JP2024505626A - 遺伝子ｂｂｄ２９＿０４９２０を改造したｌ－グルタミン酸生産組換え菌株及びその構築方法と応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、コリネバクテリウムにおけるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のコード配列に点変異を導入し又はその発見を改善する方法を提供し、前記方法は、前記変異を有する菌株にグルタミン酸の発酵生産量を向上させることができる。前記点変異は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子配列の１５６０番目の塩基をシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に変異させ、コードされる該当するアミノ酸配列の５２０番目のアスパラギンをリジンに置換させる。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子工学と微生物技術分野に属し、具体的にＬ－グルタミン酸生産組換え菌株及びその構築方法と応用に関する。
Ｌ－グルタミン酸は、重要なアミノ酸であり、食品、臨床薬物及びその他の方面に応用されている。
従来、Ｌ－グルタミン酸は、主に発酵により、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属又はミクロバクテリウム属などの菌属に属するＬ－グルタミン酸生産細菌又はその変異体を用いて生産される。
Ｌ－グルタミン酸は、微生物細胞内でクエン酸が循環する中間産物であるα－ケトグルタル酸から生物合成されたものである。α－ケトグルタル酸からアンモニウムイオンの同化作用によりＬ－グルタミン酸を形成する生物合成経路は、２つある。ここで、１つの経路は、高濃度のアンモニウムイオンが存在している場合、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）の触媒によりＬ－グルタミン酸を合成することである。もう１つの経路（ＧＳ／ＧＯＧＡＴ経路）は、グルタミンシンセターゼ及びグルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼによりＬ－グルタミン酸を合成することである。グルタミンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ）は、Ｌ－グルタミン酸とアンモニウムイオンのグルタミンへの変換反応を触媒し、グルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、「グルタミン酸シンセターゼ」（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧＯＧＡＴ）とも呼ばれる）は、Ｌ－グルタミン酸合成反応を触媒し、該反応において、すでにＧＳから合成された１分子のグルタミンと１分子のα－ケトグルタル酸分子から２分子のＬ－グルタミン酸を合成する。
発酵法によるＬ－アミノ酸の生産の改良は、発酵技術、例えば攪拌と酸素供給に関し、又は栄養培地の組成、例えば発酵中の糖濃度に関し、又は発酵液を、例えば発酵液の乾燥と造粒又はイオン交換クロマトグラフィーにより適切な製品形態に加工することに関してもよく、又は関連する微生物自体の固有の性能性質に関してもよい。
これらの微生物の性能性質を改善するための方法は、変異誘発、変異体の選択とスクリーニングを含む。このような方式で得られた菌株は、代謝物に対して耐性を有するか又は調節的に重要な代謝物に対して栄養欠損型であり、且つＬ－アミノ酸などを産生する。
Ｌ－グルタミン酸の生産能力を向上可能な方法は、すでに大量にあるが、日増しに増加する需要を満たすために、依然としてＬ－グルタミン酸の生産方法を発展させる必要がある。
本発明の目的は、細菌のＬ－グルタミン酸生産能力を改善するための新たな技術を開発し、Ｌ－グルタミン酸を効果的に生産する方法を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明の発明者らは、研究により、細菌における遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０又はその相同遺伝子について、前記遺伝子を修飾するか又はその発見を改善することにより、細菌のＬ－グルタミン酸生産能力を改善できることを発見した。これらの発見に基づいて、本発明を完成した。
本発明は、Ｌ－グルタミン酸生成細菌を提供し、ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発見が改善された。本発明は、前記微生物を使用することでＬ－グルタミン酸を生産する方法をさらに提供した。
本発明の第一の態様は、Ｌ－グルタミン酸生成細菌を提供し、そのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発見が改善されている。本発明によれば、前記改善された発見は、前記ポリヌクレオチド発見が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発見が増強されていることである。
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列は、遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０又はその相同遺伝子がコードするタンパクである。
前記細菌は、未修飾菌株と比べて増強されたＬ－グルタミン酸生産能力を有する。
本発明において、用語である「Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌」とは、細菌が培地で培養される時にＬ－グルタミン酸を収集できるように、培地及び／又は細菌の細胞において以下の程度で目的Ｌ－グルタミン酸を生産、蓄積能力を有する細菌を指す。Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、未修飾菌株の取得可能な量よりも多い量で培地及び／又は細菌の細胞において目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
用語である「未修飾菌株」とは、特定の特徴を有するように修飾されていない対照菌株を指す。即ち、未修飾菌株の例は、野生型菌株と親株を含む。
Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、培地において好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
本発明において、別段の説明がない限り、用語である「Ｌ－グルタミン酸」とは、遊離形態のＬ－グルタミン酸、その塩又はその混合物を指す。
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。本明細書で使用されるように、用語である「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドモジュール間のパーセンテージ同一性を指す。当分野で既知の方法であるモジュールと別のモジュールとの間の配列相同性を測定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってこのような配列相同性を測定することができる。
ポリヌクレオチドの発見は、置換又は変異による発見調節配列、ポリヌクレオチド配列への変異導入、染色体挿入又はベクターを介して導入されるポリヌクレオチドコピー数の増加、又はその組み合わせなどによって増強されることができる。
ポリヌクレオチドの発見調節配列を修飾してもよい。発見調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発見を制御し、且つ例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドを染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させてもよい。本明細書において、特定の部位は、例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発見ベクターに配合し、前記発見ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させてもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを発見ベクターに配合し、前記発見ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを発見ベクターに配合し、前記発見ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していることによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の５２０番目のアスパラギンは、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、５２０番目のアスパラギンは、リジンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、５２０番目のアスパラギンがリジンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用されるように、用語である「操作可能な連結」とは、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、それによって調節配列は、ポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発見レベルを向上させることができる強力なプロモーターであってもよい。調節配列は、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のプロモーターであってもよく、又は他の微生物由来のプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子）のプロモーターである。
本明細書で使用されるように、用語である「ベクター」とは、遺伝子の調節配列と遺伝子配列を含み且つ適切な宿主細胞において標的遺伝子を発見するように構成されたポリヌクレオチド構築体を指す。又は、ベクターは、相同組換えに利用可能な配列を含むポリヌクレオチド構築体をさらに指してもよく、それによって宿主細胞に導入されたベクターにより、宿主細胞のゲノムにおける内因性遺伝子の調節配列を変更することができ、又は発見可能な標的遺伝子を宿主のゲノムの特定の部位に挿入することができる。この点では、本発明で使用されるベクターは、ベクターの宿主細胞への導入又はベクターの宿主細胞の染色体への挿入を決定する選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、選択可能な表現型、例えば薬物耐性、栄養欠損型、細胞毒剤に対する耐性、又は表面タンパクの発見を与えるマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理された環境では、選択マーカーを発見させた細胞のみが生存できるか又は異なる表現型性状を示すため、形質転換された細胞を選択してもよい。本明細書に記載のベクターは、当業者に公知のものであり、プラスミド、ファージ（例えば、λファージ又はＭ１３糸状ファージなど）、コスミド（即ちコスミド）又はウィルスベクターを含むが、それらに限定されない。
本発明のいくつかの具体的な実施の形態において、使用されるベクターは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
本明細書で使用されるように、用語である「形質転換」とは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することによって、ポリヌクレオチドがゲノム外素子とするか又は宿主細胞に挿入されたゲノムで複製できることを指す。本発明で使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術に開示されるように、宿主細胞に応じて電気パルス法を実施することができる。
