RU2817252C1 - Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина - Google Patents
Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817252C1 RU2817252C1 RU2023124249A RU2023124249A RU2817252C1 RU 2817252 C1 RU2817252 C1 RU 2817252C1 RU 2023124249 A RU2023124249 A RU 2023124249A RU 2023124249 A RU2023124249 A RU 2023124249A RU 2817252 C1 RU2817252 C1 RU 2817252C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- threonine
- gene
- plasmid
- strain
- trrnb
- Prior art date
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 53
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 20
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 44
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 44
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 15
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 9
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 9
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 101150003909 yjeM gene Proteins 0.000 description 7
- 101100375940 Escherichia coli (strain K12) ychE gene Proteins 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 5
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 5
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 5
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 5
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 101150099894 GDHA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 4
- 101150014717 LysP gene Proteins 0.000 description 4
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 4
- 101150098189 brnQ gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100277701 Halobacterium salinarum gdhX gene Proteins 0.000 description 3
- 101100392454 Picrophilus torridus (strain ATCC 700027 / DSM 9790 / JCM 10055 / NBRC 100828) gdh2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 235000017304 Ruaghas Nutrition 0.000 description 3
- 241000554738 Rusa Species 0.000 description 3
- 101100116769 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) gdhA-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 3
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001482237 Pica Species 0.000 description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 101150107375 rusA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- OJCKRNPLOZHAOU-RSXXJMTFSA-N (1r,2r)-2-[(2s,4e,6e,8r,9s,11r,13s,15s,16s)-7-cyano-8,16-dihydroxy-9,11,13,15-tetramethyl-18-oxo-1-oxacyclooctadeca-4,6-dien-2-yl]cyclopentane-1-carboxylic acid Chemical compound O1C(=O)C[C@H](O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@H](C)[C@@H](O)\C(C#N)=C\C=C\C[C@H]1[C@H]1[C@H](C(O)=O)CCC1 OJCKRNPLOZHAOU-RSXXJMTFSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000190525 Acropora millepora Species 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OJCKRNPLOZHAOU-BNXNOGCYSA-N Borrelidin Natural products CC1CC(C)CC(C)C(O)C(=C/C=C/CC(OC(=O)CC(O)C(C)C1)C2CCCC2C(=O)O)C#N OJCKRNPLOZHAOU-BNXNOGCYSA-N 0.000 description 1
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N CI Basic red 9 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000404883 Pisa Species 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 1
- 229940052223 basic fuchsin Drugs 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 101150065058 nlpD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- -1 scrKYABR Proteins 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 101150107585 tetA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 101150103782 thrL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 101150074973 ychE gene Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Escherichia coli ВКПМ В-14344, имеющий генотип Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK ΔlivKHMGF ΔbrnQ ΔilvA ΔlysP ΔyjeM::PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔychE::Ptac-thrBC-TrrnB miniMu[pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA] и являющийся продуцентом L-треонина. Изобретение обеспечивает высокую продукцию и конверсию глюкозы в треонин. 5 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к микробиологическому синтезу L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli.
Уровень техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов с генетическими модификациями, направленными увеличение продукции L-аминокислот.
В настоящее время известны штаммы-продуценты треонина с различным уровнем продукции аминокислоты. Известен штамм Е. coli Н-8460, полученный в результате мутагенеза и последовательной селекции на резистентность к нескольким аналогам, который продуцирует 75 г/л L-треониназа 70 ч (US 5474918). Другой штамм Е. coli KYI0935, отобранный селективно, является ауксотрофом по метионину и продуцирует 100 г/л L-треонина через 77 ч культивирования при наличии метионина (0,9 г/л) в ферментационной среде (Bioscience, biotechnology, and biochemistry 61.11 (1997): 1877-1882).
Рекомбинантный штамм Е. coli MDS-205, содержащий модификации генов треонинового оперона, генов, ответственных за деградацию и транспорт L-треонина, а также геном редуцированный за счет удаления несущественных участков генома, продуцирует 40,1 г/л L-треонина (Microbial cell factories 8.1 (2009): 1-12).
Описан устойчивый к боррелидину рекомбинантный штамм Е. coli, ADM kat-13, в котором мутантный треониновый оперон в составе хромосомы находится под контролем сильного промотора ptac, функционирующего конститутивно за счет инактивации гена-репрессора lad. Штамм продуцирует 102 г/л L-треонина за 48 ч культивирования, конверсия 33,1% (US 5939307).
