JP2009517088A - L−スレオニン生成変異微生物及びそれを使用したl−スレオニンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明なことである。
実施例1:L−スレオニン高生成微生物の製作
1−1:pSacHR06の製作
thrAのフィードバック阻害を除去するために、染色体DNAの特定塩基または塩基の置換のためにバシラス・サブチリス来由のsacB相同性組換え技法(Wohlleben等,J.Bacteriol.,1992年,第174巻,5462頁)を使用する目的でpSacHR06ベクターを製作した(図1)。
配列番号1(pucoriup):5’-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacg
tcctcactgactcgctgcgctc-3’
配列番号2(pucorido):5’-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccac
tgagcgtcagacc-3
配列番号3(sacBf):5’-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3’
配列番号4(sacBr):5’-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3’
1−2:大膓菌W3110からlacI遺伝子の欠失
大膓菌W3110(ATTC39936)で配列番号5及び配列番号6のプライマーを使用したワンステップ不活性化(one step inactivation)方法(Warner等,PNAS,2000年,第6巻,6640頁)を使用して、lacオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子で、ラクトース分解を担当するlacオペロンの転写を抑制する機能を有するlacI遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を除去して、大膓菌W3110ΔlacIを製作した。
配列番号5(lacI_1stup):5’-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtg
tctcttagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号6(lacI_1stdo):5’-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgc
attaatgcacttaacggctgacatggg-3’
1−3:thrAのフィードバック阻害除去
1−1で製作した相同性組換えベクターであるpSacHR06と1−2で製作した5W3110ΔlacIを使用してリー等の研究発表(Lee等,J.Bacteriol.,2003年、第185巻,5442頁)を参考にして、アスパルトキナーゼI(aspartokinase I)をコードするthrAのフィードバック阻害を除去した。
配列番号8(thrA2):5’-gattgcgtaatcagcaccacgaaaatacgggcgcgtgacatcg-3’
配列番号9(thrA3):5’-cgatgtcacgcgcccgtattttcgtggtgctgattacgcaatc-3’
配列番号10(thrA4):5’-cacgcgtcgacctggaagtgcagttaacaatgaccggg-3’
1−4:lysCのフィードバック阻害除去
前記1−3のthrAのフィードバック阻害が除去された菌株にすでに発表された研究結果(Ogawa−Myyata等,Biosci.Biotechnol.Biochem.2001年,第65巻,1149頁)を参考にして、アスパルトキナーゼIII(aspartokinase III)をコードする遺伝子であるlysCのフィードバック阻害を除去した。大膓菌W3110(ATTC39936)の染色体DNAを鋳型に使用して、配列番号11/12のプライマー対と配列番号13/14のプライマー対を各々使用してPCRを遂行した後、修得された二つのPCR断片を同一な濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号11/14のプライマー対を使用してオーバーラッピングPCRを遂行した。前記方法で得た1484bpのPCR断片をBamHI及びSalIで切断して、やはりBamHI及びSalI酵素で切断したpSacHR06に挿入した後、塩基配列を分析して、lysCの1055番目塩基(C)が(T)に置換されたことを確認した。
配列番号11(lysC1):5’-ctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgc-3’
配列番号12(lysC2):5’-ggttgaaccggtggtatcaaggataatgccacgctcacttctg-3’
配列番号13(lysC3):5’-cagaagtgagcgtggcattaatccttgataccaccggttcaacc-3’
配列番号14(lysC4):5’-ccagctaaatgacgcttcaggatccggtttataag-3’
1−5:L−スレオニンオペロン(thrABC)のプロモーター置換
1−4で製作されたthrA遺伝子とlysC遺伝子のフィードバック阻害が除去された大膓菌W3110で、減衰機序(attenuation)による転写発現調節を除去するためにアッテネータ(attenuator)配列を含むスレオニンオペロンのプロモーターを強力なプロモーターであるtacプロモーターに置換した。
配列番号15(thrAT1):5’-gcagccagctgtagcgatctgcggattgtcgatagt -3’
配列番号16(thrAT2):5’-caggagcatgccagaagctgctatcagacactcttt-3’
配列番号17(thrAT3):5’-cagcagaattcatgcgagtgttgaagttcggcggta -3’
配列番号18(thrAT4):5’-cagagctgcagtccgtccaaatctcgcaacaatcgg-3’
1−6:lysA、metA、tdh、及びiclR遺伝子の欠失
前記の1−5で修得されたlacI遺伝子とthrA及びlysCのフィードバック阻害除去されてthrABCオペロンのプロモーターがtacプロモーターに置換されたW3110でlysA、metA、tdh、及びiclR遺伝子をワンステップ不活性化方法(Warner等,PNAS,2000年,第6巻,6640頁)によって欠損させて、抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号19(KOlysA1):5’-atgccacattcactgttcagcaccgataccgatctcaccgccgaa
aatctgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号20(KOlysA2):5’-gttgataaggaacagaaagcccaccgcccgcagaaatagcctg
taaatcccacttaacggctgacatggga-3’
ホモセリンO−スクシニル転移酵素(homoserine O−succinyltransferase)をコードする遺伝子であるmetA遺伝子が欠失された菌株を製作するために、配列番号21/22のプライマーを使用してワンステップ不活性化方法でmetA遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号21(KOmetA1):5’-gtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaa
aacgtctttgtgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号22(KOmetA2):5’-cgggatggcccgtcacaaaggcaatgcgcttatctttactggca
aacagacacttaacggctgacatggga-3’
L−スレオニンデヒドロゲナーゼ(L−threonine dehydrogenase)をコードする遺伝子であるtdh欠失菌株製作のために、配列番号23/24のプライマー対を使用してワンステップ不活性化方法で、tdh遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号23(KOtdh1):5’-atgaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggat
gaccgagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号24(KOtdh2):5’-atcactttggtccagtcgatagacatatcagacggcggaataccc
agcatcacttaacggctgacatggga-3’
グリオキシレートシャント(glyoxylate shunt)の発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子iclRの欠失菌株製作のために、配列番号25/26のプライマー対を使用して、ワンステップ不活性化方法でiclR遺伝子を欠損して抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号25(KOiclR1):5’-tgaaaatgatttccacgatacagaaaaaagagactgtcatggtc
gcacccgattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号26(KOiclR2):5’-atagaaattgcggcaaacggttcacggtgctcatcgaaaatac
acgctgccacttaacggctgacatggga-3’
1−7:スレオニンデヒドラターゼの活性が弱化された菌株の製作
L−スレオニンを基質にして生成されるL−イソロイシンの生成量を減らして、L−スレオニンの生成量を増大させるための目的で、リー等の研究発表(Lee等,J.Bacteriol.,2003年,第185巻,5442頁)を参考にして、該当経路の一番目酵素であるスレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)をコードするilvA遺伝子に部位特異的変異を作って製作された菌株の成長が培地中に添加されるL−イソロイシンの濃度によって大きく左右されることを確認した。
配列番号27(KOilvA1):5’-atcgccagccagtgcacagctttaagctgcgcggcgcatacgcc
atgatggattgcagcattacacgtcttg-3'
配列番号28(KOilvA2):5’-cccctgctgctgtgacagttcgatcgctttggctttcgcttcat
caaagtcacttaacggctgacatggga-3'
配列番号29(ilvA1):5’-gacgggatccgcaaagcctgtgcgctgatcaccgacgg-3’
配列番号30(ilvA2):5’-cacgcctaaccgcgcagaaaaaaacgcgacgccctgcg-3’
配列番号31(ilvA3):5’-cgcagggcgtcgcgtttttttctgcgcggttaggcgtg-3’
配列番号32(ilvA4):5’-caggtactgcagaccggaaagaatatgcgccagccgttcg-3'
1−8:プラスミドpMloxCの製造
ワンステップ不活性化で遺伝子を欠失させる場合、一つの遺伝子欠失ごとに染色体DNAにリコンビナーゼの認知部位であるFRTまたはloxP配列が1個ずつ残るようになる。その結果、連続的な多数の遺伝子欠失を遂行時に目的としない部位の欠失が起きて変異菌株製作に困難があった(Nagy A.,Genesis,2000年,第26巻,99頁)。スズキ等は、このような問題点を解決するための方案として、lox71とlox66と命名したmutat loxPを使用した、改善された遺伝子欠失方法を提示したことがある(Appl.Environ.Microbiol.2005年,第71巻,8472頁)。それで、本発明者等はそれをさらに容易に使用できるようにlox71とlox66を一緒に導入した新規のベクターであるpMloxCを製造した。
配列番号33(ECmulox_up):5’-atataagctt taccgttcgtatagcatacattatacgaa
gttatctgccctgaaccgacgaccg-3’
配列番号34(ECmulox_do):5’-aattcccggg taccgttcgtataatgtatgctatacgaagt
tatgcatcacccgacgcactttgc -3’
1−9:tdcC遺伝子の欠失
スレオニン/セリントランスポーターをコードする遺伝子であるtdcCが欠失した菌株を製作するために、前記1−8で製作したpMloxCベクターを鋳型にして、配列番号35/36のプライマー対を使用してPCR反応を遂行し、修得したDNA断片を分離精製して、前記精製されたDNA断片を鋳型にして、配列番号37/38のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した。
配列番号35(KOtdcC1):5’-gcgtaaatcagataccacatggacgttaggcttgtttggtacggc
aatcgtaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号36(KOtdcC3):5’-ccagtgtaatcgcgaacgttgttttggtaccggtcatggacgcaa
agtggtagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号37(KOtdcC2):5’-atgagtacttcagatagcattgtatccagccagacaaaacaatcg
