RU2339699C2 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2339699C2 RU2339699C2 RU2005134209/13A RU2005134209A RU2339699C2 RU 2339699 C2 RU2339699 C2 RU 2339699C2 RU 2005134209/13 A RU2005134209/13 A RU 2005134209/13A RU 2005134209 A RU2005134209 A RU 2005134209A RU 2339699 C2 RU2339699 C2 RU 2339699C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- threonine
- gene
- pcka
- escherichia coli
- loxpcat
- Prior art date
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 155
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 7
- 101150088738 pckA gene Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 77
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 29
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 29
- 101150067708 pckG gene Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 9
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 9
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L oxaloacetate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CC(=O)C([O-])=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 5
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 4
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SAUCHDKDCUROAO-VKHMYHEASA-N L-2-amino-3-oxobutanoic acid Chemical compound CC(=O)[C@H](N)C(O)=O SAUCHDKDCUROAO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BCDGQXUMWHRQCB-UHFFFAOYSA-N aminoacetone Chemical compound CC(=O)CN BCDGQXUMWHRQCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- -1 E. coli strain Chemical compound 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010043075 L-threonine 3-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженернии. Сконструирована рекомбинантная плазмида pTΔpckA::loxpcat путем клонирования неполного pckA-гена в рТ7Blue-вектор. Плазмида содержит фрагмент pckA-гена, который включает в себя устойчивый к хлорамфениколу ген и loxP-сайты. Путем трансформации клеток Е.coli плазмидной ДНК pT7ΔpckA::loxpcat получен штамм Е.coli FTR2717 - продуцент L-треонина. Изобретение позволяет существенно повысить выход L-треонина в присутствии высоких концентраций глюкозы. 2 н.з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Description
Сущность изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, который продуцирует L-треонин, и к способу получения L-треонина с использованием данного микроорганизма. В частности, настоящее изобретение относится к микроорганизму, который содержит в хромосоме инактивированные гены tdcBC и pckA и существенно улучшает продуктивность L-треонина, что обусловлено инактивацией этих двух генов, а также к способу получения L-треонина с использованием такого микроорганизма.
Описание предшествующего уровня техники
Известно, что L-треонин является незаменимой аминокислотой, которую широко используют в качестве фуражной, кормовой добавки и стимулятора роста животного, а также в качестве компонента в лекарственных водных растворах и дополнительного сырья в медицинских продуктах. В настоящее время в развитых странах L-треонин производят всего пять компаний, в том числе Ajinomoto Company в Японии, и L-треонин в два-три раза дороже лизина, о котором известно, что его высокая ценность на международном рынке обусловлена его высокой ценой, 5000-6000 долларов за тонну. Поэтому для производства L-треонина существует возможность быстрого роста на мировом рынке.
В настоящее время L-треонин получают лишь с помощью методов микробиологической ферментации, в основном используя мутанты, полученные из микроорганизмов дикого типа, включая Escherichia coli, представителей рода Corynebacterium, представителей рода Brevibacterium, представителей рода Serratia и представителей рода Providencia. Примеры таких мутантов включают в себя мутантов, обладающих резистентностью к аминокислотным аналогам или лекарственным средствам, и их ауксотрофов по диаминопимелиновой кислоте, метионину, лизину и изолейцину (Японская патентная публикация № Heisei 2-219582; Корейская патентная публикация № 1998-32951; Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:550-553, 1988). Вместе с тем такие мутантные штаммы из-за их ауксотрофных свойств в отношении диаминопимелиновой кислоты или изолейцина убыточны в том плане, что обладают низкой продуктивностью L-треонина и растут только в среде, в которую добавлены дорогостоящие диаминопимелиновая кислота или изолейцин. Иными словами, при использовании мутанта, нуждающегося для своего роста в диаминопимелиновой кислоте, данное ферментативное производство L-треонина требует высоких издержек. В случае использования ауксотрофа по изолейцину ферментационная среда для данного ауксотрофа также должна содержать добавку дорогостоящего изолейцина, что ведет к возрастанию издержек при производстве L-треонина.