Описан высокопродуктиный штамм Е. coli ВКПМ В-12204, в котором гены треонинового оперона экспрессированы под сильным конститутинвым промотором, инактивирован путь синтеза ацетата и усилен транспорт глюкозы в клетку. Штамм несет десенсибилизирующую мутацию в гене thrA. В оптимальных условиях ферментации за 36 ч штамм накапливает в КЖ L-треонин до 105 г/л, при этом конверсия составляет 43%, скорость синтеза 2,91 г/л/ч (RU 2697499).
Известен штамм Е. coli ВКПМ В-13240, имеющий генотип Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK-attL-aadA-attR и обладающий высоким уровнем продукции. При культивировании в ферментере в течение 36 часов данный штамм накапливает треонин в культуральной жидкости в концентрации свыше 100 г/л (RU 2697499).
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является, расширение арсенала штаммов Escherichia coli, способных к продукции треонина.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является конструирование на основе бактерий Escherichia coli штамма-продуцента треонина, обладающего высокими биотехнологическими характеристиками: продукцией и конверсией глюкозы в треонин.
Технический результат достигнут тем, что получен штамм ВКПМ В-14344 продуцент незаменимой аминокислоты треонина, имеющий генотип Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK ΔlivKHMGF ΔbrnQ ΔilvA ΔlysP ΔyjeM::PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔychE::Ptac-thrBC-TrrnB mmiMu[pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA]. При культивировании в ферментере в течение 36 ч полученный штамм способен синтезировать до 110 г/л с и конверсией глюкозы в L-треонин 53%.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показана схема интеграции кассеты cat-sacB-Ptac-thrAfbrBC-TrrnB в локус yjeM.
На фигуре 2 показана схема интеграции кассеты cat-sacB-Ptac-thrBC-TrrnB в локус ychE.
На фигуре 3 показана схема плазмиды pMH10-rfp.
На фигуре 4 показана схема плазмиды pM17-Tc-amilCP.
На фигуре 5 показана схема плазмиды pPASPAGR.
Осуществление изобретения
Заявленный штамм получен на основе ранее созданного штамма Escherichia coli ВКПМ В-13240 в несколько этапов, путем введения направленных модификаций.
Генетические модификации бактерии Е. coli ВКПМ В-13240 осуществляют любым подходящим способом с использованием различных модельных штаммов, векторов, бактериофагов, транспозонов, хелперных и экспрессионных плазмид.
Трансформацию бактерий линейными фрагментами ДНК осуществляют с использованием штаммов с мутациями в генах рекомбинационного комплекса RecBCD (Journal of Bacteriology 171.5 (1989): 2609-2613) с последующим переносом данной делеции в штамм-хозяин методом трансдукции, или с использованием гомологичной системы рекомбинации бактериофага λ (λRed). Гены Red-системы рекомбинации фага λ системы экспрессируют в хромосоме штамма-реципиента или в составе автономных хелперных плазмид, например, pKD46, pDL17, pCD31 (Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12 (2000): 6640-6645; Journal of microbiological methods 158 (2019): 86-92).
Перенос генетического материала в хромосому штамма реципиента осуществляют методом неспецифической трансдукции с использованием фагов P1, Р22, Т4 и их производных. Трансформацию бактерий осуществляют методом электропорации или химическим методом.
Генетические конструкции получают стандартными методами клонирования, методом Gap-Repair Cloning, методом OE-PCR (Overlap extension polymerase chain reaction), сборкой методом Gibson или искусственным синтезом генов. В качестве маркеров прямой селекции в генетических конструкциях используют широкий арсенал генов антибиотикорезистентности, например, гены устойчивости к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, стрептомицину, спектиномицину, гентамицину и др. Репортерные флуоресцентные белки и белки биолюминесценции также применяют в качестве селективных маркеров. Для маркеров обратной селекции используют, например, гены rpsL, sacB {Bacillus subtillis) или систему негативной селеции VL-cat // PRM-cI hok (Nucleic Acids Research 50.15 (2022): 8947-8960). Для вырезания селективных маркеров из хромосомы кодирующие их гены фланкируют сайтами узнавания рекомбиназ, например, FRT-сайтамами рекомбиназы flp, att-сайты системы сайт-направленной рекомбинации фага λ (Gene 158.1 (1995): 9-14). С использованием селектиных маркеров получают конструкции для инактивации и экспрессии генов.
Термин «инактивация гена», то же что «нокаут гена», означает целенаправленную модификацию определенного гена в геноме, в результате которой в организме не синтезируется белок, кодируемый геном, или синтезируется мутантный белок со сниженной активностью, или полностью неактивный белок. Под термином «делеция гена» понимают мутацию, при которой из хромосомы исключается полная или частичная последовательность гена. Инактивацию гена выполняют путем делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающей к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д. Инактивацию гена осуществляют любым известным способом, например, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или мутагенных агентов, сайт-направленный мутагенез, с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза, CRISPR-Cas9 редактирования гена и др.
Задачу по повышению уровня экспрессии генов решают путем замены промотора на более сильный, амплификации гена в составе автономных плазмид, а также путем множественной интеграции гена в хромосому. Для экспрессии генов в бактериях Е. coli используют различные промоторы: собственные, фаговые, а также синтетические, гибридные промоторы, состоящие из участков различных промоторных последовательностей. В качестве промоторов могут быть использованы, например, PT7, PA1, P1(rrnB), PD/E20, PH207, PL, PN25, PA3, PL-tac, PA2, PG25, PL-trc, Ptac, Ptrc, PLtetO-1, Ptic, Ptacl1, Ptac3, PompA, PtetA, PBAD, PlacUV5, Plac, PlacL8UV5, Plpp, PnlpD. Для многокопийного встраивания фрагментов ДНК в хромосому Е. coli, применяют различные системы на основе транспозонов, например, систему, основанную на транспозоне фага Mu.
Конструирование высокопродуктивного штамма-продуцента незаменимой аминокислоты треонина проводят путем введения в геном штамма ВКПМ В-13240 (RU2697499). следующих модификаций:
- инактивация генов: livKHMGF, brnQ, ilvA, lysP, yjeM, ychE,
- введение дополнительных копий генов thrAfbrBC и thrBC под контролем сильных промоторов;
- экспрессия генов pntAB, aspC, asd, русА, gdhA, rhtA.
Показано, что именно введение указанных модификаций в хромосому позволило увеличить продуктивность штамма более, чем на 10% и конверсию на 8%.
Сочетания модификаций, использованного в заявляемом изобретении, в источниках информации нами не обнаружено.
Пример 1. Конструирование штамма Escherichia coli ВКПМ В-14344.
1.1 Инактивация генов livKHMGF
Инактивацию генов livKHMGF проводят в родительском штамме ВКПМ В-13240, в геноме которого присутствует ген устойчивости к спектиномицину aadA, фланкированный последовательностями attL- и attR-сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis фага λ. С целью возможности повторного использования данного селективного маркера ген aadA удаляют из хромосомы штамма ВКПМ-13240 посредством трансформации плазмидой pINT-xis (Gene 150.1 (1994): 51-56), несущей гены системы Int/Xis фага λ. Отбор трансформантов проводят на чашках с L-агаром (мас. %: агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0) с добавлением ампициллина (125 мг/л) при 30°С. Три колонии рассевают на чашках с L-агаром без добавления антибиотиков, чашки инкубируют при повышенной температуре 42°С для элиминации плазмиды pINT-xis. Полученные клоны проверяют на селективных средах на потерю устойчивости к спектиномицину (75 мг/л) и ампициллину (125 мг/л). Один клон с подтвержденным генотипом и фенотипом отбирают для дальнейшей трансформации вспомогательной плазмидой pKD46 (Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12 (2000): 6640-6645). Плазмида несет pKD46 гены Red-зависиой ситемы рекомбинации фага λ, необходимые для интеграции линейной молекулы ДНК в хромосому.
Инактивацию livKHMGF осуществляют путем делеции оперона и замены его (номер по базе данных GenBank NC_000913.3 5393437…3597560) на селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу, ген cat, фланкированной attL- и attR-сайтами фага λ. Последовательность ДНК амплифицируют с плазмиды pICA (Applied biochemistry and microbiology 53 (2017): 859-866) с использованием следующих праймеров:
Амлифицированным продуктом ДНК трансформируют электрокомпетентные клетки родительского штамма, несущие плазмиду pKD46. Селекцию трансформантов, несущих делецию в опероне livKHMGF, проводят на чашках с L-агаром (мас. %: агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода -остальное, рН 7,0) с добавлением хлорамфеникола (10 мг/л). Элиминацию вспомогательной плазмиды pKD46 проводят пересевом на чашках с L-агаром с добавлением хлорамфеникола (10 мг/л) при 42°С. Полученные колонии проверяют на чувствительность к ампициллину (125 мг/л). Маркер устойчивости к хлорамфениколу удаляют из хромосомы трансформацией плазмидой pINT-xis, несущей гены системы сайт-специфической системы Int/Xis фага λ.