本明細書において、前記微生物は、酵母、細菌、藻又は真菌であってもよい。
本発明によれば、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する微生物、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）などであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１であり、該菌は、多収型グルタミン酸であり、保存情報は、以下のとおりである。菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム、ラテン名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、保存機構：中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保存日：２０２０年１１月２３日、保存センター登録簿番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０。
本発明によれば、前記細菌は、Ｌ－グルタミン酸の生産量の向上に関連する他の改良、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼなどの酵素の活性又は遺伝子の増強又は低下の発見をさらに有してもよく、又は遺伝子を外来遺伝子に置換させてもよい。
本発明の第二の態様によれば、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株を提供する。
本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記配列の５２０番目のアスパラギンは、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、５２０番目のアスパラギンは、リジンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、５２０番目のアスパラギンがリジンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記変異方法は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から少なくとも一つを選択してもよい。本発明において、好ましくは、ＰＣＲ固定点変異法及び／又は相同組換えを採用する。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明によれば、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築される。
本発明の一つの実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
本発明の別の実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を介して前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドを組換えベクターとして構築してもよい。
本発明によれば、前記組換え菌株は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の第三の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その１５６０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿０４９２０コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その１５６０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿０４９２０コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
本発明の構築方法によれば、前記改造は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも一つを含む。
本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における１５６０番目の塩基がシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に変化することを指し、具体的には、前記は、変異ＢＢＤ２９＿０４９２０コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その１５６０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿０４９２０コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その１５６０番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿０４９２０コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点変異のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子の構築を含み、即ち、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子断片を増幅するプライマーＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を２組合成し、ＰＣＲ固定点変異法によって野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に点変異を導入し、点変異ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を得、ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａとする。
本発明の一つの実施の形態において、前記未修飾菌株ゲノムは、ＡＴＣＣ １３８６９菌株に由来してもよく、そのゲノム配列は、ＮＣＢＩサイトから取得されてもよい。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣ ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧ ＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴ ＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣ ＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣ ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧ ＣＡＧＧＴＧＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣ ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧ ＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴ ＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣ ＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣ ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧ ＣＡＧＧＴＧＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築を含み、分離精製されたＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０ＡとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築を含み、即ち組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得る。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、電気変換法である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記組換えは、相同組換えによって実現される。
本発明の第四の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿０４９２０の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿０４９２０の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴ ＧＡＣＡＴＡＡＣＧＡ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１１：５’ ＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡ ＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴ ＧＡＣＡＴＡＡＣＧＡ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１１：５’ ＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡ ＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである。
Ｐ９：５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＴＣＧＴ ＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧ ＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣ ＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣ ＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
本発明の一つの実施の形態において、採用されたＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと統合相同アーム断片を組み立て、統合プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、統合プラスミドを宿主菌株にトランスフェクトし、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を導入する。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明の第五の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生産する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総容積５０μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自己プロモーターを持つＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ断片を組み立て、過剰発現プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明で得た組換え菌株は、単独でＬ－グルタミン酸の発酵生産に応用されてもよく、Ｌ－グルタミン酸を生産する他の細菌と混合してＬ－グルタミン酸を発酵生産してもよい。
