CN109666617B

CN109666617B - 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109666617B
Application number: CN201710953111.8A
Authority: CN
Inventors: 谢新开; 徐伟
Original assignee: Sichuan Lier Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan lier Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: CN109666617A; CN112725254B; CN112725254A; WO2019071668A1

Abstract

本发明提供一种L‑高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L‑苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因。

Description

一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。

目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：

(1)化学法；该方法采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；

(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。

(3)生物酶催化法；该方法利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该方法主要问题是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。

(4)微生物发酵法；该方法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，目前的L-高丝氨酸发酵依赖于以质粒为载体的基因过表达体系，其劣势是菌种传代稳定性差。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种稳定的L-高丝氨酸的生产菌株。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的基因工程方法。

因此，本发明提供一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，其染色体DNA上一个或多个与L-苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因。

优选地，所述被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；所述被突变以增强的基因为thrA和/或rhtA，所述整合拷贝的基因为thrA*、ppc、pntA、pntB、asd、aspA和aspC中的一个或多个。

优选地，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。

进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

本发明还提供所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：

A、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；

B、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因通过点突变过表达或增强功能；

C、构建菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达。

优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB和/或thrL；

所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA和/或rhtA；

所述步骤B中，thrA和/或rhtA基因分别被突变为thrA*和/或rthA23基因。且所述突变thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性，突变rhtA23具有增加表达量的效果；

所述步骤C中所述的通过提高染色体拷贝数来过表达的基因为thrA*、ppc、pntA、pntB、apsA，aspC和asd中的一个或多个。

优选地，上述步骤中所述的构建菌株属于大肠杆菌种属。

进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

本发明还提供所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸中的应用。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明通过对L-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因的多拷贝整合表达，可实现稳定高产的目的。相对之前报道的通过质粒载体过表达的方式，本发明的菌株传代稳定性好，发酵结果稳定，并且产量较之前高。

(2)本发明所构建的L-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，相对带质粒形式的菌种副产物少，糖酸转化率高。

(3)本发明的L-高丝氨酸的生产菌株，发酵全程无需使用抗生素，避免了抗生素对环境的污染以及潜在的抗性基因流入环境的可能。

具体实施方式

实施例中均采用大肠杆菌MG1655构建L-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技术。可参照文献“Lambda Red Recombination One-step inactivation of chromosomalgenes inEscherichia coli K-12 using PCR products.”Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun 6；97(12):6640-5.和“Development of a fast and easy method for Escherichiacoli genome editing with CRISPR/Cas9.”Microb Cell Fact.2016 Dec 1；15(1):205.。

实施例中采用的所述温敏质粒具有文献Cell Fact.2016 Dec 1；15(1):205.中的温敏质粒所示的DNA序列结构；所述原始菌株大肠杆菌MG1655购买自ATCC；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。实施例中，所述阿拉伯糖诱导条件具体为：在含20mM阿拉伯糖的LB培养基中，30℃诱导培养。

实施例1

敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因增强菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建。

本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建，其构建方法可见中国专利申请CN201710106474.8。

实施例2

在染色体DNA上单拷贝表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建。

本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为染色体DNA上同时整合表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB)，其构建方法可参考文献:Microb Cell Fact.2016 Dec 1；15(1):205，具体包括如下步骤：

(1)以实施例1中所得菌种染色体DNA为模板，以pSOE-thrA-f、pSOE-ppc-thrA-r；pSOE-thrA-ppc-f、pSOE-aspA-ppc-r；pSOE-ppc-aspA-f、pSOE-pntA-aspA-r；pSOE-aspA-pntA-f、pntB-r为引物，通过重叠延伸PCR法(即SOE-PCR法)进行扩增，将模板菌中位于对应天然启动子下的thrA*、ppc、AspA、pntAB等基因连接起来，得到整合插入的基因DNA片段；

其中，所述引物pSOE-thrA-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pSOE-ppc-thrA-r SEQ ID No.2所示的序列，所述引物pSOE-thrA-ppc-f具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述引物pSOE-aspA-ppc-r具有如SEQ ID No.4所示的序列，所述引物pSOE-ppc-aspA-f具有如SEQ ID No.5所示的序列，所述引物pSOE-pntA-aspA-r具有如SEQ ID No.6所示的序列，所述引物pSOE-aspA-pntA-f具有如SEQ ID No.7所示的序列，所述引物pntB-r具有如SEQ ID No.8所示的序列，

具体如下：

SEQ ID No.1：5’-GCTCATATTGGCACTGGAAG-3’；

SEQ ID No.2：5’-CTTATGGAAATGTTAAAAAATCGCCAA

GCTTTACGCGAACGAG-3’；

SEQ ID No.3：5’-CTCGTTCGCGTAAAGCTTGGCGATTTT

TTAACATTTCCATAAG-3’；

SEQ ID No.4：5’-CATTTTCCTTTATGTCTATATTGAGAT

TTCCCTTAAGGATATCTGAAGGTATATTCAG-3’；

SEQ ID No.5：5’-CTGAATATACCTTCAGATATCCTTAAG

GGAAATCTCAATATAGACATAAAGGAAAATG-3’；

SEQ ID No.6：5’-GTACTGAAAATTATGCCTGTGATCTGT

GCCTTTTTTATTTGTACTACCCT-3’；

SEQ ID No.7：5’-AGGGTAGTACAAATAAAAAAGGCACAG

ATCACAGGCATAATTTTCAGTAC-3’；

SEQ ID No.8：5’-TCTCAATAAAGAGTGACGGC-3’。

(2)以MG1655基因组DNA为模板，使用pSOE-cadA-H1-f、pSOE-cadA-H1-r；pSOE-cadA-H2-f、pSOE-cadA-H2-r为引物，分别获得cadA的上下游整合同源臂，再通过重叠延伸PCR法(即SOE-PCR法)与步骤(1)中得到的所述片段DNA进行扩增，构成整合供体DNA。结合pcadA-N20-f、pcadA-N20-r克隆到温敏质粒中，所述温敏质粒含有通过诱导表达Gam、Bet以及Exo 3种Lambda噬菌体重组酶、Cas9DNA内切酶；

所述引物pSOE-cadA-H1-f具有如SEQ ID No.9所示的序列，所述引物pSOE-cadA-H1-r具有如SEQ ID No.10所示的序列，所述引物pSOE-cadA-H2-f具有如SEQ ID No.11所示的序列，所述引物pSOE-cadA-H2-r具有如SEQ ID No.12所示的序列，所述引物pcadA-N20-f具有如SEQ ID No.13所示的序列，所述引物pcadA-N20-r具有如SEQ ID No.14所示的序列，

