CN108504613A - 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的L‑高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变。本发明还提供了该生产菌株的构建方法以及其应用。本发明的L‑高丝氨酸生产菌株，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，具有广阔的应用前景。

Description

一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用。
背景技术
L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。
目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：
(1)化学法；该方法合成L-高丝氨酸主要是采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；
(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。
(3)生物法；目前主要见报导的是生物酶法，其工艺是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该工艺主要问题仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。
微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，由于高丝氨酸对于细菌生长具有较强的抑制作用(可能是源于其对谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，J Bacteriol.1973Nov；116(2):663-72),对L-高丝氨酸的直接发酵生产具有挑战性。因此，目前尚未探索出合适的通过发酵获得L-高丝氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种L-高丝氨酸生产菌株。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的方法。
本发明要解决的第三个技术问题是现有技术中的生产L-高丝氨酸的方法存在生产成本高、污染大、产率低的问题，进而提供一种可实现低成本、高产量、条件温和、环境污染少的生产L-高丝氨酸的方法。
本发明的L-高丝氨酸生产菌株，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；
其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
优选地，所述thrA*为thrA*(G433R)；
具体而言：所述thrB基因的敲除或弱化可阻断或减弱L-高丝氨酸往L-苏氨酸的转化，从而提高L-高丝氨酸的产量；
所述thrL基因为编码前导肽基因，其敲除或弱化可去除或减弱了转录衰减调控，保证thrA基因的转录效率；
所述thrA基因的突变可引入抑制产物的反馈抑制，解除产物的反馈抑制；所述rhtA基因的过表达或增强表达可提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的外运能力，同时提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的耐受性；
所述ppc、pntAB、thrA*、asd基因均属于用以糖酵解、天门冬氨酸合成以及还原性辅酶循环转化等、与天门冬氨酸或苏氨酸发酵相关的基因，其过表达或增强表达可增强从葡萄糖到L-高丝氨酸的合成途径；
所述thrB的R235H突变体可消除苏氨酸合成缺陷所带来的潜在的菌体生长问题。
优选地，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。
本发明还提供了所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：
A、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；
B、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强；
C、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；
D、将含有L-高丝氨酸代谢途径中敲除或被弱化和/或过表达或增强和/或突变关键基因的重组质粒转入菌株中，即获得了L-高丝氨酸生产菌株。
优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB、thrC、thrL中的一个或多个；
所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；
所述步骤C中所述的被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
优选地，所述步骤D中所述的菌株为大肠杆菌。
进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。
本发明所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。
本发明还提供了一种生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
取权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述L-高丝氨酸。
优选地，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。
优选地，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L,(NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，其余为水。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明对于L-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因进行改造，可实现截断苏氨酸合成途径中高丝氨酸的下游途径、增强上游相关生物合成基因、弱化分支代谢途径的技术效果，由此得到高产的L-高丝氨酸的生产菌株；
(2)本发明的技术方案在构建L-高丝氨酸的生产菌株时，采用的手段具体包括敲除(或弱化)染色体上编码高丝氨酸激酶的天然基因thrB、过表达L-高丝氨酸产物泵出基因，由此得到能耐受L-高丝氨酸并不代谢L-高丝氨酸的菌株；还包括通过基因工程修饰或增强原有菌种中编码糖酵解以及天门冬氨酸、部分苏氨酸生物合成的相关基因，使得菌种自发合成L-高丝氨酸；
