、最小量の０．９ＮａＣ１
に懸濁した後、２０μｆ／−のトリプトファンを含みか
つスレオニンを含まぬＭｉｎＡ １ ％グルコース平板
にまいた。平板を３０℃で保温した。得られた分離物は
検査により、ＧＸ１７２９と同一のλ感染発現型とトリ
プトファン要求性をもちかつスレオニン要求性をもたぬ
ことが確認された。得られた分離物をＧＸ １７３１
（Ｆ−、υＩＥＤ １０２ 、 ｔｎａ ２ 、 ［λ
旦８５７ΔＢａｍΔＨ１〕、Δ［ｃｈｌＤ−ｐｇｌ：Ｉ
、 ｎａｄＡ： ：ＴｎｌＯ）と命名した。
実施例■
トリプトファン欠損クレブシェラガス産生菌ＧＸ１７０
５の創出 ｔｒｐオペロンに変異のある宿主株は化学的突然変異誘
発により誘導した。
５の創出 ｔｒｐオペロンに変異のある宿主株は化学的突然変異誘
発により誘導した。
クレブシェラガス産生菌株ＬＶＯ２５（１Ｉｌｄ）細胞
を２０７！のＬＢ培地で３０℃でＡ３１ｉ０＝ ０．４
５となるまで生育させ、遠心分離後、０．１Ｍクエン酸
ナトリウムｐＨ５，５２０ｔｄ中に再び懸濁した。新し
く調製し濾過滅菌した。クエン酸緩衝液ｐＨ５，５中で
濃度を１１−に調整したニトロソグアニジン溶液を懸濁
した細胞に添加した。細胞をニトロソグアニジン（約５
０チのクレブシェラガス産生菌を殺すとされている）の
存在で３０℃で０．５時間保温した後、細胞を４０００
ｆで遠心分離し、０．１Ｍリン酸（ｐＨ７，０）で洗
浄し、５０ｆｎｔのＬＢ培地に再び懸濁し３０℃で１晩
振盪培養した。
を２０７！のＬＢ培地で３０℃でＡ３１ｉ０＝ ０．４
５となるまで生育させ、遠心分離後、０．１Ｍクエン酸
ナトリウムｐＨ５，５２０ｔｄ中に再び懸濁した。新し
く調製し濾過滅菌した。クエン酸緩衝液ｐＨ５，５中で
濃度を１１−に調整したニトロソグアニジン溶液を懸濁
した細胞に添加した。細胞をニトロソグアニジン（約５
０チのクレブシェラガス産生菌を殺すとされている）の
存在で３０℃で０．５時間保温した後、細胞を４０００
ｆで遠心分離し、０．１Ｍリン酸（ｐＨ７，０）で洗
浄し、５０ｆｎｔのＬＢ培地に再び懸濁し３０℃で１晩
振盪培養した。
次にシクロセリン処理を利用してトリプトファン要求性
変異株濃度を高めた（ Ｊ、 Ｈ，ミラー、前掲２３０
〜２３４頁）。前記細胞の１／４を遠心分離で集め、１
チグルコースを含みグリシンとトリプトファン以外の全
アミノ酸を補足（２０μｆ／ｒｒＬｌ）シた最小Ａ培地
１００ ｔｎｔに再び懸濁した。全最小培地培養物にビ
タミン類の標準溶液を補足した。混合物を３０℃で３堤
時間保温し、新たに調製した０、２ＭＤ−シクロセリン
の０．１Ｍリン酸緩衝液溶液１−を添加し、さらに３時
間保温を続けて成長細胞の溶菌を起こさせた。グリシン
とトリプトファンの生合成能を欠く細胞はこの培地中で
は成長できないため、Ｄ−シクロセリン処理しても生き
残る。
変異株濃度を高めた（ Ｊ、 Ｈ，ミラー、前掲２３０
〜２３４頁）。前記細胞の１／４を遠心分離で集め、１
チグルコースを含みグリシンとトリプトファン以外の全
アミノ酸を補足（２０μｆ／ｒｒＬｌ）シた最小Ａ培地
１００ ｔｎｔに再び懸濁した。全最小培地培養物にビ
タミン類の標準溶液を補足した。混合物を３０℃で３堤
時間保温し、新たに調製した０、２ＭＤ−シクロセリン
の０．１Ｍリン酸緩衝液溶液１−を添加し、さらに３時
間保温を続けて成長細胞の溶菌を起こさせた。グリシン
とトリプトファンの生合成能を欠く細胞はこの培地中で
は成長できないため、Ｄ−シクロセリン処理しても生き
残る。
細胞を遠心分離して集め、５０ｄのＬＢ培地に再懸濁し
３０℃で一晩保温した。前記と同様のシクロセリン濃縮
処理をもう一度行なった後、細胞を集め第３番目の処理
として０．２ＭＤ−シクロセリン１−の存在下で１００
−の最小Ａ１％グルコース培地中で２時間生育させ、そ
