CN112779204B - 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产L‑高丝氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述菌株以Escherichia coli MG1655为宿主，敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，弱化编码高丝氨酸激酶基因thrB，并通过系统代谢工程策略包括增强高丝氨酸合成通量、提高NADPH的再生以及精准调控高丝氨酸输出，最终构建了一株非营养缺陷型，无需诱导剂，不携带质粒的高丝氨酸高产菌株。该菌株经过48h发酵，L‑高丝氨酸产量达125.7g/L，生产强度达2.62g/L/h。该方法采用的发酵工艺简单，无需额外添加营养物质，不携带质粒，无需诱导，易于控制，更加稳定，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

Description

一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
技术领域：
本发明涉及一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
L-高丝氨酸是一种非蛋白质氨基酸，是苏氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸的前体物质。并且L-高丝氨酸作为重要的平台化合物，被广泛用于合成高丝氨酸内酯、γ-丁内酯、异丁醇等重要化学成分。正是由于高丝氨酸及其衍生物丰富的生物、化学活性，使得L-高丝氨酸被广泛应用于食品、医药、农业、化妆品以及饲料添加等行业。目前L-高丝氨酸主要通过小规模化学法合成，但是存在原材料昂贵，反应条件苛刻，提取过程复杂以及污染环境等问题。相比之下，微生物发酵法生产成本低，条件温和，并且绿色环保，近年来该法被广泛应用于生产各种氨基酸。
目前谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌这两种工业微生物被广泛应用于发酵法生产L-高丝氨酸。周景文等(202010439183.2)阻断C.glutamicum ATCC 13032中高丝氨酸降解途径，并通过加强高丝氨酸合成通量，最终高丝氨酸产量达8.8g/L。该方法的不足之处在于，该工程菌携带用于过表达关键基因的重组质粒，从而需要添加抗生素来保证质粒稳定遗传，需要添加诱导剂来激活基因表达，导致生产成本增加，并损伤细胞生长。柳志强等(201810844040.2)，阻断了大肠杆菌高丝氨酸竞争、降解途径，并在基因组过表达了高丝氨酸合成途径的相关基因，最终高丝氨酸产量达60g/L。上述方法的不足之处在于，该工程菌需要额外添加L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸等用于恢复细胞生长，这无疑使发酵过程复杂化并且增加了生产成本。谢新开等(201710106474.8)通过点突变技术弱化大肠杆菌中编码高丝氨酸激酶的基因thrB，使得在不添加任何氨基酸的情况下，高丝氨酸积累量达47g/L。该方法同样使用质粒过表达关键基因。谢新开等(201710953111.8)，通过敲除thrB基因，阻断高丝氨酸向苏氨酸降解途径，并在大肠杆菌基因组上多拷贝高丝氨酸合成途径中的关键基因，使得高丝氨酸产量达88g/L。该菌株为营养缺陷型菌株，需要额外添加L-苏氨酸等营养物质。
发明内容：
为解决上述需要添加抗生素和(或)诱导剂及额外的营养物质导致生产成本增加，损伤细胞生长等瓶颈问题，本发明提供一种非营养缺陷型、不携带质粒的产L-高丝氨酸的基因工程菌及采用该菌直接发酵生产L-高丝氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之一是：提供一株L-高丝氨酸高产菌株，所述菌株以Escherichia coli MG1655为出发菌株，在基因组上敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，将高丝氨酸激酶编码基因thrB(NCBI基因编号：ECK0003，SEQ ID NO.4)弱化表达，接着过表达编码天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的基因thrA(NCBI基因编号：ECK0002，SEQ ID NO.5)、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc(NCBI基因编号：ECK3947，SEQ ID NO.6)、编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB(NCBI基因编号：ECK1598-ECK1597，SEQ ID NO.7)以及苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA(NCBI基因编号：ECK0802，SEQ ID NO.8)；
进一步地，敲除lacI基因，获得E.coli MG1655ΔlacI；
进一步地，thrA基因的过表达为三拷贝；
进一步地，所述弱化表达是通过将thrB原启动子替换为PfliC弱启动子实现的；
进一步地，所述PfliC弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述thrA、ppc和pntAB基因采用的启动子为强启动子Ptrc；
进一步地，所述rhtA基因采用的启动子为Plpp启动子；
进一步地，所述Ptrc强启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
进一步地，所述Plpp启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之二是：提供构建上述L-高丝氨酸基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)E.coli MG1655ΔlacI的构建
以野生型大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物lac-1/lac-2及lac-3/lac-4扩增lacI的上下游同源臂，然后利用重叠PCR获得lacI上下游同源臂融合片段UlacI-DlacI；
将RB-lac1/RB-lac2退火后连接至pGRB，获得pGRB-lacI；
将pGRB-lacI和UlacI-DlacI电转化至含pREDcas9的E.coli MG1655，经筛选获得lacI敲除菌株E.coli MG1655ΔlacI。
(2)HOM-1的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增thrB启动子上下游同源臂UPthrB、DPthrB，并通过重叠PCR获得重叠片段UPthrB-Pflic-DPthrB；
PG-1/PG-2退火后连接至pGRB，获得pGRB 1；
将pGRB 1和UPthrB-Pflic-DPthrB电转化至含pREDcas9的E.coli MG1655ΔlacI，经筛选获得thrB弱化菌株HOM-1。
(3)HOM-2的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ylbe上下游同源臂Uylbe、Dylbe以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe；
PG-3/PG-4退火后连接至pGRB，获得pGRB 2；
将pGRB 2和Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe电转化至含pREDcas9的HOM-1，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-2。
(4)HOM-3的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yjit上下游同源臂Uyjit、Dyjit以及ppc，并通过重叠PCR获得重叠片段Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit；
PG-5/PG-6退火后连接至pGRB，获得pGRB 3；
将pGRB 3和Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit电转化至含pREDcas9的HOM-2，经筛选获得ppc过表达菌株HOM-3。
(5)HOM-4的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增rph上下游同源臂Urph、Drph以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Urph-Ptrc-thrA-Drph；
