CN114480233A - 一种高效发酵生产l-高丝氨酸的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效发酵生产L‑高丝氨酸菌株，其特征在于，该菌株为突变型大肠杆菌重组工程菌株11‑A，于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20947。本发明通过代谢工程的方法，构建出能发酵生产高浓度L‑高丝氨酸的大肠杆菌CGMCC No.20947，利用该菌株发酵生产L‑高丝氨酸的产量高达97.45g/L，适合工业化生产L‑高丝氨酸。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种高效发酵生产L-高丝氨酸的菌株及其构建方法和应用。
背景技术
L-高丝氨酸是一种天然存在的非必需氨基酸，可用作生产许多重要化合物，例如蛋氨酸、苏氨酸、γ-丁内酯等。同时，L-高丝氨酸也作为重要的含硫化合物的前体，例如 L-蛋氨酸及S-腺苷甲硫氨酸等共有中间体而存在于很多物种中。基于L-高丝氨酸具有的L-型-α氨基酸基本骨架且其γ-羟基具有多样性的化学活性，因而作为重要的功能性氨基酸，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。
目前，国内外生产L-高丝氨酸的方法主要有以下几种：(1)化学法；(2)化学手性拆分法；(3)生物法。化学法合成L-高丝氨酸主要是采用成本较昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；化学手性拆分法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁；生物法目前主要包括生物酶法及发酵法两种方式。其中常见报导的是生物酶法，其工艺是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L- 氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该工艺主要问题仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。而微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，由于高丝氨酸对于细菌生长具有较强的抑制作用，对L-高丝氨酸的直接发酵生产具有挑战性。综合上述，这三种方法都存在一定的问题，影响了L-高丝氨酸的产率和产量。虽然高丝氨酸具有极其重要的经济价值，但目前提取L-高丝氨酸的工艺复杂，副产物多，成本高，产量低，仍没有找到合适的方式大规模工业化生产L-高丝氨酸。基于以上，提供一种能够高效发酵生产L-高丝氨酸的菌株及其构建方法对提高L-高丝氨酸的产量并且降低生产成本具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于：针对上述问题，提供一种高效发酵生产L-高丝氨酸的菌株及其构建方法和应用。本发明通过基因工程构建高产L-高丝氨酸的菌株，能够明显提高菌种密度和生产强度，同时采用无机盐培养基进行发酵培养，进一步降低了生产成本，生产过程更加绿色环保，市场竞争优势明显。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一方面提供了一种高效发酵生产L-高丝氨酸菌株，该菌株为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，株号11-A，于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20947。
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的工程菌株11-A是通过依次将大肠杆菌K-12MG1655的葡糖激酶基因(glk)整合在其染色体的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)处，将运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白(zglf)整合在其染色体的半乳糖操纵子的调节子基因(galR)处，将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)整合在其染色体的外膜蛋白酶VII基因(ompT)处，将L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA)整合在其染色体的乳酸脱氢酶基因(ldhA)处，将 L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB)整合在其染色体的脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)处，将天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)整合在其染色体的的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)处，将天冬氨酸氨裂解酶酶基因(aspA)整合在其染色体的的丙酮酸氧化酶基因(poxB)处，同时敲除DNA结合转录抑制因子基因(iclR)，庚二酸脱羧酶基因(lysA)，高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶基因(metA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)得到宿主菌株，然后在宿主菌株中过表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1 基因thrA(S345F)而得到的。
本发明的另一方面还提供了一种高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，包括：
宿主菌株的构建：用葡糖激酶基因(glk)替换大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)，用运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白(zglf)替换大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因(galR)，用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)替换大肠杆菌基因组中的外膜蛋白酶VII基因(ompT)，用L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA) 替换所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，用L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB)替换大肠杆菌基因组中的脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)，用天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)替换大肠杆菌基因组中的丙酮酸甲酸裂解酶基因 (pflB)，用天冬氨酸氨裂解酶酶基因(aspA)替换大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因(poxB)；并且同时敲除DNA结合转录抑制因子基因(iclR)，庚二酸脱羧酶基因(lysA)，高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶基因(metA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)，得到突变型大肠杆菌，命名为ST11；
质粒的构建：将解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因thrA(S345F) 插入质粒载体pRB1k的NcoI和EcoRI位点间得到重组载体，命名为pA；
工程菌株的构建：将上述重组载体质粒pA导入上述突变型大肠杆菌ST11中，即得到重组工程菌株，命名为11-A；
其中，所述大肠杆菌为野生型大肠杆菌K12 MG1655；
所述突变型大肠杆菌基因型为E.coli BW25113ΔptsG::glk,ΔgalR::zglf,ΔompT::ppc, ΔldhA::rhtA,ΔlpxM::rhtB,ΔpflB::asd,ΔpoxB::aspA,ΔiclR,ΔlysA,ΔmetA,ΔthrB；
所述天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因thrA(S345F)源自大肠杆菌K-12MG1655。
优选地，所述重组载体质粒pA的构建步骤如下：
以大肠杆菌K12的基因组DNA为模板，用引物thrA-F和S345F-R、S345F-F和thrA-R进行PCR扩增得到解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因的2个片段 thrA-1和thrA-2；所述正向引物thrA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物S345F-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述正向引物S345F-F的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示，所述反向引物thrA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
将pRB1k载体用NcoI和EcoRI双酶切后，回收载体大片段，将上述得到的thrA-1 和thrA-2基因片段与载体大片段用Gibson方法进行连接，将产物转化感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板，37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物pBAD-F 和pBAD-R进行PCR验证，筛选出正确构建的重组载体质粒pDE；所述正向引物pBAD-F 的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，所述反向引物pBAD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述重组载体质粒pA是将pRB1k载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因得到的；所述pRB1k载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述突变型大肠杆菌ST11的构建步骤如下：
(1)以pTargetF为模板，分别使用引物对pTarget-ptsG-F和pTarget-ptsG-R，pTarget-galR-F和pTarget-galR-R，pTarget-ompT-F和pTarget-ompT-R，pTarget-ldhA-F和 pTarget-ldhA-R，pTarget-lpxM-F和pTarget-lpxM-R，pTarget-pflB-F和pTarget-pflB-R， pTarget-poxB-F和pTarget-poxB-R，pTarget-iclR-F和pTarget-iclR-R，pTarget-lysA-F和pTarget-lysA-R，pTarget-metA-F和pTarget-metA-R，pTarget-thrB-F和pTarget-thrB-R进行PCR扩增，将扩增得到的片段用DpnI甲基化酶消化后转化大肠杆菌Fast-T1感受态，在含链霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并用引物pTarget-cexu-F测序验证，测序正确后分别命名为pTarget-ptsG，pTarget-galR，pTarget-ompT，pTarget-ldhA，pTarget-lpxM， pTarget-pflB，pTarget-poxB，pTarget-iclR，pTarget-lysA，pTarget-metA和pTarget-thrB；
(2)分别用引物对ptsG-up500-F和ptsG-up500-R，glk-F和glk-R，ptsG-down500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ptsG-up500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，得到ptsG::glk打靶片段；分别用引物对galR-up500-F和galR-up500-R，zglf-F和zglf-R，galR-down500-F和 galR-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对galR-up500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，得到galR::zglf打靶片段；分别用引物对ompT-up500-F和ompT-up500-R，ppc-F和ppc-R，ompT-down500-F和 ompT-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ompT-up500-F和ompT-down500-R进行PCR扩增，得到ompT::ppc打靶片段；分别用引物对ldhA-up500-F和ldhA-up500-R，rhtA-F和rhtA-R，ldhA-down500-F和 ldhA-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ldhA-up500-F和ldhA-down500-R进行PCR扩增，得到ldhA::rhtA打靶片段；分别用引物对lpxM-up500-F和lpxM-up500-R，rhtB-F和rhtB-R，lpxM-down500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对lpxM-up500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，得到lpxM::rhtB打靶片段；分别用引物对pflB-up500-F和pflB-up500-R，asd-F和asd-R，pflB-down500-F和 pflB-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对pflB-up500-F和pflB-down500-R进行PCR扩增，得到pflB::asd打靶片段；分别用引物对poxB-up500-F和poxB-up500-R，aspA-F和aspA-R，poxB-down500-F和 poxB-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对poxB-up500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，得到poxB::aspA打靶片段；分别用引物对iclR-up500-F和iclR-up500-R，iclR-down500-F和iclR-down500-R进行PCR 扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对iclR-up500-F和 iclR-down500-R进行PCR扩增，得到ΔiclR打靶片段；分别用引物对lysA-up500-F和 lysA-up500-R，lysA-down500-F和lysA-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对lysA-up500-F和lysA-down500-R进行PCR扩增，得到ΔlysA打靶片段；分别用引物对metA-up500-F和metA-up500-R，metA-down500-F 和metA-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对metA-up500-F和metA-down500-R进行PCR扩增，得到ΔmetA打靶片段；分别用引物对thrB-up500-F和thrB-up500-R，thrB-down500-F和thrB-down500-R进行PCR 扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对thrB-up500-F和 thrB-down500-R进行PCR扩增，得到ΔthrB打靶片段；将得到的打靶片段ptsG::glk， galR::zglf，ompT::ppc，ldhA::rhtA，lpxM::rhtB，pflB::asd，poxB::aspA，ΔiclR，ΔlysA，ΔmetA和ΔthrB分别回收；
(3)将pTarget-ptsG质粒，打靶片段ptsG::glk与电转化感受态细胞混合，置于电转杯中电击，加入LB液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上， 30℃培养，筛选阳性克隆，并用引物对ptsG-up700-F和ptsG-down700-R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证筛选出阳性克隆；
(4)将上述得到的阳性克隆接种在含有IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget质粒，过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线， 30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glk，命名为ST01；
(5)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST01制备电转感受态细胞，与pTarget-galR 质粒和galR::zglf打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对galR-up700-F和galR-down700-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglf，命名为ST02；
(6)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST02制备电转感受态细胞，与 pTarget-ompT质粒和ompT::ppc打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对 ompT-up800-F和ompT-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppc，命名为ST03；
(7)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST03制备电转感受态细胞，与pTarget-ldhA 质粒和ldhA::rhtA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对ldhA-up800-F和ldhA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtA，命名为ST04；
(8)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST04制备电转感受态细胞，与 pTarget-lpxM质粒和lpxM::rhtB打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对 lpxM-up800-F和lpxM-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtB，命名为ST05；
(9)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST05制备电转感受态细胞，与pTarget-pflB 质粒和pflB::asd打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对pflB-up800-F和pflB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asd，命名为 ST06；
(10)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST06制备电转感受态细胞，与 pTarget-poxB质粒和poxB::aspA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对 poxB-up800-F和poxB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp A，命名为ST07；
(11)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST07制备电转感受态细胞，与pTarget-iclR 质粒和ΔiclR打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对iclR-up800-F和iclR-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclR，命名为ST08；
(12)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST08制备电转感受态细胞，与pTarget-lysA 质粒和ΔlysA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对lysA-up800-F和lysA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysA，命名为ST09；
(13)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST09制备电转感受态细胞，与 pTarget-metA质粒和ΔmetA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对 metA-up800-F和metA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetA，命名为ST10；