の後細胞を再び遠心分離して集めトリプトファンとグリ
シンを２０μｆ／ｄ添加した最小ＡｌｔＩＯグルコース
培地で１晩生育させた。最終的なシクロセリン濃縮処理
を第３番目の処理と同様の方法で打力った。次に細胞を
２０μｆ／−のトリプトファンを含む最小Ａ１％グルコ
ース平板上に接種し、レプリカを最小Ａ１ｅｓグルコー
ス平板上に接種した。トリプトファン不在下では最小量
１％グルコース平板上で生育しない３種の変異株が同定
された。そのうちの１種は１０μｔ／−のインドールを
添加した最小量グルコース培地でも生育不可能であシ、
これは突然変異がトリプトファンシンセターゼを暗号化
するｔｒｐ−オペロン（ｔｇ２ ＢＡ ）の領域に生じ
たことを示す。この株をクレブシェラガス産生菌ｃｘ１
７０５ （ｌａｄす」−）と命名した。
３０℃で一晩保温した。前記と同様のシクロセリン濃縮
処理をもう一度行なった後、細胞を集め第３番目の処理
として０．２ＭＤ−シクロセリン１−の存在下で１００
−の最小Ａ１％グルコース培地中で２時間生育させ、そ
の後細胞を再び遠心分離して集めトリプトファンとグリ
シンを２０μｆ／ｄ添加した最小ＡｌｔＩＯグルコース
培地で１晩生育させた。最終的なシクロセリン濃縮処理
を第３番目の処理と同様の方法で打力った。次に細胞を
２０μｆ／−のトリプトファンを含む最小Ａ１％グルコ
ース平板上に接種し、レプリカを最小Ａ１ｅｓグルコー
ス平板上に接種した。トリプトファン不在下では最小量
１％グルコース平板上で生育しない３種の変異株が同定
された。そのうちの１種は１０μｔ／−のインドールを
添加した最小量グルコース培地でも生育不可能であシ、
これは突然変異がトリプトファンシンセターゼを暗号化
するｔｒｐ−オペロン（ｔｇ２ ＢＡ ）の領域に生じ
たことを示す。この株をクレブシェラガス産生菌ｃｘ１
７０５ （ｌａｄす」−）と命名した。
前記の培地の組成を以下に示す。
ＬＢ培地：５ｆ／を酵母抽出物
１０ｔ／ｌトリプトン
５ ｆ／Ｌ ＮａＣｔ
最小量培地： Ｋ２ＨＰＯ１１１０，５ｔ／１ＫＨ２
ＰＯ１１４，５ｆ／１ （ＮＨｕ）２ＳＯ＋４ １． ｏ ｔ７
ｔクエン酸ナトリウム・２Ｈ２００，５９７１Ｍｇ５Ｏ
１１０，２ｆ／Ｌ １００Ｘビタミン溶液：ビオチン ０．１ｍ
ｇ／／ｎｔニコチン酸 ２．０勢− チアミン １．０ｍｇ／− パラアミノ安息香酸 １．０■／−パントテン酸
５．０肋ｔ ピリドキサミン ０．５ｒＩｖｍｊ実施例■ セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現のため
の補償プラスミドＰＧＸ２２３７ （思ＥＤＣＢＡ。
ＰＯ１１４，５ｆ／１ （ＮＨｕ）２ＳＯ＋４ １． ｏ ｔ７
ｔクエン酸ナトリウム・２Ｈ２００，５９７１Ｍｇ５Ｏ
１１０，２ｆ／Ｌ １００Ｘビタミン溶液：ビオチン ０．１ｍ
ｇ／／ｎｔニコチン酸 ２．０勢− チアミン １．０ｍｇ／− パラアミノ安息香酸 １．０■／−パントテン酸
５．０肋ｔ ピリドキサミン ０．５ｒＩｖｍｊ実施例■ セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現のため
の補償プラスミドＰＧＸ２２３７ （思ＥＤＣＢＡ。
−ｇ４ｙ Ａ ）の作成
プラスミドＰＧＸ２２３７ は以下の方法で作成した（
第２図参照）。プラスミドｐＥＰ ３９２についてばＢ
、 Ｅ、 Ｅｍｇｅｒ−Ｖａｌｋら著「遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）Ｊ第９巻６９〜８５頁（１９８０） Ｋ詳述されて
いる。
第２図参照）。プラスミドｐＥＰ ３９２についてばＢ
、 Ｅ、 Ｅｍｇｅｒ−Ｖａｌｋら著「遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）Ｊ第９巻６９〜８５頁（１９８０） Ｋ詳述されて