1.2 Инактивация гена brnQ
Инактивацию гена brnQ получают путем замены его ORF (номер по базе данных GenBank Ь0401 NC_000913.3 419591..420910) на селективный маркер устойчивости к спектиномицину aadA, фланкированный attL- и attR-сайтами фага λ. Последовательность ДНК амплифицируют с плазмиды pISA (Journal of microbiological methods 158 (2019): 86-92) с использованием следующих праймеров:
Электрокомпетентные клетки реципиента, несущего вспомогательную плазмиду pKD46, трансформируют амлифицированным ДНК продуктом. Отбор трансформантов, несущих делецию гена brnQ, проводят на чашках с L-агаром с добавлением спектиномицина (75 мг/л). Отбирают один трансформант, несущий целевую делецию. Следующим этапом удаляют селективный маркер трансформацией плазмидой pINT-xis.
1.3 Инактивация гена ilvA
Инактивацию гена ilvA (номер последовательности по базе данных GenBank Ь3772 NC_000913.3 3955331..3956875) выполняют посредством неспецифической трансдукции фагом PI vir. В качестве донора ДНК используют штамм В926 (Биотехнология 35.4 (2019): 42-54), несущий замену рамки считывания гена ilvA на ген устойчивости к спекциномицину aadA, фланкированный attL- и attR-сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis фага А,. После внесения делеции в локус ilvA с целью возможности повторного использования селектиного маркера из хромосомы удаляют ген устойчивости к спекцитноцицину, посредством трансформаци хелперной плазмидой pINT-xis.
1.4 Инактивация гена lysP
Инактивацию гена lysP (номер последовательности по базе данных GenBank Ь2156 NC_000913.3 2247063..2248532) выполняют посредством неспецифической трансдукции фагом PI vir. В качестве донора ДНК используют штамм ВКПМ В-13774 (RU 2758269), несущий замену рамки считывания гена lysP на ген устойчивости к спекциномицину aadA, фланкированный attL- и attR-сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis фага λ. Последующее удаление маркеров селекции из хромосомы осуществляют трансформацией штамма хелперной плазмиды pINT-xis.
1.5 Введение дополнительных копий треонинового оперона
Амплифицировать гены треонинового оперона thrABC возможно как в составе автономных плазмид, так и в хромосоме. Однако технологически применение плазмид в промышленных штаммах-продуцентах затруднительно, поэтому на данном этапе работ гены thrABC интегрируют в хромосому. В качестве локусов для интеграции выбирают гены yjeM и ychE,
В хромосоме родительского штамма ВКПМ В-13240 в ген thrA введена десенсибилизирующая мутация, снимающая ретроингибирование треонином. Из генома удалена последовательность thrL и нативный промотор треонинового оперона заменен на прототор PH207. Дополнительную, вторую, копию генов треонинового оперона интегрируют в локус yjeM (номер последовательности по базе данных GenBank b4156 NC_000913.3 4383839..4385341).
Последовательность гена yjeM амплифицируют с хромосомы штамма MG1655 с использованием праймеров
и клонируют в плазмиду pBR322, линеаризованную по BamHI. В результате получают плазмиду pBR- yjeM.
Гены треонинового оперона thrB и thrC амплифицируют с хромосомы штамма дикого типа MG1655 и клонируют в плазмиду pKK233-2 (Pharmacia, Uppsala). Заменяют промотор Ptrc на промотор Ptoc и клонируют мутантный ген thrAfbr, амплифицированный с хромосомы штамма ВКПМ В-13207 (Биотехнология, 2022, том 38. 6 (2022): 47-53). Затем клонируют ген cat, фланкированный att-сайтами фага λ, из плазмиды pMW118-λattL-CmR-λattR (Molekuliarnaia biologiia 39.5 (2005): 823-831), и ген sacB, амплифицированный с хромосомы В. subtilis 768. В результате получают плазмиду pKK-up-SC-dw-thrAtbrBC.
Из полученной плазмиды pKK-up-SC-dw-thrAfbrBC вырезают PaeI / PagI фрагмент, и лигируют с фрагментом плазмиды pBR-yjeM, расщепленной по KpnI. Таким образом конструируют плазмиду, несущую маркеры прямой и обратной селекции, гены cat и sacB, attL- и attR-сайты фага λ, гены треонинового оперона thrAtbrBC с десенсибилизирующей мутацией под промотором Ptoc, терминатор транскрипции Тгтв и области гомологии к локусу yjeM. Схема интеграции кассеты cat-sacB-Ptac-rthrAfbrBC-TrrnB в локус yjeM представлена на фиг. 1.
Генетические манипуляции по интеграции линейных фрагментов ДНК в хромососу проводят с использованием хелперной плазмиды pDL17 (Journal of microbiological methods 158 (2019): 86-92), несущей гены системы рекомбинации Red фага λ. Следующим этапом в полученном штамме заменяют индуцируемый промотор Ptac на конститутивный промотор PH207 и удаляют из хромосомы селективные маркеры, гены cat и sacB.