具体如下：

SEQ ID No.9：5’-GTGCAGCGCCAGAGCCAC-3’；

SEQ ID No.10：5’-GCCGTCACTCTTTATTGAGAGCTTTAGT

CAGCGGAGGC-3’；

SEQ ID No.11：5’-CTTCCAGTGCCAATATGAGCACTGTTTA

AATATGTTCGTGAAGG-3’；

SEQ ID No.12：5’-GAGCTGGATGGATTTCACATCCAGTG-3’；

SEQ ID No.13：5’-AGCGGCCTCCGCTGACTAAAGCAT-3’；

SEQ ID No.14：5’-AAACATGCTTTAGTCAGCGGAGGC-3’；

所述整合插入的基因DNA片段具有如SEQ ID No.15所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.15：5’-GCTCATATTGGCACTGGAAGCCGGGGCATAAACTTTAACCATGTCAGACTCCTAACTTCCATGAGAGGGTACGTAGCAGATCAGCAAAGACACCGGCAGCTGTAACGTCATTGCCCGCACCATATCCGCGCAGTACCAACGGCAGCGGCTGATAATAGTGGCTATAGAAGGCCAGGGCGTTTTCGCCATTTTTCACTTTGAACAGCGGATCATTACCATCCACTTCGGCAATCTTCACGCGGCAGACGCCATCTTCATCAATATTGCCAACATAGCGCAAAACTTTTCCTTCATCACGGGCCTTCGCCACGCGCGCGGCAAAGAGATCGTCGAGTTGTGACAGATTCGCCATAAAAGCGGCAACATCACCCTCGGCGTTAAACTCTGCGGGCAGCACAGGTTCAATTTCAATATCCGCCAGCTCCAGTTCACGTCCCGTTTCACGAGCGAGAATCAATAGTTTACGCGCCACATCCATACCAGAAAGATCATCTCGCGGGTCCGGTTCGGTATAACCCATTTCCCGCGCCAGCGTGGTCGCCTCGGAGAAACTCATGCCTTCGTCTAACTTGCCGAAGATATAAGAAAGCGAACCAGAAAGAATGCCGGAGAACTTCATCAATTCATCACCTGCATTGAGCAGATTTTGCAGGTTCTCAATAACCGGTAATCCAGCCCCAACGTTGGTGTCATAGAGGAATTTACGCCGCGATTTTTCCGCCGCATAACGCAACTGATGGTAGTAATCCATCGACGAGGTGTTGGCCTTTTTGTTCGGCGTGACAACGTGGAAACCTTCGCGCAGGAAGTCGGCATATTGATCCGCCACTGCCTGGCTGGAAGTGCAGTCAACAATGACCGGGTTCAGCAGATGATATTCTTTCACGAGGCGAATTAAGCGCCCGAGATTAAACGGCTCTTTGGCTTGCGCCAGTTCTTCCTGCCAGTTTTCCAGATTAAGGCCATGTACATTGGTGAGCAGAGCCTTCGAGTTGGCAACACCGCAGACACGTAAGTCGATATGTTTATTCTTCAGCCAGCTTTGCTGACGCTTCAGTTGCTCCAGCAGCGCACCGCCAACGCCACCGACGCCAATCACAAACACTTCGATAACCTGATCGGTATTGAACAGCATCTGATGAGTAACGCGCACGCCAGTGGTCGCATCATCGTTATTTACCACGACAGAGATTGAGCGTTCAGAAGATCTCTGAGCAATGGCGACAATGTTGATATTGGCGCGGGCCAGTGCGGCAAAGAATTTCGCCGAGATCCCACGCAAGGTGCGCATACCATCACCTACCACCGAGATAATGGCCAGCCGTTCCGTCACTGCCAGCGGCTCCAGTAAGCCTTCTTTCAGTTCCAGGTAGAACTCTTCCTGCATTGCCCGTTCAGCTCGCACACAGTCGCTTTGTGGAACGCAGAAACTGATGCTGTATTCGGAAGATGATTGCGTAATCAGCACCACGGAAATACGGGCGCGTGACATCGCTGCAAAGACGCGCGCCGCCATGCCGACCATCCCTTTCATCCCCGGACCAGAAACGCTGAACATTGCCATGTTATTCAGATTGGAAATGCCCTTGACCGGTAATTCGTCTTCATCACGGCTGGCACCAATGAGCGTACCTGGTGCTTGAGGATTTCCGGTATTTTTAATCAGGCAAGGGATCTGGAACTGGGCGATGGGGGTAATGGTGCGGGGGTGAAGAACTTTAGCGCCGAAGTAGGAAAGCTCCATCGCTTCCTGGTAGGACATCGACTTCAACAACCTCGCATCGGGCACCTGACGCGGGTCGCAGGTATAGACCCCGTCAACGTCCGTCCAAATCTCGCAACAATCGGCGCGTAAACAGGCAGCCAGCACCGCAGCAGAGTAGTCGGAACCGTTGCGTCCAAGCACCACCAGTTCGCCTTTTTCATTACCGGCGGTGAAACCTGCCATCAGCACCATGTGATCAGCCGGAATGCGGCTTGCCGCAATACGGCGGGTGGACTCAGCAATATCGACGGTAGATTCGAGGTAATGCCCCACTGCCAGCAGTTTTTCGACCGGATCGATAACAGTAACGTTGTGACCGCGCGCTTCTAATACGCCGGCCATAATGGCGATCGACATTTTCTCGCCACGGCAAATCAGCGCAGCGTTGATGCTATCCGGGCACTGCCCCAACAAACTAATGCCATGCAGGACATGTTTTATTTGGGCAAATTCCTGATCGACGAAAGTTTTCAATTGCGCCAGCGGGAACCCCGGCTGGGCGGCGGCGAGTCCCGTCAAAAGTTCGGCAAAAATACGTTCGGCATCGCTGATATTGGGTAAAGCATCCTGGCCGCTAATGGTTTTTTCAATCATCGCCACCAGGTGGTTGGTGATTTTGGCGGGGGCAGAGAGGACGGTGGCCACCTGCCCCTGCCTGGCATTGCTTTCCAGAATATCGGCAACACGCAGAAAACGTTCTGCATTTGCCACTGATGTACCGCCGAACTTCAACACTCGCATGGTTGTTACCTCGTTACCTTTGGTCGGACTCTAGAGTCTTTATCTGTCTGTGCGCTATGCCTATATTGGTTAAAGTATTTAGTGACCTAAGTCAATAAAATTTTAATTTACTCACGGCAGGTAACCAGTTCAGAAGCTGCTATCAGACACTCTTTTTTTAATCCACACAGAGACATATTGCCCGTTGCAGTCAGAATGAAAAGCTGAAAAATACTTACTAAGGCGTTTTTTATTTGGTGATATTTTTTTCAATATCATGCAGCAAACGGTGCAACATTGCCGTGTCTCGTTGCTCTAAAAGCCCCAGGCGTTGTTGTAACCAGTCGACCAGTTTTATGTCATCTGCCACTGCCAGAGTCGTCAGCAATGTCATGGCTCGTTCGCGTAAAGCTTGGCGATTTTTTAACATTTCCATAAGTTACGCTTATTTAAAGCGTCGTGAATTTAATGACGTAAATTCCTGCTATTTATTCGTTTGCTGAAGCGATTTCGCAGCATTTGACGTCACCGCTTTTACGTGGCTTTATAAAAGACGACGAAAAGCAAAGCCCGAGCATATTCGCGCCAATGCGACGTGAAGGATACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAATATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCAAAGTGCTGGGAGAAACCATCAAGGATGCGTTGGGAGAACACATTCTTGAACGCGTAGAAACTATCCGTAAGTTGTCGAAATCTTCACGCGCTGGCAATGATGCTAACCGCCAGGAGTTGCTCACCACCTTACAAAATTTGTCGAACGACGAGCTGCTGCCCGTTGCGCGTGCGTTTAGTCAGTTCCTGAACCTGGCCAACACCGCCGAGCAATACCACAGCATTTCGCCGAAAGGCGAAGCTGCCAGCAACCCGGAAGTGATCGCCCGCACCCTGCGTAAACTGAAAAACCAGCCGGAACTGAGCGAAGACACCATCAAAAAAGCAGTGGAATCGCTGTCGCTGGAACTGGTCCTCACGGCTCACCCAACCGAAATTACCCGTCGTACACTGATCCACAAAATGGTGGAAGTGAACGCCTGTTTAAAACAGCTCGATAACAAAGATATCGCTGACTACGAACACAACCAGCTGATGCGTCGCCTGCGCCAGTTGATCGCCCAGTCATGGCATACCGATGAAATCCGTAAGCTGCGTCCAAGCCCGGTAGATGAAGCCAAATGGGGCTTTGCCGTAGTGGAAAACAGCCTGTGGCAAGGCGTACCAAATTACCTGCGCGAACTGAACGAACAACTGGAAGAGAACCTCGGCTACAAACTGCCCGTCGAATTTGTTCCGGTCCGTTTTACTTCGTGGATGGGCGGCGACCGCGACGGCAACCCGAACGTCACTGCCGATATCACCCGCCACGTCCTGCTACTCAGCCGCTGGAAAGCCACCGATTTGTTCCTGAAAGATATTCAGGTGCTGGTTTCTGAACTGTCGATGGTTGAAGCGACCCCTGAACTGCTGGCGCTGGTTGGCGAAGAAGGTGCCGCAGAACCGTATCGCTATCTGATGAAAAACCTGCGTTCTCGCCTGATGGCGACACAGGCATGGCTGGAAGCGCGCCTGAAAGGCGAAGAACTGCCAAAACCAGAAGGCCTGCTGACACAAAACGAAGAACTGTGGGAACCGCTCTACGCTTGCTACCAGTCACTTCAGGCGTGTGGCATGGGTATTATCGCCAACGGCGATCTGCTCGACACCCTGCGCCGCGTGAAATGTTTCGGCGTACCGCTGGTCCGTATTGATATCCGTCAGGAGAGCACGCGTCATACCGAAGCGCTGGGCGAGCTGACCCGCTACCTCGGTATCGGCGACTACGAAAGCTGGTCAGAGGCCGACAAACAGGCGTTCCTGATCCGCGAACTGAACTCCAAACGTCCGCTTCTGCCGCGCAACTGGCAACCAAGCGCCGAAACGCGCGAAGTGCTCGATACCTGCCAGGTGATTGCCGAAGCACCGCAAGGCTCCATTGCCGCCTACGTGATCTCGATGGCGAAAACGCCGTCCGACGTACTGGCTGTCCACCTGCTGCTGAAAGAAGCGGGTATCGGGTTTGCGATGCCGGTTGCTCCGCTGTTTGAAACCCTCGATGATCTGAACAACGCCAACGATGTCATGACCCAGCTGCTCAATATTGACTGGTATCGTGGCCTGATTCAGGGCAAACAGATGGTGATGATTGGCTATTCCGACTCAGCAAAAGATGCGGGAGTGATGGCAGCTTCCTGGGCGCAATATCAGGCACAGGATGCATTAATCAAAACCTGCGAAAAAGCGGGTATTGAGCTGACGTTGTTCCACGGTCGCGGCGGTTCCATTGGTCGCGGCGGCGCACCTGCTCATGCGGCGCTGCTGTCACAACCGCCAGGAAGCCTGAAAGGCGGCCTGCGCGTAACCGAACAGGGCGAGATGATCCGCTTTAAATATGGTCTGCCAGAAATCACCGTCAGCAGCCTGTCGCTTTATACCGGGGCGATTCTGGAAGCCAACCTGCTGCCACCGCCGGAGCCGAAAGAGAGCTGGCGTCGCATTATGGATGAACTGTCAGTCATCTCCTGCGATGTCTACCGCGGCTACGTACGTGAAAACAAAGATTTTGTGCCTTACTTCCGCTCCGCTACGCCGGAACAAGAACTGGGCAAACTGCCGTTGGGTTCACGTCCGGCGAAACGTCGCCCAACCGGCGGCGTCGAGTCACTACGCGCCATTCCGTGGATCTTCGCCTGGACGCAAAACCGTCTGATGCTCCCCGCCTGGCTGGGTGCAGGTACGGCGCTGCAAAAAGTGGTCGAAGACGGCAAACAGAGCGAGCTGGAGGCTATGTGCCGCGATTGGCCATTCTTCTCGACGCGTCTCGGCATGCTGGAGATGGTCTTCGCCAAAGCAGACCTGTGGCTGGCGGAATACTATGACCAACGCCTGGTAGACAAAGCACTGTGGCCGTTAGGTAAAGAGTTACGCAACCTGCAAGAAGAAGACATCAAAGTGGTGCTGGCGATTGCCAACGATTCCCATCTGATGGCCGATCTGCCGTGGATTGCAGAGTCTATTCAGCTACGGAATATTTACACCGACCCGCTGAACGTATTGCAGGCCGAGTTGCTGCACCGCTCCCGCCAGGCAGAAAAAGAAGGCCAGGAACCGGATCCTCGCGTCGAACAAGCGTTAATGGTCACTATTGCCGGGATTGCGGCAGGTATGCGTAATACCGGCTAATCTTCCTCTTCTGCAAACCCTCGTGCTTTTGCGCGAGGGTTTTCTGAAATACTTCTGTTCTAACACCCTCGTTTTCAATATATTTCTGTCTGCATTTTATTCAAATTCTGAATATACCTTCAGATATCCTTAAGGGAAATCTCAATATAGACATAAAGGAAAATGGCAATAAAAGGTAACCAGCGCAAAGGTTTCTCCTGTAATAGCAGCCGGTTAACCCCGGCTACCTGAATGGGTTGCGAATCGCGTTTAGCTTATATTGTGGTCATTAGCAAAATTTCAAGATGTTTGCGCAACTATTTTTGGTAGTAATCCCAAAGCGGTGATCTATTTCACAAATTAATAATTAAGGGGTAAAAACCGACACTTAAAGTGATCCAGATTACGGTAGAAATCCTCAAGCAGCATATGATCTCGGGTATTCGGTCGATGCAGGGGATAATCGTCGGTCGAAAAACATTCGAAACCACATATATTCTGTGTGTTTAAAGCAAATCATTGGCAGCTTGAAAAAGAAGGTTCACATGTCAAACAACATTCGTATCGAAGAAGATCTGTTGGGTACCAGGGAAGTTCCAGCTGATGCCTACTATGGTGTTCACACTCTGAGAGCGATTGAAAACTTCTATATCAGCAACAACAAAATCAGTGATATTCCTGAATTTGTTCGCGGTATGGTAATGGTTAAAAAAGCCGCAGCTATGGCAAACAAAGAGCTGCAAACCATTCCTAAAAGTGTAGCGAATGCCATCATTGCCGCATGTGATGAAGTCCTGAACAACGGAAAATGCATGGATCAGTTCCCGGTAGACGTCTACCAGGGCGGCGCAGGTACTTCCGTAAACATGAACACCAACGAAGTGCTGGCCAATATCGGTCTGGAACTGATGGGTCACCAAAAAGGTGAATATCAGTACCTGAACCCGAACGACCATGTTAACAAATGTCAGTCCACTAACGACGCCTACCCGACCGGTTTCCGTATCGCAGTTTACTCTTCCCTGATTAAGCTGGTAGATGCGATTAACCAACTGCGTGAAGGCTTTGAACGTAAAGCTGTCGAATTCCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTACCCAGCTGCAGGACGCAGTACCGATGACCCTCGGTCAGGAATTCCGCGCTTTCAGCATCCTGCTGAAAGAAGAAGTGAAAAACATCCAACGTACCGCTGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTTGGTGCAACGGCAATCGGTACTGGTCTGAACACGCCGAAAGAGTACTCTCCGCTGGCAGTGAAAAAACTGGCTGAAGTTACTGGCTTCCCATGCGTACCGGCTGAAGACCTGATCGAAGCGACCTCTGACTGCGGCGCTTATGTTATGGTTCACGGCGCGCTGAAACGCCTGGCTGTGAAGATGTCCAAAATCTGTAACGACCTGCGCTTGCTCTCTTCAGGCCCACGTGCCGGCCTGAACGAGATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCGGGCTCTTCCATCATGCCAGCTAAAGTAAACCCGGTTGTTCCGGAAGTGGTTAACCAGGTATGCTTCAAAGTCATCGGTAACGACACCACTGTTACCATGGCAGCAGAAGCAGGTCAGCTGCAGTTGAACGTTATGGAGCCGGTCATTGGCCAGGCCATGTTCGAATCCGTTCACATTCTGACCAACGCTTGCTACAACCTGCTGGAAAAATGCATTAACGGCATCACTGCTAACAAAGAAGTGTGCGAAGGTTACGTTTACAACTCTATCGGTATCGTTACTTACCTGAACCCGTTCATCGGTCACCACAACGGTGACATCGTGGGTAAAATCTGTGCCGAAACCGGTAAGAGTGTACGTGAAGTCGTTCTGGAACGCGGTCTGTTGACTGAAGCGGAACTTGACGATATTTTCTCCGTACAGAATCTGATGCACCCGGCTTACAAAGCAAAACGCTATACTGATGAAAGCGAACAGTAATCGTACAGGGTAGTACAAATAAAAAAGGCACAGATCACAGGCATAATTTTCAGTACGTTATAGGGCGTTTGTTACTAATTTATTTTAACGGAGTAACATTTAGCTCGTACATGAGCAGCTTGTGTGGCTCCTGACACAGGCAAACCATCATCAATAAAACCGATGGAAGGGAATATCATGCGAATTGGCATACCAAGAGAACGGTTAACCAATGAAACCCGTGTTGCAGCAACGCCAAAAACAGTGGAACAGCTGCTGAAACTGGGTTTTACCGTCGCGGTAGAGAGCGGCGCGGGTCAACTGGCAAGTTTTGACGATAAAGCGTTTGTGCAAGCGGGCGCTGAAATTGTAGAAGGGAATAGCGTCTGGCAGTCAGAGATCATTCTGAAGGTCAATGCGCCGTTAGATGATGAAATTGCGTTACTGAATCCTGGGACAACGCTGGTGAGTTTTATCTGGCCTGCGCAGAATCCGGAATTAATGCAAAAACTTGCGGAACGTAACGTGACCGTGATGGCGATGGACTCTGTGCCGCGTATCTCACGCGCACAATCGCTGGACGCACTAAGCTCGATGGCGAACATCGCCGGTTATCGCGCCATTGTTGAAGCGGCACATGAATTTGGGCGCTTCTTTACCGGGCAAATTACTGCGGCCGGGAAAGTGCCACCGGCAAAAGTGATGGTGATTGGTGCGGGTGTTGCAGGTCTGGCCGCCATTGGCGCAGCAAACAGTCTCGGCGCGATTGTGCGTGCATTCGACACCCGCCCGGAAGTGAAAGAACAAGTTCAAAGTATGGGCGCGGAATTCCTCGAGCTGGATTTTAAAGAGGAAGCTGGCAGCGGCGATGGCTATGCCAAAGTGATGTCGGACGCGTTCATCAAAGCGGAAATGGAACTCTTTGCCGCCCAGGCAAAAGAGGTCGATATCATTGTCACCACCGCGCTTATTCCAGGCAAACCAGCGCCGAAGCTAATTACCCGTGAAATGGTTGACTCCATGAAGGCGGGCAGTGTGATTGTCGACCTGGCAGCCCAAAACGGCGGCAACTGTGAATACACCGTGCCGGGTGAAATCTTCACTACGGAAAATGGTGTCAAAGTGATTGGTTATACCGATCTTCCGGGCCGTCTGCCGACGCAATCCTCACAGCTTTACGGCACAAACCTCGTTAATCTGCTGAAACTGTTGTGCAAAGAGAAAGACGGCAATATCACTGTTGATTTTGATGATGTGGTGATTCGCGGCGTGACCGTGATCCGTGCGGGCGAAATTACCTGGCCGGCACCGCCGATTCAGGTATCAGCTCAGCCGCAGGCGGCACAAAAAGCGGCACCGGAAGTGAAAACTGAGGAAAAATGTACCTGCTCACCGTGGCGTAAATACGCGTTGATGGCGCTGGCAATCATTCTTTTTGGCTGGATGGCAAGCGTTGCGCCGAAAGAATTCCTTGGGCACTTCACCGTTTTCGCGCTGGCCTGCGTTGTCGGTTATTACGTGGTGTGGAATGTATCGCACGCGCTGCATACACCGTTGATGTCGGTCACCAACGCGATTTCAGGGATTATTGTTGTCGGAGCACTGTTGCAGATTGGCCAGGGCGGCTGGGTTAGCTTCCTTAGTTTTATCGCGGTGCTTATAGCCAGCATTAATATTTTCGGTGGCTTCACCGTGACTCAGCGCATGCTGAAAATGTTCCGCAAAAATTAAGGGGTAACATATGTCTGGAGGATTAGTTACAGCTGCATACATTGTTGCCGCGATCCTGTTTATCTTCAGTCTGGCCGGTCTTTCGAAACATGAAACGTCTCGCCAGGGTAACAACTTCGGTATCGCCGGGATGGCGATTGCGTTAATCGCAACCATTTTTGGACCGGATACGGGTAATGTTGGCTGGATCTTGCTGGCGATGGTCATTGGTGGGGCAATTGGTATCCGTCTGGCGAAGAAAGTTGAAATGACCGAAATGCCAGAACTGGTGGCGATCCTGCATAGCTTCGTGGGTCTGGCGGCAGTGCTGGTTGGCTTTAACAGCTATCTGCATCATGACGCGGGAATGGCACCGATTCTGGTCAATATTCACCTGACGGAAGTGTTCCTCGGTATCTTCATCGGGGCGGTAACGTTCACGGGTTCGGTGGTGGCGTTCGGCAAACTGTGTGGCAAGATTTCGTCTAAACCATTGATGCTGCCAAACCGTCACAAAATGAACCTGGCGGCTCTGGTCGTTTCCTTCCTGCTGCTGATTGTATTTGTTCGCACGGACAGCGTCGGCCTGCAAGTGCTGGCATTGCTGATAATGACCGCAATTGCGCTGGTATTCGGCTGGCATTTAGTCGCCTCCATCGGTGGTGCAGATATGCCAGTGGTGGTGTCGATGCTGAACTCGTACTCCGGCTGGGCGGCTGCGGCTGCGGGCTTTATGCTCAGCAACGACCTGCTGATTGTGACCGGTGCGCTGGTCGGTTCTTCGGGGGCTATCCTTTCTTACATTATGTGTAAGGCGATGAACCGTTCCTTTATCAGCGTTATTGCGGGTGGTTTCGGCACCGACGGCTCTTCTACTGGCGATGATCAGGAAGTGGGTGAGCACCGCGAAATCACCGCAGAAGAGACAGCGGAACTGCTGAAAAACTCCCATTCAGTGATCATTACTCCGGGGTACGGCATGGCAGTCGCGCAGGCGCAATATCCTGTCGCTGAAATTACTGAGAAATTGCGCGCTCGTGGTATTAATGTGCGTTTCGGTATCCACCCGGTCGCGGGGCGTTTGCCTGGACATATGAACGTATTGCTGGCTGAAGCAAAAGTACCGTATGACATCGTGCTGGAAATGGACGAGATCAATGATGACTTTGCTGATACCGATACCGTACTGGTGATTGGTGCTAACGATACGGTTAACCCGGCGGCGCAGGATGATCCGAAGAGTCCGATTGCTGGTATGCCTGTGCTGGAAGTGTGGAAAGCGCAGAACGTGATTGTCTTTAAACGTTCGATGAACACTGGCTATGCTGGTGTGCAAAACCCGCTGTTCTTCAAGGAAAACACCCACATGCTGTTTGGTGACGCCAAAGCCAGCGTGGATGCAATCCTGAAAGCTCTGTAACCCTGACGGCCTCTGCTGAGGCCGTCACTCTTTATTGAGA-3’；