Указанные проблемы можно преодолеть путем использования leaky-мутанта по изолейцину, который описан в Корейской патентной публикации № 92-8365, исключающего присутствие в среде изолейцина и продуцирующего большие количества L-треонина по сравнению с известными штаммами. Однако данный классический мутационный способ для селекции новых бактериальных штаммов, способных продуцировать большие количества L-треонина, все же является трудоемким и неэффективным и его самый большой недостаток состоит в том, что он лишь ограниченно улучшает продуктивность L-треонина.
В связи с этим вместо использования данных ауксотрофов с помощью методов метаболической инженерии разработаны другие способы для массового производства L-треонина, в которых используют рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие L-треонин, и которые обладают повышенной активностью ферментов, участвующих в биосинтезе L-треонина. А именно, применяя методы генетической рекомбинации, выделяют гены, соответствующие ферментам, участвующим в метаболизме L-треонина, клонируют выделенные гены в надлежащие генные носители и встраивают их в микробные мутанты для улучшения продуктивности L-треонина в данных мутантах.
Авторы настоящего изобретения ранее разработали способ создания штамма, продуцирующего L-треонин, с использованием таких методов метаболической инженерии, который раскрыт в Корейской патентной заявке № 2001-6976. Подробно, высокого выхода L-треонина можно достичь путем использования рекомбинантного микроорганизма, который обладает одной или несколькими хромосомными копиями гена, кодирующего фосфоенолпируваткарбоксилазу (в дальнейшем именуемую просто "ppc"), которая катализирует образование оксалацетата (ОАА) в качестве предшественника в биосинтезе L-треонина из фосфоенолпирувата (PEP), а также содержит оперон, содержащий гены, кодирующие три фермента, участвующих в биосинтезе L-треонина из аспартата, аспартокиназа 1-гомосериндегидрогеназы (thrA), гомосеринкиназы (thrB) и треонинсинтазы (thrC).
L-треонин синтезируется из аспартата многоступенчатым путем, в котором аспартат образуется из ОАА, преобразуемого в PPC из PEP. Биосинтез L-треонина ингибируется при наличии в среде глюкозы в относительно высокой концентрации по сравнению с темпом бактериального роста и суммарной скоростью цикла трикарбоновых кислот. В данной ситуации экспрессия ppc-гена супрессируется, а экспрессия гена, кодирующего PEP-карбоксикиназу (в дальнейшем именуемую просто "pckA"), катализирующую преобразование ОАА в PEP, повышается. Повышенные уровни pckA приводят к образованию в качестве предшественника биосинтеза аминокислоты PEP из ОАА, где из данного PEP синтезируются другие побочные продукты (Goldie H. Medina V., Mol. Gen. Genet., 220(2):191-196, 1990; Dang et al., E. coli and Salmonella, 1:191-102, 1996). По этой причине pckA-ген необходимо существенно инактивировать с целью получения большого количества L-треонина путем увеличения интенсивности метаболических путей, ответственных за синтез L-треонина.
С другой стороны, известно несколько путей деградации L-треонина, которые включают в себя следующие три пути. Первый включает в себя путь, инициируемый треониндегидрогеназой, производящий α-амино-β-кетобутират. Полученный α-амино-β-кетобутират преобразуется в ацетил-КоА и глицин или же спонтанно распадается до аминоацетона, который преобразуется в пируват. Второй путь связан с треониндегидратазой, производящей α-кетобутират, который в последующем катаболизируется до пропионил-КоА и, в конечном счете, до промежуточного соединения цикла трикарбоновых кислот - сукцинил-КоА. Третий путь использует треонинальдолазу (Neidhardt F.C. et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM press. Washington DC, pp.369-370). Из них треониндегидратаза представляет собой оперон, который экспрессируется при гипоксии и высоком уровне треонина.
В настоящем изобретении с помощью метода генетической рекомбинации (Корейская патентная заявка № 2002-015380) создан микроорганизм с улучшенной продуктивностью L-треонина в результате специфической инактивации данного гена-оперона (tdcBC).
С другой стороны, в Международной патентной публикации № WO 02/29080 A2 раскрыт способ получения L-треонина с использованием дефектного по pckA-гену микроорганизма, который получают путем введения в штамм микроорганизма дикого типа рекомбинантного вектора, несущего частично делетированный pckA-ген. Однако при использовании указанного микроорганизма остается открытым вопрос об образовании L-треонина, так как пути деградации и внутриклеточного поступления синтезируемого L-треонина все еще активированы в данном микроорганизме.
