CN115521954B - 一种高丝氨酸的发酵生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高丝氨酸的发酵生产工艺，包括利用氨基酸营养缺陷型基因工程菌来生产高丝氨酸的发酵生产方法。在本发明方法的发酵过程中，当菌浓达到OD600=50‑60时，将溶氧控制由30%降低为10%，达到了提高发酵液中高丝氨酸产量以及转化率的目的。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产技术领域，具体为一种利用氨基酸营养缺陷型基因工程菌生产高丝氨酸的发酵生产工艺。
背景技术
L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，具有L-型-α-氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此在药物学、生理学等方面有重要应用前景。由于其结构活性，L-高丝氨酸及其衍生物作为手性中间体，在手性化学品合成领域也具有较好的应用潜力。L-高丝氨酸具有L-草铵膦相同的分子骨架，是制备L-草铵膦的理想手性前体。草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦。目前化学合成的草铵膦均为DL外消旋体，但仅L-草铵膦具有除草作用，而D型则几乎无活性。若制成仅有L-草铵膦（也称精草铵膦）的产品进行使用，可使草铵膦的用量减少一半，显著提高经济性，降低使用成本，减轻环境压力。
L-高丝氨酸是少数还未实现规模化生产的氨基酸品种，国内外文献报道以及专利中，发酵法生产L-高丝氨酸的产量均低于100g/L。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的利用氨基酸营养缺陷型基因工程菌来生产高丝氨酸的发酵生产方法。在本发明方法的发酵过程中，当菌浓达到OD600=50-60时，将溶氧控制由30%降低为10%，达到了提高发酵液中高丝氨酸产量以及转化率的目的。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种高丝氨酸的发酵生产工艺，包括以下步骤：
S1：配制LB摇瓶种子培养基；
S2：将保藏于超低温冰箱的菌种融化后接种到上述培养基上，进行摇瓶培养，其中所用菌种为已于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的氨基酸营养缺陷型基因工程菌，保藏号为CGMCC No.20947；
S3：配制高丝氨酸发酵培养基以及补料培养基；
S4：将培养好的LB摇瓶种子转接到高丝氨酸发酵培养基中进行发酵；
S5：发酵培养，其中发酵条件为，发酵初始调节溶氧30%-40%；OD600=30-35时，降温到30-34℃，加入诱导剂阿拉伯糖；菌浓度达到OD600=50-60时，将溶氧控制降为10-15%，直到发酵结束，发酵过程中，利用氨水控制pH 6.5-7.5，监测残糖在1%以下；
S6：发酵结束条件，补料培养基耗完后，继续搅拌一段时间，直至溶氧回升至40%或pH回升至7.20以上，发酵结束。
优选地，步骤S1中，所述LB培养基制备方法如下：配方为蛋白胨0.8-1.2%，酵母抽提粉0.4-0.6%，氯化钠0.4-0.6%，pH为自然pH，配制500 ml体积，500ml摇瓶，每瓶分装100ml，灭菌条件为121℃，0.1mpa，20min。
优选地，步骤S2中，所述摇瓶培养条件为：200rpm，30-37℃，4-6h。
优选地，步骤S3中，所述高丝氨酸发酵培养基的配制方法为：配制发酵罐培养基，单独灭菌，另外配制底糖溶液，单独灭菌后冷却，再移入发酵罐培养基中混合形成高丝氨酸发酵培养基，接种前用用氨水调到pH7.0。
进一步优选地，所述发酵罐培养基由如下成分组成：柠檬酸0.16-0.18%，磷酸二氢钾1.3-1.5%，磷酸氢二铵0.3-0.5%，七水硫酸镁0.05-0.07%，微量无机盐10ml/L，聚醚类消泡剂0.015-0.02%，赖氨酸0.08-0.10%，甲硫氨酸0.03-0.50%，苏氨酸0.05-0.07%，灭菌条件为121℃，0.1mpa，20min。
进一步优选地，所述底糖为葡萄糖，葡萄糖溶液浓度为20-22.5g/100ml，灭菌条件为115℃，0.1mpa，20min。
优选地，步骤S3中，所述高丝氨酸发酵补料为60%g/ml葡萄糖，灭菌在115℃，0.1mpa，20min。
优选地，步骤S5中，培养工艺为：初始流量为1vvm，培养温度为35-37℃，搅拌，氨水控制pH在6.5-7.5，同时控制残糖不超过1%，菌浓OD600达到30-35时，降温到30-34℃，加入诱导剂开始诱导；菌浓OD600达到50-60时，溶氧控制在10-15%，直至发酵结束。
进一步优选地，所述诱导剂为5%阿拉伯糖溶液，灭菌在115℃，0.1mpa，20min。