(3)筛选步骤(2)中得到的所述温敏质粒，并将正确的质粒转入实施例1中得到的所述菌株的感受态细胞中，然后，在30℃下进行培养，将成功转入质粒的菌株置于阿拉伯糖诱导条件下继续培养，使其表达Lambda噬菌体重组酶、gRNA和Cas9DNA内切酶，再筛选目标突变体菌落；

(4)将步骤(3)中筛选确认的所述突变体菌落在42℃下培养消除CRISPR/Cas9质粒，同时消除质粒所导致的卡纳霉素抗性，即得到所述菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB)。

实施例3

在染色体DNA上二拷贝整合表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建。

本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为在染色体DNA上同时二次整合表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对yidJ基因的下游插入实施例2中所述SEQ ID No.15片段，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例2产物菌株为操作对象，整合位置为yidJ基因下游。具体为：将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-cadA-H1-f、pSOE-cadA-H1-r、pSOE-cadA-H2-f、pSOE-cadA-H2-r、pcadA-N20-f、pcadA-N20-r,替换为pSOE-yidJ-H1-f、pSOE-yidJ-H1-r、pSOE-yidJ-H2-f、pSOE-yidJ-H2-r、pyidJ-N20-f、pyidJ-N20-r；

其中，所述引物pSOE-yidJ-H1-f具有如SEQ ID No.16所示的序列，所述引物pSOE-yidJ-H1-r具有如SEQ ID No.17所示的序列，所述引物pSOE-yidJ-H2-f具有如SEQ IDNo.18所示的序列，所述引物pSOE-yidJ-H2-r具有如SEQ ID No.19所示的序列，所述引物pyidJ-N20-f具有如SEQ ID No.20所示的序列，所述引物pyidJ-N20-r具有如SEQ ID No.21所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.16：5’-GTGCGAAATTTTCATTGTTGCTCCTTTGC-3’；

SEQ ID No.17：5’-CTTCCAGTGCCAATATGAGCCGGCCTACCGACACAAG-3’；

SEQ ID No.18：5’-GGCCGTCACTCTTTATTGAGAGTGTCATA

GTCGCGTACAAC-3’；

SEQ ID No.19：5’-GAGCCGGCGATGTATGACGACATC-3’；

SEQ ID No.20：5’-AGCGGTTGTACGCGACTATGACAC-3’；

SEQ ID No.21：5’-AAACGTGTCATAGTCGCGTACAAC-3’。

实施例4

在染色体DNA上三拷贝表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建。

本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为在染色体DNA上同时三次整合表达thrA*、ppc、aspA、pntA和pntB的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对atpC基因的下游插入实施例2中所述SEQ ID No.15片段，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例3产物菌株为操作对象，整合位置为atpC基因下游。具体的：将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-cadA-H1-f、pSOE-cadA-H1-r、pSOE-cadA-H2-f、pSOE-cadA-H2-r、pcadA-N20-f、pcadA-N20-r,替换为pSOE-atpC-H1-f、pSOE-atpC-H1-r、pSOE-atpC-H2-f、pSOE-atpC-H2-r、patpC-N20-f、patpC-N20-r；

其中，所述引物pSOE-atpC-H1-f具有如SEQ ID No.22所示的序列，所述引物pSOE-atpC-H1-r具有如SEQ ID No.23所示的序列，所述引物pSOE-atpC-H2-f具有如SEQ IDNo.24所示的序列，所述引物pSOE-atpC-H2-r具有如SEQ ID No.25所示的序列，所述引物patpC-N20-f具有如SEQ ID No.26所示的序列，所述引物patpC-N20-r具有如SEQ ID No.27所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.22：5’-GTGCGAAATTTTCATTGTTGCTCCTTTGC-3’；

SEQ ID No.23：5’-CTTCCAGTGCCAATATGAGCGAAAGCGCCA

TTTTCGACC-3’；

SEQ ID No.24：5’-GCCGTCACTCTTTATTGAGAGTCAGCGGGG

ATAATCCGT-3’；

SEQ ID No.25：5’-GAGCCATAACCGGTCGGATCATCC-3’；

SEQ ID No.26：5’-AGCGGTTGTACGCGACTATGACAC-3’；

SEQ ID No.27：5’-AAACGTGTCATAGTCGCGTACAAC-3’。

实施例5

在染色体DNA继续整合thrA*的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA：：thrA*)的构建。

