RU2775206C1 - Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина - Google Patents
Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2775206C1 RU2775206C1 RU2021128734A RU2021128734A RU2775206C1 RU 2775206 C1 RU2775206 C1 RU 2775206C1 RU 2021128734 A RU2021128734 A RU 2021128734A RU 2021128734 A RU2021128734 A RU 2021128734A RU 2775206 C1 RU2775206 C1 RU 2775206C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- threonine
- yjem
- escherichia coli
- strain
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 101700028779 yjeM Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N Actinospectacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 101710013413 HOM6 Proteins 0.000 description 4
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 101710004853 THRA Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 3
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 101700083182 ilvA Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 241000404883 Pisa Species 0.000 description 2
- 101710029159 aadA Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-azaniumyl-7-oxononanoate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108010063377 Aspartokinase Homoserine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229940052223 Basic fuchsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010042687 EC 1.2.3.3 Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N Pararosaniline Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 101700030942 TDH Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 1
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 1
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 108060001830 copG Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 108060002381 dsbB Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 210000000947 motile cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 108060002036 pde-2 Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 101700012521 rhtA Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 101700051549 sstT Proteins 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 101710010451 tdh2 Proteins 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к микробиологическому синтезу L-треонина. Предложен штамм Escherichia coli ВКПМ В-14097 с инактивированным геном yjeM, продуцирующий L-треонин. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов Escherichia coli, продуцирующих L-треонин. 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к микробиологическому синтезу аминокислоты L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli.
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (US 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).
Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; ЕР 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (WO 0114525, ЕР 301572, US 5376538), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (US 5939307 и US 6297031), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (US 5175107 и US 5661012).
Известен штамм-продуцент L-треонина Е. coli ВКПМ В-3996 (SU 1694643, US 5175107 и US 5705371), полученный путем введения в штамм Е. coli ВКПМ В-7 следующих мутаций и плазмиды:
- мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный эффект на продукцию L-треонина;
- инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации L-треонина, в указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR);
- увеличение экспрессии генов, контролирующих биосинтез L-треонина, достигнута путем введения в штамм плазмиды pVIC40, содержащей мутантный треониновый оперон thrA442 BC.
Штамм Е. coli ВКПМ В-3996 в ходе ферментации пробирках продуцирует 13 г/л L-треонина (RU 2182173), при культивировании в ферментере - 85 г/л L-треонина (US 5175107).
При конструировании продуцентов важным является также поиск новых генов-мишеней, модификация которых приводит к увеличению продукции L-треонина.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение является расширение арсенала штаммов Escherichia coli, способных к продукции L-треонина.
Поставленная задача решена тем, что получен штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-14097 с инактивированным геном yjeM, обладающий способностью продуцировать L-треонин.
Термин "ген yjeM инактивирован" означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со сниженной активностью, или полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающей к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.
Инактивация гена может быть осуществлена любым возможным методом, например, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".
В данной работе инактивацию гена yjeM проводят путем замены открытой рамки считывания гена на селективный маркер aadA, ген устойчивости к спекциномицину. Полученный таким образом штамм не способен синтезировать белок YjeM, кодируемый геном yjeM.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:
Фиг. 1. Схема плазмиды pISA.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном yjeM
Инактивацию гена осуществляют в штамме Escherichia coli ВКПМ В-13207, который получен на основе дикого штамма Escherichia coli K-12 MG1655 (АТСС 47076) в результате проведения нескольких раундов мутагеза различными мутирующими агентами с целью отбора мутантов наиболее устойчивых к L-треонину, и последующего введения направленных генетических модификаций: замена промотора генов треонинового оперона, введение десенсибилизирующей мутации в ген thrA, оверэспрессия rhtA, инактивация гена sstT, инактивация гена рохВ, кодирующего пируватоксидазу.
Делецию гена yjeM осуществляют путем замены его ORF (номер последовательности по базе данных GenBank NC_000913.3 U00096.3: 4,383,839 -> 4,385,341), на селективный маркер устойчивости к спектиномицину, методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов:
yjeMinsF 5'-gttcagtgggcacgtgttatacacgcgctgaaatgaaggatggtttcatgccaagcttgcatgcctgc
yjeMinsR 5'-tttcctgtctttacgccctatcgtcaggtagacgatagggcatcgggttagggatcctctagagtcgag
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pISA (Биотехнология 2019 Т. 35 №4 с. 42-54). В своем составе эта плазмида (фиг. 1) несет следующие генетические элементы: ген aadA, обуславливающий устойчивость клеток к спектиномицину для прямого отбора трансформантов; последовательности фага λ attL и attR - сайты узнавания системы рекомбинации Int/Xis; repA - репликон; ген bla, кодирующий бета-лактамазу, обуславливающий устойчивость к ампициллину.