(3)本发明所构建的L-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，仅以葡萄糖为唯一碳源，辅以低成本氮源，在不需要添加任何氨基酸的发酵条件下，就能够实现发酵过程中L-高丝氨酸的有效积累，具有广阔的工业应用前景；
(4)本发明的L-高丝氨酸的方法，相较于化学法、化学手性拆分法、生物法生产L-高丝氨酸，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点。
具体实施方式
实施例1-中均采用大肠杆菌MG1655构建L-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技术。可参考的文献Lambda Red RecombinationOne-step inactivation of chromosomalgenes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U SA.2000Jun 6；97(12):6640-5.和Development of a fast and easy method forEscherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact.2016Dec 1；15(1):205.。
实施例1敲除thrB基因的菌株MG1655(ΔthrB)的构建
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除的菌株MG1655(ΔthrB)，其构建方法可参考文献:Proc Natl Acad Sci U S A.2000Jun 6；97(12):6640-5，具体包括如下步骤：
(1)以pΔthrB-H1-f/pΔthrB-H2-r为引物、以包含卡纳抗性盒的质粒为模板，进行PCR扩增，并胶回收、纯化该两侧带有thrB同源臂和FRT位点的含卡纳抗性的线性DNA片段；
所述引物pΔthrB-H1-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pΔthrB-H2-r具有如SEQ ID No.2所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.1:5’-TGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG-3’
SEQ ID No.2:5’-TTAGTTTTCCAGTACTCGTGCGCCCGCCGTATCCAGCCGGCAAATATGAACATGGGAATTAGCCATGGTCCATATG-3’
(2)取大肠杆菌MG1655，先转入Red协助质粒pKD46(即氨苄抗性)，通过诱导表达Gam、Bet以及Exo，这3种Lambda噬菌体重组酶，再转入步骤(1)中扩增纯化得到的所述线性DNA片段；然后，将其在卡纳抗性培养基内培养，并在培养出的菌落中筛选ΔthrB的基因型菌落；
(3)将步骤(2)中筛选确认的菌落在42℃下培养消除pKD46，将其制备感受态细胞，在该感受态细胞中转入pCP20质粒，然后在30℃下用氨苄抗性筛选目标菌，升温诱导FLP表达并消除抗性，即得到所述菌株MG1655(ΔthrB)。
本实施例中采用的所述包含卡纳抗性盒的质粒为pKD4，购买自http://www.biofeng.com；所述大肠杆菌K-12MG1655购买自ATCC(ATCC47076)；所述Red协助质粒pKD46购买自http://www.biofeng.com；所述pCP20质粒购买自http://www.miaolingbio.com；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。本实施例中，所述卡纳抗性培养基的成分为：含35mg/L卡纳霉素LB培养基。
实施例2敲除thrB基因、过表达rhtA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23)
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23)，其构建方法可参考文献:Microb Cell Fact.2016Dec 1；15(1):205，具体包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌MG1655为模板，以pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-r、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r为引物，通过重叠延伸PCR法(即SOE-PCR法)进行扩增，将苏氨酸-高丝氨酸抗性基因(转移泵基因)rhtA上游直接相邻碱基从G替换成A，得到rhtA23供体DNA片段,并在两端引入构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒所需克隆位点；
其中，所述引物pSOE-rhtA23-H1-f具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H1-r具有如SEQ ID No.4所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H2-f具有如SEQID No.5所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H2-r具有如SEQ ID No.6所示的序列，所述引物prhtA23-N20-f具有如SEQ ID No.7所示的序列，所述引物prhtA23-N20-r具有如SEQ IDNo.8所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.3：5’-CCAGGTCTCAGTGCCAAATGTGATTCAAATAAGTCCTAAG-3’；
SEQ ID No.4：5’-GTAATGAACCAGGCATTCTTTCTCCCACAAATATC-3’；
SEQ ID No.5：5’-GATATTTGTGGGAGAAAGAATGCCTGGTTCATTAC-3’；
SEQ ID No.6：5’-CCAGGTCTCAGAGCAGTGGTCCGGTGAACTC-3’；
SEQ ID No.7：5’-AGCGATTTGTGGGAGAAAGAATGCC-3’；
SEQ ID No.8：5’-AAACGGCATTCTTTCTCCCACAAAT-3’。
所述rhtA23供体DNA片段具有如SEQ ID No.9所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.9：