本实施例构建的L-继续整合thrA*的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA：：thrA*)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，在dacA基因内部插入thrA*表达盒，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例4产物菌株为操作对象，整合位置为反向插入dacA基因内部。具体的：插入片段是使用引物pSOE-thrA-f和pSOE-thrA-r从MG1655基因组通过PCR扩增获得，且将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-cadA-H1-f、pSOE-cadA-H1-r、pSOE-cadA-H2-f、pSOE-cadA-H2-r、pcadA-N20-f、pcadA-N20-r,替换为pSOE-dacA-H1-f、pSOE-dacA-H1-r、pSOE-dacA-H2-f、pSOE-dacA-H2-r、pdacA-N20-f、pdacA-N20-r；

其中，所述引物pSOE-thrA-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pSOE-thrA-r具有如SEQ ID No.28所示的序列，所述引物pSOE-dacA-H1-f具有如SEQ ID No.29所示的序列，所述引物pSOE-dacA-H1-r具有如SEQ ID No.30所示的序列，所述引物pSOE-dacA-H2-f具有如SEQ ID No.31所示的序列，所述引物pSOE-dacA-H2-r具有如SEQ IDNo.32所示的序列，所述引物pdacA-N20-f具有如SEQ ID No.33所示的序列，所述引物pdacA-N20-r具有如SEQ ID No.34所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.28：5’-AAGCTTTACGCGAACGAGC-3’；

SEQ ID No.29：5’-GTGCGAAATTTTCATTGTTGCTCCTTTGC-3’；

SEQ ID No.30：5’-GCTCGTTCGCGTAAAGCTTGTACGTCACGGATCAATGC-3’；

SEQ ID No.31：5’-CTTCCAGTGCCAATATGAGCCGAATGAATACTCGATCT

ATAAAGAAAAAG-3’；

SEQ ID No.32：5’-GAGCAACCAAACCAGTGATGGAAC-3’；

SEQ ID No.33：5’-AGCGAGTATTCATTCGGTACGTCA-3’；

SEQ ID No.34：5’-AAACTGACGTACCGAATGAATACT-3’。

实施例6

在染色体DNA继续整合thrA*的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA::thrA*，ΔbcsB::thrA*)的构建。

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，在bcsB基因内部插入thrA*表达盒，其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例5产物菌株为操作对象，整合位置为反向插入bcsB基因内部。具体的：插入片段同例5，且将实施例5中所述步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-dacA-H1-f、pSOE-dacA-H1-r、pSOE-dacA-H2-f、pSOE-dacA-H2-r、pdacA-N20-f、pdacA-N20-r替换为pSOE-bcsB-H1-f、pSOE-bcsB-H1-r、pSOE-bcsB-H2-f、pSOE-bcsB-H2-r、pbcsB-N20-f、pbcsB-N20-r；

其中，所述引物pSOE-bcsB-H1-f具有如SEQ ID No.35所示的序列，所述引物pSOE-bcsB-H1-r具有如SEQ ID No.36所示的序列，所述引物pSOE-bcsB-H2-f具有如SEQ IDNo.37所示的序列，所述引物pSOE-bcsB-H2-r具有如SEQ ID No.38所示的序列，所述引物pbcsB-N20-f具有如SEQ ID No.39所示的序列，所述引物pbcsB-N20-r具有如SEQ ID No.40所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.35：5’-GTGCTCGTTACTGCCTGTCCAGTC-3’；

SEQ ID No.36：5’-GCTCGTTCGCGTAAAGCTTCAGTTTGACGTAA

GGATTCTGC-3’；

SEQ ID No.37：5’-CTTCCAGTGCCAATATGAGCCTGGTGGTGTTT

GGTCGTGACG-3’；

SEQ ID No.38：5’-GAGCGCTGGAAGGTAATACAGTTATCCAC-3’；

SEQ ID No.39：5’-AGCGGAATCCTTACGTCAAACTGC-3’；

SEQ ID No.40：5’-AAACGCAGTTTGACGTAAGGATTC-3’；

实施例7

在染色体DNA整合aspC的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA::thrA*，ΔbcsB::thrA*，ΔmenH::aspC)的构建。

本实施例构建在染色体DNA整合aspC的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA：：thrA*，ΔmenH::aspC)。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现在menH基因内部插入aspC表达盒。其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例6产生的菌株为操作对象，将天然启动子下的aspC基因反向插入到menH基因内部。具体的：插入片段由引物pSOE-aspC-f和pSOE-aspC-r从MG1655基因组通过PCR扩增获得，且将实施例步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-dacA-H1-f、pSOE-dacA-H1-r、pSOE-dacA-H2-f、pSOE-dacA-H2-r、pdacA-N20-f、pdacA-N20-r替换为pSOE-menH-H1-f、pSOE-menH-H1-r、pSOE-menH-H2-f、pSOE-menH-H2-r、pmenH-N20-f、pmenH-N20-r；

其中，所述引物pSOE-aspC-f具有如SEQ ID No.41所示的序列，所述引物pSOE-aspC-r具有如SEQ ID No.42所示的序列，所述引物pSOE-menH-H1-f具有如SEQ ID No.43所示的序列，所述引物pSOE-menH-H1-r具有如SEQ ID No.44所示的序列，所述引物pSOE-menH-H2-f具有如SEQ ID No.45所示的序列，所述引物pSOE-menH-H2-r具有如SEQ IDNo.46所示的序列，所述引物pmenH-N20-f具有如SEQ ID No.47所示的序列，所述引物pmenH-N20-r具有如SEQ ID No.48所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.41：5’-CTGACCGTACCAACCTGCA-3’；

SEQ ID No.42：5’-CCTGATAAGCGTAGCGCAT-3’；

SEQ ID No.43：5’-GTGCGTTTGCCGACTACTCACG-3’；

SEQ ID No.44：5’-TGCAGGTTGGTACGGTCAGGCGCTAAGGTT

AGCACGTAAAT-3’；

SEQ ID No.45：5’-ATGCGCTACGCTTATCAGGCCGCACATTTG

CGTTTTATTAT-3’；

SEQ ID No.46：5’-GAGCACATTCAGGTGATGTACGCC-3’；

SEQ ID No.47：5’-AGCGACGCAAATGTGCGGGCGCTA-3’；

SEQ ID No.48：5’-AAACTAGCGCCCGCACATTTGCGT-3’。

实施例8

在染色体DNA整合aspC的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA::thrA*，ΔbcsB::thrA*，ΔmenH::aspC，ΔyddB::asd)的构建。

本实施例构建在染色体DNA整合asd的基因工程菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R)，ΔcadA::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔyidJ::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔatpC::thrA*-ppc-aspA-pntAB，ΔdacA::thrA*，ΔbcsB::thrA*，ΔmenH::aspC，ΔyddB::asd)。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现在yddB基因内部插入asd表达盒。其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例7产生的菌株为操作对象，将天然启动子下的asd基因插入到yddB基因内部。具体的：插入片段由引物pSOE-asd-f和pSOE-asd-r从MG1655基因组通过PCR扩增获得，且将实施例步骤(2)中采用的引物由所述pSOE-menH-H1-f、pSOE-menH-H1-r、pSOE-menH-H2-f、pSOE-menH-H2-r、pmenH-N20-f、pmenH-N20-r替换为pSOE-yddB-H1-f、pSOE-yddB-H1-r、pSOE-yddB-H2-f、pSOE-yddB-H2-r、pyddB-N20-f、pyddB-N20-r；

其中，所述引物pSOE-asd-f具有如SEQ ID No.49所示的序列，所述引物pSOE-asd-r具有如SEQ ID No.50所示的序列，所述引物pSOE-yddB-H1-f具有如SEQ ID No.51所示的序列，所述引物pSOE-yddB-H1-r具有如SEQ ID No.52所示的序列，所述引物pSOE-yddB-H2-f具有如SEQ ID No.53所示的序列，所述引物pSOE-yddB-H2-r具有如SEQ ID No.54所示的序列，所述引物pyddB-N20-f具有如SEQ ID No.55所示的序列，所述引物pyddB-N20-r具有如SEQ ID No.56所示的序列，具体如下：

SEQ ID No.41：5’-GGATCCATAATCAGGATCAATAAAACT-3’；

SEQ ID No.42：5’-AGGATCCGCAAAATGGCC-3’；

SEQ ID No.43：5’-GTGCGGCTCTTCAGGAAGTACTTATTAC-3’；

SEQ ID No.44：5’-GTTTTATTGATCCTGATTATGGATCCCAGTCCA

CGCATCGGAATAG-3’；

SEQ ID No.45：5’-GGCCATTTTGCGGATCCTAACGCCATAACCAGT

CTGAAT-3’；

SEQ ID No.46：5’-GAGCCTGAACGAATGCGTTTTGG-3’；

SEQ ID No.47：5’-AGCGATGGCGTTCAGTCCACGCAT-3’；

SEQ ID No.48：5’-AAACATGCGTGGACTGAACGCCAT-3’。

实施例9

L-高丝氨酸生产菌株发酵生产L-高丝氨酸

本实施例采用实施例1中制备得到的菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，其生产方法具体可参见中国专利申请CN201710106474.8，发酵获得高丝氨酸5.3g/L。