いる。
プラスミドＰＥＰ ３９２ （υ」−プロモーターに制
御されるｔｒｐ ＥＤＣＢＡを暗号化する塩基配列と、
竺１プロモーターの前方にあるｘｈｏＩ制限部位と、ｘ
ｈｏ Ｉ部位の前方にあるＥｃｏＲＩ制限部位とを含む
）を２ｊＨＩで処理して線状化した。プラスミドＰＧＸ
１３９は大腸菌ｇ１７ Ａ遺伝子をその制限領域も含め
て保有しており、この遺伝子は酵素のセリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ ）を暗号化する
。プラスミドＰＧＸ １３９をｓａｌ Ｉで処理して線
状化し、ＤＮＡリガーゼにより高ＤＮＡ ９度（１００
０μｆ／＋＋／）においてｐＥＰ ３９２のｘｈｏ Ｉ
と結合した。得られた高分子量結合ポリマーをＥｃ
ｏ ＲＩで分解し短い結合ポリマー産物を作成した。こ
の結合産物をＤＮＡＩＪカー−Ｌ’により低ＤＮＡ濃度
（１０μｒ／７りにおいて環状化した。
御されるｔｒｐ ＥＤＣＢＡを暗号化する塩基配列と、
竺１プロモーターの前方にあるｘｈｏＩ制限部位と、ｘ
ｈｏ Ｉ部位の前方にあるＥｃｏＲＩ制限部位とを含む
）を２ｊＨＩで処理して線状化した。プラスミドＰＧＸ
１３９は大腸菌ｇ１７ Ａ遺伝子をその制限領域も含め
て保有しており、この遺伝子は酵素のセリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ ）を暗号化する
。プラスミドＰＧＸ １３９をｓａｌ Ｉで処理して線
状化し、ＤＮＡリガーゼにより高ＤＮＡ ９度（１００
０μｆ／＋＋／）においてｐＥＰ ３９２のｘｈｏ Ｉ
と結合した。得られた高分子量結合ポリマーをＥｃ
ｏ ＲＩで分解し短い結合ポリマー産物を作成した。こ
の結合産物をＤＮＡＩＪカー−Ｌ’により低ＤＮＡ濃度
（１０μｒ／７りにおいて環状化した。
実施例Ｔｌｌで得られたトリプトファン欠損細胞のクレ
ブシェラガス産生菌ＧＸ １７０５を結合産物で形質転
換し、Ｐ上形質転換細胞集落をトリプトファン存在下と
不在下でのレプリカ平板培養によυ同定し後続の分析用
に選択した。プラスミドＤＮＡを違法により分離しＰＧ
Ｘ２２３７と推定される大きさのプラスミドをゲル電気
泳動法により同定した。対応する形質転換細胞集落はさ
らに酵素活性測定において高ＳＨＭＴ産生レベルに関し
て分析された。
ブシェラガス産生菌ＧＸ １７０５を結合産物で形質転
換し、Ｐ上形質転換細胞集落をトリプトファン存在下と
不在下でのレプリカ平板培養によυ同定し後続の分析用
に選択した。プラスミドＤＮＡを違法により分離しＰＧ
Ｘ２２３７と推定される大きさのプラスミドをゲル電気
泳動法により同定した。対応する形質転換細胞集落はさ
らに酵素活性測定において高ＳＨＭＴ産生レベルに関し
て分析された。
プラスミドＰＧＸ２２３７で形質転換したクレブシェラ
ガス産生菌ＧＸ１７０５の試料は、メリーランド州ロッ
クヴイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに取得番号ＡＴＣＣ３９４０７で保管した。
ガス産生菌ＧＸ１７０５の試料は、メリーランド州ロッ
クヴイルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに取得番号ＡＴＣＣ３９４０７で保管した。
実施例Ｖ
ｔｒｐＥＤ安定化遺伝子を伴うプロキモジン生産用プラ
スミドであるＰＧＸ２２５７による、プラスミド安定化
法の評価 プラスミドＰＧＸ１０４９とｐｃｘ２２５７で、アンピ
リジン抵抗性により選別するカルシウムショック法（Ｍ
、 ＭｅｎｄｅｌおよびＡ、 Ｈｉｇａ ｒ分子生物学
ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｔｏｆ Ｍｏｔｅｃｕｔａｒ