PG-7/PG-8退火后连接至pGRB，获得pGRB 4；
将pGRB 4和Urph-Ptrc-thrA-Drph电转化至含pREDcas9的HOM-3，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-4。
(6)HOM-5的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增yjip上下游同源臂Uyjip、Dyjip以及thrA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip；
PG-9/PG-10退火后连接至pGRB，获得pGRB 5；
将pGRB 5和Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip电转化至含pREDcas9的HOM-4，经筛选获得thrA过表达菌株HOM-5。
(7)HOM-6的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增gapc上下游同源臂Ugapc、Dgapc以及pntAB，并通过重叠PCR获得重叠片段Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc；
PG-11/PG-12退火后连接至pGRB，获得pGRB 6；
将pGRB 6和Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc电转化至含pREDcas9的HOM-5，经筛选获得pntAB过表达菌株HOM-6。
(8)HOM-7的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模版，分别扩增ygay上下游同源臂Uygay、Dygay以及Plpp和rhtA，并通过重叠PCR获得重叠片段Uygay-Plpp-rhtA-Dygay
PG-13/PG-14退火后连接至pGRB，获得pGRB 7；
将pGRB 7和Uygay-Plpp-rhtA-Dygay电转化至含pREDcas9的HOM-6，经筛选获得rhtA过表达菌株HOM-7。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之三是：提供菌株HOM-7在生产L-高丝氨酸中的应用；
进一步地，采用菌株HOM-7发酵生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
①种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
②发酵罐发酵：以8％-10％接种量将种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％-50％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含2g/L-5g/L或不含甜菜碱)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期36-52h。
③发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到91.4-125.7g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L-15g/L葡萄糖，3g/L-4g/L酵母粉，3g/L-5g/L胰蛋白胨，2g/L-5g/L KH2PO4，1g/L-2g/L MgSO4·7H2O，10mg/L-15mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L-15mg/LMnSO4，加0.1g/L-0.5g/L或不加甜菜碱，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。有益效果：
(1)本发明以E.coli MG1655为出发菌株，通过启动子替换动态调控高丝氨酸降解途径，平衡细胞生长和高丝氨酸生产，利用系统代谢工程手段加强高丝氨酸合成通量并精准调控高丝氨酸外排系统，最终构建了一株无需添加抗生素，诱导剂以及非营养缺陷型的L-高丝氨酸高产菌株。于5L发酵罐进行分批补料发酵，48h时L-高丝氨酸产量达到125.7g/L，发酵强度为2.62g/L/h。在整个发酵过程中未检测到其他副产物。
(2)该方法采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。与现有技术相比，本发明获得的工程菌株和工艺无营养缺陷，不携带质粒，无需添加抗生素、诱导剂等，其L-高丝氨酸产量和发酵强度优于现有技术。
附图说明：
图1实施例9L-高丝氨酸基因工程菌摇瓶发酵结果；
图2实施例13L-高丝氨酸基因工程菌HOM-7的发酵过程曲线。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：lacI敲除菌E.coli MG1655ΔlacI的构建
(1)重叠片段UlacI-DlacI的构建
以野生型大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物lac-1/lac-2及lac-3/lac-4扩增lacI的上下游同源臂，然后利用重叠PCR获得lacI上下游同源臂融合片段UlacI-DlacI。
(2)pGRB-lacI质粒的构建
根据lacI序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列RB-lac1/RB-lac2，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB-lacI。
(3)lacI敲除菌E.coli MG1655ΔlacI的构建
将重组质粒pGRB-lacI和融合片段UlacI-DlacI电转化至含有pREDcas9质粒的E.coliMG1655感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素、氨苄青霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物lac-1/lac-4进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB-lacI丢失；然后42℃振荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得菌株E.coli MG1655ΔlacI。
实施例2：thrB弱化菌HOM-1的构建
(1)重叠片段UPthrB-Pflic-DPthrB的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物thrB-1/thrB-2及thrB-3/thrB-4扩增thrB启动子的上下游同源臂，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含thrB启动子上、下游同源臂、启动子Pflic的融合片段UPthrB-Pflic-DPthrB。
(2)pGRB-1质粒的构建
根据thrB启动子序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-1和PG-2，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB-1。
(3)thrB弱化菌HOM-1的构建
将重组质粒pGRB-1和融合片段UPthrB-Pflic-DPthrB电转化至含有pREDcas9质粒的E.coli MG1655ΔlacI感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素、氨苄青霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物thrB-5/thrB-4进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB-1丢失；然后42℃振荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得菌株HOM-1。
实施例3：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-2的构建
(1)重叠片段Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物ylbe-1/ylbe-2、ylbe-3/ylbe-4以及thrA-1/thrA-2扩增ylbe的上下游同源臂和thrA基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含ylbe上、下游同源臂、Ptrc-thrA的融合片段Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe。