本発明の別の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸の生産方法を提供し、該方法は、前記細菌を培養し、且つ培養物からＬ－グルタミン酸を得ることを含む。
当分野の既知の培養条件で適切な培地において細菌の培養を行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びその組み合わせを含んでもよい。培養において、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養の際に、気泡の発生を防止することを含んでもよく、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止する。また、培養の際に、培養物にガスを注入することを含んでもよい。ガスは、培養物の好気条件を維持できる任意のガスを含んでもよい。培養において、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。生成されたＬ－グルタミン酸を培養物から回収し、即ち硫酸又は塩酸などで培養物を処理し、そして例えばアニオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析と等電点沈殿の方法を組み合わせて行ってもよい。
本発明は、タンパク質をさらに提供し、名称は、タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋであり、前記タンパク質は、
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
本発明は、核酸分子をさらに提供し、名称は、ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａであり、前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、
Ｂ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋをコードする核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ｂ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋをコードする核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるタンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋをコードする。
前記タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３における５２０番目のアスパラギン（Ｎ）をリジン（Ｋ）に変化させたものである。
本発明は、生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む発見カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）前記組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む発見カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）前記組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
本発明は、
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用をさらに提供し、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発見カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用をさらに提供し、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発見カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示されるタンパク質をコードする。
本明細書において、同一性とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性を指す。国際インターネット上の相同性検索サイト、例えばＮＣＢＩホームページサイトのＢＬＡＳＴページを用いて、アミノ酸配列の同一性を測定することができる。例えば、拡張ＢＬＡＳＴ２．１では、ｂｌａｓｔｐをプログラムとして使用し、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０に設定し、すべてのＦｉｌｔｅｒをＯＦＦに設定し、ＢＬＯＳＵＭ６２をＭａｔｒｉｘとして使用し、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔとＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１と０．８５（デフォルト値）に設定して１組のアミノ酸配列の同一性を検索して計算することにより、同一性の値（％）を得ることができる。
本明細書において、前記８０％以上の同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
本明細書において、前記９０％以上の同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
本明細書に記載の微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の蓄積量（即ちＬ－グルタミン酸の生物合成を促進又は抑制する）を向上又は低下させることであってもよい。
本発明は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
上記方法において、前記変異は、点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、即ち単一ヌクレオチドの変異であってもよい。
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子をコードするアミノ酸配列の５２０番目のアスパラギン残基を別のアミノ酸残基に変異させるものであってもよい。
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子をコードするアミノ酸配列の５２０番目のアスパラギンをリジンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋを得るものであってもよい。
前記変異とは、固定点変異により遺伝子におけるいずれか一つ又は複数の塩基を変化させることにより、対応するタンパク質アミノ酸組が変化し、新たなタンパク質を生産し又は元のタンパク質に新たな機能を発生させ、即ち遺伝子固定点変異を指す。遺伝子の固定点変異技術、例えばオリゴヌクレオチドプライマーを介した固定点変異、ＰＣＲを介した固定点変異又はカセット変異などは、当業者には周知である。
本明細書に記載の点変異は、一塩基置換、一塩基挿入または一塩基欠失であってもよく、具体的には、一塩基置換であってもよい。前記一塩基置換は、対立遺伝子置換であってもよい。
前記点変異は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の１５６０番目のシトシン（Ｃ）の核酸改造であってもよい。
具体的には、前記点変異は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の１５６０番目のシトシン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変化させ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を得るものであってもよい。
本明細書において、前記組換えベクターは、具体的に組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａであってもよい。
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの８４６～１７８８番目に示されるＤＮＡ分子を含む。
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０は、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０を宿主染色体に統合し、菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを宿主染色体に統合し、菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０は、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０を染色体外に発見させ、さらに菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを染色体外に発見させ、さらに菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０とｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、いずれも本発明の保護範囲内にある。
本明細書において、前記組換え微生物は、具体的に組換え菌ＹＰＧ－００１、ＹＰＧ－００２、ＹＰＧ－００３、ＹＰＧ－００４又はＹＰＧ－００５であってもよい。
前記組換え菌ＹＰＧ－００１は、前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａをコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に形質転換して得られた組換え菌であり、前記組換え菌ＹＰＧ－００１は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む。
前記組換え菌ＹＰＧ－００２は、２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含み、２コピーＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子の発見量を顕著かつ安定的に増加させることができる。組換え菌ＹＰＧ－００２は、ゲノム上の野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
前記組換え菌ＹＰＧ－００３は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－００３は、ゲノム上の変異型ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
組換え菌ＹＰＧ－００４は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－００４は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０が染色体外に過剰発現を行う。
組換え菌ＹＰＧ－００５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－００５は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａが染色体外に過剰発現を行う。
前記組換え菌ＹＰＧ－００１、ＹＰＧ－００２、ＹＰＧ－００３、ＹＰＧ－００４又はＹＰＧ－００５は、いずれも本発明の保護範囲内にある。
本発明は、前記組換え微生物を構築する方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
前記導入は、化学形質転換法又は電気ショック形質転換法などの既知の形質転換方法により本発明ＤＮＡ分子を担持したベクターを宿主菌に形質転換することであってもよい。導入されたＤＮＡ分子は、シングルコピーであってもよくマルチコピーであってもよい。前記導入は、外来遺伝子を宿主染色体に統合してもよく、プラスミドが染色体外に発見してもよい。