作为本实施例可替换的实施方式，所述实施例1最终制备得到的菌株还可替换为实施例2-8中最终制备得到的菌株。

实施例10 L-高丝氨酸生产菌株发酵的结果统计

本实施例优选采用实施例1和实施例4、实施例8构建菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，与MG1655菌对比。其生产方法与实施例10中所述的生产方法完全一致。

按照采用实施例4中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为Hom4、采用实施例8中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为Hom8，分别对L-高丝氨酸的产量进行检测和计算，其结果如下：

菌种	L-高丝氨酸产量(g/L)
		MG1655	0
Hom1	4.8±1.2
		Hom4	53.8±5.9
Hom8	88.1±11.4

由上述结果可知，采用本发明的菌株发酵生产L-高丝氨酸的产量最高达近100g/L，表明本发明对各基因的敲除、弱化、增强、过表达、突变起到了明显的效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州引航生物科技有限公司

<120> 一种L-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用

<130> 2017

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctcatattg gcactggaag 20

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cttatggaaa tgttaaaaaa tcgccaagct ttacgcgaac gag 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctcgttcgcg taaagcttgg cgatttttta acatttccat aag 43

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cattttcctt tatgtctata ttgagatttc ccttaaggat atctgaaggt atattcag 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctgaatatac cttcagatat ccttaaggga aatctcaata tagacataaa ggaaaatg 58

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtactgaaaa ttatgcctgt gatctgtgcc ttttttattt gtactaccct 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

agggtagtac aaataaaaaa ggcacagatc acaggcataa ttttcagtac 50

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tctcaataaa gagtgacggc 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtgcagcgcc agagccac 18

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gccgtcactc tttattgaga gctttagtca gcggaggc 38

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cttccagtgc caatatgagc actgtttaaa tatgttcgtg aagg 44

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gagctggatg gatttcacat ccagtg 26

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

agcggcctcc gctgactaaa gcat 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aaacatgctt tagtcagcgg aggc 24

<210> 15

<211> 10891

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gctcatattg gcactggaag ccggggcata aactttaacc atgtcagact cctaacttcc 60