При осуществлении настоящего изобретения его авторы с целью решения проблем, имеющихся в прототипе, выполнили интенсивное и основательное исследование способов получения микроорганизмов, способных продуцировать большое количество L-треонина даже при их выращивании в среде с высокой концентрацией глюкозы и без деградации производимого L-треонина, и установили, что когда хромосомный pckA-ген данного микроорганизма инактивируется с помощью метода генетической рекомбинации, то микроорганизм с разрушенным tdcBC-опероном, созданный авторами настоящего изобретения, обладает повышенной продуктивностью L-треонина по сравнению с традиционно используемыми микроорганизмами, продуцирующими L-треонин.
По этой причине цель настоящего изобретения заключается в создании микроорганизма, способного эффективно продуцировать большое количество L-треонина.
Краткое изложение сущности изобретения
Для того чтобы осуществить вышеуказанную цель, в настоящем изобретении создали новый штамм E. coli, который содержит в хромосоме инактивированные гены tdcBC и pckA.
У штамма E. coli с инактивированными tdcBC/pckA-генами pckA-ген инактивируют путем введения фрагмента чужеродного pckA-гена, содержащего ген устойчивости к антибиотику и сайт связывания сайт-специфической рекомбиназы на каждом из его концов, в штамм E. coli, содержащий оперон tdcBC, ассоциированный с деградацией L-треонина, который инактивируется, а затем проводили гомологическую рекомбинацию между фрагментом чужеродного pckA-гена и pckA-геном хромосомы для инактивации данного хромосомного pckA-гена.
Кроме того, в настоящем изобретении разработан способ получения L-треонина с использованием штамма E. coli с инактивированным tdcBC/pckA-геном.
Краткое описание чертежей
Вышеуказанные и иные цели, характеристики и другие преимущества настоящего изобретения станут более понятными из нижеследующего подробного описания вместе с иллюстрируемыми чертежами, в которых
на фиг.1 схематически изображена технология клонирования pckA-гена;
на фиг.2 схематически изображена технология получения рекомбинантного микроорганизма, в который введен фрагмент pckA-гена, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу (cat) и loxP-сайты, ΔpckA::loxpcat; и
на фиг.3 представлена фотография, изображающая результаты Саузерн-блоттинга, в котором идентифицирован ген устойчивости к хлорамфениколу (cat), встроенный в pckA-ген хромосомы штамма E. coli, продуцирующего L-треонин (дорожка 1: рекомбинантный штамм, отобранный в присутствии хлорамфеникола в соответствии с настоящим изобретением; дорожка 2: родительский штамм TRN212 и дорожка 3: маркер молекулярных масс).
Подробное описание изобретения
Штамм E. coli, который содержит ассоциированный с деградацией L-треонина оперон, специфически инактивируемый с помощью генетической рекомбинации и обладающий повышенной продуктивностью L-треонина вследствие инактивации данного оперона, можно использовать в качестве родительского штамма в настоящем изобретении. Предпочтительный родительский штамм представляет собой штамм E. coli TRN212 (инвентарный номер: KCCM-10353; Корейская патентная заявка № 2002-015380), который создан в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение характеризуется получением нового штамма E. coli, продуцирующего большое количество и высокий выход L-треонина в результате инактивирования pckA-гена, вовлеченного в ингибирование синтеза L-треонина в родительском штамме E. coli, содержащем ассоциированный с деградацией L-треонина инактивированный оперон (tdcBC). Инактивация обоих генов, tdcBC и pckA, ведет к предотвращению деградации и внутриклеточного поступления L-треонина, опосредуемого продуктами трансляции tdcBC-оперона, и ингибированию синтеза L-треонина, опосредуемого трансляционным продуктом pckA-гена, и приводит к получению большого количества L-треонина.
Следовательно, в настоящем изобретении создан штамм E. coli с инактивированным геном tdcBC/pckA, который получают путем введения фрагмента чужеродного pckA-гена, включающего в себя ген устойчивости к антибиотику, имеющий сайт связывания сайт-специфической рекомбиназы на каждом из его концов в штамме E. coli, содержащем ассоциированный с деградацией L-треонина оперон tdcBC, который инактивирован, а затем предусматривая гомологическую рекомбинацию между фрагментом чужеродного и содержащегося в хромосоме pckA-гена для инактивации хромосомного pckA-гена.