本発明は、Ｌ－グルタミン酸の製造方法をさらに提供し、前記方法は、本明細書におけるいずれか一つの前記組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む。
上記方法において、前記方法は、発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造であってもよく、前記組換え微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であってもよく、具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びその変異体であってもよい。
本発明において、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿０４９２０野生型コード領域配列
ＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａコード領域配列
ＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣ ＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＢＢＤ２９＿０４９２０野生型コードされたタンパクアミノ酸配列
ＭＴＴＳＤＰＮＳＫＰ ＩＶＥＤＡＱＰＥＱＩ ＴＡＴＥＥＬＡＧＬＬ ＥＮＰＴＮＬＥＧＫＬ ＡＤＡＥＥＥＩＩＬＥ ＧＥＤＡＱＡＳＬＮＷ ＳＶＩＶＰＡＬＶＩＶ ＬＡＴＶＶＷＧＩＧＦ ＫＤＳＦＴＮＦＡＳＳ ＡＬＳＡＶＶＤＮＬＧ ＷＡＦＩＬＦＧＴＶＦ ＶＦＦＩＶＶＩＡＡＳ ＫＦＧＴＩＲＬＧＲＩ ＤＥＡＰＥＦＲＴＶＳ ＷＩＳＭＭＦＡＡＧＭ ＧＩＧＬＭＦＹＧＴＴ ＥＰＬＴＦＹＲＮＧＶ ＰＧＹＤＥＨＮＶＧＶ ＡＭＳＴＴＭＦＨＷＴ ＬＨＰＷＡＩＹＡＩＶ ＧＬＡＩＡＹＳＴＦＲ ＶＧＲＫＱＬＬＳＳＡ ＦＶＰＬＩＧＥＫＧＡ ＥＧＷＬＧＫＬＩＤＩ ＬＡＩＩＡＴＶＦＧＴ ＡＣＳＬＧＬＧＡＬＱ ＩＧＡＧＬＳＡＡＮＩ ＩＥＮＰＳＤＷＴＶＩ ＧＩＶＳＶＬＴＬＡＦ ＩＦＳＡＩＳＧＶＧＫ ＧＩＱＹＬＳＮＡＮＭ ＶＬＡＡＬＬＡＩＦＶ ＦＶＶＧＰＴＶＳＩＬ ＮＬＬＰＧＳＩＧＮＹ ＬＳＮＦＦＱＭＡＧＲ ＴＡＭＳＡＤＧＴＡＧ ＥＷＬＧＳＷＴＩＦＹ ＷＡＷＷＩＳＷＳＰＦ ＶＧＭＦＬＡＲＩＳＲ ＧＲＳＩＲＥＦＩＬＧ ＶＬＬＶＰＡＧＶＳＴ ＶＷＦＳＩＦＧＧＴＡ ＩＶＦＥＱＮＧＥＳＩ ＷＧＤＧＡＡＥＥＱＬ ＦＧＬＬＨＡＬＰＧＧ ＱＩＭＧＩＩＡＭＩＬ ＬＧＴＦＦＩＴＳＡＤ ＳＡＳＴＶＭＧＴＭＳ ＱＨＧＱＬＥＡＮＫＷ ＶＴＡＡＷＧＶＡＴＡ ＡＩＧＬＴＬＬＬＳＧ ＧＤＮＡＬＮＮＬＱＮ ＶＴＩＶＡＡＴＰＦＬ ＦＶＶＩＧＬＭＦＡＬ ＶＫＤＬＳＮＤＶＩＹ ＬＥＹＲＥＱＱＲＦＮ ＡＲＬＡＲＥＲＲＶＨ ＮＥＨＲＫＲＥＬＡＡ ＫＲＲＲＥＲＫＡＳＧ ＡＧＫＲＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋコードされたタンパクアミノ酸配列
ＭＴＴＳＤＰＮＳＫＰ ＩＶＥＤＡＱＰＥＱＩ ＴＡＴＥＥＬＡＧＬＬ ＥＮＰＴＮＬＥＧＫＬ ＡＤＡＥＥＥＩＩＬＥ ＧＥＤＡＱＡＳＬＮＷ ＳＶＩＶＰＡＬＶＩＶ ＬＡＴＶＶＷＧＩＧＦ ＫＤＳＦＴＮＦＡＳＳ ＡＬＳＡＶＶＤＮＬＧ ＷＡＦＩＬＦＧＴＶＦ ＶＦＦＩＶＶＩＡＡＳ ＫＦＧＴＩＲＬＧＲＩ ＤＥＡＰＥＦＲＴＶＳ ＷＩＳＭＭＦＡＡＧＭ ＧＩＧＬＭＦＹＧＴＴ ＥＰＬＴＦＹＲＮＧＶ ＰＧＹＤＥＨＮＶＧＶ ＡＭＳＴＴＭＦＨＷＴ ＬＨＰＷＡＩＹＡＩＶ ＧＬＡＩＡＹＳＴＦＲ ＶＧＲＫＱＬＬＳＳＡ ＦＶＰＬＩＧＥＫＧＡ ＥＧＷＬＧＫＬＩＤＩ ＬＡＩＩＡＴＶＦＧＴ ＡＣＳＬＧＬＧＡＬＱ ＩＧＡＧＬＳＡＡＮＩ ＩＥＮＰＳＤＷＴＶＩ ＧＩＶＳＶＬＴＬＡＦ ＩＦＳＡＩＳＧＶＧＫ ＧＩＱＹＬＳＮＡＮＭ ＶＬＡＡＬＬＡＩＦＶ ＦＶＶＧＰＴＶＳＩＬ ＮＬＬＰＧＳＩＧＮＹ ＬＳＮＦＦＱＭＡＧＲ ＴＡＭＳＡＤＧＴＡＧ ＥＷＬＧＳＷＴＩＦＹ ＷＡＷＷＩＳＷＳＰＦ ＶＧＭＦＬＡＲＩＳＲ ＧＲＳＩＲＥＦＩＬＧ ＶＬＬＶＰＡＧＶＳＴ ＶＷＦＳＩＦＧＧＴＡ ＩＶＦＥＱＮＧＥＳＩ ＷＧＤＧＡＡＥＥＱＬ ＦＧＬＬＨＡＬＰＧＧ ＱＩＭＧＩＩＡＭＩＬ ＬＧＴＦＦＩＴＳＡＤ ＳＡＳＴＶＭＧＴＭＳ ＱＨＧＱＬＥＡＮＫＷ ＶＴＡＡＷＧＶＡＴＡ ＡＩＧＬＴＬＬＬＳＧ ＧＤＮＡＬＮＮＬＱＫ ＶＴＩＶＡＡＴＰＦＬ ＦＶＶＩＧＬＭＦＡＬ ＶＫＤＬＳＮＤＶＩＹ ＬＥＹＲＥＱＱＲＦＮ ＡＲＬＡＲＥＲＲＶＨ ＮＥＨＲＫＲＥＬＡＡ ＫＲＲＲＥＲＫＡＳＧ ＡＧＫＲＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿０４９２０野生型コード領域配列
ＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａコード領域配列
ＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣＴＴＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣ ＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＢＢＤ２９＿０４９２０野生型コードされたタンパクアミノ酸配列
ＭＴＴＳＤＰＮＳＫＰ ＩＶＥＤＡＱＰＥＱＩ ＴＡＴＥＥＬＡＧＬＬ ＥＮＰＴＮＬＥＧＫＬ ＡＤＡＥＥＥＩＩＬＥ ＧＥＤＡＱＡＳＬＮＷ ＳＶＩＶＰＡＬＶＩＶ ＬＡＴＶＶＷＧＩＧＦ ＫＤＳＦＴＮＦＡＳＳ ＡＬＳＡＶＶＤＮＬＧ ＷＡＦＩＬＦＧＴＶＦ ＶＦＦＩＶＶＩＡＡＳ ＫＦＧＴＩＲＬＧＲＩ ＤＥＡＰＥＦＲＴＶＳ ＷＩＳＭＭＦＡＡＧＭ ＧＩＧＬＭＦＹＧＴＴ ＥＰＬＴＦＹＲＮＧＶ ＰＧＹＤＥＨＮＶＧＶ ＡＭＳＴＴＭＦＨＷＴ ＬＨＰＷＡＩＹＡＩＶ ＧＬＡＩＡＹＳＴＦＲ ＶＧＲＫＱＬＬＳＳＡ ＦＶＰＬＩＧＥＫＧＡ ＥＧＷＬＧＫＬＩＤＩ ＬＡＩＩＡＴＶＦＧＴ ＡＣＳＬＧＬＧＡＬＱ ＩＧＡＧＬＳＡＡＮＩ ＩＥＮＰＳＤＷＴＶＩ ＧＩＶＳＶＬＴＬＡＦ ＩＦＳＡＩＳＧＶＧＫ ＧＩＱＹＬＳＮＡＮＭ ＶＬＡＡＬＬＡＩＦＶ ＦＶＶＧＰＴＶＳＩＬ ＮＬＬＰＧＳＩＧＮＹ ＬＳＮＦＦＱＭＡＧＲ ＴＡＭＳＡＤＧＴＡＧ ＥＷＬＧＳＷＴＩＦＹ ＷＡＷＷＩＳＷＳＰＦ ＶＧＭＦＬＡＲＩＳＲ ＧＲＳＩＲＥＦＩＬＧ ＶＬＬＶＰＡＧＶＳＴ ＶＷＦＳＩＦＧＧＴＡ ＩＶＦＥＱＮＧＥＳＩ ＷＧＤＧＡＡＥＥＱＬ ＦＧＬＬＨＡＬＰＧＧ ＱＩＭＧＩＩＡＭＩＬ ＬＧＴＦＦＩＴＳＡＤ ＳＡＳＴＶＭＧＴＭＳ ＱＨＧＱＬＥＡＮＫＷ ＶＴＡＡＷＧＶＡＴＡ ＡＩＧＬＴＬＬＬＳＧ ＧＤＮＡＬＮＮＬＱＮ ＶＴＩＶＡＡＴＰＦＬ ＦＶＶＩＧＬＭＦＡＬ ＶＫＤＬＳＮＤＶＩＹ ＬＥＹＲＥＱＱＲＦＮ ＡＲＬＡＲＥＲＲＶＨ ＮＥＨＲＫＲＥＬＡＡ ＫＲＲＲＥＲＫＡＳＧ ＡＧＫＲＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋコードされたタンパクアミノ酸配列
ＭＴＴＳＤＰＮＳＫＰ ＩＶＥＤＡＱＰＥＱＩ ＴＡＴＥＥＬＡＧＬＬ ＥＮＰＴＮＬＥＧＫＬ ＡＤＡＥＥＥＩＩＬＥ ＧＥＤＡＱＡＳＬＮＷ ＳＶＩＶＰＡＬＶＩＶ ＬＡＴＶＶＷＧＩＧＦ ＫＤＳＦＴＮＦＡＳＳ ＡＬＳＡＶＶＤＮＬＧ ＷＡＦＩＬＦＧＴＶＦ ＶＦＦＩＶＶＩＡＡＳ ＫＦＧＴＩＲＬＧＲＩ ＤＥＡＰＥＦＲＴＶＳ ＷＩＳＭＭＦＡＡＧＭ ＧＩＧＬＭＦＹＧＴＴ ＥＰＬＴＦＹＲＮＧＶ ＰＧＹＤＥＨＮＶＧＶ ＡＭＳＴＴＭＦＨＷＴ ＬＨＰＷＡＩＹＡＩＶ ＧＬＡＩＡＹＳＴＦＲ ＶＧＲＫＱＬＬＳＳＡ ＦＶＰＬＩＧＥＫＧＡ ＥＧＷＬＧＫＬＩＤＩ ＬＡＩＩＡＴＶＦＧＴ ＡＣＳＬＧＬＧＡＬＱ ＩＧＡＧＬＳＡＡＮＩ ＩＥＮＰＳＤＷＴＶＩ ＧＩＶＳＶＬＴＬＡＦ ＩＦＳＡＩＳＧＶＧＫ ＧＩＱＹＬＳＮＡＮＭ ＶＬＡＡＬＬＡＩＦＶ ＦＶＶＧＰＴＶＳＩＬ ＮＬＬＰＧＳＩＧＮＹ ＬＳＮＦＦＱＭＡＧＲ ＴＡＭＳＡＤＧＴＡＧ ＥＷＬＧＳＷＴＩＦＹ ＷＡＷＷＩＳＷＳＰＦ ＶＧＭＦＬＡＲＩＳＲ ＧＲＳＩＲＥＦＩＬＧ ＶＬＬＶＰＡＧＶＳＴ ＶＷＦＳＩＦＧＧＴＡ ＩＶＦＥＱＮＧＥＳＩ ＷＧＤＧＡＡＥＥＱＬ ＦＧＬＬＨＡＬＰＧＧ ＱＩＭＧＩＩＡＭＩＬ ＬＧＴＦＦＩＴＳＡＤ ＳＡＳＴＶＭＧＴＭＳ ＱＨＧＱＬＥＡＮＫＷ ＶＴＡＡＷＧＶＡＴＡ ＡＩＧＬＴＬＬＬＳＧ ＧＤＮＡＬＮＮＬＱＫ ＶＴＩＶＡＡＴＰＦＬ ＦＶＶＩＧＬＭＦＡＬ ＶＫＤＬＳＮＤＶＩＹ ＬＥＹＲＥＱＱＲＦＮ ＡＲＬＡＲＥＲＲＶＨ ＮＥＨＲＫＲＥＬＡＡ ＫＲＲＲＥＲＫＡＳＧ ＡＧＫＲＲ
保存情報：菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム、ラテン名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、保存機構：中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、保存日：２０２０年１１月２３日、保存センター登録簿番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０。
以下では、具体的な実施例を結び付けながら本発明の技術案についてさらに詳細に説明する。理解すべきこととして、以下の実施例は、例示的に本発明を説明、解釈するものであり、本発明の保護範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本発明の上記内容に基づいて実現された技術は、いずれも本発明が保護を意図する範囲内に含まれる。別段の説明がない限り、以下の実施例で使用される原料と試薬は、いずれも市販品であり、又は既知の方法で製造することができ、行われた操作は、すべて当分野に知られており、又は市販品のユーザーマニュアルに準拠して行われたものである。
以下の実施例において前記菌株を培養するために使用される基礎培地の組成が同じであり、この上に培地組成に必要のある該当するショ糖、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどを添加し、基礎培地における成分組成を次に示し、以下の成分を水に溶かして基礎培地を得る、
下記実施例におけるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０は、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所）に保存されており、保存登録番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０とも呼ばれる。