5’-CAAATGTGATTCAAATAAGTCCTAAGTTTTAAATATATCAAAAATTAATGGGAAACTCTTCGCGATTTGTGATGTCTAACGGGCCATTTCATGTAACAGAACGTTTCCATACACCGCTATCCATCTAAATTTAAATCACTTTTTCAGAGAACTGCGTAAGTATTACGCATGTTTTCCCTGTCATTCATCCAGATTATTCCTAATCACCAGACTAATGATTCCATCAATCCTGGCGCATTTTAGTCAAAACGGGGGAAAATTTTTTCAACAAATGCTCGACCAGCATTGGGTATATCCAGTACACTCCACGCTTTACTTAAGTCTAGATATTTGTGGGAGAAAGAATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCCGGTCTGGTTACCAATAGTCATATTGCTCGTTGCCATGGCGTCTATTCAGGGTGGAGCCTCGTTAGCTAAGTCACTTTTTCCTCTGGTGGGCGCACCGGGTGTCACTGCGCTGCGTCTGGCATTAGGAACGCTGATCCTCATCGCGTTCTTTAAGCCATGGCGACTGCGCTTTGCCAAAGAGCAACGGTTACCGCTGTTGTTTTACGGCGTTTCGCTGGGTGGGATGAATTATCTTTTTTATCTTTCTATTCAGACAGTACCGCTGGGTATTGCGGTGGCGCTGGAGTTCACCGGACCACT-3’
(2)将步骤(1)中得到的所述rhtA23供体DNA与对应的靶点序列N20克隆到温敏质粒中，所述温敏质粒含有通过诱导表达Gam、Bet以及Exo 3种Lambda噬菌体重组酶、Cas9DNA内切酶；
(3)筛选步骤(2)中得到的所述温敏质粒，并将正确的质粒转入实施例1中得到的所述菌株MG1655(ΔthrB)的感受态细胞中，然后，在30℃下进行培养，将成功转入的菌株置于阿拉伯糖诱导条件下继续培养，使其表达Lambda噬菌体重组酶、gRNA和Cas9DNA内切酶，再筛选目标rhtA23突变体菌落；
(4)将步骤(3)中筛选确认的所述目标rhtA23突变体菌落在42℃下培养消除CRISPR/Cas9质粒，同时消除质粒所导致的卡纳霉素抗性，即得到所述菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23)。
本实施例中采用的所述温敏质粒具有文献Cell Fact.2016Dec1；15(1):205.中的温敏质粒pRed_Cas9_recA_Δpoxb300所示的DNA序列结构；所述大肠杆菌MG1655购买自ATCC；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。本实施例中，所述阿拉伯糖诱导条件具体为：在含20mM阿拉伯糖的LB培养基中，30℃诱导培养。
实施例3弱化thrB基因、过表达rhtA基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23)的构建
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对thrB基因的R235位置和rhtA的基因上游碱基进行突变，其构建方法与实施例2的方法基本相同，区别仅在于：以原始菌MG1655为操作对象，分两步分别实现rhtA23和thrB(R235H)的基因编辑。具体的：第一步是在MG1655菌上，重复实施例2中所述步骤，获得过表达rhtA基因的菌株；第二步，在该过度菌株的基础上使用一样的方法实现对thrB基因R235位置的编辑：只是将实施例2中所述步骤(1)中采用的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-thrB-R235H-H1-f、pSOE-thrB-R235H-H1-r、pSOE-thrB-R235H-H2-f、pSOE-thrB-R235H-H2-r、pthrB-R235H-N20-f、pthrB-R235H-N20-r；
其中，所述引物pSOE-thrB-R235H-H1-f具有如SEQ ID No.10所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-H1-r具有如SEQ ID No.11所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-H2-f具有如SEQ ID No.12所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-H2-r具有如SEQ IDNo.13所示的序列，所述引物pthrB-R235H-N20-f具有如SEQ ID No.14所示的序列，所述引物pthrB-R235H-N20-r具有如SEQ ID No.15所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.10:5’-CCAGGTCTCAGTGCCCGGCAGCATTCATTACGAC-3’；
SEQ ID No.11：5’-CTCGTGATATGGCTCGGCTATAACATCTTTCATCAGCTTCGC-3’；
SEQ ID No.12：5’-TAGCCGAGCCATATCACGAGCGGTTACTGCCAGGCTTCCG-3’；
SEQ ID No.13：5’-CCAGGTCTCAGAGCTTTGCCCAACCCCTGGGTTAC-3’；
SEQ ID No.14：5’-AGCGTAGCCGAGCCATATCACGAG-3’；
SEQ ID No.15：5’-AAACCTCGTGATATGGCTCGGCTA-3’。
实施例4敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL)的构建
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在实施例2的基础上实现菌株的构建，其构建方法与实施例2的方法基本相同，区别仅在于：将实施例2中所述步骤(1)中采用的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-ΔthrL-H1-f、pSOE-ΔthrL-H1-r、pSOE-ΔthrL-H2-f、pSOE-ΔthrL-H2-r、pthrL-N20-f、pthrL-N20-r；
其中，所述引物pSOE-ΔthrL-H1-f具有如SEQ ID No.16所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H1-r具有如SEQ ID No.17所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H2-f具有如SEQ ID No.18所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H2-r具有如SEQ ID No.19所示的序列，所述引物pthrL-N20-f具有如SEQ ID No.20所示的序列，所述引物pthrL-N20-r具有如SEQID No.21所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.16:5’-CCAGGTCTCAGTGCCCAGGTCTCAGTGC-3’；