Амплификацию фрагмента проводят с использованием полимеразы KАРА (KAPAbiosystems) для того, чтобы избежать ошибок в последовательности. Используют следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; 25 циклов: 20 сек при 98°С, 20 сек при 60°С, 2 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 2 мин при 72°С. ПЦР продукт размером 2036 п.о. очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма Е. coli ВКПМ В-13207, который предварительно трансформируют плазмидой pKD46, которая необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.А. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены Red гомологичной системы рекомбинации (β, γ, ехо гены) под контролем промотора ParaB; индуцируемого арабинозой.
Электрокомпетентные клетки получают следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli ВКПМ В-13207 выращивают при 30°С в жидкой среде LB (мас. %): триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавкой ампициллина (125 мг/л), разводят в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, MgCl2 - 0,0956, MgSO4⋅7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода остальное с добавлением ампициллина (100 мг/л) и L-арабинозы (1 мМ). Полученную культуру растят с перемешиванием при 30°С до достижения оптической плотности ОП660нм 0,6 ед., после чего делают клетки электрокомпетентными путем концентрации в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию проводят с использованием 40 мкл клеток и 1 мкг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубируют в 1 мл среды SOC (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, глюкоза - 0,36, MgCl2 - 0,0956, MgSO4⋅7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода - остальное при 37°С в течение 2,5 часов, после чего высевают на чашки со средой LA (мас. %): агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавлением спектиномицина (75 мкг/мл).
Отбор трансформантов, несущих делецию в гене yjeM, проводят на чашках со средой LA с добавлением спектиномицина. Наличие инсерции в локусе yjeM у отобранных клонов подтверждают методом ПЦР. Для амплификации фрагмента используют полимеразу Taq (Thermo Fisher Scientific) и следующие олигонуклеотиды:
yjeMoutF 5'-taacagcgaagaatggcgtg
yjeMoutR 5'-agagagaatcgtctgctctat
Для проведения ПЦР используют следующий температурный профиль: денатурация при 94°С в течение 4 мин; 25 циклов: 20 сек при 94°С, 20 сек при 55°С, 1 мин 30 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
Наличие продукта размером 2294 п. о. интерпретируют как интеграцию кассеты в целевой локус. Для удаления вспомогательной плазмиды pKD46, проводят 2 пассажа на среде LA со спектиномицином при 42°С и полученные колонии тестируют на чувствительность к ампициллину.
В результате отобрано 5 клонов, несущих делецию в гене yjeM.
Пример 2. Отбор наиболее продуктивного клона
Для проверки влияния делеции гена yjeM на продукцию L-треонина проводят пробирочную ферментацию пяти отобранных клонов, в качестве контрольного штамма используют родительский штамм Е. coli ВКПМ В-13207.
Штаммы выращивают на чашках со средой LA в течение 24 часов при 37°С. Для приготовления инокулята используют посевную среду следующего состава (мас. %)
В пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 5 мл посевной среды вносят биомассу клеток до стартового значения оптической плотности равной ОП660нм 0,1 ед. Пробирки инкубируют на роторной качалке в течение 5 часов при 37°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Для основного процесса ферментации используют среду следующего состава (мас. %):
Растворы глюкозы, сульфата марганца и сульфата магния стерилизуют отдельно автоклавированием при 121°С в течение 40 мин. Навески СаСО3 по 40 мг стерилизуют в стеклянных пробирках автоклавированием при 121°С в течение 20 мин. рН доводят до значения 7,0. Раствор сульфата железа стерилизуют фильтрованием через мембрану диаметром пор 22 мкм.
Полученный инокулят вносят в пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 2 мл ферментационной среды до стартовой оптической плотности ОП660 нм 0,1 ед. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С на роторной качалке - 220 об/мин.
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяют с методом ВЭЖХ (Waters 2695, Alliance). Результаты ферментации пяти клонов приведены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, клон 3, содержащий делецию гена yjeM, накапливает большее количество L-треонина по сравнению с контрольным штаммом E. coli ВКПМ В-13207. Отобранный клон 3 депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Escherichia coli ВКПМ В-14097.
Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-14097 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические характеристики
Грамм-отрицательная бактерия. Суточная культура в жидкой LB представлена слабо подвижными клетками округлой формы 1 мкм в диаметре. При культивировании на L-агаре в течение 18-24 часов при 37°С образует круглые, беловатый, полупрозрачные на свет колонии колонии 1-2 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется. При культивировании на агаризованной среде Эндо (мас. %: пептон - 1, лактоза - 1, Na2SO3 - 0,33, K2HPO4 - 0,25, фуксин основной - 0,03, агар-агар - 2%, вода - остальное) при 37°С образуются колонии, круглой формы с ровным четко очерченным краем малиново-красного цвета с металлическим блеском. Диаметр колоний 0,5-1,5 мм.
Физиолого-биохимические характеристики.
Факультативный анаэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: D-глюкозу, L-арабинозу, D-маннитол, D-ксилозу, в меньшей мере: D-галактозу, D-лактозу. Отсутствует способность к гидролизу крахмала. Отстутствует потребность в факторах роста. Штамм устойчив к хлорамфениколу. Оптимальное значение рН для роста 7,2-7,4. Не растет при температурах свыше 45°С. Оптимальная температура роста 37°С. Штамм не патогенен.
Таким образом, получен штамм Escherichia coli ВКПМ В-14097 с инактивированным геном yjeM, способный синтезировать до 16,8 г/л L-треонина при культивировании в пробирках.
Claims (1)
- Штамм Escherichia coli ВКПМ В-14097 с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2775206C1 true RU2775206C1 (ru) | 2022-06-28 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2817252C1 (ru) * | 2023-09-20 | 2024-04-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175107A (en) * | 1988-10-25 | 1992-12-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine |
| RU2731282C1 (ru) * | 2019-11-22 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ttdT - продуцент L-треонина |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175107A (en) * | 1988-10-25 | 1992-12-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine |
| RU2731282C1 (ru) * | 2019-11-22 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ttdT - продуцент L-треонина |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| /7171_2006_069/Published online: 22 February 2007 Найдено онлайн: https://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2F7171_2006_069.pdf Дата обращения 26.04.2022. См. с. 299. ВЫБОРНАЯ Т.В. И ДР. Использование альтернативного пути синтеза изолейцина в штаммах Escherichia coli - продуцентах треонина. Биотехнология, 2019. Т. 35, N4, C. 42-54. * |
| KAY MARIN ET AL. Amino Acid Transport Systems in Biotechnologically Relevant Bacteria. Microbiol Monogr (5), V. F. Wendisch: Amino Acid Biosynthesis. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2817252C1 (ru) * | 2023-09-20 | 2024-04-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2144564C1 (ru) | ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ | |
| RU2148642C1 (ru) | Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты | |
| KR100792095B1 (ko) | Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법 | |
| RU2355763C2 (ru) | Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот | |
| ES2382473T3 (es) | Procedimiento de producción de L-treonina usando un microorganismo que tiene el gen galR inactivado | |
| CN100582220C (zh) | 含有与色氨酸的生物合成有关的突变基因的大肠杆菌突变体和用所述突变体生产色氨酸的方法 | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| KR20000029691A (ko) | 에스케리챠콜리의신규균주,그제조방법및그균주를엘-트레오닌생산을위한발효공정에사용하는용도 | |
| RU2697499C1 (ru) | Бактерия вида Escherichia coli - продуцент L-треонина, способ микробиологического синтеза L-треонина с ее использованием. | |
| RU2728251C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ychE - продуцент L-треонина | |
| RU2775206C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yjeM - продуцент L-треонина | |
| CN112725254A (zh) | 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用 | |
| RU2774071C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном sdaC - продуцент L-треонина | |
| RU2787585C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yhjE - продуцент L-треонина | |
| RU2787583C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном yqeG - продуцент L-треонина | |
| RU2731282C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ttdT - продуцент L-треонина | |
| RU2748676C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ydgI - продуцент L-треонина | |
| RU2758269C1 (ru) | Штамм Escherichia coli с инактивированным геном lysP - продуцент L-треонина | |
| RU2728242C1 (ru) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| RU2697219C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| KR20230005137A (ko) | 헤파로산의 제조 방법 및 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균 | |
| RU2817252C1 (ru) | Штамм Escherichia coli - продуцент L-треонина | |
| RU2528056C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА | |
| EP1824962A1 (en) | A microorganism producing l-threonine having an inactivated lysr gene, method for producing the same and method for producing l-threonine using the microorganism | |
| RU2215784C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) |