atgagagggt acgtagcaga tcagcaaaga caccggcagc tgtaacgtca ttgcccgcac 120

catatccgcg cagtaccaac ggcagcggct gataatagtg gctatagaag gccagggcgt 180

tttcgccatt tttcactttg aacagcggat cattaccatc cacttcggca atcttcacgc 240

ggcagacgcc atcttcatca atattgccaa catagcgcaa aacttttcct tcatcacggg 300

ccttcgccac gcgcgcggca aagagatcgt cgagttgtga cagattcgcc ataaaagcgg 360

caacatcacc ctcggcgtta aactctgcgg gcagcacagg ttcaatttca atatccgcca 420

gctccagttc acgtcccgtt tcacgagcga gaatcaatag tttacgcgcc acatccatac 480

cagaaagatc atctcgcggg tccggttcgg tataacccat ttcccgcgcc agcgtggtcg 540

cctcggagaa actcatgcct tcgtctaact tgccgaagat ataagaaagc gaaccagaaa 600

gaatgccgga gaacttcatc aattcatcac ctgcattgag cagattttgc aggttctcaa 660

taaccggtaa tccagcccca acgttggtgt catagaggaa tttacgccgc gatttttccg 720

ccgcataacg caactgatgg tagtaatcca tcgacgaggt gttggccttt ttgttcggcg 780

tgacaacgtg gaaaccttcg cgcaggaagt cggcatattg atccgccact gcctggctgg 840

aagtgcagtc aacaatgacc gggttcagca gatgatattc tttcacgagg cgaattaagc 900

gcccgagatt aaacggctct ttggcttgcg ccagttcttc ctgccagttt tccagattaa 960

ggccatgtac attggtgagc agagccttcg agttggcaac accgcagaca cgtaagtcga 1020

tatgtttatt cttcagccag ctttgctgac gcttcagttg ctccagcagc gcaccgccaa 1080

cgccaccgac gccaatcaca aacacttcga taacctgatc ggtattgaac agcatctgat 1140

gagtaacgcg cacgccagtg gtcgcatcat cgttatttac cacgacagag attgagcgtt 1200

cagaagatct ctgagcaatg gcgacaatgt tgatattggc gcgggccagt gcggcaaaga 1260

atttcgccga gatcccacgc aaggtgcgca taccatcacc taccaccgag ataatggcca 1320

gccgttccgt cactgccagc ggctccagta agccttcttt cagttccagg tagaactctt 1380

cctgcattgc ccgttcagct cgcacacagt cgctttgtgg aacgcagaaa ctgatgctgt 1440

attcggaaga tgattgcgta atcagcacca cggaaatacg ggcgcgtgac atcgctgcaa 1500

agacgcgcgc cgccatgccg accatccctt tcatccccgg accagaaacg ctgaacattg 1560

ccatgttatt cagattggaa atgcccttga ccggtaattc gtcttcatca cggctggcac 1620

caatgagcgt acctggtgct tgaggatttc cggtattttt aatcaggcaa gggatctgga 1680

actgggcgat gggggtaatg gtgcgggggt gaagaacttt agcgccgaag taggaaagct 1740

ccatcgcttc ctggtaggac atcgacttca acaacctcgc atcgggcacc tgacgcgggt 1800

cgcaggtata gaccccgtca acgtccgtcc aaatctcgca acaatcggcg cgtaaacagg 1860

cagccagcac cgcagcagag tagtcggaac cgttgcgtcc aagcaccacc agttcgcctt 1920

tttcattacc ggcggtgaaa cctgccatca gcaccatgtg atcagccgga atgcggcttg 1980

ccgcaatacg gcgggtggac tcagcaatat cgacggtaga ttcgaggtaa tgccccactg 2040

ccagcagttt ttcgaccgga tcgataacag taacgttgtg accgcgcgct tctaatacgc 2100

cggccataat ggcgatcgac attttctcgc cacggcaaat cagcgcagcg ttgatgctat 2160

ccgggcactg ccccaacaaa ctaatgccat gcaggacatg ttttatttgg gcaaattcct 2220

gatcgacgaa agttttcaat tgcgccagcg ggaaccccgg ctgggcggcg gcgagtcccg 2280

tcaaaagttc ggcaaaaata cgttcggcat cgctgatatt gggtaaagca tcctggccgc 2340

taatggtttt ttcaatcatc gccaccaggt ggttggtgat tttggcgggg gcagagagga 2400

cggtggccac ctgcccctgc ctggcattgc tttccagaat atcggcaaca cgcagaaaac 2460

gttctgcatt tgccactgat gtaccgccga acttcaacac tcgcatggtt gttacctcgt 2520

tacctttggt cggactctag agtctttatc tgtctgtgcg ctatgcctat attggttaaa 2580

gtatttagtg acctaagtca ataaaatttt aatttactca cggcaggtaa ccagttcaga 2640

agctgctatc agacactctt tttttaatcc acacagagac atattgcccg ttgcagtcag 2700

aatgaaaagc tgaaaaatac ttactaaggc gttttttatt tggtgatatt tttttcaata 2760

tcatgcagca aacggtgcaa cattgccgtg tctcgttgct ctaaaagccc caggcgttgt 2820

tgtaaccagt cgaccagttt tatgtcatct gccactgcca gagtcgtcag caatgtcatg 2880

gctcgttcgc gtaaagcttg gcgatttttt aacatttcca taagttacgc ttatttaaag 2940

cgtcgtgaat ttaatgacgt aaattcctgc tatttattcg tttgctgaag cgatttcgca 3000

gcatttgacg tcaccgcttt tacgtggctt tataaaagac gacgaaaagc aaagcccgag 3060

catattcgcg ccaatgcgac gtgaaggata cagggctatc aaacgataag atggggtgtc 3120

tggggtaata tgaacgaaca atattccgca ttgcgtagta atgtcagtat gctcggcaaa 3180

gtgctgggag aaaccatcaa ggatgcgttg ggagaacaca ttcttgaacg cgtagaaact 3240

atccgtaagt tgtcgaaatc ttcacgcgct ggcaatgatg ctaaccgcca ggagttgctc 3300

accaccttac aaaatttgtc gaacgacgag ctgctgcccg ttgcgcgtgc gtttagtcag 3360

ttcctgaacc tggccaacac cgccgagcaa taccacagca tttcgccgaa aggcgaagct 3420

gccagcaacc cggaagtgat cgcccgcacc ctgcgtaaac tgaaaaacca gccggaactg 3480

agcgaagaca ccatcaaaaa agcagtggaa tcgctgtcgc tggaactggt cctcacggct 3540

cacccaaccg aaattacccg tcgtacactg atccacaaaa tggtggaagt gaacgcctgt 3600

ttaaaacagc tcgataacaa agatatcgct gactacgaac acaaccagct gatgcgtcgc 3660

ctgcgccagt tgatcgccca gtcatggcat accgatgaaa tccgtaagct gcgtccaagc 3720

ccggtagatg aagccaaatg gggctttgcc gtagtggaaa acagcctgtg gcaaggcgta 3780

ccaaattacc tgcgcgaact gaacgaacaa ctggaagaga acctcggcta caaactgccc 3840

gtcgaatttg ttccggtccg ttttacttcg tggatgggcg gcgaccgcga cggcaacccg 3900

aacgtcactg ccgatatcac ccgccacgtc ctgctactca gccgctggaa agccaccgat 3960

ttgttcctga aagatattca ggtgctggtt tctgaactgt cgatggttga agcgacccct 4020

gaactgctgg cgctggttgg cgaagaaggt gccgcagaac cgtatcgcta tctgatgaaa 4080

aacctgcgtt ctcgcctgat ggcgacacag gcatggctgg aagcgcgcct gaaaggcgaa 4140

gaactgccaa aaccagaagg cctgctgaca caaaacgaag aactgtggga accgctctac 4200

gcttgctacc agtcacttca ggcgtgtggc atgggtatta tcgccaacgg cgatctgctc 4260

gacaccctgc gccgcgtgaa atgtttcggc gtaccgctgg tccgtattga tatccgtcag 4320

gagagcacgc gtcataccga agcgctgggc gagctgaccc gctacctcgg tatcggcgac 4380

tacgaaagct ggtcagaggc cgacaaacag gcgttcctga tccgcgaact gaactccaaa 4440

cgtccgcttc tgccgcgcaa ctggcaacca agcgccgaaa cgcgcgaagt gctcgatacc 4500

tgccaggtga ttgccgaagc accgcaaggc tccattgccg cctacgtgat ctcgatggcg 4560

aaaacgccgt ccgacgtact ggctgtccac ctgctgctga aagaagcggg tatcgggttt 4620

gcgatgccgg ttgctccgct gtttgaaacc ctcgatgatc tgaacaacgc caacgatgtc 4680

atgacccagc tgctcaatat tgactggtat cgtggcctga ttcagggcaa acagatggtg 4740

atgattggct attccgactc agcaaaagat gcgggagtga tggcagcttc ctgggcgcaa 4800

tatcaggcac aggatgcatt aatcaaaacc tgcgaaaaag cgggtattga gctgacgttg 4860

ttccacggtc gcggcggttc cattggtcgc ggcggcgcac ctgctcatgc ggcgctgctg 4920

tcacaaccgc caggaagcct gaaaggcggc ctgcgcgtaa ccgaacaggg cgagatgatc 4980

cgctttaaat atggtctgcc agaaatcacc gtcagcagcc tgtcgcttta taccggggcg 5040

attctggaag ccaacctgct gccaccgccg gagccgaaag agagctggcg tcgcattatg 5100

gatgaactgt cagtcatctc ctgcgatgtc taccgcggct acgtacgtga aaacaaagat 5160

tttgtgcctt acttccgctc cgctacgccg gaacaagaac tgggcaaact gccgttgggt 5220

tcacgtccgg cgaaacgtcg cccaaccggc ggcgtcgagt cactacgcgc cattccgtgg 5280

atcttcgcct ggacgcaaaa ccgtctgatg ctccccgcct ggctgggtgc aggtacggcg 5340

ctgcaaaaag tggtcgaaga cggcaaacag agcgagctgg aggctatgtg ccgcgattgg 5400

ccattcttct cgacgcgtct cggcatgctg gagatggtct tcgccaaagc agacctgtgg 5460

ctggcggaat actatgacca acgcctggta gacaaagcac tgtggccgtt aggtaaagag 5520

ttacgcaacc tgcaagaaga agacatcaaa gtggtgctgg cgattgccaa cgattcccat 5580

ctgatggccg atctgccgtg gattgcagag tctattcagc tacggaatat ttacaccgac 5640

ccgctgaacg tattgcaggc cgagttgctg caccgctccc gccaggcaga aaaagaaggc 5700

caggaaccgg atcctcgcgt cgaacaagcg ttaatggtca ctattgccgg gattgcggca 5760

ggtatgcgta ataccggcta atcttcctct tctgcaaacc ctcgtgcttt tgcgcgaggg 5820

ttttctgaaa tacttctgtt ctaacaccct cgttttcaat atatttctgt ctgcatttta 5880

ttcaaattct gaatatacct tcagatatcc ttaagggaaa tctcaatata gacataaagg 5940

aaaatggcaa taaaaggtaa ccagcgcaaa ggtttctcct gtaatagcag ccggttaacc 6000

ccggctacct gaatgggttg cgaatcgcgt ttagcttata ttgtggtcat tagcaaaatt 6060

tcaagatgtt tgcgcaacta tttttggtag taatcccaaa gcggtgatct atttcacaaa 6120

ttaataatta aggggtaaaa accgacactt aaagtgatcc agattacggt agaaatcctc 6180

aagcagcata tgatctcggg tattcggtcg atgcagggga taatcgtcgg tcgaaaaaca 6240

ttcgaaacca catatattct gtgtgtttaa agcaaatcat tggcagcttg aaaaagaagg 6300

ttcacatgtc aaacaacatt cgtatcgaag aagatctgtt gggtaccagg gaagttccag 6360

ctgatgccta ctatggtgtt cacactctga gagcgattga aaacttctat atcagcaaca 6420

acaaaatcag tgatattcct gaatttgttc gcggtatggt aatggttaaa aaagccgcag 6480

ctatggcaaa caaagagctg caaaccattc ctaaaagtgt agcgaatgcc atcattgccg 6540

catgtgatga agtcctgaac aacggaaaat gcatggatca gttcccggta gacgtctacc 6600

agggcggcgc aggtacttcc gtaaacatga acaccaacga agtgctggcc aatatcggtc 6660

tggaactgat gggtcaccaa aaaggtgaat atcagtacct gaacccgaac gaccatgtta 6720

acaaatgtca gtccactaac gacgcctacc cgaccggttt ccgtatcgca gtttactctt 6780

ccctgattaa gctggtagat gcgattaacc aactgcgtga aggctttgaa cgtaaagctg 6840

tcgaattcca ggacatcctg aaaatgggtc gtacccagct gcaggacgca gtaccgatga 6900

ccctcggtca ggaattccgc gctttcagca tcctgctgaa agaagaagtg aaaaacatcc 6960

aacgtaccgc tgaactgctg ctggaagtta accttggtgc aacggcaatc ggtactggtc 7020

tgaacacgcc gaaagagtac tctccgctgg cagtgaaaaa actggctgaa gttactggct 7080

tcccatgcgt accggctgaa gacctgatcg aagcgacctc tgactgcggc gcttatgtta 7140

tggttcacgg cgcgctgaaa cgcctggctg tgaagatgtc caaaatctgt aacgacctgc 7200