tcctggcgtaaatcagataccacat-3’
配列番号38(KOtdcC4):5’-gaagaaagatttgaagatagccacgagtgcgatgatggaagcc
gcatattccagtgtaatcgcgaacgt-3’
1−10:ppc遺伝子のプロモーター置換
染色体上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするppc遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。ppcのプロモーター置換のために前記製作したpMloxCプラスミドを鋳型に配列番号39/40のプライマーを使用してPCR反応を遂行し、修得したDNA断片を鋳型にして、配列番号41/42のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した。その結果修得したDNA断片を鋳型にして、配列番号43/44のプライマー対でPCR反応を遂行した。その結果得られた最終のDNA断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でppc遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してppcの元来のプロモーターより強力なtrcプロモーターに交替された菌株を製作した。
配列番号39(FPppc1):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
Gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3'
配列番号40(RPppc1):5’-tctgcgctttggcttccgccatgttggccggagacagagtaaac
aggcagctaaaggcaaagaac-3'
配列番号41(FPppc2):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtggtg
gcctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
配列番号42(RPppc2):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号43(FPppc3):5’-ggcagctaaaggcaaagaacatcaccactgcaaccatcagca
tgcttagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号44(RPppc3):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtgtggc
ctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
1−11:acs遺伝子のプロモーター置換
スレオニン生成菌株をフェドバッチ(Fed−batch)培養する時に生成される酢酸を減少させるための目的で、染色体上のアセチルコーエーシンターゼをコードするacs遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。acsのプロモーター置換のために前記製作したpMloxCプラスミドを鋳型に配列番号45/46のプライマーを使用してPCR反応を遂行し、修得したDNA断片を鋳型にして、配列番号47/48のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した。前記PCR反応に修得したDNA断片を鋳型にして、配列番号49/50のプライマー対でPCR反応を遂行し、得られた最終DNA断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でacs遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してacsの元来のプロモーターより強力なtrcプロモーターに交替した菌株を製作した。
配列番号45(FPacs1):5’-gcccctatgtgtaacaaataaccacactgtgaatgttgtctaggt
gacactatagaacgcg-3’
配列番号46(RPacs1):5’-tgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggatgatta
attgtcaacagctagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号47(FPacs2):5’-tcacgacagtaaccgcacctacactgtcatgacattgctcgccc
ctatgtgtaacaaata-3’
配列番号48(RPacs2):5’-cgatgttggcaggaatggtgtgtttgtgaatttggctcatggtctg
tttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcc-3’
配列番号49(FPacs3):5’-cgaattgcgccattgttgcaatggcggtttttattgtttttcacg
acagtaaccgcacct-3’
配列番号50(RPacs3):5’-ttgttgatacatcgcctcgtactgctgagggtttatcaggcaacgg
tctgcgatgttggcaggaatggtg-3’
1−12:pBRThrEベクターの製作
(1)pKKThrABCベクターの製作
L−スレオニン生合成において一番重要なL−スレオニン生合成関連オペロン(thrABC)を含むベクターをクローニングするために、前記1−3で製作したthrAのフィードバック阻害が解除された変異株の染色体DNAを鋳型にして、配列番号51/52のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した。その結果、合成されたDNA断片をXmaIとHindIIIで切断して、該切断した断片を同一な制限酵素で処理したpKK223−3ベクター(Pharmacia Biotech,米国)にクローニングして塩基配列を分析し、9.4kbのL−スレオニン生合成関連オペロン(thrABC)を含むpKKThrABCベクターを製作した。
配列番号51(Thr_Xma):5’-gttgcccgggatgcgagtgttgaagttcgg-3’
配列番号52(Thr_Hin):5’-gcgtcaagcttcggcggttgttattctccgc-3’
(2)pBRThrABCベクターの製作
前記製作したpKKThrABCベクターのプラスミド安定性を高めるために、pBR322ベクター(New England Biolab、米国)をNdeIとSalIで切断してrop遺伝子を含む1.6kbのDNA切片を獲得し、前記(1)で製作したpKKThrABCベクターを同じ酵素で切断して、7.8kbのDNA切片を獲得した後、それらをライゲーションして、9.4kbのpBRThrABCベクターを製作した (図3)。