(2)pGRB-2质粒的构建
根据ylbe序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-3和PG-4，通过上述方法构建重组质粒pGRB-2。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-2的构建
将重组质粒pGRB-2和融合片段Uylbe-Ptrc-thrA-Dylbe转化至含有pREDcas9质粒的HOM-1的感受态细胞中，用引物ylbe-1/ylbe-4筛选阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-2。
实施例4：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-3的构建
(1)重叠片段Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yjit-1/yjit-2、yjit-3/yjit-4以及ppc-1/ppc-2扩增yjit的上下游同源臂和ppc基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yjit上、下游同源臂、Ptrc-ppc的融合片段Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit。
(2)pGRB-3质粒的构建
根据yjit序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-5和PG-6，通过上述方法构建重组质粒pGRB-3。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-3的构建
将重组质粒pGRB-3和融合片段Uyjit-Ptrc-ppc-Dyjit转化至含有pREDcas9质粒的HOM-2的感受态细胞中，用引物yjit-1/yjit-4鉴定阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-3。
实施例5：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-4的构建
(1)重叠片段Urph-Ptrc-thrA-Drph的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物rph-1/rph-2、rph-3/rph-4以及thrA-1/thrA-2扩增rph的上下游同源臂和thrA基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含rph上、下游同源臂、Ptrc-thrA的融合片段Urph-Ptrc-thrA-Drph。
(2)pGRB-4质粒的构建
根据rph序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-7和PG-8，通过上述方法构建重组质粒pGRB-4。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-4的构建
将重组质粒pGRB-4和融合片段Urph-Ptrc-thrA-Drph转化至含有pREDcas9质粒的HOM-3的感受态细胞中，用引物rph-1/rph-4筛选阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-4。
实施例6：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-5的构建
(1)重叠片段Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物yjip-1/yjip-2、yjip-3/yjip-4以及thrA-1/thrA-2扩增yjip的上下游同源臂和thrA基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含yjip上、下游同源臂、Ptrc-thrA的融合片段Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip。
(2)pGRB-5质粒的构建
根据yjip序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-9和PG-10，通过上述方法构建重组质粒pGRB-5。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-5的构建
将重组质粒pGRB-5和融合片段Uyjip-Ptrc-thrA-Dyjip转化至含有pREDcas9质粒的HOM-4的感受态细胞中，用引物yjip-1/yjip-4筛选阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-5。
实施例7：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-6的构建
(1)重叠片段Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物gapc-1/gapc-2、gapc-3/gapc-4以及pntAB-1/pntAB-2扩增gapc的上下游同源臂和pntAB基因，其中包含Ptrc启动子，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含gapc上、下游同源臂、Ptrc-pntAB的融合片段Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc。
(2)pGRB-6质粒的构建
根据gapc序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-11和PG-12，通过上述方法构建重组质粒pGRB-6。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-6的构建
将重组质粒pGRB-6和融合片段Ugapc-Ptrc-pntAB-Dgapc转化至含有pREDcas9质粒的HOM-5的感受态细胞中，用引物gapc-1/gapc-4筛选阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-6。
实施例8：L-高丝氨酸基因工程菌HOM-7的构建
(1)重叠片段Uygay-Plpp-rhtA-Dygay的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别利用引物ygay-1/ygay-2、ygay-3/ygay-4、Plpp-1/Plpp-2以及rhtA-1/rhtA-2扩增ygay的上下游同源臂、lpp基因启动子以及rhtA基因，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含gapc上、下游同源臂、Plpp-pntAB的融合片段Uygay-Plpp-rhtA-Dygay。
(2)pGRB-7质粒的构建
根据ygay序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列PG-15和PG-16，通过上述方法构建重组质粒pGRB-7。
(3)L-高丝氨酸基因工程菌HOM-7的构建
将重组质粒pGRB-7和融合片段Uygay-Plpp-rhtA-Dygay转化至含有pREDcas9质粒的HOM-7的感受态细胞中，用引物ygay-1/ygay-4筛选阳性转化子。并按上述方法丢失质粒，获得菌株HOM-7。
实施例9：L-高丝氨酸基因工程菌摇瓶发酵
(1)种子培养
分别将高丝氨酸基因工程菌HOM-1、HOM-2、HOM-3、HOM-4、HOM-4、HOM-6和HOM-7接种到LB固体培养基斜面上，以E.coli MG1655ΔlacI为对照，培养12h。然后接种至30mL种子培养基中，37℃，220rpm摇床振荡培养6h-8h。
(2)发酵培养
以1％接种量接种至发酵培养基，35℃，220rpm摇床振荡培养48h。发酵过程中根据情况补充80％葡萄糖2-3次维持残糖浓度为0.1-0.5％，每次补充1mL，用氨水调节pH约为7。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-高丝氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-2、HOM-3、HOM-4、HOM-5、HOM-6、HOM-7L-高丝氨酸产量分别达到1.8g/L、2.9g/L、4.6g/L、8.1g/L、8.8g/L、19.9g/L。
其中：