Ｂｉｏｔｏｇｙ ） Ｊ第５３巻１５９〜１６２頁（
１９７０） ）を利用して大腸菌ＧＸ１７３１ （実施
例■参照）を形質転換した。発酵過程においてはアンピ
リジンを選別機構として使用するのは不可能と考えられ
る。プラスミドＰＧＸ２２５７に対するｔｒｐＥＤ遺伝
子の安定化効果を確定するために、ＰＧＸ２２５７の安
定性をトリプトファン遺伝子安定化（実施例Ｉ）を備え
ぬ類似プラスミドであるプラスミドＰＧＸ１０４９と比
較した。ＧＸ１７３１（ＰＧＸ ２２５７ ）をトリプ
トファンを欠＜ ｃａｓａｍｉｎ。
スミドであるＰＧＸ２２５７による、プラスミド安定化
法の評価 プラスミドＰＧＸ１０４９とｐｃｘ２２５７で、アンピ
リジン抵抗性により選別するカルシウムショック法（Ｍ
、 ＭｅｎｄｅｌおよびＡ、 Ｈｉｇａ ｒ分子生物学
ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｔｏｆ Ｍｏｔｅｃｕｔａｒ
Ｂｉｏｔｏｇｙ ） Ｊ第５３巻１５９〜１６２頁（
１９７０） ）を利用して大腸菌ＧＸ１７３１ （実施
例■参照）を形質転換した。発酵過程においてはアンピ
リジンを選別機構として使用するのは不可能と考えられ
る。プラスミドＰＧＸ２２５７に対するｔｒｐＥＤ遺伝
子の安定化効果を確定するために、ＰＧＸ２２５７の安
定性をトリプトファン遺伝子安定化（実施例Ｉ）を備え
ぬ類似プラスミドであるプラスミドＰＧＸ１０４９と比
較した。ＧＸ１７３１（ＰＧＸ ２２５７ ）をトリプ
トファンを欠＜ ｃａｓａｍｉｎ。
ａｃｉｄ （カサミノ酸）培地（０，４％カサミノ酸を
含む最小人塩類）中でフラスコ連続継代培養により３０
世代以上生育した。トリプトファンを欠く培地では、ｔ
ｒｐ変異宿主細胞によるＰＧＸ２２５７の保有に対して
正の選択圧が作用する。同様に、ＧＸ１７３１（ｐｃｘ
１０４９ ）をそのｔｒｐＥＤ欠損を補償するために
トリプトファンを添加したカサミノ酸培地で生育した。
含む最小人塩類）中でフラスコ連続継代培養により３０
世代以上生育した。トリプトファンを欠く培地では、ｔ
ｒｐ変異宿主細胞によるＰＧＸ２２５７の保有に対して
正の選択圧が作用する。同様に、ＧＸ１７３１（ｐｃｘ
１０４９ ）をそのｔｒｐＥＤ欠損を補償するために
トリプトファンを添加したカサミノ酸培地で生育した。
この場合、アンピリジンは不在のためＰＧＸ１０４９へ
の正の選択圧はない。プラスミドの安定性を、トリプト
ファン２０μｆ／ｍ／を含有するカサミノ酸培地（全生
存細胞の確定のため）と含有しない同培地（プラスミド
保有細胞の確定のため）上にＧＸ１７３１ （ＰＧＸ２
２５７ ）培養希釈液を等量ずつ直接接種することによ
り数回検査した。同様に、ＧＸ１７３１ （ＰＧＸ１０
４９）培養希釈液を２０μｆ７個トリプトファン含有カ
サミノ酸培地（全生存細胞の確定のため）とトリプトフ
ァンおよび１００μｆ／−アンピリジン含有カサミノ酸
培地（プラスミド保有細胞の確定のため）上に接種した
。結果を次の表に示す。
の正の選択圧はない。プラスミドの安定性を、トリプト
ファン２０μｆ／ｍ／を含有するカサミノ酸培地（全生
存細胞の確定のため）と含有しない同培地（プラスミド
保有細胞の確定のため）上にＧＸ１７３１ （ＰＧＸ２
２５７ ）培養希釈液を等量ずつ直接接種することによ
り数回検査した。同様に、ＧＸ１７３１ （ＰＧＸ１０
４９）培養希釈液を２０μｆ７個トリプトファン含有カ
サミノ酸培地（全生存細胞の確定のため）とトリプトフ
ァンおよび１００μｆ／−アンピリジン含有カサミノ酸
培地（プラスミド保有細胞の確定のため）上に接種した
。結果を次の表に示す。
係安定性（選択地 の°°＝−数ｘｌＯＯ）非選択培地
上のコロニー数 直接接種実験に固有のピペット操作変動誤差を生ずる可