実施例１ 点変異ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿０４９２０）を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０（シークエンスにより該菌株染色体上のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域とＡＴＣＣ １３８６９とが一致していることが確認された）に点変異を導入し、対応するコードされたタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のヌクレオチド配列の１５６０番目のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ）に変化したものであり、対応するコードされたタンパクのアミノ酸配列は、５２０番目のアスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋ）に変化したものである。プライマーは、以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣ ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧ ＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴ ＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣ ＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣ ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧ ＣＡＧＧＴＧＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行った。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＢＢＤ２９＿０４９２０）を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０（シークエンスにより該菌株染色体上のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域とＡＴＣＣ １３８６９とが一致していることが確認された）に点変異を導入し、対応するコードされたタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子のヌクレオチド配列の１５６０番目のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ）に変化したものであり、対応するコードされたタンパクのアミノ酸配列は、５２０番目のアスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｎ５２０Ｋ）に変化したものである。プライマーは、以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣ ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧ ＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴ ＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣ ＡＡＡＡＡＧＴＣＡＣ ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＡＣＡＧＡＴＴＧＧＧ ＣＡＧＧＴＧＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、テンプレート１μＬ、残量が水であり、総容積が５０μＬである。
上記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われ、大きさがそれぞれ７６６ｂｐと７７８ｂｐであり、ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿０４９２０ ＵｐとＢＢＤ２９＿０４９２０ Ｄｏｗｎ）を２つ得た。
上記２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、上記２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、オーバーラップＰＣＲにより長さ１５１４ｂｐの断片（即ちＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－ｕｐ－ｄｏｗｎ）を増幅し、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の８４６～１７８８番目である。
ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、テンプレート１μＬ、残量が水であり、総容積が５０μＬである。
上記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
このＤＮＡ断片によってコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０におけるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域の１５６０番目のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に変化し、最終的にコードされたタンパクの５２０番目のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）に変化した。
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）をＸｂａ Ｉ酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動でＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａと線形化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを分離精製し、さらにＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系（ＮＥＢ Ｅ５５２０Ｓ）で組み立て、ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを得、該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれる。そしてベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａをシーケンシング会社に送ってシーケンシング鑑定し、正しい点変異（Ｃ－Ａ）を含むベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを保存して予備した。
ｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の８４６～１４８８番目に示されるＤＮＡ断片ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－ｕｐ－ｄｏｗｎをｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉ認識部位間に挿入した後、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
実施例２ 点変異ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを含む工学的菌株の構築
構築方法：アイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒ（５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ３’）により鑑定され、大きさ約１５２１ ｂｐバンド（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９に示される）を増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地とカナマイシンを含まない培地上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５：５’ ＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴ ＣＴＧＧＴＧＧＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＴＣＧＣＣＴＴＡＣＧ ＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
上記ＰＣＲ増幅産物（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０に示される）は、高温変性、氷浴後にＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの増幅断片を陽性対照とし、ＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照とし、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。アイソサイト置換に成功した菌株の目の断片を、さらにプライマーＰ５とＰ６でＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比較により、塩基配列に変異が生じた配列検証菌株のアイソサイト置換に成功し、ＹＰＧ－００１と命名された。
構築方法：アイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒ（５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ３’）により鑑定され、大きさ約１５２１ ｂｐバンド（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９に示される）を増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地とカナマイシンを含まない培地上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５：５’ ＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴ ＣＴＧＧＴＧＧＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＴＣＧＣＣＴＴＡＣＧ ＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
上記ＰＣＲ増幅産物（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０に示される）は、高温変性、氷浴後にＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａの増幅断片を陽性対照とし、ＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照とし、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。アイソサイト置換に成功した菌株の目の断片を、さらにプライマーＰ５とＰ６でＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、配列比較により、塩基配列に変異が生じた配列検証菌株のアイソサイト置換に成功し、ＹＰＧ－００１と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－００１は、アレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異Ｃ１５６０Ａを導入し、該遺伝子の１５６０番目のＣをＡに変異させ、該遺伝子の他の配列をそのままし、得た点変異（Ｃ－Ａ）を含む遺伝子工学菌ＹＰＧ－００１である。
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－００１との相違点は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムにおけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子に置換したことである。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２には、１５６０番目に位置するヌクレオチドの相違点が１つしか存在しない。
ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの製造及び条件は、以下のとおりである、
実施例３ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、上下流相同アーム断片及びＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを３組設計して合成し、相同組換えの方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０にＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を導入した。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、上下流相同アーム断片及びＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを３組設計して合成し、相同組換えの方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０にＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を導入した。