gcttgctctc ttcaggccca cgtgccggcc tgaacgagat caacctgccg gaactgcagg 7260

cgggctcttc catcatgcca gctaaagtaa acccggttgt tccggaagtg gttaaccagg 7320

tatgcttcaa agtcatcggt aacgacacca ctgttaccat ggcagcagaa gcaggtcagc 7380

tgcagttgaa cgttatggag ccggtcattg gccaggccat gttcgaatcc gttcacattc 7440

tgaccaacgc ttgctacaac ctgctggaaa aatgcattaa cggcatcact gctaacaaag 7500

aagtgtgcga aggttacgtt tacaactcta tcggtatcgt tacttacctg aacccgttca 7560

tcggtcacca caacggtgac atcgtgggta aaatctgtgc cgaaaccggt aagagtgtac 7620

gtgaagtcgt tctggaacgc ggtctgttga ctgaagcgga acttgacgat attttctccg 7680

tacagaatct gatgcacccg gcttacaaag caaaacgcta tactgatgaa agcgaacagt 7740

aatcgtacag ggtagtacaa ataaaaaagg cacagatcac aggcataatt ttcagtacgt 7800

tatagggcgt ttgttactaa tttattttaa cggagtaaca tttagctcgt acatgagcag 7860

cttgtgtggc tcctgacaca ggcaaaccat catcaataaa accgatggaa gggaatatca 7920

tgcgaattgg cataccaaga gaacggttaa ccaatgaaac ccgtgttgca gcaacgccaa 7980

aaacagtgga acagctgctg aaactgggtt ttaccgtcgc ggtagagagc ggcgcgggtc 8040

aactggcaag ttttgacgat aaagcgtttg tgcaagcggg cgctgaaatt gtagaaggga 8100

atagcgtctg gcagtcagag atcattctga aggtcaatgc gccgttagat gatgaaattg 8160

cgttactgaa tcctgggaca acgctggtga gttttatctg gcctgcgcag aatccggaat 8220

taatgcaaaa acttgcggaa cgtaacgtga ccgtgatggc gatggactct gtgccgcgta 8280

tctcacgcgc acaatcgctg gacgcactaa gctcgatggc gaacatcgcc ggttatcgcg 8340

ccattgttga agcggcacat gaatttgggc gcttctttac cgggcaaatt actgcggccg 8400

ggaaagtgcc accggcaaaa gtgatggtga ttggtgcggg tgttgcaggt ctggccgcca 8460

ttggcgcagc aaacagtctc ggcgcgattg tgcgtgcatt cgacacccgc ccggaagtga 8520

aagaacaagt tcaaagtatg ggcgcggaat tcctcgagct ggattttaaa gaggaagctg 8580

gcagcggcga tggctatgcc aaagtgatgt cggacgcgtt catcaaagcg gaaatggaac 8640

tctttgccgc ccaggcaaaa gaggtcgata tcattgtcac caccgcgctt attccaggca 8700

aaccagcgcc gaagctaatt acccgtgaaa tggttgactc catgaaggcg ggcagtgtga 8760

ttgtcgacct ggcagcccaa aacggcggca actgtgaata caccgtgccg ggtgaaatct 8820

tcactacgga aaatggtgtc aaagtgattg gttataccga tcttccgggc cgtctgccga 8880

cgcaatcctc acagctttac ggcacaaacc tcgttaatct gctgaaactg ttgtgcaaag 8940

agaaagacgg caatatcact gttgattttg atgatgtggt gattcgcggc gtgaccgtga 9000

tccgtgcggg cgaaattacc tggccggcac cgccgattca ggtatcagct cagccgcagg 9060

cggcacaaaa agcggcaccg gaagtgaaaa ctgaggaaaa atgtacctgc tcaccgtggc 9120

gtaaatacgc gttgatggcg ctggcaatca ttctttttgg ctggatggca agcgttgcgc 9180

cgaaagaatt ccttgggcac ttcaccgttt tcgcgctggc ctgcgttgtc ggttattacg 9240

tggtgtggaa tgtatcgcac gcgctgcata caccgttgat gtcggtcacc aacgcgattt 9300

cagggattat tgttgtcgga gcactgttgc agattggcca gggcggctgg gttagcttcc 9360

ttagttttat cgcggtgctt atagccagca ttaatatttt cggtggcttc accgtgactc 9420

agcgcatgct gaaaatgttc cgcaaaaatt aaggggtaac atatgtctgg aggattagtt 9480

acagctgcat acattgttgc cgcgatcctg tttatcttca gtctggccgg tctttcgaaa 9540

catgaaacgt ctcgccaggg taacaacttc ggtatcgccg ggatggcgat tgcgttaatc 9600

gcaaccattt ttggaccgga tacgggtaat gttggctgga tcttgctggc gatggtcatt 9660

ggtggggcaa ttggtatccg tctggcgaag aaagttgaaa tgaccgaaat gccagaactg 9720

gtggcgatcc tgcatagctt cgtgggtctg gcggcagtgc tggttggctt taacagctat 9780

ctgcatcatg acgcgggaat ggcaccgatt ctggtcaata ttcacctgac ggaagtgttc 9840

ctcggtatct tcatcggggc ggtaacgttc acgggttcgg tggtggcgtt cggcaaactg 9900

tgtggcaaga tttcgtctaa accattgatg ctgccaaacc gtcacaaaat gaacctggcg 9960

gctctggtcg tttccttcct gctgctgatt gtatttgttc gcacggacag cgtcggcctg 10020

caagtgctgg cattgctgat aatgaccgca attgcgctgg tattcggctg gcatttagtc 10080

gcctccatcg gtggtgcaga tatgccagtg gtggtgtcga tgctgaactc gtactccggc 10140

tgggcggctg cggctgcggg ctttatgctc agcaacgacc tgctgattgt gaccggtgcg 10200

ctggtcggtt cttcgggggc tatcctttct tacattatgt gtaaggcgat gaaccgttcc 10260

tttatcagcg ttattgcggg tggtttcggc accgacggct cttctactgg cgatgatcag 10320

gaagtgggtg agcaccgcga aatcaccgca gaagagacag cggaactgct gaaaaactcc 10380

cattcagtga tcattactcc ggggtacggc atggcagtcg cgcaggcgca atatcctgtc 10440

gctgaaatta ctgagaaatt gcgcgctcgt ggtattaatg tgcgtttcgg tatccacccg 10500

gtcgcggggc gtttgcctgg acatatgaac gtattgctgg ctgaagcaaa agtaccgtat 10560

gacatcgtgc tggaaatgga cgagatcaat gatgactttg ctgataccga taccgtactg 10620

gtgattggtg ctaacgatac ggttaacccg gcggcgcagg atgatccgaa gagtccgatt 10680

gctggtatgc ctgtgctgga agtgtggaaa gcgcagaacg tgattgtctt taaacgttcg 10740

atgaacactg gctatgctgg tgtgcaaaac ccgctgttct tcaaggaaaa cacccacatg 10800

ctgtttggtg acgccaaagc cagcgtggat gcaatcctga aagctctgta accctgacgg 10860

cctctgctga ggccgtcact ctttattgag a 10891

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gtgcgaaatt ttcattgttg ctcctttgc 29

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cttccagtgc caatatgagc cggcctaccg acacaag 37

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ggccgtcact ctttattgag agtgtcatag tcgcgtacaa c 41

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gagccggcga tgtatgacga catc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

agcggttgta cgcgactatg acac 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aaacgtgtca tagtcgcgta caac 24

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gtgcgaaatt ttcattgttg ctcctttgc 29

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

cttccagtgc caatatgagc gaaagcgcca ttttcgacc 39

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gccgtcactc tttattgaga gtcagcgggg ataatccgt 39

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gagccataac cggtcggatc atcc 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

agcggttgta cgcgactatg acac 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

aaacgtgtca tagtcgcgta caac 24

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

aagctttacg cgaacgagc 19

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gtgcgaaatt ttcattgttg ctcctttgc 29

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gctcgttcgc gtaaagcttg tacgtcacgg atcaatgc 38

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

cttccagtgc caatatgagc cgaatgaata ctcgatctat aaagaaaaag 50

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gagcaaccaa accagtgatg gaac 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

agcgagtatt cattcggtac gtca 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

aaactgacgt accgaatgaa tact 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

gtgctcgtta ctgcctgtcc agtc 24

<210> 36

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

gctcgttcgc gtaaagcttc agtttgacgt aaggattctg c 41

<210> 37

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

cttccagtgc caatatgagc ctggtggtgt ttggtcgtga cg 42

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

gagcgctgga aggtaataca gttatccac 29

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

agcggaatcc ttacgtcaaa ctgc 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

aaacgcagtt tgacgtaagg attc 24

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

ctgaccgtac caacctgca 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

cctgataagc gtagcgcat 19

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

gtgcgtttgc cgactactca cg 22

<210> 44

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

tgcaggttgg tacggtcagg cgctaaggtt agcacgtaaa t 41

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

atgcgctacg cttatcaggc cgcacatttg cgttttatta t 41

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

gagcacattc aggtgatgta cgcc 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

agcgacgcaa atgtgcgggc gcta 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

aaactagcgc ccgcacattt gcgt 24

Claims

1.一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，在其染色体DNA上thrB基因被敲除；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB和aspA基因被过表达或增强，其中所述rhtA的过表达或增强通过rhtA23实现；

其中所述thrA*基因以额外的不少于三拷贝的形式整合到染色体DNA上而过表达，且所述ppc、pntAB和aspA基因以额外的三拷贝的形式整合到染色体DNA上而过表达；

其中所述L-高丝氨酸的生产菌株由大肠杆菌种属构建。

2.一种L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体，在其染色体DNA上thrB基因被敲除；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB、aspA、aspC和asd基因被过表达或增强，其中所述rhtA的过表达或增强通过rhtA23实现；

其中所述thrA*基因以额外的不少于三拷贝的形式整合到染色体DNA上而过表达，且所述ppc、pntAB和aspA基因以额外的三拷贝的形式整合到染色体DNA上而过表达，且所述aspC和asd基因以额外的单拷贝的形式整合到染色体DNA上而过表达；

其中所述L-高丝氨酸的生产菌株由大肠杆菌种属构建。

3.如权利要求1或2所述的L-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

4.一种权利要求1-3任一项的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括任意顺序的以下步骤：

A、敲除菌株中的thrB基因；

B、过表达菌株中的rhtA基因；

C、敲除菌株中的thrL基因；

D、突变菌株中的thrA基因为thrA*，所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；

C、在菌株中将thrA*、ppc、pntAB和aspA基因或thrA*、ppc、pntAB、aspA、aspC和asd基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达；

其中所述L-高丝氨酸的生产菌株由大肠杆菌种属构建。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

6.如权利要求1-3任一项所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸中的应用。