(14)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST10制备电转感受态细胞，与pTarget-thrB 质粒和ΔthrB打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)的步骤，并用引物对thrB-up800-F 和thrB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，命名为ST11；
(15)将测序验证正确的含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB(ST11)接种在LB液体培养基中，37℃培养过夜以消除pCas 质粒，将过夜培养后的菌株在LB固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到不含质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，简称ST11。
优选地，还包括制备电转感受态细胞的步骤：将pCas质粒利用化学转化法转化大肠杆菌K12，在含卡那霉素的LB平板上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L 阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，得到电转感受态细胞。
优选地，步骤(1)中所述正向引物pTarget-ptsG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物pTarget-ptsG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述正向引物pTarget-galR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述反向引物pTarget-galR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述正向引物pTarget-ompT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述反向引物pTarget-ompT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述正向引物pTarget-ldhA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述反向引物 pTarget-ldhA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述正向引物pTarget-lpxM-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，所述反向引物pTarget-lpxM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述正向引物pTarget-pflB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述反向引物pTarget-pflB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述正向引物 pTarget-poxB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示，所述反向引物pTarget-poxB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述正向引物pTarget-iclR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述反向引物pTarget-iclR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述正向引物pTarget-lysA-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，所述反向引物pTarget-lysA-R 的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述正向引物pTarget-metA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述反向引物pTarget-metA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述正向引物pTarget-thrB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.30所示，所述反向引物 pTarget-thrB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述正向引物pTarget-cexu-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
所述PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板pTargetF 20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
优选地，步骤(2)中所述正向引物ptsG-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.33 所示，所述反向引物ptsG-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述正向引物 glk-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，所述反向引物glk-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述正向引物ptsG-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述反向引物ptsG-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述正向引物 galR-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述反向引物galR-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述正向引物zglf-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述反向引物zglf-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；所述正向引物galR-down500-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，所述反向引物galR-down500-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.44所示；所述正向引物ompT-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述反向引物ompT-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述正向引物ppc-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，所述反向引物ppc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述正向引物ompT-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，所述反向引物ompT-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；所述正向引物 ldhA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示，所述反向引物ldhA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；所述正向引物rhtA-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.53所示，所述反向引物rhtA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；所述正向引物 ldhA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示，所述反向引物ldhA-down500-R 的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；所述正向引物lpxM-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示，所述反向引物lpxM-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示；所述正向引物rhtB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示，所述反向引物rhtB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述正向引物lpxM-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，所述反向引物lpxM-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示；所述正向引物pflB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示，所述反向引物 pflB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示；所述正向引物asd-F的核苷酸序列如 SEQ ID NO.65所示，所述反向引物asd-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；所述正向引物pflB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示，所述反向引物 pflB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示；所述正向引物poxB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示，所述反向引物poxB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示；所述正向引物aspA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示，所述反向引物 aspA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示；所述正向引物poxB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，所述反向引物poxB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；所述正向引物iclR-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示，所述反向引物iclR-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；所述正向引物iclR-down500-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，所述反向引物iclR-down500-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.78所示；所述正向引物lysA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示，所述反向引物lysA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述正向引物 lysA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述反向引物lysA-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；所述正向引物metA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示，所述反向引物metA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示；所述正向引物metA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示，所述反向引物 metA-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；所述正向引物thrB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示，所述反向引物thrB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示；所述正向引物thrB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示，所述反向引物thrB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示；
所述PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板5-20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase 1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸0.5-2分钟(30秒/kb)(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
优选地，步骤(3)中所述正向引物ptsG-up700-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.91 所示，所述反向引物ptsG-up700-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.92所示；
步骤(5)所述正向引物galR-up700-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.93所示，所述反向引物galR-up700-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.94所示；
步骤(6)所述正向引物ompT-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.95所示，所述反向引物ompT-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.96所示；
步骤(7)所述正向引物ldhA-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.97所示，所述反向引物ldhA-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.98所示；
步骤(8)所述正向引物lpxM-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.99所示，所述反向引物lpxM-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.100所示；
步骤(9)所述正向引物pflB-down800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.101所示，所述反向引物pflB-down800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.102所示；
步骤(10)所述正向引物poxB-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.103所示，所述反向引物poxB-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.104所示；
步骤(11)所述正向引物iclR-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.105所示，所述反向引物iclR-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.106所示；
步骤(12)所述正向引物lysA-down800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.107所示，所述反向引物lysA-down800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.108所示；
步骤(13)所述正向引物metA-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.109所示，所述反向引物metA-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.110所示；
步骤(14)所述正向引物thrB-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.111所示，所述反向引物thrB-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.112所示。
本发明的另一方面还提供了一种高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的应用，用于制备L-高丝氨酸。
优选地，该应用是将活化后的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株接种于发酵培养基中并采用生物发酵法制备L-高丝氨酸，所述方法包括：
温度为37℃，初始空气通量为2vvm，搅拌转速300rpm，此时的溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至3vvm，同时将搅拌转速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％，当初始葡萄糖消耗完时，开启补料培养基，发酵过程采用氨水控制pH在7.0，当菌体密度达到600nm的吸光度(OD600)为70-80时，加入终浓度1g/L的L-阿拉伯糖诱导蛋白表达，当补料培养基耗尽即结束发酵。
优选地，所述发酵培养基组成为：柠檬酸1-5g/L，磷酸二氢钾1-20g/L，氮源1-5g/L，聚醚类消泡剂150uL/L，葡萄糖5-30g/L，MgSO4·7H2O 0.3-1g/L，VB1 5-10mg/L，赖氨酸0.1-1g/L，甲硫氨酸0.1-1g/L，异亮氨酸0.1-1g/L，苏氨酸0.1-1g/L，微量无机盐 I 1-10mL/L，pH 7.0±0.5；
所述补料培养基组成为：葡萄糖100-800g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，赖氨酸1-10g/L，甲硫氨酸1-10g/L，异亮氨酸1-10g/L，苏氨酸1-10g/L，微量无机盐II 1-10mL/L。
优选地，所述发酵培养基中所述微量无机盐I组成为：EDTA 840mg/L，CoCl2·6H2O250mg/L，MnCl2·4H2O 1500mg/L，CuCl2·2H2O 150mg/L，H3BO3 300mg/L， Na2MoO4·2H2O250mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 1300mg/L，柠檬酸铁10g/L；所述氮源选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种；
所述补料培养基中所述微量无机盐II组成为：EDTA 1300mg/L，CoCl2·6H2O 400mg/L，MnCl2·4H2O 2350mg/L，CuCl2·2H2O 250mg/L，H3BO3 500mg/L，Na2MoO4·2H2O 400mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 1600mg/L，柠檬酸铁4g/L。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明构建了一种能够高效生产L-高丝氨酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，株号11-A。本发明通过基因工程改造，获得高产L-高丝氨酸的工程菌株，同时采用无机盐培养基进行发酵培养，进一步降低了生产成本，生产过程更加绿色环保，市场竞争优势明显。本发明所采用的生物法生产工艺替代了传统的石化工艺，以可再生的生物基为原料替代了不可再生的石化原料，实现了节能减排、清洁生产、绿色环保、循环经济的大产业。通过对菌株和制造工艺的不断优化升级，使得产品的品质更好、成本更低，具有很大的市场前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。
附图说明
图1为pRB1k的物理图谱；
图2为大肠杆菌CGMCC No.20947的发酵过程中L-高丝氨酸产量随时间变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
在本发明的实施例中，如无特殊说明，所涉及的测序验证过程均由第三方检测机构完成，该机构为苏州金唯智生物科技有限公司。
本发明的实施例中，大肠杆菌K12记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,TakaiY, Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12的全基因组序列的GenBankAccession为U00096.3(GI：545778205，update date是AUG 01，2014，version是3)，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