能性があるため、プラスミド安定性に関してレプリカ平
板による第２の検査も行なった。
上のコロニー数 直接接種実験に固有のピペット操作変動誤差を生ずる可
能性があるため、プラスミド安定性に関してレプリカ平
板による第２の検査も行なった。
本実験の結果も前記の表に示す。レプリカ平板実験にも
誤差を生ずる可能性がある、というのは本実験は非選択
培地上に接種された１００この集落を採取しこれを選択
培地上にレプリカして行なったためである。非選択培地
上で集落へ成長してゆく間にプラスミドが失なわれる可
能性もある。しかし、結果はｔｒｐＥＤ選択機構の使用
が、大量の菌を得る之め何世代にもわたる生育を必要と
するような大規模な発酵における、実行可能な方法であ
ることを証明している。
誤差を生ずる可能性がある、というのは本実験は非選択
培地上に接種された１００この集落を採取しこれを選択
培地上にレプリカして行なったためである。非選択培地
上で集落へ成長してゆく間にプラスミドが失なわれる可
能性もある。しかし、結果はｔｒｐＥＤ選択機構の使用
が、大量の菌を得る之め何世代にもわたる生育を必要と
するような大規模な発酵における、実行可能な方法であ
ることを証明している。
実施例■
ｔｒｐ ＥＤＣＢＡ遺伝子安定化を伴うセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼ生産用プラスミドである、
プラスミドＰＧＸ２２３７によるプラスミド安定化法の
評価 ＰＧＸ２２３７ （実施例■およびＩＶＫ記載のＡＴ
Ｃ’Ｃ３９４０７）で形質転換したクレブシェラガス産
生菌細胞ＧＸ１７０５細胞を発酵培地１００−に接種し
、３０℃で５００−の振盪フラスコ内で１２時間生育さ
せた。２つの同一の培養種を２つの１０ ｔニュー・プ
ランスヴイック・サイエンティフィック発酵槽に接種し
、３０℃で反応させた。成長が停止する反応終了時点で
、細胞を滅菌生理食塩水（０，１５％ＮａＣｔ）で種々
の程度に希釈し、ＬＢおよび最小人グルコース寒天培地
に等容量ずつ接種した（Ｍｉｌｌｅｒ著［分子遺伝学に
おける実験（Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） Ｊコールトスプリ
ングツ１−バー研究所発行（１９７２） ４３２〜４３
３頁、および実施例■参照）。
シメチルトランスフェラーゼ生産用プラスミドである、
プラスミドＰＧＸ２２３７によるプラスミド安定化法の
評価 ＰＧＸ２２３７ （実施例■およびＩＶＫ記載のＡＴ
Ｃ’Ｃ３９４０７）で形質転換したクレブシェラガス産
生菌細胞ＧＸ１７０５細胞を発酵培地１００−に接種し
、３０℃で５００−の振盪フラスコ内で１２時間生育さ
せた。２つの同一の培養種を２つの１０ ｔニュー・プ
ランスヴイック・サイエンティフィック発酵槽に接種し
、３０℃で反応させた。成長が停止する反応終了時点で
、細胞を滅菌生理食塩水（０，１５％ＮａＣｔ）で種々
の程度に希釈し、ＬＢおよび最小人グルコース寒天培地
に等容量ずつ接種した（Ｍｉｌｌｅｒ著［分子遺伝学に
おける実験（Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ） Ｊコールトスプリ
ングツ１−バー研究所発行（１９７２） ４３２〜４３
３頁、および実施例■参照）。
平板培養実験 ：ｊｏニー数
最小平板培地のコロニー数はＬＢ平板培地のコロニー数
と同等であシ、プラスミドの消失は問題にならぬことを
示している。この問題をさらに確認するためにレプリカ
平板培養実験を行なった。前記のＬＢ平板培地から１０
０この集落を滅菌した楊子で採取し、第２のＬＢ平板培
地と最小人グルコース平板培地に接種し３０℃で生育さ
せた。
と同等であシ、プラスミドの消失は問題にならぬことを