Кроме того, pckA-ген на хромосоме родительского штамма E. coli инактивируют при удалении встроенного в хромосомный pckA-ген гена устойчивости к антибиотику путем активации сайт-специфической рекомбиназы, экспрессируемой в данном бактериальном штамме, и наличия одной копии связывающего сайта сайт-специфической рекомбиназы в хромосомном pckA-гене.
Инактивирование pckA-гена бактериальной хромосомы осуществляют путем гомологической рекомбинации с фрагментом чужеродного pckA-гена. Фрагмент чужеродного pckA-гена инактивируют путем встраивания в него гена устойчивости к антибиотику. Этот инактивированный фрагмент чужеродного pckA-гена вводят в родительский штамм E. coli, после чего происходит двойная перекрестная рекомбинация между pckA-геном бактериальной хромосомы и фрагментом чужеродного pckA-гена для инактивирования pckA-гена бактериальной хромосомы. Присутствие гена устойчивости к антибиотику в чужеродном инактивируемом pckA-гене облегчает селекцию клеток с инактивируемым pckA-геном.
Неограничивающие примеры гена устойчивости к антибиотику, используемого для инактивации pckA-гена, включают в себя ген устойчивости к хлорамфениколу, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к гентамицину и ген устойчивости к ампициллину.
С другой стороны, после селекции штамма E. coli с инактивируемым pckA-геном дают возможность экспрессироваться сайт-специфической рекомбиназе для удаления устойчивого к антибиотику гена, встроенного в бактериальную хромосому. То есть ген устойчивости к данному антибиотику встраивают в pckA-ген бактериальной хромосомы вместе со связывающими сайтами сайт-специфической рекомбиназы и удаляют путем активации сайт-специфической рекомбиназы, экспрессируемой в бактериальном штамме. Примеры такой сайт-специфической рекомбиназы включают в себя, без ограничения, сайты связывания FLP, Cre и XerC/D. Удаление гена устойчивости к данному антибиотику позволяет вновь использовать тот же ген устойчивости к данному антибиотику в качестве селективного маркера, если необходимо инактивировать другой ген идентичного бактериального штамма.
Для того чтобы инактивировать хромосомный pckA-ген, в настоящем изобретении используют фрагмент, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу, каждый конец которого присоединен к loxP-сайту. Этот loxP-сайт распознается сайт-специфической рекомбиназой Cre. В результате активизации рекомбиназы Cre, экспрессируемой в штамме E. coli, ген устойчивости к антибиотику, расположенный между двумя loxP-сайтами, удаляется из бактериальной хромосомы.
Экспрессию рекомбиназы Cre в штамме E. coli можно осуществить известным в данной области техники способом. В настоящем изобретении плазмиду pJW168, несущую cre-ген, встраивают в штамм E. coli для экспрессии в нем Cre-фермента.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неполный pckA-ген амплифицируют с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК, выделенную из продуцирующего L-треонин штамма E. coli, включающего в себя инактивированный tdcBC-оперон. Амплифицированный неполный pckA-ген клонируют в pT7Blue-вектор (Novagen Co.), получая таким образом рекомбинантный вектор pT7Blue/pckA, содержащий неполный pckA-ген. Кроме того, из ploxpcat2-плазмиды (Betriz Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000) получают ДНК-фрагмент loxpcat2, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу и loxP-сайты и лигируют с NruI-обработанной pT7Blue/pckA, создавая таким образом рекомбинантную плазмиду pT7ΔpckA::loxpcat, содержащую фрагмент pckA-гена, включающий в себя ген устойчивости к хлорамфениколу и loxP-сайты. Следовательно, в настоящем изобретении создают, как показано выше, рекомбинантную плазмиду pT7ΔpckA::loxpcat.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент pckA-гена, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу, каждый конец которого присоединен к loxP-сайту, встраивают в штамм E. coli TRN212, содержащий tdcBC-оперон, который инактивируют путем гомологической рекомбинации с использованием устойчивого к канамицину гена, имеющего на каждом из двух его концов loxP-сайт. Затем осуществляют гомологическую рекомбинацию между pckA-геном бактериальной хромосомы и фрагментом чужеродного pckA-гена, содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу и loxP-сайты, создавая таким образом рекомбинантный штамм E. coli, содержащий tdcBC-ген и инактивированный pckA-ген хромосомы. Указанный рекомбинантный штамм E. coli был обозначен "FTR2717" и депонирован в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (KCCM) 20 марта 2003 г. под инвентарным номером KCCM-10475.