ДНК фрагмент, несущий промотор PH207 амплифицируют методом ПНР с хромосомы ранее ВКПМ В-13207 с использованием праймеров:
Третью копию генов thrB и thrC треонинового оперона интегрируют в локус ychE (номер последовательности по базе данных GenBank b1242 NC_000913.3 1298598..1299245).
Последовательность гена ychE амплифицируют с хромосомы штамма MG1655 с использованием праймеров
и клонируют в плазмиду pBR322, линеаризованную по BamHI. В результате получают плазмиду pBR-ychE.
Из плазмиды pKX-up-SC-dw-thrAfbrBC вырезают PaeI / PagI фрагмент, и лигируют с фрагментом плазмиды pBR-yjeM, расщепленной по MluI. Из полученной плазмиды удаляют последовательность мобильного элемента путем рестрикции по Eco72I и самолигирования, затем вырезают фрагмент AdeI /BshTI, несущий, ген thrA, Таким образом конструируют плазмиду, несущую маркеры прямой и обратной селекции, гены cat и sacB, attL- и attR-сайты фага λ, гены треонинового оперона thrB и thrC под промотором Ptac, терминатор транскрипции TrrnB и области гомологии к локусу ychE. Схема интеграции кассеты cat-sacB-Ptac-thrBC-TrrnB представлена на фиг. 2.
1.6 Получение генетических конструкций для индуцируемой экспрессии генов, контролирующих транспозицию
В плазмиду рМН10 (Biotechnology in Russia 4 (2007): 1-23) клонируют удобный фенотипический маркер rfp Discosoma coral, кодирующий красный флюоресцентный белок RFP. Ген rfp амплифицируют с плазмиды pGR-Blue (Journal of Visualized Experiments 110 (2016): e54064) (номер в коллекции Addgene Plasmid #68374) с ипользованием плаймеров:
и клонируют в составе рМН10 по сайтам рестрикции Eco31I, EheI. Полученная плазмида рМН10-rfp (фиг. 3) содержит; гены muA и muB, контролирующие синтез транспозазы и кофактора транспозиции; репрессоры cts и ner; маркер устойчивости к канамицину, neo; ген rfp; ориджин репликации р15а.
1.7 Конструирование генетических конструкций способных к транспозиции в клетках Е. coli
На основе вектора рМ17 (Biotechnology in Russia 4 (2007): 1-23) получают пазмиду pM17-Tc-amilCP, которая в своем составе несет attL- и attR-сайты фага Ми; две копии гена amilCP Acropora millepora, кодирующего хромогенный белок; промотор Pr; терминатор транскрипции 2Tfd; селективный маркер tetA; ориджин репликации pSC101 (фиг. 4).
Ген tetA амлпифицируют с хромосомы штамма XL 1-Blue по следующим праймерам:
Амлифицированный фрагмент ДНК лигируют с продуктом рестрикции PvuII/EheI плазмиды рМ17. Полученную плазмиду линеаризуют по PvuI и используют в качестве вектора для клонирования amilCP. Ген amilCP амплифицируют с плазмиды pGR-Blue (номер в коллекции Addgene Plasmid #68374) с использованием следующих праймеров:
Первичный ПЦР продукт получают по праймерам TL-amylCPI, PR-amylCPI, и используют далее в качестве матрицы для амплификации по праймерам TL-amylCP2, PR-amylCP2. Последняя пара праймеров содержит сайт узнавания Pvul для клонирования в вектор. В результате проделанных работ получают плазмиду pM17-Tc-amilCP.
1.8 Экспрессия генов pntAB, aspC, asd, русА, gdhA, rhtA
Повышения продукции треонина достигают за счет модификации путей центрального метаболизма, биосинтеза треонина, пути аминирования, регенерации НАДФН и экспорта треонина. Для этих целей конструируют плазмиду pPASPAGR (фиг. 5), которая в своем составе несет интегративную кассету mmiMu[attL-cat-aUR-pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA]. Указанная кассета включает следующие генетические элементы: ген asd, кодирующий аспартатсемиальдегиддегидрогеназу; ген ррс, кодирующий фосфоенолпируаткарбоксилазу, гетерологичный ген русА S.meliloti, кодирующий пируваткарбоксилазу; ген aspC, кодирующий аспартатаминотрансферазу; ген gdhA, кодирующий глутаматдегидрогеназу; гены pntAB, кодирующие трансгидрогеназу и ген rhtA, кодирующий основной транспортер треонина из клетки; оперон scrKYABR, который обеспечивает утилизацию сахарозы и служит фенотипическим маркером. Кроме того, в состав интегративной кассеты введен ген устойчивости к хлорамфениколу cat, фланкированный последовательностями attL- и attR-сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis фага λ.