在本发明的实施例中，解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因的编码序列如SEQ ID NO.2所示。葡糖激酶基因(glk)的编码序列如Gene ID:946858(由966 个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_416889(由321个氨基酸残基组成)所示的葡糖激酶；运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白基因(zglf)的编码序列如SEQ ID NO.3 (由1422个核苷酸组成)所示，编码Acession号AAA27691(由473个氨基酸残基组成) 所示的运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的编码序列如Gene ID:948457(由2652个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_418391 (由883个氨基酸残基组成)所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA)的编码序列如GeneID:947045(由888个核苷酸组成)所示，编码Acession 号NP_415334(由295个氨基酸残基组成)所示的L-高丝氨酸转运蛋白；L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB)的编码序列如Gene ID:948316(由621个核苷酸组成)所示，编码 Acession号YP_026265(由206个氨基酸残基组成)所示的L-高丝氨酸转运蛋白；天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)的编码序列如Gene ID:947939(由1104个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_417891(由367个氨基酸残基组成)所示的天冬氨酸半醛脱氢酶；天冬氨酸氨裂解酶基因(aspA)的编码序列如Gene ID:948658(由1437个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_418562(由478个氨基酸残基组成)所示的天冬氨酸氨裂解酶酶；D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)的编码序列如Gene ID:945651(由1434 个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415619(由477个氨基酸残基组成)所示的D-葡萄糖PTS通透酶；半乳糖操纵子的调节子基因(galR)的编码序列如Gene ID:947314(由1032个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_417314(由343个氨基酸残基组成) 所示的半乳糖操纵子的调节子；外膜蛋白酶VII基因(ompT)的编码序列如Gene ID: 945185(由954个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415097(由317个氨基酸残基组成)所示的外膜蛋白酶VII；乳酸脱氢酶基因(ldhA)的编码序列如Gene ID:946315 (由990个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415898(由329个氨基酸残基组成) 所示的乳酸脱氢酶；脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)的编码序列如Gene ID: 945143(由972个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_416369(由323个氨基酸残基组成)所示的脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶；丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的编码序列如Gene ID:945514(由2283个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415423 (由760个氨基酸残基组成)所示的丙酮酸甲酸裂解酶；丙酮酸氧化酶基因(poxB)的编码序列如Gene ID:946132(由1719个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415392 (由572个氨基酸残基组成)所示的丙酮酸氧化酶；DNA结合转录抑制因子基因(iclR) 的编码序列如Gene ID:948524(由825个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_418442 (由274个氨基酸残基组成)所示的DNA结合转录抑制因子；庚二酸脱羧酶基因(lysA) 的编码序列如Gene ID:947313(由1263个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_417315 (由420个氨基酸残基组成)所示的庚二酸脱羧酶；高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶基因 (metA)的编码序列如Gene ID:948513(由930个核苷酸组成)所示，编码Acession号 NP_418437(由309个氨基酸残基组成)所示的高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶；高丝氨酸激酶基因(thrB)的编码序列如Gene ID:947498(由933个核苷酸组成)所示，编码Acession 号NP_414544(由310个氨基酸残基组成)所示的高丝氨酸激酶。
下述实施例中pRB1k载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)RSF1030复制起始位点片段；(4)卡那霉素抗性基因Kan片段。pRB1k载体图谱如图1所示。
SEQ ID NO.1：
aatgtgcctgtcaaatggacgaagcagggattctgcaaaccctatgctactccgtcaagccgtcaattgtctgattcgttaccaatt atgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgc gagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctgg ctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaa acatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgccc ttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattgg caaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccgg atgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccac cccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaat cggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactccc gccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaa ccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaa agtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgc aactctctactgtttctccatacccgttttttgggctaacaggaggaattaaccatgggtacctctcatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcctcgagggtagatctggtactagtggtgaattcggtgagctcggtctgcagctggtgccgcgcggcagc caccaccaccaccaccactaatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcgg tggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtaggga actgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgtcgaccatgcagcgctcttccgcttcctcgctcact gactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggtgtcagctcactcaaaagcggtaatacggttatccacagaatcaggggata aagccggaaagaacatgtgagcaaaaagcaaagcaccggaagaagccaacgccgcaggcgtttttccataggctccgcccccctga cgagcatcacaaaaatcgacgctcaagccagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagct ccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctca cgctgttggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcctta tccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccattggtaactgatttagaggactttgtc ttgaagttatgcacctgttaaggctaaactgaaagaacagattttggtgagtgcggtcctccaacccacttaccttggttcaaagagttggt agctcagcgaaccttgagaaaaccaccgttggtagcggtggtttttctttatttatgagatgatgaatcaatcggtctatcaagtcaacgaa cagctattccgttactctagatttcagtgcaatttatctcttcgcggccgccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcat gagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcg attaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatg ggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactgg ctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaac agcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgt ttgtaattgtccttttaacagcgaccgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgat gacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatc ttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaa ttgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagggg ttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacttgcggagacccggtcgtcagcttgtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagcgca tgc
SEQ ID NO.2：
atgcgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcaaatgcagaacgttttctgcgtgttgccgatattctggaaagcaatgcca ggcaggggcaggtggccaccgtcctctctgcccccgccaaaatcaccaaccacctggtggcgatgattgaaaaaaccattagcggcc aggatgctttacccaatatcagcgatgccgaacgtatttttgccgaacttttgacgggactcgccgccgcccagccggggttcccgctg gcgcaattgaaaactttcgtcgatcaggaatttgcccaaataaaacatgtcctgcatggcattagtttgttggggcagtgcccggatagca tcaacgctgcgctgatttgccgtggcgagaaaatgtcgatcgccattatggccggcgtattagaagcgcgcggtcacaacgttactgtta tcgatccggtcgaaaaactgctggcagtggggcattacctcgaatctaccgtcgatattgctgagtccacccgccgtattgcggcaagc cgcattccggctgatcacatggtgctgatggcaggtttcaccgccggtaatgaaaaaggcgaactggtggtgcttggacgcaacggtt ccgactactctgctgcggtgctggctgcctgtttacgcgccgattgttgcgagatttggacggacgttgacggggtctatacctgcgacc cgcgtcaggtgcccgatgcgaggttgttgaagtcgatgtcctaccaggaagcgatggagctttcctacttcggcgctaaagttcttcacc cccgcaccattacccccatcgcccagttccagatcccttgcctgattaaaaataccggaaatcctcaagcaccaggtacgctcattggtg ccagccgtgatgaagacgaattaccggtcaagggcatttccaatctgaataacatggcaatgttcagcgtttctggtccggggatgaaa gggatggtcggcatggcggcgcgcgtctttgcagcgatgtcacgcgcccgtattttcgtggtgctgattacgcaatcatcttccgaatac agcatcagtttctgcgttccacaaagcgactgtgtgcgagctgaacgggcaatgcaggaagagttctacctggaactgaaagaaggct tactggagccgctggcagtgacggaacggctggccattatctcggtggtaggtgatggtatgcgcaccttgcgtgggatctcggcgaa attctttgccgcactggcccgcgccaatatcaacattgtcgccattgctcagggatcttctgaacgctcaatctctgtcgtggtaaataacg atgatgcgaccactggcgtgcgcgttactcatcagatgctgttcaataccgatcaggttatcgaagtgtttgtgattggcgtcggtggcgtt ggcggtgcgctgctggagcaactgaagcgtcagcaaagctggctgaagaataaacatatcgacttacgtgtctgcggtgttgccaact cgaaggctctgctcaccaatgtacatggccttaatctggaaaactggcaggaagaactggcgcaagccaaagagccgtttaatctcgg gcgcttaattcgcctcgtgaaagaatatcatctgctgaacccggtcattgttgactgcacttccagccaggcagtggcggatcaatatgc cgacttcctgcgcgaaggtttccacgttgtcacgccgaacaaaaaggccaacacctcgtcgatggattactaccatcagttgcgttatgc ggcggaaaaatcgcggcgtaaattcctctatgacaccaacgttggggctggattaccggttattgagaacctgcaaaatctgctcaatgc aggtgatgaattgatgaagttctccggcattctttctggttcgctttcttatatcttcggcaagttagacgaaggcatgagtttctccgaggc gaccacgctggcgcgggaaatgggttataccgaaccggacccgcgagatgatctttctggtatggatgtggcgcgtaaactattgattc tcgctcgtgaaacgggacgtgaactggagctggcggatattgaaattgaacctgtgctgcccgcagagtttaacgccgagggtgatgtt gccgcttttatggcgaatctgtcacaactcgacgatctctttgccgcgcgcgtggcgaaggcccgtgatgaaggaaaagttttgcgctat gttggcaatattgatgaagatggcgtctgccgcgtgaagattgccgaagtggatggtaatgatccgctgttcaaagtgaaaaatggcgaaaacgccctggccttctatagccactattatcagccgctgccgttggtactgcgcggatatggtgcgggcaatgacgttacagctgccg gtgtctttgctgatctgctacgtaccctctcatggaagttaggagtctga
SEQ ID NO.3：
atgagttctgaaagtagtcagggtctagtcacgcgactagccctaatcgctgctataggcggcttgcttttcggttacgattcagc ggttatcgctgcaatcggtacaccggttgatatccattttattgcccctcgtcacctgtctgctacggctgcggcttccctttctgggatggt cgttgttgctgttttggtcggttgtgttaccggttctttgctgtctggctggattggtattcgcttcggtcgtcgcggcggattgttgatgagtt ccatttgtttcgtcgccgccggttttggtgctgcgttaaccgaaaaattatttggaaccggtggttcggctttacaaattttttgctttttccggtttcttgccggtttaggtatcggtgtcgtttcaaccttgaccccaacctatattgctgaaattcgtccgccagacaaacgtggtcagatggttt ctggtcagcagatggccattgtgacgggtgctttaaccggttatatctttacctggttactggctcatttcggttctatcgattgggttaatgc cagtggttggtgctggtctccggcttcagaaggcctgatcggtattgccttcttattgctgctgttaaccgcaccggatacgccgcattggt tggtgatgaagggacgtcattccgaggctagcaaaatccttgctcgtctggaaccgcaagccgatcctaatctgacgattcaaaagatta aagctggctttgataaagccatggacaaaagcagcgcaggtttgtttgcttttggtatcaccgttgtttttgccggtgtatccgttgctgcctt ccagcagttagtcggtattaacgccgtgctgtattatgcaccgcagatgttccagaatttaggttttggagctgatacggcattattgcaga ccatctctatcggtgttgtgaacttcatcttcaccatgattgcttcccgtgttgttgaccgcttcggccgtaaacctctgcttatttggggtgct ctcggtatggctgcaatgatggctgttttaggctgctgtttctggttcaaagtcggtggtgttttgcctttggcttctgtgcttctttatattgca gtctttggtatgtcatggggccctgtctgctgggttgttctgtcagaaatgttcccgagttccatcaagggcgcagctatgcctatcgctgtt accggacaatggttagctaatatcttggttaacttcctgtttaaggttgccgatggttctccagcattgaatcagactttcaaccacggtttct cctatctcgttttcgcagcattaagtatcttaggtggcttgattgttgctcgcttcgtgccggaaaccaaaggtcggagcctggatgaaatc gaggagatgtggcgctcccagaagtag
实施例1构建表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的重组质粒pA
以大肠杆菌K12的基因组DNA为模板，用引物thrA-F和S345F-R、S345F-F和thrA-R进行PCR扩增得到解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因的2个片段 thrA-1和thrA-2。
将pRB1k载体用NcoI和EcoRI双酶切后，回收载体大片段，约3450bp，将回收的thrA-1和thrA-2基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，连接产物转化Fast-T1 感受态细胞(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为C505)，涂布含卡那霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物(pBAD-F和pBAD-R) 进行PCR验证，正确的克隆送测序。将pRB1k载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为SEQ IDNO.2所示的解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因得到的重组载体命名为pA。