SEQ ID No.17：5’-TAGGCATAGCGCACAGACAGATAAAGACTCTAGAGTCCGACCAAAGGTAACGAGGTAAC-3’；
SEQ ID No.18：5’-GTTACCTCGTTACCTTTGGTCGGACTCTAGAGTCTTTATCTGTCTGTGCGCTATGCCTA-3’；
SEQ ID No.19：5’-CCAGGTCTCAGAGCGCACTGCCCCAACAAACTAATGC-3’；
SEQ ID No.20：5’-AGCGACCACCATCACCATTACCAC-3’；
SEQ ID No.21：5’-AAACGTGGTAATGGTGATGGTGGT-3’。
实施例5弱化thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL)的构建
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，其构建方法与实施例4的方法基本相同，区别仅在于：本菌株是在实施例3生成菌株基础上获得。
实施例6敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除、thrA基因被突变的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，其构建方法与实施例2的方法基本相同，区别仅在于：本菌株是在实施例4生成菌株基础上获得，且将实施例2中所述步骤(1)中采用的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-thrA*-H1-f、pSOE-thrA*-H1-r、pSOE-thrA*-H2-f、pSOE-thrA*-H2-r、pthrA-N20-f、pthrA-N20-r；
其中，所述引物pSOE-thrA*-H1-f具有如SEQ ID No.22所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H1-r具有如SEQ ID No.23所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H2-f具有如SEQID No.24所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H2-r具有如SEQ ID No.25所示的序列，所述引物pthrA-N20-f具有如SEQ ID No.26所示的序列，所述引物pthrA-N20-r具有如SEQ IDNo.27所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.22:5’-CCAGGTCTCAGTGCTGAAAGGGATGGTCGGCATG-3’；
SEQ ID No.23：5’-TATCAACATTGTCGCCATTGCTCAGGGATCTTCTGAACGCTCAATCTC-3’；
SEQ ID No.24：5’-GAGATTGAGCGTTCAGAAGATCCCTGAGCAATGGCGACAATGTTGATA-3’；
SEQ ID No.25：5’-CCAGGTCTCAGAGCCATATTGATCCGCCACTGCCTGGC-3’；
SEQ ID No.26：5’-AGCGTTCAGAAGATCCCTGAGCAA-3’；
SEQ ID No.27：5’-AAACTTGCTCAGGGATCTTCTGAA-3’。
实施例7弱化thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除、thrA基因被突变的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，其构建方法与实施例6的方法基本相同，区别仅在于：本菌株是在实施例5生成菌株基础上获得。
实施例8重组质粒pHom1的构建及其菌株
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrA*基因被突变、asd基因被过表达的菌株，将基因Asd过表达利用了thrA*内部天然的thrB的核糖体结合位点，其构建方法如下：
(1)以pACYC-duet为载体，通过SOE-PCR法将thrA*基因与asd基因克隆到天然的Lac启动子下方，得到具有p15a复制原点和氯霉素抗性基因的质粒pHom1；
(2)将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入大肠杆菌MG1655中，即得所述L-高丝氨酸生产菌株。
作为本实施例优选的实施方式，可将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入实施例1-7中制备得到所述L-高丝氨酸生产菌株中。
本实施例中采用的所述pACYC-duet的载体购买自Novagen公司。需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。
取本实施例中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株、将所述质粒pHom1分别转入实施例1-7中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株，进行发酵实验，结果证明上述7种所述L-高丝氨酸生产菌株具有稳定的将L-天门冬氨酸转化为L-高丝氨酸的能力。
实施例9重组质粒pHom2的构建及其菌株
本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrA*基因被突变，asd基因、pcc基因、pntAB基因被过表达的菌株，其构建方法如下：
(1)以pACYC-duet为载体，通过SOE-PCR法将thrA*基因、asd基因pcc基因、pntAB基因克隆到天然的Lac启动子下方，得到具有p15a复制原点和氯霉素抗性基因的质粒pHom2；
(2)将步骤(1)中得到的所述质粒pHom2转入大肠杆菌MG1655中，即得所述L-高丝氨酸生产菌株。
作为本实施例优选的实施方式，可将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入实施例1-7中制备得到所述L-高丝氨酸生产菌株中。
取本实施例中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株、将所述质粒pHom2分别转入实施例1-7中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株，进行发酵实验，结果证明上述7种所述L-高丝氨酸生产菌株具有具有自发生产L-高丝氨酸的能力。
实施例10L-高丝氨酸生产菌株发酵生产L-高丝氨酸
本实施例采用实施例1中制备得到的菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，其生产方法具体如下：