Плазмиду pPASPAGR конструируют методом Gibson assembly (Methods in enzymology. Vol. 498. Academic Press, 2011. 349-361) из нескольких фрагментов. Плазмиду pM17-Tc-amilCP, расщепленную по KpnI и Mph11031 используют в качестве вектора на следующей стадии клонирования. Вставку с маркером cat аплифицируют с плазмиды pICA по праймерам:
Вставку с геном rhtA (номер последовательности по базе данных GenBank b0813 NC_000913.3 849210..850097) аплифицируют с хромосомы штамма ВКПМ В-13207 штамма по праймерам:
Вставку pntAB-gdhA длиной 22 т.п.н., содержащую гены pntAB, gdhA, aspC, asd, scrKYABR, русА, получают из плазмиды pMW-pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA (Nucleic Acids Research 50.15 (2022): 8947-8960) рестрикцией no ScaIl.
Вставки в вектор собирают методом Gibson assembly, в результате получают плазмиду pPASPAGR.
Для интеграции кассеты mmiMu[attL-cat-attR-pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA] в геном реципиента штамм предварительно трансформируют хелперной плазмидой pMH10-rfp. Трансформанты отбирают на L-агаре с добавлением канамицина (100 мг/л) при 30°С. Из одного трансформанта выращивают ночную культуру в среде LB (мас. %: триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода -остальное, рН 7,0) с добавлением канамицина (100 мг/л) при 30°С в течение 24 часов. Ночную культуру разводят в 100 раз при помощи 20 мл LB с добавлением канамицина (100 мг/л) и растят с перемешиванием при 30°С до достижения оптической плотности ОП660 0,4 ед. Затем колбу с клетками помещают на водяную качалку с установленной температурой 42°С и инкубируют 20 минут. Далее готовят электрокомпетентные клетки. Электропорацию проводят с использованием 40 мкл клеток и 100 нг плазмидной ДНК pPASPAGR. После электропорации клетки инкубируют в 1 мл среды LB в течение 20 минут при 44°С, затем 40 минут при 37°С, после чего высевают на чашки с L-агаром с добавлением хлорамфеникола (10 мг/л). Чашки инкубируют в течение суток при 37°С.
После трансформации на чашках Петри с селективным антибиотиком вырастают колонии нескольких фенотипов: красные колонии несут только хелперную плазмиду (pMHIO-rfp); синие колонии несут только матричную плазмиду (автономную pPASPAGR), красно-синие колонии несут автономно реплицирующиеся матричную и хелперную плазмиды, в белых колониях произошла интеграция и транспозиция кассеты miniMu[aUL-cat-attR-pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA], и также они не содержат автономных матричной и хелперной плазмид.
Белые колонии отбирают и повторно рассевают на чашках Петри с L-агаром с добавлением хлорамфеникола (10 мг/л), чашки инкубируют в течение суток при 37°С. Клоны сравнивают по продукции треонина в условиях пробирочной ферментации в питательной среде на основе кукурузного экстракта (RU 2758269). Отбирают клон с наибольшей продукцией треонина и вырезают из его генома селективный маркер с использованием хелперной плазмиды pINT-xis. Удаление маркера из хромосомы подтверждают фенотипически по чувствительности к хлорамфениколу (10 мг/л).
В результате проделанных работ получают штамм с генотипом Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK ΔlivKHMGF ΔbrnQ ΔilvA ΔlysP ΔyjeM::PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔychE::Ptac-thrBC-TrrnB mmiMu[pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA] и депонируют его Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» под номером ВКПМ В-14344.
Пример 2. Синтез треонина штаммом ВКПМ В-14344 в ферментере Для оценки биотехнологического потенциала штамма ВКПМ В-14344 проводят ферментацию в течение 36 часов в 3 л ферментере в питательной среде на основе дрожжевого экстракта с подпиткой глюкозой В качестве контрольного штамма используют родительский штамм ВКПМ В-13240.
Для выращивания инокулята в колбах используют среду ИСК следующего состава (мас. %):
Для выращивания посевной культуры в ферментере используют среду ПСФ следующего состава (мас. %):
Для проведения основного процесса биосинтеза используют среду ОСФ следующего состава (мас. %):
Вода Остальное Значение рН всех сред до стерилизации - естественный. Глюкозу моногидрат вносят асептически в среды ПСФ и ОСФ после стерилизации сред в виде стерильного запасного раствора с концентрацией 770 г/л.