引物序列如下：
thrA-F SEQ ID NO.4 5’-ggctaacaggaggaattaaccatgcgagtgttgaagttcgg-3’
S345F-R SEQ ID NO.5 5’-agcaccacgaaaatacgggcgcgtgacatc-3’
S345F-F SEQ ID NO.6 5’-gcccgtattttcgtggtgctgattacgcaatc-3’
thrA-R SEQ ID NO.7 5’-gctgcagaccgagctcaccgaattctcagactcctaacttccatg-3’
pBAD-F SEQ ID NO.8 5’-cggcgtcacactttgctatg-3’
pBAD-R SEQ ID NO.9 5’-cgtttcacttctgagttcggc-3’
在所述解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因表达盒中，启动所述解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因转录的启动子是pBAD启动子。
实施例2构建大肠杆菌突变体ST11
大肠杆菌突变体ST11是利用CRISPR技术(Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,YangJ, Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)将大肠杆菌K12 MG1655的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)替换为葡糖激酶基因(glk)，半乳糖操纵子的调节子基因(galR)替换为运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白基因(zglf)，外膜蛋白酶VII基因(ompT)替换为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)，乳酸脱氢酶基因(ldhA)替换为L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA)，脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)替换为L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)替换为天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)，丙酮酸氧化酶基因(poxB)替换为天冬氨酸氨裂解酶酶基因(aspA)，同时敲除DNA结合转录抑制因子基因(iclR)，庚二酸脱羧酶基因(lysA)，高丝氨酸 -O-琥珀酸转移酶基因(metA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)从而获得的大肠杆菌K12 MG1655的突变体，在本申请中简称为ST11，其基因型为E.coli BW25113ΔptsG::glk, ΔgalR::zglf,ΔompT::ppc,ΔldhA::rhtA,ΔlpxM::rhtB,ΔpflB::asd,ΔpoxB::aspA,ΔiclR, ΔlysA,ΔmetA,ΔthrB。
具体而言，在该实施例中，所述大肠杆菌突变体ST11是将大肠杆菌K12 MG1655 的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)替换为Gene ID:946858所示的葡糖激酶基因(glk)，半乳糖操纵子的调节子基因(galR)替换为SEQ ID NO.3所示的运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白(zglf)，外膜蛋白酶VII基因(ompT)替换为Gene ID:948457所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)，乳酸脱氢酶基因(ldhA)替换为Gene ID:947045 所示的L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA)，脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM) 替换为Gene ID:948316所示的L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB),丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)替换为Gene ID:947939所示的天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd),丙酮酸氧化酶基因(poxB)替换为Gene ID:948658所示的天冬氨酸氨裂解酶基因(aspA),同时敲除DNA结合转录抑制因子基因(iclR)，庚二酸脱羧酶基因(lysA)，高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶基因(metA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)得到的大肠杆菌突变体(简称ST11)。
大肠杆菌突变体ST11的具体构建步骤如下：
(1)制备电转感受态细胞：将pCas质粒(Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)利用化学转化法转化大肠杆菌K12，在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50ug/ml)上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，制备电转感受态细胞。
(2)构建pTarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org选取敲除位点的N20，设计引物构建pTarget质粒。以pTargetF(Jiang Y,Chen B,Duan C,SunB, Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)为模板，分别用引物对 pTarget-ptsG-F和pTarget-ptsG-R，pTarget-galR-F和pTarget-galR-R，pTarget-ompT-F和 pTarget-ompT-R，pTarget-ldhA-F和pTarget-ldhA-R，pTarget-lpxM-F和pTarget-lpxM-R， pTarget-pflB-F和pTarget-pflB-R，pTarget-poxB-F和pTarget-poxB-R，pTarget-iclR-F和 pTarget-iclR-R，pTarget-lysA-F和pTarget-lysA-R，pTarget-metA-F和pTarget-metA-R， pTarget-thrB-F和pTarget-thrB-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约2100bp的片段。 PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板pTargetF 20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P501)1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul。扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸1.5分钟(30 个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。用DpnI甲基化酶反应约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌Fast-T1感受态，在含链霉素的LB平板(链霉素浓度为 50ug/ml)上筛选阳性克隆，并用引物pTarget-cexu-F测序验证。测序正确后分别命名为 pTarget-ptsG，pTarget-galR，pTarget-ompT，pTarget-ldhA，pTarget-lpxM，pTarget-pflB， pTarget-poxB，pTarget-iclR，pTarget-lysA，pTarget-metA和pTarget-thrB。
所用引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：
pTarget-ptsG-F SEQ ID NO.10 5’-tccttcatttggccgccgatgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-ptsG-R SEQ ID NO.11 5’-atcggcggccaaatgaaggaactagtattatacctaggac-3’
pTarget-galR-F SEQ ID NO.12 5’-cagcaaggtcatacccgcatgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-galR-R SEQ ID NO.13 5’-atgcgggtatgaccttgctgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-ompT-F SEQ ID NO.14 5’-caacgaacccaattaccgccgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-ompT-R SEQ ID NO.15 5’-ggcggtaattgggttcgttgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-ldhA-F SEQ ID NO.16 5’-cgatccgtatccaagtgcaggttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-ldhA-R SEQ ID NO.17 5’-ctgcacttggatacggatcgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-lpxM-F SEQ ID NO.18 5’-tctttctggtgccgcacggtgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-lpxM-R SEQ ID NO.19 5’-accgtgcggcaccagaaagaactagtattatacctaggac-3’
pTarget-pflB-F SEQ ID NO.20 5’-gatcaccgaacaagaagcgcgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-pflB-R SEQ ID NO.21 5’-gcgcttcttgttcggtgatcactagtattatacctaggac-3’
pTarget-poxB-F SEQ ID NO.22 5’-cagcaaggtggatatggcacgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-poxB-R SEQ ID NO.23 5’-gtgccatatccaccttgctgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-iclR-F SEQ ID NO.24 5’-gctaaccacgatgcaacagcgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-iclR-R SEQ ID NO.25 5’-gctgttgcatcgtggttagcactagtattatacctaggac-3’
pTarget-lysA-F SEQ ID NO.26 5’-cgtcatcatctgcagctggtgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-lysA-R SEQ ID NO.27 5’-accagctgcagatgatgacgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-metA-F SEQ ID NO.28 5’-gccgcagatcaaacaggtgcgttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-metA-R SEQ ID NO.29 5’-gcacctgtttgatctgcggcactagtattatacctaggac-3’
pTarget-thrB-F SEQ ID NO.30 5’-cagggtttgatgagtggctggttttagagctagaaatagc-3’
pTarget-thrB-R SEQ ID NO.31 5’-cagccactcatcaaaccctgactagtattatacctaggac-3’
pTarget-cexu-F SEQ ID NO.32 5’-ctttcctgcgttatcccctg-3’
(3)扩增打靶片段：分别用引物对ptsG-up500-F和ptsG-up500-R，glk-F和glk-R，ptsG-down500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1400bp 和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对ptsG-up500-F和ptsG-down500-R 进行PCR扩增，得到大小约为2400bp的ptsG::glk打靶片段。分别用引物对galR-up500-F 和galR-up500-R，zglf-F和zglf-R，galR-down500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，2000bp和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对galR-up500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为3000bp的galR::zglf 打靶片段。分别用引物对ompT-up500-F和ompT-up500-R，ppc-F和ppc-R， ompT-down500-F和ompT-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，3200bp 和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对ompT-up500-F和 ompT-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为4200bp的ompT::ppc打靶片段。分别用引物对ldhA-up500-F和ldhA-up500-R，rhtA-F和rhtA-R，ldhA-down500-F和 ldhA-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1400bp和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对ldhA-up500-F和ldhA-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为2400bp的ldhA::rhtA打靶片段。分别用引物对lpxM-up500-F和 lpxM-up500-R，rhtB-F和rhtB-R，lpxM-down500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1200bp和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对lpxM-up500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为2200bp的 lpxM::rhtB打靶片段。分别用引物对pflB-up500-F和pflB-up500-R，asd-F和asd-R，pflB-down500-F和pflB-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1600bp 和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对pflB-up500-F和pflB-down500-R 进行PCR扩增，得到大小约为2600bp的pflB::asd打靶片段。分别用引物对poxB-up500-F 和poxB-up500-R，aspA-F和aspA-R，poxB-down500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，2000bp和500bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对poxB-up500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为3000bp的 poxB::aspA打靶片段。分别用引物对iclR-up500-F和iclR-up500-R，iclR-down500-F和 iclR-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp的片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对iclR-up500-F和iclR-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为1000bp的ΔiclR打靶片段。分别用引物对lysA-up500-F和lysA-up500-R， lysA-down500-F和lysA-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp 的片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对lysA-up500-F和lysA-down500-R进行 PCR扩增，得到大小约为1000bp的ΔlysA打靶片段。分别用引物对metA-up500-F和metA-up500-R，metA-down500-F和metA-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp的片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对metA-up500-F和 metA-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为1000bp的ΔmetA打靶片段。分别用引物对thrB-up500-F和thrB-up500-R，thrB-down500-F和thrB-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp的片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对 thrB-up500-F和thrB-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为1000bp的ΔthrB打靶片段。
PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板5-20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P501)1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul。扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸0.5-2分钟(30 秒/kb)(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将打靶片段ptsG::glk，galR::zglf，ompT::ppc，ldhA::rhtA，lpxM::rhtB，pflB::asd， poxB::aspA，ΔiclR，ΔlysA，ΔmetA和ΔthrB分别回收。打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，替换基因表达盒和500bp下游同源臂。
所用引物序列如下：
ptsG-up500-F SEQ ID NO.33 5’-gcgttatgtccccctggatc-3’
ptsG-up500-R SEQ ID NO.34 5’-aattgagagtgctcctgagt-3’
glk-F SEQ ID NO.35 5’-actcaggagcactctcaattatgacaaagtatgcattagtc-3’
glk-R SEQ ID NO.36 5’-tctccccaacgtcttacggattacagaatgtgacctaagg-3’
ptsG-down500-F SEQ ID NO.37 5’-tccgtaagacgttggggaga-3’
ptsG-down500-R SEQ ID NO.38 5’-cgcctataaagcggtggatg-3’
galR-up500-F SEQ ID NO.39 5’-cgcgagcgacagtaaattag-3’
galR-up500-R SEQ ID NO.40 5’-gaaaataccttagtgggtaa-3’
zglf-F SEQ ID NO.41 5’-ttacccactaaggtattttcatgagttctgaaagtagtcag-3’
zglf-R SEQ ID NO.42 5’-tggaattgctttaactgcggctacttctgggagcgccaca-3’
galR-down500-F SEQ ID NO.43 5’-ccgcagttaaagcaattcca-3’
galR-down500-R SEQ ID NO.44 5’-tttgggccaccctgtgaaac-3’
ompT-up500-F SEQ ID NO.45 5’-aaggcgttttacggcctgac-3’