Рекомбинантный штамм E. coli FTR2717 обнаруживает следующие характеристики:
(1) по сравнению со штаммом дикого типа он обладает устойчивостью к аналогам треонина, аналогам лизина, аналогам изолейцина и аналогам метионина;
(2) его хромосома содержит эндогенный ppc-ген и эндогенный треониновый оперон, содержащий гены thrA, thrB и thrC, а также одну или несколько копий экзогенного ppc-гена и экзогенные гены thrA, thrB и thrC;
(3) он включает в себя инактивированный ген-оперон tdcBC, участвующий в деградации L-треонина; и
(4) он включает в себя инактивированный pckA-ген, вовлеченный в ингибирование синтеза L-треонина, и поэтому он производит большое количество L-треонина при высокой концентрации глюкозы в среде.
Лучшего понимания настоящего изобретения можно добиться с помощью нижеследующих примеров, которые представлены для иллюстрации и не должны рассматриваться в качестве ограничения настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1: Клонирование pckA-гена
Получен рекомбинантный вектор, несущий pckA-ген (см. фиг.1). Вначале из штамма E. coli TRN212 (инвентарный номер: KCCM-10353), включающего в себя tdcBC-оперон и продуцирующего L-треонин (QIAGEN Co.), выделяют с использованием QIAGEN Genomic-tip system бактериальную геномную ДНК. Используя выделенную геномную ДНК в качестве матрицы, осуществляют ПЦР для амплификации неполной, около 1,5 т.п.н., области pckA-гена. В данной ПЦР используют набор праймеров, состоящий из прямого и обратного праймера, представленных соответственно в SEQ ID NO: 1 и 2. Условия ПЦР включают 30 циклов денатурации при 94°C в течение 30 сек, отжига при 55°C в течение 30 сек и удлинения при 72°C в течение 1 мин 30 сек.
Полученные продукты ПЦР подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, после чего из геля вырезают полосу в 1,5 т.п.н. Из этой вырезанной полосы путем очистки выделяют 1,5 т.п.н. ДНК-фрагмент с использованием набора DNA Gel Purification Kit (QIAGEN Co.) и клонируют его в EcoRV-обработанный pT7Blue-вектор (Novagen Co.) путем лигирования по тупым концам при 16°C, создавая таким образом рекомбинантный вектор pT7Blue/pckA, содержащий неполный pckA-ген. Затем c помощью вектора pT7Blue/pckA штамм E. coli NM522 трансформируют и наносят мазком на твердую среду (LB: 1% NaCl, 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта), содержащую ампициллин (100 мг/л), с последующей инкубацией в течение ночи при 37°C. Выращенные на твердой среде колонии инокулируют в 3 мл жидкой среды, содержащей ампициллин, с последующей инкубацией в течение ночи при 37°C. С использованием набора QIAGEN mini prep kit (QIAGEN Co.) из культивированных бактерий выделяют плазмидную ДНК и исследуют ее размер. Кроме того, ориентацию pckA-гена определяют с помощью Nrul и Stul рестрикционного картирования. После этого плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазой Nrul и подвергают электрофорезу в 0,7% агарозном геле. Из этого геля вырезают полосу размером около 4,3 т.п.н., и из вырезанной полосы путем очистки выделяют фрагмент 4,3 т.п.н.
ПРИМЕР 2: Конструирование рекомбинантного вектора, несущего инактивируемый pckA-ген, и получение штамма E. coli с инактивированным pckA-геном.
2-1) Конструирование рекомбинантного вектора, несущего инактивируемый pckA-ген.