プライマーは、以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴ ＧＡＣＡＴＡＡＣＧＡ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＴＣＧＴ ＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧ ＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣ ＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ ＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡ ＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
構築方法：それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－００１をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２で、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示される）、ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片約１９８７ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３に示される）及び下流相同アーム断片約７８８ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４に示される）を得た。さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０－下流（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５に示される）又は統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－下流（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６に示される）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて必要な約３５０１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ ＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧ ＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＴ ＧＡＣＡＴＡＡＣＧＡ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＴＣＧＴ ＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧ ＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣ ＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ ＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡ ＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
構築方法：それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－００１をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２で、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片約８０６ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示される）、ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片約１９８７ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３に示される）及び下流相同アーム断片約７８８ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４に示される）を得た。さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０－下流（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５に示される）又は統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－下流（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６に示される）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて必要な約３５０１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０－下流をシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢのＸｂａ Ｉ酵素切断点に挿入して得られた組換えベクターである。
ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－下流をシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢのＸｂａ Ｉ酵素切断点に挿入して得られた組換えベクターである。
ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、テンプレートが１μＬであり、残量が水であり、総容積が５０μＬである。
前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１２０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
２つの統合プラスミドをそれぞれ電気転換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｐ１３／Ｐ１４プライマーでＰＣＲ鑑定され、ＰＣＲが増幅できた大きさ約１６７４ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７に示される）の断片を含むのは、陽性菌株であり、断片を増幅できなかったのは、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖スクリーニングを経てた後に、それぞれカナマイシンを含む培地とカナマイシンを含まない培地上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１６プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ約１９４３ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８に示される）の菌は、ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０ゲノムに統合した菌株であり、ＹＰＧ－００２（変異点を含まない）とＹＰＧ－００３（変異点を含む）と命名された。
Ｐ１３：５’ ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧ ＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ ＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣ ＡＡＴＧＡＧＴＧＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ１５：５’ ＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧ ＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣ ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
組換え菌ＹＰＧ－００２は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０－下流を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られた２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含む組換え菌であり、２コピーＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿０４９２０の発見量を顕著かつ安定的に増加させることができる。
Ｐ１４：５’ ＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣ ＡＡＴＧＡＧＴＧＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ１５：５’ ＣＣＧＴＡＡＡＣＡＧ ＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣ ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
組換え菌ＹＰＧ－００２は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０－下流を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られた２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含む組換え菌であり、２コピーＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿０４９２０の発見量を顕著かつ安定的に増加させることができる。
組換え菌ＹＰＧ－００３は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ－下流を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ変異遺伝子を含む組換え菌である。
実施例４ プラスミドにおいてＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマーは、以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
構築方法：それぞれＹＰＧ－００２又はＹＰＧ－００１をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子及びそのプロモーターを含むＤＮＡ断片２０１７ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０に示される）を得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１９４７ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマーは、以下のように設計される（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