示している。この問題をさらに確認するためにレプリカ
平板培養実験を行なった。前記のＬＢ平板培地から１０
０この集落を滅菌した楊子で採取し、第２のＬＢ平板培
地と最小人グルコース平板培地に接種し３０℃で生育さ
せた。
２００この集落のうち最小培地で生育しなかったのは１
つのみであった。これらのコロニーははじめ平板培地実
験でのＬＢ培地（トリプトファンの存−在に関して選択
的条件ではない）で生育したため、１つの集落が生育不
能であることは予想されうろことでおる。このように、
プラスミドの安定性は１ｏｔの大規模な発酵過程でも保
たれた。
つのみであった。これらのコロニーははじめ平板培地実
験でのＬＢ培地（トリプトファンの存−在に関して選択
的条件ではない）で生育したため、１つの集落が生育不
能であることは予想されうろことでおる。このように、
プラスミドの安定性は１ｏｔの大規模な発酵過程でも保
たれた。
発酵培地：
に２ＨＰＯ１１５，２５ｆ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ１１２
，２５ｆ／ｌクエン酸ナトリウム ｏ、ｓｔ７ｔ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０５，７Ｘ１０ ｔ／ｌシヨ糖
２Ｃ）ｔ／Ｌ １００×微量ミネラル ＣａＣｌ２ ・２Ｈ２０１，１ｆ／Ｌ Ｆｅ８０ｑ ・７ Ｈ２Ｏ０，７ｆ／ＬＭｎＳＯｑ ・
４Ｈ２００，２ｆ／Ｌ ＺｎＳＯ１１・７Ｈ２００，２ｆ／１ ＣｎＳＯｑ ・５ Ｈ２Ｏ０，０４ｔ／ｌエチレジアミ
ン四酢酸二ナトリウム ３９．４ ｆ／を発酵条件 二ニー・プランズヴイツク・サイエンティフィック・マ
イクロファーム発酵槽（ＭＦ−１１４） ’ｔ’使用し
、ｐＨは１０１池ＯＨと１０チＨ２５ｏｉｌの自動滴下
によりフ、０に保った。振盪は６００ ｒｐｍ ＊温度
は３０℃、通気は１分間当υ等容積の空気とした。
，２５ｆ／ｌクエン酸ナトリウム ｏ、ｓｔ７ｔ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０５，７Ｘ１０ ｔ／ｌシヨ糖
２Ｃ）ｔ／Ｌ １００×微量ミネラル ＣａＣｌ２ ・２Ｈ２０１，１ｆ／Ｌ Ｆｅ８０ｑ ・７ Ｈ２Ｏ０，７ｆ／ＬＭｎＳＯｑ ・
４Ｈ２００，２ｆ／Ｌ ＺｎＳＯ１１・７Ｈ２００，２ｆ／１ ＣｎＳＯｑ ・５ Ｈ２Ｏ０，０４ｔ／ｌエチレジアミ
ン四酢酸二ナトリウム ３９．４ ｆ／を発酵条件 二ニー・プランズヴイツク・サイエンティフィック・マ
イクロファーム発酵槽（ＭＦ−１１４） ’ｔ’使用し
、ｐＨは１０１池ＯＨと１０チＨ２５ｏｉｌの自動滴下
によりフ、０に保った。振盪は６００ ｒｐｍ ＊温度
は３０℃、通気は１分間当υ等容積の空気とした。
第１図は宿主細胞の瓜ＥＤ １０２変異を補償するｌＥ
Ｄ遺伝子を伴うプロキモジン発現ベクターである、プラ
スミドＰＧＸ２２５７の作成を図式化した説明図である
。 第２図は宿主細胞のｔｒｐ変異を補償するｍオペロン遺
伝子を運ぶセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
発現ベクターである、プラスミドＰＧＸ２２３７の作成
を図式化した説明図である。
Ｄ遺伝子を伴うプロキモジン発現ベクターである、プラ
スミドＰＧＸ２２５７の作成を図式化した説明図である
。 第２図は宿主細胞のｔｒｐ変異を補償するｍオペロン遺
伝子を運ぶセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
発現ベクターである、プラスミドＰＧＸ２２３７の作成
を図式化した説明図である。
Claims (15)
- （１）微生物によりタンパク質を大規模生産する方法で
あつて、 ａ）微生物の細胞内のトリプトファンオペロンの遺伝子
の１つ以上に、細胞がその生存と成長に必要なトリプト