1,2 т.п.н. loxpcat-фрагмент, который содержит устойчивый к хлорамфениколу ген, имеющий loxP-сайт на каждом конце, получают путем обработки рестриктазой HincII плазмиды ploxpcat2 (плазмиды, несущей устойчивый к хлорамфениколу ген, имеющий на своих концах loxP-сайты; Beatriz Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000, Professor G. Gosset, University of Mexico). Полученный ДНК-фрагмент в 1,2 т.п.н. лигируют с Nrul-обработанной pT7Blue/pckA, полученной в примере 1 путем лигирования по тупым концам, создавая таким образом рекомбинантный вектор pT7ΔpckA::loxpcat длиной почти в 5,7 т.п.н. и содержащий инактивированный pckA-ген (см. фиг.2).
2-2) Получение штамма E. coli с инактивированным pckA-геном.
Рекомбинантный вектор pT7ΔpckA::loxpcat, полученный в примере 2-1), встраивают в штамм E. coli NM522. Данный трансформированный штамм NM522 наносят мазком на твердую среду (LB: 1% NaCl, 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта), содержащую ампициллин и хлорамфеникол, с последующей инкубацией в течение ночи при 37°C. Выращенные на данной среде колонии инокулируют в 3 мл жидкой среды, содержащей ампициллин и хлорамфеникол, с последующей инкубацией в течение ночи при 37°C. Из данной бактериальной культуры с использованием набора QIAGEN mini prep kit выделяют плазмидную ДНК и исследуют ее размер, а также ориентацию встроенного pckA-гена. После этого плазмидную ДНК подвергают двойной обработке с помощью PstI и KpnI и электрофорезу в 0,7% агарозном геле. Из геля вырезают полосу в 2,7 т.п.н. и из этой полосы путем очистки выделяют фрагмент размером 2,7 т.п.н.(ΔpckA::loxpcat).
Полученный фрагмент pckA-гена, ΔpckA::loxpcat, содержащий устойчивый к хлорамфениколу ген, имеющий на своих концах loxP-сайты, встраивают путем электропорации в продуцирующий L-треонин штамм E. coli TRN212 (инвентарный номер: KCCM-10353). Затем трансформированный штамм TRN212 наносят мазком на твердую среду, содержащую хлорамфеникол, чтобы отобрать только устойчивые к хлорамфениколу клетки, получая в результате селекции клетки, в которых хромосомный pckA-ген замещен фрагментом чужеродного pckA-гена (ΔpckA::loxpcat). С помощью Саузерн-блот-анализа в соответствии с таким же способом, что и в нижеприведенном экспериментальном примере 1, определяют, действительно ли в отобранных клонах специфически разрушен хромосомный pckA-ген.
Отобранные клоны, идентифицированные с помощью Саузерн-блот-анализа на наличие специфически разрушенного в хромосоме pckA-гена, трансформируют pJW168-плазмидой (подарок от Prof. Guillermo Gosset из Университета в Мехико), которая содержит cre-ген, кодирующий сайт-специфическую рекомбиназу, распознающую loxP-сайты. Эти трансформированные клетки культивируют в течение ночи в культуральной среде, содержащей 10 мМ L-арабинозы, для удаления устойчивого к хлорамфениколу гена, встроенного в искомую бактериальную хромосому. Затем культуральную жидкость 107-кратно разбавляют и наносят мазком на твердую среду LB с добавлением ампициллина (100 мг/л) с последующей инкубацией в течение ночи при 30°C. Каждую из 100 колоний, выращенных на твердой среде, инокулируют в две 3 мл порции жидкой среды LB, содержащей или не содержащей ампициллин, с последующей инкубацией в течение ночи при 30°C. Определяют колонии, которые погибли в среде, содержащей хлорамфеникол, но выжили в среде, не содержащей хлорамфеникола. При проведении такой селекции отбирают лишь те клоны, которые имеют делецию по устойчивому к хлорамфениколу гену.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1: Оценка разрушения в хромосоме pckA-гена с помощью Саузерн-блоттинга.