ompT-up500-R SEQ ID NO.46 5’-gttagctgtgcataaaagttctccattcaatc-3’
ppc-F SEQ ID NO.47 5’-gaacttttatgcacagctaacaccacgtcgtc-3’
ppc-R SEQ ID NO.48 5’-acttaagaccagtactcacctgcgatatcg-3’
ompT-down500-F SEQ ID NO.49 5’-ggtgagtactggtcttaagtacacattttaag-3’
ompT-down500-R SEQ ID NO.50 5’-gagcggcaatggcatttaaaag-3’
ldhA-up500-F SEQ ID NO.51 5’-gccagacaagcagaatcaag-3’
ldhA-up500-R SEQ ID NO.52 5’-gacgacgtggtgttagctgtgcataagactttctccagtgatg-3’
rhtA-F SEQ ID NO.53 5’-gaaagtcttatgcacagctaacaccacgtcgtc-3’
rhtA-R SEQ ID NO.54 5’-cgttcgggcaagtactcacctgcgatatcg-3’
ldhA-down500-F SEQ ID NO.55 5’-cgatatcgcaggtgagtacttgcccgaacgaactggtttaatc-3’
ldhA-down500-R SEQ ID NO.56 5’-tcgccagcgttaactggttc-3’
lpxM-up500-F SEQ ID NO.57 5’-tgcaccacacagaggtgttg-3’
lpxM-up500-R SEQ ID NO.58 5’-acgacgtggtgttagctgtgcatgcttttccagtttcgga-3’
rhtB-F SEQ ID NO.59 5’-gaaaagcatgcacagctaacaccacgtcgtc-3’
rhtB-R SEQ ID NO.60 5’-gataaagatcagtactcacctgcgatatcg-3’
lpxM-down500-F SEQ ID NO.61 5’-cgatatcgcaggtgagtactgatctttatcccatcaaata-3’
lpxM-down500-R SEQ ID NO.62 5’-ttctaaacaccgtctggacg-3’
pflB-up500-F SEQ ID NO.63 5’-ttccggcgagtatatgaccg-3’
pflB-up500-R SEQ ID NO.64 5’-gacgacgtggtgttagctgtgcatgtaacacctaccttcttaag-3’
asd-F SEQ ID NO.65 5’-gtgttacatgcacagctaacaccacgtcgtc-3’
asd-R SEQ ID NO.66 5’-gagtgaaggtagtactcacctgcgatatcg-3’
pflB-down500-F SEQ ID NO.67 5’-cgatatcgcaggtgagtactaccttcactcaatctatgta-3’
pflB-down500-R SEQ ID NO.68 5’-aaccgttggtgtccagacag-3’
poxB-up500-F SEQ ID NO.69 5’-tcacgtaccgtgatgacctg-3’
poxB-up500-R SEQ ID NO.70 5’-gacgacgtggtgttagctgtgcatggttctccatctcctgaatg-3’
aspA-F SEQ ID NO.71 5’-gagaaccatgcacagctaacaccacgtcgtc-3’
aspA-R SEQ ID NO.72 5’-agtttgttttagtactcacctgcgatatcg-3’
poxB-down500-F SEQ ID NO.73 5’-cgatatcgcaggtgagtactaaaacaaactggctaaggta-3’
poxB-down500-R SEQ ID NO.74 5’-ctcgcgggtaaattcccatg-3’
iclR-up500-F SEQ ID NO.75 5’-cgcaaagttgatttccgccg-3’
iclR-up500-R SEQ ID NO.76 5’-caccgtacgccatgacagtctcttttttctg-3’
iclR-down500-F SEQ ID NO.77 5’-gactgtcatggcgtacggtggaatgcgctg-3’
iclR-down500-R SEQ ID NO.78 5’-cagcttgtaagacggacgtg-3’
lysA-up500-F SEQ ID NO.79 5’-tcaagtagcggtgattcctg-3’
lysA-up500-R SEQ ID NO.80 5’-ccagcgccagcataacaaactccagataagtgc-3’
lysA-down500-F SEQ ID NO.81 5’-gtttgttatgctggcgctggaattgctttaac-3’
lysA-down500-R SEQ ID NO.82 5’-tcctatctcgttttcgcagc-3’
metA-up500-F SEQ ID NO.83 5’-tatagaacccaaccgcctgc-3’
metA-up500-R SEQ ID NO.84 5’-ttggattcatcataacctgattacctcacta-3’
metA-down500-F SEQ ID NO.85 5’-tcaggttatgatgaatccaacgctggattaatc-3’
metA-down500-R SEQ ID NO.86 5’-tcagcatcgcgaatggaagc-3’
thrB-up500-F SEQ ID NO.87 5’-tcggcaagttagacgaaggc-3’
thrB-up500-R SEQ ID NO.88 5’-cagtactcgtgccatgtcagactcctaacttcc-3’
thrB-down500-F SEQ ID NO.89 5’-gtctgacatggcacgagtactggaaaactaaatg-3’
thrB-down500-R SEQ ID NO.90 5’-tgccgcccaatgtacagaac-3’
(4)电转化：将200ng pTarget-ptsG质粒，400ng打靶片段ptsG::glk与100μl步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中，2.5kV电击，加入1ml LB 液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上(卡那霉素浓度为50 ug/ml，链霉素浓度为50ug/ml)，30℃培养，筛选阳性克隆。用引物对ptsG-up700-F和 ptsG-down700-R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证。
所述PCR扩增体系为：Green Taq Mix 10ul(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P131)、引物(10uM)各0.8ul、蒸馏水8.4ul、模板菌液0.2ul，总体积为 20ul；所述PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、55℃退火15秒、72℃延伸1-5分钟(60秒/kb)(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
(5)消除pTarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mM IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget质粒。过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glk，命名为ST01。
(6)从步骤(5)的平板上挑取单克隆，制备电转感受态细胞，与pTarget-galR质粒和galR::zglf打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对galR-up700-F 和galR-down700-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglf，命名为ST02。
(7)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体SG103制备电转感受态细胞，与 pTarget-ompT质粒和ompT::ppc打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对ompT-up800-F和ompT-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppc，命名为ST03。
(8)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST03制备电转感受态细胞，与pTarget-ldhA 质粒和ldhA::rhtA打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对ldhA-up800-F 和ldhA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtA，命名为ST04。
(9)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST04制备电转感受态细胞，与pTarget-lpxM 质粒和lpxM::rhtB打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对lpxM-up800-F 和lpxM-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtB，命名为ST05。
(10)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST05制备电转感受态细胞，与pTarget-pflB 质粒和pflB::asd打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对pflB-up800-F和pflB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asd，命名为 ST06。
(11)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST06制备电转感受态细胞，与 pTarget-poxB质粒和poxB::aspA打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对poxB-up800-F和poxB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp A，命名为ST07。
(12)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST07制备电转感受态细胞，与pTarget-iclR 质粒和ΔiclR打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对iclR-up800-F和iclR-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclR，命名为ST08。
(13)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST08制备电转感受态细胞，与pTarget-lysA 质粒和ΔlysA打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对lysA-up800-F 和lysA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysA，命名为ST09。
(14)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST09制备电转感受态细胞，与 pTarget-metA质粒和ΔmetA打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对 metA-up800-F和metA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetA，命名为ST10。
(15)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST10制备电转感受态细胞，与pTarget-thrB 质粒和ΔthrB打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对thrB-up800-F 和thrB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，命名为ST11。
(16)消除pCas质粒：将测序验证正确的含有pCas质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::asp AΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB(ST11)接种在LB液体培养基中，37℃培养过夜以消除pCas 质粒。将过夜培养后的菌株在LB固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到不含质粒的大肠杆菌突变体 BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asd ΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，简称ST11。
用于验证和测序的引物序列如下：
ptsG-up700-F SEQ ID NO.91 5’-actgaacaagccggttatcg-3’
ptsG-down700-R SEQ ID NO.92 5’-acctacgccagctatacctc-3’
galR-up700-R SEQ ID NO.93 5’-ggcgtaattagaacgcgctc-3’
galR-down700-R SEQ ID NO.94 5’-acatgcacattggttctggc-3’
ompT-up800-F SEQ ID NO.95 5’-cagcattactggaatctgcg-3’
ompT-down800-R SEQ ID NO.96 5’-agaggaacctccattatcgc-3’
ldhA-up800-F SEQ ID NO.97 5’-ttacaggaagtccatccggc-3’
ldhA-down800-R SEQ ID NO.98 5’-agcgttttgggtagggtgtg-3’
lpxM-up800-F SEQ ID NO.99 5’-agccatgcagtggcaaatgg-3’
lpxM-down800-R SEQ ID NO.100 5’-gtcatggacgtagcaaacgc-3’
pflB-up800-F SEQ ID NO.101 5’-accgccggtgttttcatctc-3’
pflB-down800-R SEQ ID NO.102 5’-tcaacgttgcccatatcacg-3’
poxB-up800-F SEQ ID NO.103 5’-tacctgcgacgataaagcag-3’
poxB-down800-R SEQ ID NO.104 5’-tgtcgtggtcttcctgcaag-3’
iclR-up800-F SEQ ID NO.105 5’-cgttttcaccgcaaataccg-3’
iclR-down800-R SEQ ID NO.106 5’-gcagcaatgtgtcggcatac-3’
lysA-up800-F SEQ ID NO.107 5’-cgctgtgggtttctacgatc-3’
lysA-down800-R SEQ ID NO.108 5’-atggctgttttaggctgctg-3’
metA-up800-F SEQ ID NO.109 5’-tctccatgaagtggtcgctg-3’
metA-down800-R SEQ ID NO.110 5’-accgcgtacccgacaaatca-3’
thrB-up800-F SEQ ID NO.111 5’-aggtttccacgttgtcacgc-3’
thrB-down800-R SEQ ID NO.112 5’-agtttccgcttggcaccgag-3’
实施例3构建高产L-高丝氨酸的工程菌株11-A
将实施例1中构建的表达载体pA用化学转化法转化大肠杆菌突变体ST11，在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50ug/ml)上筛选阳性克隆，得到的克隆菌株命名为11-A。
实施例4菌株11-A的高密度发酵
发酵培养基组成为：柠檬酸1.7g/L，磷酸二氢钾14g/L，磷酸氢二铵4g/L，聚醚类消泡剂150uL/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，VB1 9mg/L，赖氨酸0.4g/L，甲硫氨酸0.2g/L，异亮氨酸0.2g/L，苏氨酸0.3g/L，微量无机盐I10mL/L，pH 7.0。
微量无机盐I组成为：EDTA 840mg/L，CoCl2·6H2O 250mg/L，MnCl2·4H2O 1500mg/L，CuCl2·2H2O 150mg/L，H3BO3 300mg/L，Na2MoO4·2H2O 250mg/L， Zn(CH3COO)2·2H2O1300mg/L，柠檬酸铁10g/L。
补料流加培养基组成为：葡萄糖600g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，赖氨酸4g/L，甲硫氨酸2g/L，异亮氨酸2g/L，苏氨酸3g/L，微量无机盐II 10mL/L。
微量无机盐II组成为：EDTA 1300mg/L，CoCl2·6H2O 400mg/L，MnCl2·4H2O 2350mg/L，CuCl2·2H2O 250mg/L，H3BO3 500mg/L，Na2MoO4·2H2O 400mg/L， Zn(CH3COO)2·2H2O1600mg/L，柠檬酸铁4g/L。
本领域技术人员可根据实际情况对上述各成分进行一定幅度的调整，本实施例仅提供一种具体实现方案。作为本实施例可替换的实施方式，所述发酵培养基包括的成分含量可替换为以下范围内的任意值：柠檬酸1-5g/L，磷酸二氢钾1-20g/L，氮源1-5g/L，葡萄糖5-30g/L，MgSO4·7H2O 0.3-1g/L，VB1 5-10mg/L，赖氨酸0.1-1g/L，甲硫氨酸 0.1-1g/L，异亮氨酸0.1-1g/L，苏氨酸0.1-1g/L，微量无机盐I1-10mL/L，pH 7.0±0.5。所述氮源为无机含氮化合物，可选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种。所述微量无机盐选自可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或多种。所述流加培养基包括的成分含量可替换为以下范围内的任意值：葡萄糖100-800g/L， MgSO4·7H2O 1-5g/L，赖氨酸1-10g/L，甲硫氨酸1-10g/L，异亮氨酸1-10g/L，苏氨酸 1-10g/L，微量无机盐II 1-10mL/L。
种子液培养：250mL三角瓶中装液LB为100mL，121℃灭菌20min。冷却后接入-80℃保藏的甘油菌11-A，培养温度为37℃，摇床转速200rpm，培养6-8h，用于发酵培养基接种。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。本实施例仅提供一种具体实现方案，作为本实施例可替换的实施方式，所述培养条件可替换为以下范围内的任意值：培养温度为25-42℃，摇床转速 100-300rpm。
发酵罐接种：作为本实施例优选的实施方式，5L发酵罐发酵培养基体积为2L，灭菌后接入上述种子液，接种量为5％(V/V)，葡萄糖初始浓度为20g/L。温度为37℃，初始空气通量为2vvm，搅拌转速300rpm，此时的溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至3vvm，同时将搅拌转速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％。当初始葡萄糖消耗完时，开启补料。发酵过程采用氨水控制pH在7.0。当菌体密度达到600nm的吸光度(OD600)为70-80时，加入终浓度1g/L的L-阿拉伯糖诱导蛋白表达，当补料培养基耗尽即结束发酵。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。L-高丝氨酸的检测方法为：样品适当稀释后用2,4-二硝基氟苯(DNFB)进行衍生， 100uL样品加入50uL 10g/L DNFB乙腈溶液和100uL 0.5M NaHCO3溶液，充分混匀， 60℃避光反应1h，冷却后加入750uL 0.01M KH2PO4溶液，混匀，用0.22um滤膜过滤后进行高效液相色谱检测。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18 column(4.6×150 mm,5um；Agilent)，柱温为30℃，流动相为35％乙腈甲酸(千分之一)水溶液，流速为1mL/min，检测波长为360nm。
结果：如图2所示，发酵液中，L-高丝氨酸的产量达97.45g/L，整个发酵阶段L- 高丝氨酸转化率可达56.7g/100g葡萄糖。
对比实施例1
专利号201710106474.8通过将大肠杆菌K-12MG1655菌株的thrB基因弱化，rhtA基因过表达、thrL基因敲除、thrA基因突变(MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL, thrA*(G433R))，并以pACYC-duet为载体过表达被突变的thrA*基因、asd基因、pcc基因、pntAB基因获得高产L-高丝氨酸的工程菌株HomoS7/pHom2，其发酵可得47g/L 的L-高丝氨酸，明显低于本发明的菌株产L-高丝氨酸的产量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司
<120> 一种高效发酵生产L-高丝氨酸的菌株及其构建方法和应用
<160> 110