構築方法：それぞれＹＰＧ－００２又はＹＰＧ－００１をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿０４９２０又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子及びそのプロモーターを含むＤＮＡ断片２０１７ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０に示される）を得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１９４７ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用してＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
ＰＣＲ系は、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、テンプレートが１μＬであり、残量が水であり、総容積が５０μＬである。
前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子及びそのプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９に示される）をシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９のＥｃｏＲ Ｉ酵素切断点に挿入して得られた組換えベクターである。
過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａは、ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子及びそのプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０に示される）をシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９のＥｃｏＲ Ｉ酵素切断点に挿入して得られた組換えベクターである。
２つのプラスミドをそれぞれ電気転換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｍ１３Ｒ（－４８）（５’ ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ ＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ ＡＧＧＡ ３’）とＰ１８プライマーでＰＣＲ鑑定され、ＰＣＲ増幅できた大きさ約２０５６ ｂｐの断片（点変異を含まない配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１に示され、点変異を含む配列の１７９４番目は、Ａであり、その他は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１に示される）を含むのは、転入菌株であり、ＹＰＧ－００４（点変異を含まない）とＹＰＧ－００５（点変異を含む）と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－００４は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－００４は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０が染色体外に過剰発現を行う。
組換え菌ＹＰＧ－００５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０５は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａが染色体外に過剰発現を行う。
実施例５ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を欠失させた工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマーは、以下のように設計される（上海英俊公司により合成された）、
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧ ＴＴＧＧＴＣＴＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ ＧＴＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＣＣ ＣＴＧＧＣＡＧＡＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ ＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＴＣＧＣＧＣＧ ＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０とＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７３３ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２に示される）及び下流相同アーム断片８１４ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３に示される）を得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＰＣＲをオーバーラップして相同アーム断片１５０７ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４に示される）全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１５０７ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれる。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマーは、以下のように設計される（上海英俊公司により合成された）、
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧ ＴＴＧＧＴＣＴＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ ＧＴＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＣＣ ＣＴＧＧＣＡＧＡＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ ＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＴＣＧＣＧＣＧ ＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０とＰ２１／Ｐ２２でＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７３３ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２に示される）及び下流相同アーム断片８１４ ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３に示される）を得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＰＣＲをオーバーラップして相同アーム断片１５０７ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４に示される）全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１５０７ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれる。
ノックアウトプラスミドを電気転換により菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれ以下のプライマー（上海英俊公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定された、
Ｐ２３：５’ ＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧ ＴＴＧＧＴＣＴＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
Ｐ２４：５’ ＡＴＡＴＣＧＣＧＣＧ ＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ１４３３ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５に示される）及び３３８０ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６に示される）バンドの菌株は、陽性菌株であり、３３８０ｂｐバンドのみ増幅できた菌株は、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地とカナマイシンを含まない培地上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１４３３ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－００６と命名された。
Ｐ２３：５’ ＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧ ＴＴＧＧＴＣＴＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
Ｐ２４：５’ ＡＴＡＴＣＧＣＧＣＧ ＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ１４３３ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５に示される）及び３３８０ｂｐ（配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６に示される）バンドの菌株は、陽性菌株であり、３３８０ｂｐバンドのみ増幅できた菌株は、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地とカナマイシンを含まない培地上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１４３３ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－００６と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－００６は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０上のゲノムにおけるＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域がノックアウトされて得られた菌株である。
実施例６ Ｌ－グルタミン酸発酵実験
実施例で構築された菌株ＹＰＧ－００１、ＹＰＧ－００２、ＹＰＧ－０３、ＹＰＧ－００４、ＹＰＧ－００５、ＹＰＧ－００６とオリジナル菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）に、表１に示される培地（表１に示される溶質を水に溶かして、培地を得た。）と表２に示される制御プロセスに従って発酵実験を行い、発酵産物を収集した。
実施例で構築された菌株ＹＰＧ－００１、ＹＰＧ－００２、ＹＰＧ－０３、ＹＰＧ－００４、ＹＰＧ－００５、ＹＰＧ－００６とオリジナル菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）に、表１に示される培地（表１に示される溶質を水に溶かして、培地を得た。）と表２に示される制御プロセスに従って発酵実験を行い、発酵産物を収集した。