Штамм TRN212 в качестве родительского штамма и один из хлорамфеникол-устойчивых клонов, отобранных в примере 2-2), культивируют в течение ночи в 3 мл жидкой среды, содержащей хлорамфеникол (15 мг/л). Затем с использованием набора QIAGEN genomic kit 20 из культуры клеток выделяют геномную ДНК и обрабатывают ее в течение ночи с помощью EcoRV. Полученные в результате ДНК-фрагменты разделяют по их размеру в 0,7% агарозном геле. После электрофореза разделенные ДНК-фрагменты переносят на найлоновую мембрану (Biodyne B membrane, Young Sci.) в течение ночи путем капиллярного переноса (Molecular Cloning, Vol. 1, pp.6.31-6.38). Мембрану высушивают и затем экспонируют в УФ-свете (120 mJ/cm2 SpectroLinker™) для иммобилизации ДНК-фрагментов в данной мембране (Molecular Cloning, Vol. 1, pp.6.45). Полученную мембрану инкубируют в прегибридизационном растворе I (Roche #1093657) при 55°C в течение 2 ч и гибридизуют с денатурированным ДНК-зондом в термостате для гибридизации (BAMBINO 230300) при 55°C.
ДНК-зонд готовят следующим образом. Вначале, с использованием набора QIAGEN, выделяют плазмиду ploxpcat2 и обрабатывают ее с помощью HincII для получения ДНК-фрагмента (около 1,2 т.п.н.), содержащего устойчивый к хлорамфениколу ген, имеющий loxP-сайт на каждом из обоих концов. Выделенный 1,2 т.п.н. фрагмент кипятят в воде в течение 5 мин и быстро охлаждают на льду, получая таким образом одноцепочечную ДНК. Полученную одноцепочечную ДНК метят DIG-UDP, используя набор DIG Labeling and Detection Kit (Roche #1093657), путем инкубации в течение ночи при 37°C.
После гибридизации мембрану отмывают с помощью отмывочных растворов I и II (Roche #1093657) для удаления неспецифически связавшихся ДНК-молекул. Эту отмытую мембрану инкубируют в прегибридизационном растворе II (Roche #1093657) при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем при комнатной температуре в течение 30 мин подвергают взаимодействию с анти-DIG-антителом, специфически связывающимся с DIG-UTP. Мембрану отмывают с помощью отмывочного раствора III (Roche #1093657) для удаления неспецифически связавшихся анти-DIG-антител и с помощью набора Labeling and Detection Kit (Roche #1093657)проявляют при комнатной температуре до появления видимых полос. Полученные результаты представлены на фиг.3.
Как показано на фиг.3, в случае родительского штамма TRN212 полоса не детектируется (дорожка 2), поскольку штамм TRN212 не содержит устойчивого к хлорамфениколу гена. Напротив, хлорамфениколустойчивый клон, отобранный в соответствии с настоящим изобретением, обнаруживает полосу около 3,6 т.п.н. (дорожка 1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что соответствующие селективные клоны содержат на своей хромосоме устойчивый к хлорамфениколу ген.
ПРИМЕР 3: Сравнение селективных клонов, продуцирующих L-треонин, при их культивировании в колбах Эрленмейера.
Среди окончательно отобранных рекомбинантных клонов E. coli из примера 2-2), в которых был удален встроенный устойчивый к хлорамфениколу ген, тридцать клонов оказались продуктивными в отношении L-треонина. Каждый из них культивируют в колбе Эрленмейера, содержащей культуральную среду, приготовленную в соответствии с составом, представленным ниже в таблице 1. Затем для каждой культуральной жидкости определяют выход L-треонина. Вкратце, после выращивания на твердой LB-среде при 32°C каждого из тридцати клонов одиночную колонию каждого клона инокулируют одной петлей в 25 мл указанной культуральной среды и культивируют при 32°C и 250 об/мин в течение 48 ч. После центрифугирования каждой культуральной жидкости полученный супернатант разбавляют дистиллированной водой в 250 раз. Концентрацию L-треонина в таком разбавленном супернатанте измеряют с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.