取实施例1最终制备得到的菌株，将其接种至活化斜面培养基，在37℃下培养12h后，用接种环刮取斜面菌种，再将其接种至种子培养基，在37℃、转速250rpm下，培养10.5h，然后按10％(v/v)的接种量转接至装有发酵培养基的容量为3L的发酵罐中进行发酵，发酵即得L-高丝氨酸。
作为本实施例优选的实施方式，在所述发酵罐中进行发酵时，维持温度在37℃、溶氧在30-40％，并用NH3·H2O调节发酵液pH值在7.0；作为进一步优选的实施方式，在所述发酵罐中发酵时，在线监测所述发酵液中葡萄糖的残留量，当其下降至3g/L时，流加70％葡萄糖至发酵液的残糖量为1-5g/L。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。
需要说明的是，本实施例中采用的所述斜面培养基为LB培养基，具体成分为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基为TB培养基，具体成分为：酵母膏24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L，72mM K2HPO4(所述mM是指mmol/L，下同，后文不再冗述),17mM KH2PO4；所述发酵培养基的具体成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆20g/L,糖蜜15g/L，甜菜碱0.25g/L,(NH4)2SO43g/L，KCl 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O0.02g/L，其余为水，pH值为7.0。本领域技术人员可根据实际情况对上述各成分进行一定幅度的调整，本实施例仅提供一种具体实现方案,作为本实施例可替换的实施方式，所述发酵培养基包括的成分含量可替换为以下范围内的任意值：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L,(NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O0.01-0.1g/L，其余为水。
作为本实施例可替换的实施方式，所述实施例1最终制备得到的菌株还可替换为实施例2-9中最终制备得到的菌株。
实施例11 L-高丝氨酸生产菌株发酵的结果统计
本实施例优选采用实施例6和实施例7中所述已转入了pHom2质粒的菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，与MG1655菌对比。其生产方法与实施例10中所述的生产方法完全一致，对含有质粒的菌发酵时额外添加氯霉素至终浓度30ug/mL。
按照采用实施例6中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为HomoS6、采用实施例7中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为HomoS7，分别对L-高丝氨酸的产量、糖转化率进行检测和计算，其结果如下：
菌种 L-高丝氨酸产量(g/L)
MG1655 0
MG1655/pHom2 0.16±0.06
HomoS6/pHom2 34.7±6.4
HomoS7/pHom2 42.3±4.7
由上述结果可知，采用本发明的菌株发酵生产L-高丝氨酸的产量最高达约47g/L，表明本发明对各基因的敲除、弱化、增强、过表达、突变起到了明显的效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州引航生物科技有限公司
<120> 一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
<130> 2017
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggttaaagt ttatgccccg gcttccagtg ccaatatgag cgtcgggttt gtgtaggctg 60
gagctgcttc gaag 74
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagttttcc agtactcgtg cgcccgccgt atccagccgg caaatatgaa catgggaatt 60
agccatggtc catatg 76
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccaggtctca gtgccaaatg tgattcaaat aagtcctaag 40
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtaatgaacc aggcattctt tctcccacaa atatc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gatatttgtg ggagaaagaa tgcctggttc attac 35
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ccaggtctca gagcagtggt ccggtgaact c 31
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
agcgatttgt gggagaaaga atgcc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
aaacggcatt ctttctccca caaat 25
<210> 9
<211> 670
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
caaatgtgat tcaaataagt cctaagtttt aaatatatca aaaattaatg ggaaactctt 60
cgcgatttgt gatgtctaac gggccatttc atgtaacaga acgtttccat acaccgctat 120
ccatctaaat ttaaatcact ttttcagaga actgcgtaag tattacgcat gttttccctg 180
tcattcatcc agattattcc taatcaccag actaatgatt ccatcaatcc tggcgcattt 240
tagtcaaaac gggggaaaat tttttcaaca aatgctcgac cagcattggg tatatccagt 300
acactccacg ctttacttaa gtctagatat ttgtgggaga aagaatgcct ggttcattac 360
gtaaaatgcc ggtctggtta ccaatagtca tattgctcgt tgccatggcg tctattcagg 420