ファンを生産することを不可能とするような突然変異を
起こさせること、 ｂ）前記の株を、 １）目的のタンパク質を暗号化し、かつベクター上の発
現信号の制御下にある遺伝子、 および ２）発現信号の制御下で宿主細胞の変異遺伝子または変
異遺伝子群を補償する機能的 ￥ｔｒｐ￥遺伝子または遺伝子群 からなる組み換えベクターで形質転換すること、および ｃ）形質転換細胞を実質的にトリプトファン不在の培地
中で遺伝子発現条件下で生育させること、 からなる方法。 - （２）トリプトファンオペロンの一部のみが前記の突然
変異により欠損されている特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （３）突然変異が遺伝子の誤つた翻訳を生じさせる特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （４）突然変異が遺伝子の転写と翻訳のいずれかを妨害
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）宿主細胞の突然変異が紫外線によりもたらされる
特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記
載の方法。 - （６）宿主細胞の突然変異が化学薬品により誘発される
特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記
載の方法。 - （７）宿主細胞の突然変異がウィルスにより誘発される
特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記
載の方法。 - （８）宿主細胞の突然変異がトランスポゾンにより誘発
される特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
４項記載の方法。 - （９）前記のトリプトファンオペロンの欠損部が￥ｔｒ
ｐ￥ＥＤ領域である特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （１０）（ｃ）項の生育培地がトリプトファンを分解し
てある培地である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１１）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
項、第５項、第６項、第７項、第８項または第９項に記
載の方法のいずれかより安定化された、宿主細胞系統−
発現ベクター系。 - （１２）生産される外来タンパク質がプロキモジンであ
る特許請求の範囲第１１項記載の安定化した宿主細胞−
発現ベクター系。 - （１３）生産される外来タンパク質がセリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼである特許請求の範囲第１１
項記載の安定化した宿主細胞−発現ベクター系。 - （１４）ＰＧＸ２２５７で形質転換されＮＲＲＬＢ−１
５７７１と指定された大腸菌株ＧＸ１７３１。 - （１５）ＰＧＸ２２３７で形質転換されＡＴＣＣ３９４
０７と指定されたクレブシエラガス産生菌株ＧＸ１７０
５。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64499884A | 1984-08-28 | 1984-08-28 | |
| US644998 | 1984-08-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6158595A true JPS6158595A (ja) | 1986-03-25 |
Family