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60
cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120
cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180
agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240
tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300
taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360
gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420
cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480
gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540
gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600
ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660
cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720
agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780
gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840
ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900
ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960
ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020
attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080
ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140
tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200
ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260
ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320
catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380
ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440
caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500
tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560
gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgaccatg cagcgctctt 1680
ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga gcggtgtcag 1740
ctcactcaaa agcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataaagcc ggaaagaaca 1800
tgtgagcaaa aagcaaagca ccggaagaag ccaacgccgc aggcgttttt ccataggctc 1860
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagcc agaggtggcg aaacccgaca 1920
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 1980
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 2040
catagctcac gctgttggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 2100
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 2160
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgatttaga 2220
ggactttgtc ttgaagttat gcacctgtta aggctaaact gaaagaacag attttggtga 2280
gtgcggtcct ccaacccact taccttggtt caaagagttg gtagctcagc gaaccttgag 2340
aaaaccaccg ttggtagcgg tggtttttct ttatttatga gatgatgaat caatcggtct 2400
atcaagtcaa cgaacagcta ttccgttact ctagatttca gtgcaattta tctcttcgcg 2460
gccgccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 2520
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagccat attcaacggg 2580
aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata 2640
aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc 2700
ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag 2760
atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt 2820
ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat 2880
tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt 2940
tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gaccgcgtat 3000
ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg 3060
atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc 3120
cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg 3180
acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc 3240
aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc 3300
tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc 3360
tcgatgagtt tttctaagaa ttaattcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 3420
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacttgc ggagacccgg 3480
tcgtcagctt gtcgtcggtt cagggcaggg tcgttaaata gcgcatgc 3528
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctaacagg aggaattaac catgcgagtg ttgaagttcg g 41
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaccacga aaatacgggc gcgtgacatc 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcccgtattt tcgtggtgct gattacgcaa tc 32
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgcagacc gagctcaccg aattctcaga ctcctaactt ccatg 45
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcgtcaca ctttgctatg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtttcactt ctgagttcgg c 21
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccttcattt ggccgccgat gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcggcggcc aaatgaagga actagtatta tacctaggac 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagcaaggtc atacccgcat gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcgggtat gaccttgctg actagtatta tacctaggac 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caacgaaccc aattaccgcc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcggtaatt gggttcgttg actagtatta tacctaggac 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgatccgtat ccaagtgcag gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgcacttgg atacggatcg actagtatta tacctaggac 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctttctggt gccgcacggt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
accgtgcggc accagaaaga actagtatta tacctaggac 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatcaccgaa caagaagcgc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgcttcttg ttcggtgatc actagtatta tacctaggac 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagcaaggtg gatatggcac gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtgccatatc caccttgctg actagtatta tacctaggac 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctaaccacg atgcaacagc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctgttgcat cgtggttagc actagtatta tacctaggac 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtcatcatc tgcagctggt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
accagctgca gatgatgacg actagtatta tacctaggac 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gccgcagatc aaacaggtgc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcacctgttt gatctgcggc actagtatta tacctaggac 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cagggtttga tgagtggctg gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cagccactca tcaaaccctg actagtatta tacctaggac 40
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctttcctgcg ttatcccctg 20
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcgttatgtc cccctggatc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aattgagagt gctcctgagt 20
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
actcaggagc actctcaatt atgacaaagt atgcattagt c 41
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tctccccaac gtcttacgga ttacagaatg tgacctaagg 40
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tccgtaagac gttggggaga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgcctataaa gcggtggatg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgcgagcgac agtaaattag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaaaatacct tagtgggtaa 20
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttacccacta aggtattttc atgagttctg aaagtagtca g 41
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tggaattgct ttaactgcgg ctacttctgg gagcgccaca 40
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccgcagttaa agcaattcca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tttgggccac cctgtgaaac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aaggcgtttt acggcctgac 20
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gttagctgtg cataaaagtt ctccattcaa tc 32
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gaacttttat gcacagctaa caccacgtcg tc 32
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acttaagacc agtactcacc tgcgatatcg 30
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggtgagtact ggtcttaagt acacatttta ag 32
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gagcggcaat ggcatttaaa ag 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gccagacaag cagaatcaag 20
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gacgacgtgg tgttagctgt gcataagact ttctccagtg atg 43
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gaaagtctta tgcacagcta acaccacgtc gtc 33
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cgttcgggca agtactcacc tgcgatatcg 30
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cgatatcgca ggtgagtact tgcccgaacg aactggttta atc 43
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcgccagcgt taactggttc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgcaccacac agaggtgttg 20
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acgacgtggt gttagctgtg catgcttttc cagtttcgga 40
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gaaaagcatg cacagctaac accacgtcgt c 31
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gataaagatc agtactcacc tgcgatatcg 30
<210> 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cgatatcgca ggtgagtact gatctttatc ccatcaaata 40
<210> 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttctaaacac cgtctggacg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccggcgag tatatgaccg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gacgacgtgg tgttagctgt gcatgtaaca cctaccttct taag 44
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtgttacatg cacagctaac accacgtcgt c 31
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtgaaggt agtactcacc tgcgatatcg 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgatatcgca ggtgagtact accttcactc aatctatgta 40
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaccgttggt gtccagacag 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tcacgtaccg tgatgacctg 20
<210> 68
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gacgacgtgg tgttagctgt gcatggttct ccatctcctg aatg 44
<210> 69
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gagaaccatg cacagctaac accacgtcgt c 31
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
agtttgtttt agtactcacc tgcgatatcg 30
<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cgatatcgca ggtgagtact aaaacaaact ggctaaggta 40
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ctcgcgggta aattcccatg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cgcaaagttg atttccgccg 20
<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
caccgtacgc catgacagtc tcttttttct g 31
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gactgtcatg gcgtacggtg gaatgcgctg 30