(3)pBRthrRベクターの製作
前記製作したpBRThrABCベクターにスレオニンエクスポーター(threonine exporter)をコードするrhtCを導入するために、まず大膓菌W3110の染色体DNAを鋳型にして、配列番号53及び配列番号54のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した後、修得されたDNA断片をEcoRIとHindIIIで切断して、同一な酵素で切断したpUC19ベクターにクローニングした後、塩基配列を分析してpUC19rhtCベクターを製作した。以後、前記(2)で製作したpBRThrABCベクターとpUC19rhtCベクターをBamHIとSphIで同時に切断してクローニングして最終的に10.7kbのpBRThrRベクターを製作した (図4)。
配列番号53(FrhtCEcBa):5’-ctgagaattcggatccagatggctgaacagatgc -3’
配列番号54(RrhtCHiBg):5’-cctacaagcttagatctcaaagcagatgaaggcgc -3’
(4)pBRthrR2ベクターの製作
前記製作されたpBRThrRベクターにスレオニンとホモセリンのエクスポーターとして知られたrhtAを導入するために、まず大膓菌W3110の染色体DNAを鋳型にして、配列番号55及び配列番号56のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した後、修得されたDNA断片をMluIとSalIで切断して、前記(3)で製作したpBRThrRベクターを同一な酵素で切断してクローニングした後、塩基配列を分析して、11.1kbのrhtAが導入されたpBRThrR2ベクターを製作した。
配列番号55(FrhtAMlu):5’-ctgaacgcgtgaactgcgtaagtattacg-3’
配列番号56(FrhtASalPst):5’-ctgacgtcgacctgcagaccatgcagaaatgtaaat -3'
(5)pBRthrEベクターの製作
前記製作されたpBRThrR2ベクターにホモセリン(homoserine)とホモセリンラクトン(homoserine lactone)のエクスポーターと推定されるrhtB導入するために、まず大膓菌W3110の染色体DNAを鋳型にして、配列番号57及び配列番号58のプライマー対を使用してPCR反応を遂行した後、修得されたDNA断片をPstIとEagIで切断して、同一な酵素で切断したpBRThrR2プラスミドにクローニングした後、塩基配列を確認して、11.7kbのrhtBが導入されたpBRThrEベクターを製作した(図5)。
配列番号57(FrhtBPst):5’-cgtagctgcagtccacaccagtaaactctg-3’
配列番号58(FrhtBEagAat):5’-catttcggccggacgtcagtcggataaggcgtttac-3’
1−13:L−スレオニン生成微生物の製作
前記1−1から1−11の過程を通じてthrAとlysCのフィードバック阻害が除去されてスレオニンオペロンのプロモーターがtacプロモーターに置換され、lacI、metA、lysA、及びtdh遺伝子が欠失された大膓菌TH08菌株に、前記1−12で製作したpBRThrRプラスミドを形質導入してTHR08菌株を製作した。以後、前記TH08菌株のppcプロモーターがtrcプロモーターに置換されて、iclRとtdcC遺伝子が欠失して製作された大膓菌TH27菌株に、前記1−12で製作されたpBRThrRとpBRThrEのベクターを各々導入してL−スレオニン生成微生物THR27とTHE27を製作した。
表1:本発明のスレオニン生成変異微生物
前記実施例1で製作したTHR08のL−スレオニン生成能を確認するために母菌株である大膓菌W3110とTHR08菌株のL−スレオニン生成能を同じ条件で比較した。前記二つの菌株をアムピシリン(ampicillin)が50μg/ml添加されたLB平板培地で継代培養してそれを表2の力価培地に接種して250rpm、31℃で48時間培養した。以後、培養液に存在するL−スレオニンの濃度をHPLCで測定した。
表2:L−スレオニン力価培地組成
表3:菌株別Lースレオニン生成量
前記実施例1で製作した微生物THR27とTHE27のL−スレオニン生成能を確認するために、それら微生物をアムピシリンが50μg/ml添加されたLB平板培地で選別した。選別した菌株を5g/lグルコース、0.15g/l L−メチオニン、0.22g/l L−リジンを含む50mlのLB培地が入っている500mlサカグチフラスコ4個に各々1%ずつ接種して31℃で12時間、毎分250回往復振蕩培養して全培養液を獲得した。L−スレオニンの生産のために表4の組成を有する生産培地を5l小型醗酵槽に1.8l入れて、前記修得した全培養液200mlを醗酵槽に接種して酸素分圧40%を維持するように撹拌速度を自動で調節して31℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が0g/lになるまで培養した。
表4:L−スレオニン生産培地
表5:Lースレオニン生成量
前記実施例1で製作した微生物THE27とTHE28のL−スレオニン生成能をフェドバッチ(fed−batch)培養で確認するためにそれら微生物をアムピシリンが50μg/ml添加されたLB平板培地で選別した。選別した菌株を5g/lグルコース、0.15g/l L−メチオニン、0.22g/l L−リジンを含む50mlのLB培地が入っている500mlサカグチフラスコ4個に各々1%ずつ接種して31℃で12時間の間、毎分250回往復振盪培養して全培養液を獲得した。L−スレオニンの生産のために表4の組成を有するスレオニン生産培地を5L小型醗酵槽に1.8l入れて、前記修得した全培養液200mlを醗酵槽に接種して酸素分圧40%を維持するように撹拌速度を自動で調節して、31℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が1g/l未満に減少すると、スレオニン添加培地(表6)を14回まで添加して培養した。ここで、pHはアンモニア水を使用して6.0〜6.5に維持した。
表6:L−スレオニン添加培地
Claims (26)
- 部位特異的変異技法で下記の変異を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のL−スレオニン生成変異微生物の製造方法:
(a)lacオペロンのリプレッサー(repressor)をコードする遺伝子、ホモセリンO−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びL−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失:
(b)アスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子の変異;及び
(c)L−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換。 - 前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の変異微生物の製造方法。
- 前記バクテリアが、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項2に記載の変異微生物の製造方法。
- グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン/セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項1に記載の変異微生物の製造方法。
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項1に記載の変異微生物の製造方法。
- 前記ストロングプロモーターが、trcプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター及びtrpプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1または請求項5に記載の変異微生物の製造方法。
- 請求項1乃至請求項5のいずれか1項の方法で製造された変異微生物に、L−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター(threonine exporter)をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン(homoserine lactone)のエックスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターを導入させることを特徴とする組換え変異微生物の製造方法。
- (a)lacオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンO−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びL−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、(b)アスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子が変異されていて、(c)L−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のL−スレオニン生成変異微生物。
- 前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の変異微生物。
- 前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の変異微生物。
- グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン/セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項8に記載の変異微生物。
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項8に記載の変異微生物。
- 前記ストロングプロモーターが、trcプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター及びtrpプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項8または請求項12に記載の変異微生物。
- 請求項8乃至請求項12のいずれか1項の変異微生物に、L−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物。
- (a)lacオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンO−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びL−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、(b)アスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼI及びアスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子が変異されていて、(c)L−スレオニンオペロンのプロモーター及びアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のL−スレオニン生成変異微生物。
- 前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項15に記載の変異微生物。
- 前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項16に記載の変異微生物。
- グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン/セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項15に記載の変異微生物。
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項15に記載の変異微生物。
- 前記ストロングプロモーターが、trcプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター及びtrpプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項15または請求項19に記載の変異微生物。
- 請求項15乃至請求項19のいずれか1項の変異微生物に、L−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入していることを特徴とする組換え変異微生物。
- lox66遺伝子、lox71遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクター。
- 前記ベクターが、pMloxCであることを特徴とする、請求項22に記載のベクター。
- 請求項8または請求項15の微生物を培養することを特徴とするL−スレオニンの製造方法。
- 請求項14の微生物を培養することを特徴とするL−スレオニンの製造方法。
- 請求項21の微生物を培養することを特徴とするL−スレオニンの製造方法。
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