种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，3g/L酵母提取物，1g/L胰蛋白胨，3g/L KH2PO4，1.8g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例10：菌株HOM-7的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以8％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期48h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到112.5g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，3g/L胰蛋白胨，3g/L KH2PO4，1.8g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例11：菌株HOM-7的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以8％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含甜菜碱2g/L)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期48h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到120.3g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，3g/L胰蛋白胨，3g/L KH2PO4，1.8g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，甜菜碱0.3g/L，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例12：菌株HOM-7的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含甜菜碱3g/L)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期48h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到122.3g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：15g/L葡萄糖，4g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，4g/L KH2PO4，1g/LMgSO4·7H2O，12mg/L FeSO4·7H2O，13mg/L MnSO4，甜菜碱0.1g/L，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例13：菌株HOM-7的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以8％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液(含甜菜碱5g/L)，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期48h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到125.7g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：15g/L葡萄糖，3.5g/L酵母粉，4g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，1.5g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，甜菜碱0.5g/L，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例14：菌株HOM-7的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HOM-7全部接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以8％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期36h。
(3)发酵液中L-高丝氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HOM-7的L-高丝氨酸产量达到91.4g/L，未检测到其他氨基酸和有机酸。
其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，3g/L胰蛋白胨，2g/L KH2PO4，1g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
本发明实施例所用引物序列列表：
Figure GDA0002989706420000121
Figure GDA0002989706420000131
Figure GDA0002989706420000141
Figure GDA0002989706420000151
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 265
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655
<400> 1
gcgatttcct tttatctttc gacacgtaaa acgaataccg gggttatcgg tctgaattgc 60
gcaaagttta cgtttaattg ttttttttaa tagcgggaat aaggggcaga gaaaagagta 120
tttcggcgac taacaaaaaa tggctgtttt tgaaaaaaat tctaaaggtt gttttacgac 180
agacgataac agggttgacg gcgattgagc cgacgggtgg aaacccaata cgtaatcaac 240
gacttgcaat ataggataac gaatc 265
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 3
<211> 185
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655
<400> 3
tgaatccgat ggaagcatcc tgttttctct caattttttt atctaaaacc cagcgttcga 60
tgcttctttg agcgaacgat caaaaataag tgccttccca tcaaaaaaat attctcaaca 120
taaaaaactt tgtgtaatac ttgtaacgct acatggagat taactcaatc tagagggtat 180
taata 185
<210> 4
<211> 933
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655
<400> 4
atggttaaag tttatgcccc ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc 60
ggggcggcgg tgacacctgt tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg 120
gcagagacat tcagtctcaa caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca 180
cgggaaaata tcgtttatca gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt 240
ccagtggcga tgaccctgga aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc 300
tgttcggtgg tcgcggcgct gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac 360
actcgtttgc tggctttgat gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac 420
gacaacgtgg caccgtgttt tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc 480