gtggagcctc gttagctaag tcactttttc ctctggtggg cgcaccgggt gtcactgcgc 480
tgcgtctggc attaggaacg ctgatcctca tcgcgttctt taagccatgg cgactgcgct 540
ttgccaaaga gcaacggtta ccgctgttgt tttacggcgt ttcgctgggt gggatgaatt 600
atctttttta tctttctatt cagacagtac cgctgggtat tgcggtggcg ctggagttca 660
ccggaccact 670
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ccaggtctca gtgcccggca gcattcatta cgac 34
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ctcgtgatat ggctcggcta taacatcttt catcagcttc gc 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tagccgagcc atatcacgag cggttactgc caggcttccg 40
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ccaggtctca gagctttgcc caacccctgg gttac 35
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
agcgtagccg agccatatca cgag 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
aaacctcgtg atatggctcg gcta 24
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ccaggtctca gtgcccaggt ctcagtgc 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
taggcatagc gcacagacag ataaagactc tagagtccga ccaaaggtaa cgaggtaac 59
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gttacctcgt tacctttggt cggactctag agtctttatc tgtctgtgcg ctatgccta 59
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
ccaggtctca gagcgcactg ccccaacaaa ctaatgc 37
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agcgaccacc atcaccatta ccac 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
aaacgtggta atggtgatgg tggt 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
ccaggtctca gtgctgaaag ggatggtcgg catg 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
tatcaacatt gtcgccattg ctcagggatc ttctgaacgc tcaatctc 48
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
gagattgagc gttcagaaga tccctgagca atggcgacaa tgttgata 48
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
ccaggtctca gagccatatt gatccgccac tgcctggc 38
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
agcgttcaga agatccctga gcaa 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
aaacttgctc agggatcttc tgaa 24

Claims (10)

1.一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。
3.一种权利要求1或2所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤中一步或多步：
A、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；
B、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强；
C、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；
D、将含有L-高丝氨酸代谢途径中敲除或被弱化和/或过表达或增强和/或突变关键基因的重组质粒转入菌株中，即获得了L-高丝氨酸生产菌株。
4.根据权利要求3所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；
所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；
所述步骤C中所述的被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
5.根据权利要求3或4中所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤D中所述的菌株为大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。
7.权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。
8.一种生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述L-高丝氨酸。
9.根据权利要求8中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。
10.根据权利要求8或9中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L,(NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，其余为水。
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