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
cagcttgtaa gacggacgtg 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tcaagtagcg gtgattcctg 20
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ccagcgccag cataacaaac tccagataag tgc 33
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gtttgttatg ctggcgctgg aattgcttta ac 32
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tcctatctcg ttttcgcagc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tatagaaccc aaccgcctgc 20
<210> 82
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ttggattcat cataacctga ttacctcact a 31
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcaggttatg atgaatccaa cgctggatta atc 33
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tcagcatcgc gaatggaagc 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tcggcaagtt agacgaaggc 20
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cagtactcgt gccatgtcag actcctaact tcc 33
<210> 87
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtctgacatg gcacgagtac tggaaaacta aatg 34
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
tgccgcccaa tgtacagaac 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
actgaacaag ccggttatcg 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
acctacgcca gctatacctc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ggcgtaatta gaacgcgctc 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
acatgcacat tggttctggc 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cagcattact ggaatctgcg 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
agaggaacct ccattatcgc 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ttacaggaag tccatccggc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
agcgttttgg gtagggtgtg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
agccatgcag tggcaaatgg 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gtcatggacg tagcaaacgc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
accgccggtg ttttcatctc 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tcaacgttgc ccatatcacg 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tacctgcgac gataaagcag 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tgtcgtggtc ttcctgcaag 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
cgttttcacc gcaaataccg 20
<210> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gcagcaatgt gtcggcatac 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cgctgtgggt ttctacgatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
atggctgttt taggctgctg 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tctccatgaa gtggtcgctg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
accgcgtacc cgacaaatca 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
aggtttccac gttgtcacgc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
agtttccgct tggcaccgag 20
Claims (13)
1.一种高效发酵生产L-高丝氨酸菌株，其特征在于，该菌株为突变型大肠杆菌重组工程菌株11-A，于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20947。
2.一种如权利要求1所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，包括：
宿主菌株的构建：用葡糖激酶基因(glk)替换大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)，用运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白(zglf)替换大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因(galR)，用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)替换大肠杆菌基因组中的外膜蛋白酶VII基因(ompT)，用L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtA)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，用L-高丝氨酸转运蛋白基因(rhtB)替换大肠杆菌基因组中的脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)，用天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)替换大肠杆菌基因组中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)，用天冬氨酸氨裂解酶酶基因(aspA)替换大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因(poxB)；并且同时敲除DNA结合转录抑制因子基因(iclR)，庚二酸脱羧酶基因(lysA)，高丝氨酸-O-琥珀酸转移酶基因(metA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)，得到突变型大肠杆菌，命名为ST11；
质粒的构建：将解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因thrA(S345F)插入质粒载体pRB1k的NcoI和EcoRI位点间得到重组载体，命名为pA；
工程菌株的构建：将上述重组载体质粒pA导入上述突变型大肠杆菌ST11中，即得到重组工程菌株，命名为11-A；
其中，所述大肠杆菌为野生型大肠杆菌K12 MG1655；
所述突变型大肠杆菌基因型为E.coli BW25113ΔptsG::glk,ΔgalR::zglf,ΔompT::ppc,ΔldhA::rhtA,ΔlpxM::rhtB,ΔpflB::asd,ΔpoxB::aspA,ΔiclR,ΔlysA,ΔmetA,ΔthrB；
所述天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因thrA(S345F)源自大肠杆菌K-12 MG1655。
3.根据权利要求2所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，所述重组载体质粒pA的构建步骤如下：
以大肠杆菌K12的基因组DNA为模板，用引物thrA-F和S345F-R、S345F-F和thrA-R进行PCR扩增得到解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因的2个片段thrA-1和thrA-2；所述正向引物thrA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物S345F-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述正向引物S345F-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述反向引物thrA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
将pRB1k载体用NcoI和EcoRI双酶切后，回收载体大片段，将上述得到的thrA-1和thrA-2基因片段与载体大片段用Gibson方法进行连接，将产物转化感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板，37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物pBAD-F和pBAD-R进行PCR验证，筛选出正确构建的重组载体质粒pDE；所述正向引物pBAD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述反向引物pBAD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求3所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，所述重组载体质粒pA是将pRB1k载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因得到的；所述pRB1k载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述解除反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
5.根据权利要求2所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，所述突变型大肠杆菌ST11的构建步骤如下：
(1)以pTargetF为模板，分别使用引物对pTarget-ptsG-F和pTarget-ptsG-R，pTarget-galR-F和pTarget-galR-R，pTarget-ompT-F和pTarget-ompT-R，pTarget-ldhA-F和pTarget-ldhA-R，pTarget-lpxM-F和pTarget-lpxM-R，pTarget-pflB-F和pTarget-pflB-R，pTarget-poxB-F和pTarget-poxB-R，pTarget-iclR-F和pTarget-iclR-R，pTarget-lysA-F和pTarget-lysA-R，pTarget-metA-F和pTarget-metA-R，pTarget-thrB-F和pTarget-thrB-R进行PCR扩增，将扩增得到的片段用DpnI甲基化酶消化后转化大肠杆菌Fast-T1感受态，在含链霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并用引物pTarget-cexu-F测序验证，测序正确后分别命名为pTarget-ptsG，pTarget-galR，pTarget-ompT，pTarget-ldhA，pTarget-lpxM，pTarget-pflB，pTarget-poxB，pTarget-iclR，pTarget-lysA，pTarget-metA和pTarget-thrB；
(2)分别用引物对ptsG-up500-F和ptsG-up500-R，glk-F和glk-R，ptsG-down500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ptsG-up500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，得到ptsG::glk打靶片段；分别用引物对galR-up500-F和galR-up500-R，zglf-F和zglf-R，galR-down500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对galR-up500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，得到galR::zglf打靶片段；分别用引物对ompT-up500-F和ompT-up500-R，ppc-F和ppc-R，ompT-down500-F和ompT-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ompT-up500-F和ompT-down500-R进行PCR扩增，得到ompT::ppc打靶片段；分别用引物对ldhA-up500-F和ldhA-up500-R，rhtA-F和rhtA-R，ldhA-down500-F和ldhA-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对ldhA-up500-F和ldhA-down500-R进行PCR扩增，得到ldhA::rhtA打靶片段；分别用引物对lpxM-up500-F和lpxM-up500-R，rhtB-F和rhtB-R，lpxM-down500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对lpxM-up500-F和lpxM-down500-R进行PCR扩增，得到lpxM::rhtB打靶片段；分别用引物对pflB-up500-F和pflB-up500-R，asd-F和asd-R，pflB-down500-F和pflB-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对pflB-up500-F和pflB-down500-R进行PCR扩增，得到pflB::asd打靶片段；分别用引物对poxB-up500-F和poxB-up500-R，aspA-F和aspA-R，poxB-down500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，分别得到三个片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对poxB-up500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，得到poxB::aspA打靶片段；分别用引物对iclR-up500-F和iclR-up500-R，iclR-down500-F和iclR-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对iclR-up500-F和iclR-down500-R进行PCR扩增，得到ΔiclR打靶片段；分别用引物对lysA-up500-F和lysA-up500-R，lysA-down500-F和lysA-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对lysA-up500-F和lysA-down500-R进行PCR扩增，得到ΔlysA打靶片段；分别用引物对metA-up500-F和metA-up500-R，metA-down500-F和metA-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对metA-up500-F和metA-down500-R进行PCR扩增，得到ΔmetA打靶片段；分别用引物对thrB-up500-F和thrB-up500-R，thrB-down500-F和thrB-down500-R进行PCR扩增，分别得到两个片段，以两个片段的混合物为模板，用引物对thrB-up500-F和thrB-down500-R进行PCR扩增，得到ΔthrB打靶片段；将得到的打靶片段ptsG::glk，galR::zglf，ompT::ppc，ldhA::rhtA，lpxM::rhtB，pflB::asd，poxB::aspA，ΔiclR，ΔlysA，ΔmetA和ΔthrB分别回收；
(3)将pTarget-ptsG质粒，打靶片段ptsG::glk与电转化感受态细胞混合，置于电转杯中电击，加入LB液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上，30℃培养，筛选阳性克隆，并用引物对ptsG-up700-F和ptsG-down700-R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证筛选出阳性克隆；
(4)将上述得到的阳性克隆接种在含有IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget质粒，过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glk，命名为ST01；
(5)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST01制备电转感受态细胞，与pTarget-galR质粒和galR::zglf打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对galR-up700-F和galR-down700-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglf，命名为ST02；
(6)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST02制备电转感受态细胞，与pTarget-ompT质粒和ompT::ppc打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对ompT-up800-F和ompT-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppc，命名为ST03；
(7)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST03制备电转感受态细胞，与pTarget-ldhA质粒和ldhA::rhtA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对ldhA-up800-F和ldhA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtA，命名为ST04；
(8)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST04制备电转感受态细胞，与pTarget-lpxM质粒和lpxM::rhtB打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对lpxM-up800-F和lpxM-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtB，命名为ST05；
(9)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST05制备电转感受态细胞，与pTarget-pflB质粒和pflB::asd打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对pflB-up800-F和pflB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asd，命名为ST06；
(10)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST06制备电转感受态细胞，与pTarget-poxB质粒和poxB::aspA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对poxB-up800-F和poxB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspA，命名为ST07；
(11)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST07制备电转感受态细胞，与pTarget-iclR质粒和ΔiclR打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对iclR-up800-F和iclR-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclR，命名为ST08；