接種完了の初期時刻で、系における菌濃度は、１５ｇ／Ｌである。発酵中に、５０～５５％のブドウ糖水溶液を補充することによって系の糖度（残糖）を制御した。
各菌株は３回繰り返し、結果を表３に示す。
結果は、表３に示すように、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子を過剰発現させ、又はＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域に対して点変異ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ及び／又は過剰発現を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上に有利であり、遺伝子を弱化又はノックアウトすることにより、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。
以上、本発明の実施形態について説明した。しかし、本発明は、上記実施方式に限定されるものではない。本発明の精神と原則において、いかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
本発明は、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子の弱化又はノックアウトにより、該遺伝子のコードする産物がＬ－グルタミン酸生産能力に影響を与え、コード配列に点変異を導入し、又は該遺伝子のコピー数を増加又は過剰発現させて組換え菌株を得ることにより、得られた菌株が未改造の菌株と比べて、高濃度のグルタミン酸を生産するのに有利であることを発見した。
具体的には、本発明は、まずアレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０のＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異を導入し、点変異（Ｃ－Ａ）を含む遺伝子工学的菌ＹＰＧ－００１を構築した。菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを過剰発現させることによりＬ－グルタミン酸の生産量を向上させることができることをさらに研究検証するために、それぞれ外来遺伝子を宿主染色体に統合し又はプラスミド染色が体外に発見させ、ゲノム上とプラスミドにおいてＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子又はＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌ＹＰＧ－００２、ＹＰＧ－００３、ＹＰＧ－００４とＹＰＧ－００５を構築した。実験によると、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子及びその変異体は、Ｌ－グルタミン酸の生物合成に関与しており、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子の過剰発現又はノックアウト、又は固定点変異（例えば点変異）を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の微生物における蓄積量を制御することができる。ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子コード領域に対して点変異又は菌生産中にＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａを過剰発現させることにより、Ｌ－グルタミン酸の生産量及び形質転換率の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子に対してノックアウト又は弱化を行うことは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。ＢＢＤ２９＿０４９２０遺伝子及びその変異体（例えばＢＢＤ２９＿０４９２０Ｃ１５６０Ａ遺伝子）を利用してＬ－グルタミン酸を生産する遺伝子工学的菌種を構築し、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上を促進することができ、工業化生産に適合する高生産、高品質の菌種を育成し、Ｌ－グルタミン酸の工業化生産に対して広範な応用価値と重要な経済意義を持つ。
菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、受託番号：ＣＧＭＣＣ ２１２２０
Claims (20)
- Ｌ－グルタミン酸生成細菌であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発見が改善されており、
好ましくは、前記改善された発見は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドの発見が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその相同配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発見が増強されていることである、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸生成細菌。 - ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点変異により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の５２０番目のアスパラギンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、５２０番目のアスパラギンは、リジンで置換される、ことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌。
- 前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基の変異により形成され、
好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変異を含み、
好ましくは、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。 - 前記細菌は、コリネバクテリウム属細菌であり、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）であり、さらに好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０又はＡＴＣＣ １３８６９である、ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細菌。
- ポリヌクレオチド配列であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、ここで、５２０番目のアスパラギンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、５２０番目のアスパラギンは、リジンで置換され、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基の変異により形成され、好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の１５６０番目の塩基のシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への変異であり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド配列。 - ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される、ことを特徴とするアミノ酸配列。
- 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする組換え菌株。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌を培養し、前記培養物からＬ－グルタミン酸を回収することを含む、Ｌ－グルタミン酸の生産方法。
- Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とするタンパク質。 - Ｂ１）請求項１１に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする核酸分子。 - Ｃ１）請求項１２に記載の核酸分子を含む発見カセットと、
Ｃ２）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）前記組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする生物材料。 - Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用であって、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）請求項１１に記載のタンパク質、
Ｄ２）請求項１２に記載の核酸分子、
Ｄ３）請求項１３に記載の生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発見カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発見カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である、Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用。 - 微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法であって、
Ｅ１）目的微生物における請求項１２に記載の核酸分子の発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物における請求項１４におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発見量又は含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む、ことを特徴とする微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法。 - 前記変異は、点変異である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- 前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子をコードするアミノ酸配列の１９９番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に変異させるものである、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
- 前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子をコードするアミノ酸配列の１９９番目のアラニンをイソロイシンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質を得るものである、ことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
- 請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法であって、
Ｆ１）請求項１２に記載の核酸分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法。 - 前記方法請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸を製造する方法。
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