另外优选地，培养基中所用微量无机盐组成为：EDTA 840 mg/L，CoCl2•6H2O 250mg/L，MnCl2•4H2O 1500 mg/L，CuCl2•2H2O 150 mg/L，H3BO3 300 mg/L，Na2MoO4•2H2O 250mg/L，Zn(CH3COO)2•2H2O 1300 mg/L，柠檬酸铁10 g/L
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了高丝氨酸的一种改进的发酵生产工艺，得到的高丝氨酸发酵液中高丝氨酸的含量高，可以达到150g/L以上，且纯度高；另外完全具有L-型-α-氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性。其本身及其衍生物作为手性中间体，完全适合在手性化学品合成领域。其具有L-草铵膦相同的分子骨架，是制备L-草铵膦的理想手性前体。其性状以及产量已经达到工业化的要求，为今后工业化的生产以及应用铺平了道路。
附图说明
图1是通过本发明方法获得的高丝氨酸发酵液的液相检测图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
本发明提供了一种高丝氨酸生产的发酵控制工艺。在本发明方法的发酵过程中，当菌浓达到OD600=50-60时，将溶氧控制由30%降低为10%，能够达到提高发酵液中高丝氨酸产量以及转化率的目的。
下面通过具体的实施例对本发明的工艺方法进行更详细的说明。
除非特别说明，否则本文中所涉及的浓度皆为质量体积百分比。
以下实施例如无特殊说明，所使用的高丝氨酸菌株为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），株号11-A，于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20947。该菌株已于2020年11月13日提交过专利申请，对应的申请号为：CN202011270812.X。
对比例1 高丝氨酸发酵
发酵使用菌株为CGMCC No.20947。发酵规模采用1吨罐。
配制LB摇瓶培养基，121℃高温灭菌20 min，取-80℃保存的甘油菌，按200ul菌液接种到100mlLB培养基，一共2升种子，放于摇床37℃、220 rpm培养4h。
配制发酵罐培养基：柠檬酸0.17%，磷酸二氢钾1.4%，磷酸氢二铵0.4%，七水硫酸镁0.06%，微量无机盐10 ml/L，聚醚类消泡剂0.015%，赖氨酸0.08%，甲硫氨酸0.04%，苏氨酸0.06%，（以上培养基称量时允许误差在10%以内）；灭菌前体积300升，消毒在121℃，0.1mpa，20min。其中底糖单独115℃灭菌20 min，灭菌后，冷却，再移入到发酵培养基中，移入糖后发酵体积控制在380升以内。
配制补料培养基：60%葡萄糖，消后体积400升，115℃灭菌20 min。
在移种前，用氨水调pH7.0，温度保持37℃，搅拌60rpm，空气流量控制在1vvm，稳定5min后，移入培养好的种子2升。
移种结束后，将溶氧30%偶联转速，过程中适当调节空气流量，最高可达到2vvm，发酵过程用氨水控制pH6.5-7.5。
OD600为30-35时，将温度降为30℃，加入诱导剂L-阿拉伯糖。
全程发酵溶氧控制在30%以上直至发酵结束。
取发酵结束时的发酵液利用HPLC检测其中高丝氨酸含量，结果显示本次对照组高丝氨酸发酵得到高丝氨酸产量达到118g/L。
实施例1高丝氨酸发酵
发酵使用菌株为CGMCC No.20947。发酵规模采用1吨罐。
配制LB摇瓶培养基，121℃高温灭菌20 min，取-80℃保存的甘油菌，按200ul菌液接种到100mlLB培养基，一共2升种子，放于摇床37℃、220 rpm培养4h。
配制发酵罐培养基：柠檬酸0.17%，磷酸二氢钾1.4%，磷酸氢二铵0.4%，七水硫酸镁0.06%，微量无机盐10 ml/L，聚醚类消泡剂0.015%，赖氨酸0.08%，甲硫氨酸0.04%，苏氨酸0.06%，（以上培养基称量时允许误差在10%以内）；灭菌前体积300升，121℃，0.1mpa，20min灭菌。其中底糖单独115℃灭菌20 min，灭菌后，冷却，再移入到发酵培养基中，移入糖后发酵体积控制在380升以内。
配制补料培养基：60%葡萄糖，灭菌后体积400升，115℃灭菌20 min。
在移种前，用氨水调pH7.0，温度保持37℃，搅拌60rpm，空气流量控制在1vvm，稳定5min后，移入培养好的种子2升。
移种结束后，将溶氧30%偶联转速，过程中适当调节空气流量，最高可达到2vvm，发酵过程用氨水控制pH6.5-7.5。
OD600为30-35时，将温度降为30℃，加入诱导剂L-阿拉伯糖。
OD600为50-60时，控制溶氧10%偶联转速，直至发酵结束。
结束时取发酵液稀释后HPLC检测，该实施例中高丝氨酸产量为152g/L。