(12)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST08制备电转感受态细胞，与pTarget-lysA质粒和ΔlysA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对lysA-up800-F和lysA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysA，命名为ST09；
(13)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST09制备电转感受态细胞，与pTarget-metA质粒和ΔmetA打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)，并用引物对metA-up800-F和metA-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetA，命名为ST10；
(14)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体ST10制备电转感受态细胞，与pTarget-thrB质粒和ΔthrB打靶片段混合，重复上述步骤(3)-(4)的步骤，并用引物对thrB-up800-F和thrB-down800-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，命名为ST11；
(15)将测序验证正确的含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB(ST11)接种在LB液体培养基中，37℃培养过夜以消除pCas质粒，将过夜培养后的菌株在LB固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到不含质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔompT::ppcΔldhA::rhtAΔlpxM::rhtBΔpflB::asdΔpoxB::aspAΔiclRΔlysAΔmetAΔthrB，简称ST11。
6.根据权利要求5所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，还包括制备电转感受态细胞的步骤：将pCas质粒利用化学转化法转化大肠杆菌K12，在含卡那霉素的LB平板上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，得到电转感受态细胞。
7.根据权利要求5所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述正向引物pTarget-ptsG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物pTarget-ptsG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述正向引物pTarget-galR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述反向引物pTarget-galR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述正向引物pTarget-ompT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述反向引物pTarget-ompT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述正向引物pTarget-ldhA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述反向引物pTarget-ldhA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述正向引物pTarget-lpxM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述反向引物pTarget-lpxM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述正向引物pTarget-pflB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述反向引物pTarget-pflB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述正向引物pTarget-poxB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述反向引物pTarget-poxB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述正向引物pTarget-iclR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述反向引物pTarget-iclR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述正向引物pTarget-lysA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述反向引物pTarget-lysA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述正向引物pTarget-metA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述反向引物pTarget-metA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述正向引物pTarget-thrB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述反向引物pTarget-thrB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述正向引物pTarget-cexu-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
所述PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板pTargetF20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
8.根据权利要求5所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述正向引物ptsG-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述反向引物ptsG-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述正向引物glk-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示，所述反向引物glk-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述正向引物ptsG-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述反向引物ptsG-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述正向引物galR-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述反向引物galR-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述正向引物zglf-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述反向引物zglf-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；所述正向引物galR-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，所述反向引物galR-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述正向引物ompT-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述反向引物ompT-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述正向引物ppc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，所述反向引物ppc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述正向引物ompT-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，所述反向引物ompT-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；所述正向引物ldhA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示，所述反向引物ldhA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；所述正向引物rhtA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示，所述反向引物rhtA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；所述正向引物ldhA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示，所述反向引物ldhA-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；所述正向引物lpxM-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示，所述反向引物lpxM-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示；所述正向引物rhtB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.59所示，所述反向引物rhtB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述正向引物lpxM-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，所述反向引物lpxM-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示；所述正向引物pflB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示，所述反向引物pflB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示；所述正向引物asd-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示，所述反向引物asd-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；所述正向引物pflB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示，所述反向引物pflB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示；所述正向引物poxB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示，所述反向引物poxB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示；所述正向引物aspA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示，所述反向引物aspA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示；所述正向引物poxB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，所述反向引物poxB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；所述正向引物iclR-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示，所述反向引物iclR-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；所述正向引物iclR-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，所述反向引物iclR-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；所述正向引物lysA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示，所述反向引物lysA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述正向引物lysA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述反向引物lysA-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；所述正向引物metA-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示，所述反向引物metA-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示；所述正向引物metA-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示，所述反向引物metA-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；所述正向引物thrB-up500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示，所述反向引物thrB-up500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示；所述正向引物thrB-down500-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示，所述反向引物thrB-down500-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示；
所述PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板5-20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸0.5-2分钟(30秒/kb)(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
9.根据权利要求5所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述正向引物ptsG-up700-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.91所示，所述反向引物ptsG-up700-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.92所示；
步骤(5)所述正向引物galR-up700-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.93所示，所述反向引物galR-up700-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.94所示；
步骤(6)所述正向引物ompT-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.95所示，所述反向引物ompT-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.96所示；
步骤(7)所述正向引物ldhA-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.97所示，所述反向引物ldhA-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.98所示；
步骤(8)所述正向引物lpxM-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.99所示，所述反向引物lpxM-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.100所示；
步骤(9)所述正向引物pflB-down800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.101所示，所述反向引物pflB-down800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.102所示；
步骤(10)所述正向引物poxB-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.103所示，所述反向引物poxB-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.104所示；
步骤(11)所述正向引物iclR-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.105所示，所述反向引物iclR-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.106所示；
步骤(12)所述正向引物lysA-down800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.107所示，所述反向引物lysA-down800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.108所示；
步骤(13)所述正向引物metA-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.109所示，所述反向引物metA-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.110所示；
步骤(14)所述正向引物thrB-up800-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.111所示，所述反向引物thrB-up800-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.112所示。
10.一种如权利要求1所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的应用，其特征在于，用于制备L-高丝氨酸。
11.根据权利要求10所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的应用，其特征在于，该应用是将活化后的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株接种于发酵培养基中并采用生物发酵法制备L-高丝氨酸，所述方法包括：
温度为37℃，初始空气通量为2vvm，搅拌转速300rpm，此时的溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至3vvm，同时将搅拌转速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％，当初始葡萄糖消耗完时，开启补料培养基，发酵过程采用氨水控制pH在7.0，当菌体密度达到600nm的吸光度(OD600)为70-80时，加入终浓度1g/L的L-阿拉伯糖诱导蛋白表达，当补料培养基耗尽即结束发酵。
12.根据权利要求10所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：柠檬酸1-5g/L，磷酸二氢钾1-20g/L，氮源1-5g/L，聚醚类消泡剂150uL/L，葡萄糖5-30g/L，MgSO4·7H2O 0.3-1g/L，VB1 5-10mg/L，赖氨酸0.1-1g/L，甲硫氨酸0.1-1g/L，异亮氨酸0.1-1g/L，苏氨酸0.1-1g/L，微量无机盐I1-10mL/L，pH 7.0±0.5；
所述补料培养基组成为：葡萄糖100-800g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，赖氨酸1-10g/L，甲硫氨酸1-10g/L，异亮氨酸1-10g/L，苏氨酸1-10g/L，微量无机盐II 1-10mL/L。
13.根据权利要求12所述的高效发酵生产L-高丝氨酸菌株的应用，其特征在于，所述发酵培养基中所述微量无机盐I组成为：EDTA 840mg/L，CoCl2·6H2O 250mg/L，MnCl2·4H2O1500mg/L，CuCl2·2H2O 150mg/L，H3BO3 300mg/L，Na2MoO4·2H2O 250mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 1300mg/L，柠檬酸铁10g/L；所述氮源选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种；
所述补料培养基中所述微量无机盐II组成为：EDTA 1300mg/L，CoCl2·6H2O 400mg/L，MnCl2·4H2O 2350mg/L，CuCl2·2H2O 250mg/L，H3BO3 500mg/L，Na2MoO4·2H2O 400mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 1600mg/L，柠檬酸铁4g/L。
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