atcagccagc aagtgccagg gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt 540
aaagtctcga cggcagaagc cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc 600
attgcgcacg ggcgacatct ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag 660
cttgccgcga agctgatgaa agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca 720
ggcttccggc aggcgcggca ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc 780
ggctccggcc cgaccttgtt cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc 840
gactggttgg gtaagaacta cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg 900
gatacggcgg gcgcacgagt actggaaaac taa 933
<210> 5
<211> 2463
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655
<400> 5
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
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cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080
tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140
gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200
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gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320
gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380
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ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500
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tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620
gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680
gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740
gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800
cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860
aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920
tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980
cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040
cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100
attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160
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Claims (5)

1.一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以Escherichia coli MG1655为宿主，敲除乳糖操纵子阻遏蛋白lacI基因，将编码高丝氨酸激酶的基因thrB的表达弱化，过表达天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ编码基因thrA、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc、编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB以及苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA；
所述thrA基因为三拷贝过表达；
通过将thrB原启动子替换为Pflic弱启动子进行弱表达；
所述天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc和吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB由强启动子Ptrc表达；
所述rhtA基因用Plpp启动子表达；
所述Pflic弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
所述Ptrc启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2；
所述Plpp强启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
高丝氨酸激酶的编码基因thrB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ编码基因thrA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因ppc的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；
编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；
苏氨酸和高丝氨酸外排系统的编码基因rhtA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，构建方法如下：
(1)分别扩增天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc、编码吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB以及编码苏氨酸和高丝氨酸外排系统的基因rhtA，并构建基因组整合片段；
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除lacI基因，替换thrB基因的启动子，并将上述基因连同启动子整合至宿主细胞基因组表达。
3.权利要求1-2任意一项所述菌株在生产L-高丝氨酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵生产L-高丝氨酸的方法如下：将种子液以8％-10％接种量将种子液接种至发酵培养，发酵温度35℃，通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30％-50％，流加浓度为80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，pH 6.8-7.2，发酵周期36-52h；
所述浓度为80％的葡萄糖溶液含2g/L-5g/L的甜菜碱或不含甜菜碱。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基成分为：10g/L-15g/L葡萄糖，3g/L-4g/L酵母粉，3g/L-5g/L胰蛋白胨，2g/L-5g/L KH2PO4，1g/L-2g/L MgSO4·7H2O，10mg/L-15mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L-15mg/L MnSO4，加0.1g/L-0.5g/L的甜菜碱或不加甜菜碱，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
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