Подпитку углеводным субстратом в ходе основного процесса биосинтеза осуществляют 51,9%-ным (масс), раствором глюкозы. Все среды, подпиточный и запасной растворы стерилизуют автоклавированием при 1.0 атм в течение 30 мин. Поддержание рН среды в ходе выращивания посевной культуры и проведения основного процесса биосинтеза осуществляют 25%-ным (масс.) водным аммиаком.
Подготовку рабочего банка культуры (РБК) проводят следующим образом. Культуру клеток выращивают на чашках со средой L-агаре (мас. %: агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода -остальное, рН 7,0) в течение 24 ч при 37°С.Из биомассы, выросшей на чашках, готовят клеточную суспензию в дистиллированной воде. В качалочные колбы объемом 750 мл с 15 мл среды ИСК вносят суспензию клеток до получения оптической плотности (ОП660) 0.1 ед. Колбы инкубируют на качалке при скорости 220 об./мин и температуре 37°С до достижения ОП660 5-6 ед. В полученную культуру вносят стерильный раствор глицерина с концентрацией 500 г/л до его конечной концентрации 150 г/л. Аликвоты РБК штамма-продуцента объемом 1.0 мл хранят при -70°С.
Инокулят готовят следующим образом. В качалочные колбы объемом 750 мл с 15 мл среды ИСК вносят суспензию клеток из РБК до получения ОП660 0.1 ед. Колбы инкубируют на качалке при скорости 220 об./мин и температуре 37°С до достижения ОП660 5-6 ед.
Выращивание посевной культуры проводят в 3 л ферментере КФ-103/4 (ООО-фирма «Проинтех», Пущино), оснащенном контроллером Merabit («KЕKLАВ», Москва-Пущино), системой термостатирования, перистальтическими насосами для титрования, а также датчиками контроля рН- и р02. Культивирование осуществляют на среде ПСФ с автоматическим поддержанием рН 6.9. Рабочий объем КЖ составляет 1.0 л; инокуляцию проводят до получения ОП660 0.002 ед. Культивирование проводят при перемешивании со скоростью 700 об/мин, поддерживая температуру на уровне 39°С. Аэрацию проводят стерильным воздухом из расчета 1.0 л/л/мин. Культивирование проводят до достижения ОП660 25 ед.
Проведение основного процесса биосинтеза треонина. Биосинтез целевой аминокислоты проводят в 3 л ферментерах КФ-103/4 с начальным рабочим объемом КЖ 1.0 л. на среде ОСФ с автоматическим поддержанием рН 6.9. Доля посевной культуры составляет 8-9%. Аэрацию осуществляют стерильным воздухом из расчета 1.0 л/л/мин в начале процесса, с последующим увеличением на 24 час роста до 4.0 л/л/мин. Минимальная скорость перемешивания составляет 500 об/мин. В ферментационной среде поддерживают концентрацию растворенного кислорода на уровне 20% от насыщения воздухом путем каскадной регулировки скорости мешалки до 1100 об./мин, температуру культивирования - на уровне 33°С.По исчерпании исходной глюкозы в среде ОСФ, которое определяют по резкому скачку показаний р02-датчика, начинают подпитку глюкозой. При увеличении концентрации растворенного кислорода на 10% в среду автоматически подается 2.3 г раствора подпитки, такой способ подачи подпитки поддерживают до окончания процесса. Культивирование продолжают в течение 36 час. Количество накопленного в среде треонина определяют методом ВЭЖХ (Waters 2695, Alliance).
Как видно из табл. 1, сконструированный штамм-продуцент ВКПМ В-14344, накапливает большее количество треонина по сравнению с родительским штаммом ВКПМ В-13240. Среднее значение накопления треонина в культуральной жидкости повышено со 100 до 110 г/л, при этом уровень конверсии глюкозы в треонин увеличен с 43 до 53% (вес).
Штамм Escherichia coli ВКПМ В-14344 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки. Грамм-отрицательная бактерия. Суточная культура в жидкой LB представлена слабо подвижными клетками округлой формы 1 мкм в диаметре. При культивировании на L-агаре в течение 18-24 часов при 37°С образует круглые, беловатые, полупрозрачные на свет колонии 1-2 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колонии приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется. При культивировании на агаризованной среде Эндо (мас. %: пептон - 1, лактоза - 1, Na2SO3 - 0,33, K2HPO4 - 0,25, фуксин основной - 0,03, агар-агар - 2%, вода -остальное) при 37°С образуются колонии, круглой формы с ровным четко очерченным краем малиново-красного цвета с металлическим блеском. Диаметр колоний 0,5-1,5 мм.
Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: D-глюкозу, L-арабинозу, D-маннитол, D-ксилозу, в меньшей мере: D-галактозу, D-лактозу. Отсутствует способность к гидролизу крахмала. Отстутствует потребность в факторах роста. Заявляемый штамм продуцирует треонин. Оптимальное значение рН для роста 7,2-7,4. Не растет при температурах свыше 45°С.Оптимальная температура роста 37°С.Штамм не патогенен.
Таким образом, путем введения направленных модификаций в геном бактерий Е. coli ВКПМ В-13240 сконструирован штамм ВКПМ В-14344 продуцент незаменимой аминокислоты треонина, обладающий следующим генотипом Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK ΔlivKHMGF ΔbrnQ ΔilvA ΔlysP ΔyjeM::PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔychE::Ptac-thrBC-TrrnB mmiMu[pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA], способный синтезировать до 110 г/л треонина при культивировании в ферментере.
Claims (1)
- Штамм Escherichia coli ВКПМ В-14344, имеющий генотип Δtdh PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔlacI supE ΔpoxB-ltaE ΔsstT ΔtdcBCDE ΔytfG-Ptrc-pycA PLtetO1-rhtA ΔyifK ΔlivKHMGF ΔbrnQ ΔilvA ΔlysP ΔyjeM::PH207-thrAfbrBC-TrrnB ΔychE::Ptac-thrBC-TrrnB miniMu[pntAB-aspC-asd-pycA-scrKYABR-gdhA-rhtA] - продуцент L-треонина.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817252C1 true RU2817252C1 (ru) | 2024-04-12 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697499C1 (ru) * | 2018-09-28 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Бактерия вида Escherichia coli - продуцент L-треонина, способ микробиологического синтеза L-треонина с ее использованием. |
| RU2728242C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина |
| RU2728251C1 (ru) * | 2019-11-22 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ychE - продуцент L-треонина |
| RU2775206C1 (ru) * | 2021-10-01 | 2022-06-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт") | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697499C1 (ru) * | 2018-09-28 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Бактерия вида Escherichia coli - продуцент L-треонина, способ микробиологического синтеза L-треонина с ее использованием. |
| RU2728251C1 (ru) * | 2019-11-22 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ychE - продуцент L-треонина |
| RU2728242C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина |
| RU2775206C1 (ru) * | 2021-10-01 | 2022-06-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт") | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ФЕДОРОВ А.С. и др. Использование автолизированной биомассы культуры штамма-продуцента при микробиологическом синтезе L-треонина. Биотехнология, 2022, том 38, N 6, с. 47-53. BUBNOV D.M. ET AL. Robust counterselection and advanced λRed recombineering enable markerless chromosomal integration of large heterologous constructs, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 15, 26 August 2022, Pages 8947-8960, https://doi.org/10.1093/nar/gkac649. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2144564C1 (ru) | ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ | |
| JP4380305B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| US5756345A (en) | Production of tryptophan by the bacterium Escherichia coli | |
| RU2418069C2 (ru) | Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду pantoea, и способ продукции l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду pantoea | |
| JP4919529B2 (ja) | Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌの新規株、その調製方法、およびＬ―トレオニン産生のための発酵プロセスにおけるその使用 | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| WO1996006926A1 (fr) | Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine | |
| US7695949B2 (en) | Process for producing a target fermentation product | |
| JP2001231584A (ja) | 変異型ｉｌｖＨ遺伝子及びＬ−バリンの製造法 | |
| CN109666617B (zh) | 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用 | |
| JPH08501694A (ja) | ビオチンの生物工学的製造方法 | |
| CN116904379A (zh) | 一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用 | |
| RU2133773C1 (ru) | Гены бутиробетаин/кротонобетаин-l-карнитин-метаболизма и их применение для микробиологического получения l-карнитина | |
| RU2817252C1 (ru) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| RU2697499C1 (ru) | Бактерия вида Escherichia coli - продуцент L-треонина, способ микробиологического синтеза L-треонина с ее использованием. | |
| JP2009142289A (ja) | コバラミンを製造し得る生合成方法 | |
| RU2728251C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ychE - продуцент L-треонина | |
| RU2697219C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| JP4383984B2 (ja) | Ｌ−スレオニンの生産方法 | |
| RU2775206C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина | |
| RU2787585C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yhjE - продуцент L-треонина | |
| RU2787583C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yqeG - продуцент L-треонина | |
| RU2728242C1 (ru) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| RU2774071C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном sdaC - продуцент L-треонина | |
| RU2748676C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ydgI - продуцент L-треонина |