综上所述，当高丝氨酸发酵菌浓OD600达到50-60时，将溶氧从30%降到10%时，发酵结束时高丝氨酸产量从118 g/L提高到152 g/L，产量提高28.8%；另外该发酵得到的L-高丝氨酸具有L-草铵膦相同的分子骨架，是制备L-草铵膦的理想手性前体。
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
最后所要说明的是：以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改和等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：配制LB摇瓶种子培养基；
S2：将保藏于超低温冰箱的菌种融化后接种到上述培养基上，进行摇瓶培养，其中所用菌种为已于2020年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的氨基酸营养缺陷型基因工程菌，保藏号为CGMCC No.20947；
S3：配制高丝氨酸发酵培养基以及补料培养基；
S4：将培养好的LB摇瓶种子转接到高丝氨酸发酵培养基中进行发酵；
S5：发酵培养，其中发酵条件为，发酵初始调节溶氧30%-40%；OD600=30-35时，降温到30-34℃，加入诱导剂阿拉伯糖；菌浓度达到OD600=50-60时，将溶氧控制降为10-15%，直到发酵结束，发酵过程中，利用氨水控制pH 6.5-7.5，监测残糖在1%以下；
S6：发酵结束条件，补料培养基耗完后，继续搅拌一段时间，直至溶氧回升至40%或pH回升至7.20以上，发酵结束。
2.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，步骤S1中，所述LB培养基制备方法如下：配方为蛋白胨0.8-1.2%，酵母抽提粉0.4-0.6%，氯化钠0.4-0.6%，pH为自然pH，配制500 ml体积，500ml摇瓶，每瓶分装100ml，灭菌条件为121℃，0.1mpa，20min。
3.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，步骤S2中，所述摇瓶培养条件为：200rpm，30-37℃，4-6h。
4.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，步骤S3中，所述高丝氨酸发酵培养基的配制方法为：配制发酵罐培养基，单独灭菌，另外配制底糖溶液，单独灭菌后冷却，再移入发酵罐培养基中混合形成高丝氨酸发酵培养基，接种前用氨水调到pH7.0。
5.如权利要求4所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，所述发酵罐培养基由如下成分组成：柠檬酸0.16-0.18%，磷酸二氢钾1.3-1.5%，磷酸氢二铵0.3-0.5%，七水硫酸镁0.05-0.07%，微量无机盐10ml/L，聚醚类消泡剂0.015-0.02%，赖氨酸0.08-0.10%，甲硫氨酸0.03-0.50%，苏氨酸0.05-0.07%，灭菌条件为121℃，0.1mpa，20min。
6.如权利要求4所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，所述底糖为葡萄糖，葡萄糖溶液浓度为20-22.5g/100ml，灭菌条件为115℃，0.1mpa，20min。
7.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，步骤S3中，所述高丝氨酸发酵补料培养基为60%葡萄糖，灭菌在115℃，0.1mpa，20min。
8.如权利要求1所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，步骤S5中，培养工艺为：初始流量为1vvm，培养温度为35-37℃，搅拌，氨水控制pH在6.5-7.5，同时控制残糖不超过1%，菌浓OD600达到30-35时，降温到30-34℃，加入诱导剂开始诱导；菌浓OD600达到50-60时，溶氧控制在10-15%，直至发酵结束。
9.如权利要求8所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，所述诱导剂为5%阿拉伯糖溶液，灭菌在115℃，0.1mpa，20min。
10.根据权利要求5所述的高丝氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，所述微量无机盐组成为：EDTA 840 mg/L，CoCl2•6H2O 250 mg/L，MnCl2•4H2O 1500 mg/L，CuCl2•2H2O 150 mg/L，H3BO3 300 mg/L，Na2MoO4•2H2O 250 mg/L，Zn(CH3COO)2•2H2O 1300 mg/L，柠檬酸铁10 g/L。
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