ID=24587229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60186759A Pending JPS6158595A (ja) | 1984-08-28 | 1985-08-27 | 徴生物によるタンパク質規模生産方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0178764A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6158595A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009511006A (ja) * | 2005-10-06 | 2009-03-19 | ドンペ ファルマ ソシエタ ペル アチオニ | 新規選択系 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| CA2019696A1 (en) * | 1989-06-26 | 1990-12-26 | William L. Muth | Control of aberrant expression vector accumulation during fermentation procedures |
| RU2099418C1 (ru) * | 1991-11-21 | 1997-12-20 | Лонца Аг | Фрагмент днк, обеспечивающий использование бетаина, рекомбинантная плазмидная днк с фрагментом днк, обеспечивающим использование бетаина, штамм бактерий rhizobium/agrobacterium, предназначенный для стабильного хранения плазмиды с фрагментом днк, способ получения штамма бактерий |
| US6291245B1 (en) | 1998-07-15 | 2001-09-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Host-vector system |
| EP0972838B1 (en) * | 1998-07-15 | 2004-09-15 | Roche Diagnostics GmbH | Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| AU3036684A (en) * | 1983-07-07 | 1985-01-10 | Genex Corp. | Production of bovine calf chymosin |
-
1985
- 1985-08-27 EP EP85306061A patent/EP0178764A1/en not_active Ceased
- 1985-08-27 JP JP60186759A patent/JPS6158595A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009511006A (ja) * | 2005-10-06 | 2009-03-19 | ドンペ ファルマ ソシエタ ペル アチオニ | 新規選択系 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0178764A1 (en) | 1986-04-23 |
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