| ТАБЛИЦА 1 | |
| Питательные вещества | Количество на 1 л |
| Глюкоза | 70 г |
| Сульфат аммония | 28 г |
| KH2PO4 | 1,0 г |
| MgSO4·7H2O | 0,5 г |
| FeSO4·7H2O | 5 мг |
| MnSO4·8H2O | 5 мг |
| Карбонат кальция | 30 г |
| L-метионин | 0,15 г |
| Дрожжевой экстракт | 2 г |
| рН (7,0) | |
| ТАБЛИЦА 2 | ||||
| Число клонов | 2 | 5 | 14 | 9 |
| Выход L-треонина (г/л) | 20-23 | 23-24,5 | 24,5-26 | >26 |
В родительском штамме TRN212 выход L-треонина составляет 23 г/л. Как показано в таблице 2, из тридцати протестированных клонов двадцать восемь обнаруживают лучшую продуктивность по L-треонину, чем родительский штамм TRN212. В частности, девять клонов демонстрируют выход L-треонина, превышающий 26 г/л, что примерно на 13,04% выше, чем выход в родительском штамме TRN212. Из тридцати клонов был отобран один клон с наивысшим выходом L-треонина (более 26 г/л) и обозначен как "FTR2717 (инвентарный номер: KCCM-10475)".
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Как указано выше, в настоящем изобретении создан микроорганизм с инактивированным pckA-геном, который получают путем встраивания устойчивого к антибиотику гена в хромосомную ДНК родительского штамма E. coli, продуцирующего высокие уровни L-треонина, а именно штамма E. coli, содержащего участвующий в деградации L-треонина tdcBC-оперон, который инактивируется при осуществлении процедуры рекомбинации ДНК.
Так как собственный хромосомный tdcBC-оперон инактивируется, данный микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением обладает действием, предотвращающим деградацию и внутриклеточное поступление L-треонина. Кроме того, вследствие инактивации pckA-гена, участвующего в ингибировании синтеза L-треонина, микроорганизм согласно изобретению обладает более действенными путями биосинтеза L-треонина. По этой причине микроорганизм согласно изобретению пригоден для массового производства L-треонина, так как он может в большом количестве и с высоким выходом производить L-треонин даже в присутствии высоких концентраций глюкозы.
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмида pT7ΔpckA::loxpcat, обеспечивающая синтез L-треонина в клетках Escherichia coli и содержащая фрагмент pckA-гена, который включает в себя устойчивый к хлорамфениколу ген и loxP-сайты, которая получена путем клонирования неполного pckA-гена в рТ7Blue-вектор с образованием рТ7Blue/pckA-плазмиды, обработки ее NruI и лигирования с loxpcat-ДНК-фрагментом, полученным из plохрсat2-плазмиды и содержащим устойчивый к хлорамфениколу ген и loxpcat2-сайты.
2. Штамм Escherichia coli FTR2717 (КССМ-10475) - продуцент L-треонина, трансформированный рекомбинантной плазмидой по п.1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2003-0021458 | 2003-04-04 | ||
| KR10-2003-0021458A KR100498971B1 (ko) | 2003-04-04 | 2003-04-04 | 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005134209A RU2005134209A (ru) | 2006-03-20 |
| RU2339699C2 true RU2339699C2 (ru) | 2008-11-27 |
Family
ID=36117119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005134209/13A RU2339699C2 (ru) | 2003-04-04 | 2004-04-02 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7485450B2 (ru) |
| EP (1) | EP1611232B1 (ru) |
| JP (1) | JP4334565B2 (ru) |
| KR (1) | KR100498971B1 (ru) |
| CN (1) | CN100372927C (ru) |
| AT (1) | ATE455844T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004225550B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0409192A (ru) |
| DE (1) | DE602004025218D1 (ru) |
| ES (1) | ES2338555T3 (ru) |
| HU (1) | HUP0501100A3 (ru) |
| MX (1) | MXPA05010725A (ru) |
| PL (1) | PL380072A1 (ru) |
| RU (1) | RU2339699C2 (ru) |
| SK (1) | SK1192005A3 (ru) |
| WO (1) | WO2004087895A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200507688B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| KR100858913B1 (ko) * | 2007-03-09 | 2008-09-17 | 한국과학기술원 | 부위특이적 변이에 의해 제조된 고수율의 ｌ－쓰레오닌생산균주 및 이를 이용한 ｌ－쓰레오닌의 제조방법 |
| KR101608734B1 (ko) | 2014-03-21 | 2016-04-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 |
| CN116606785A (zh) * | 2022-02-08 | 2023-08-18 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其应用与构建方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU875663A1 (ru) * | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| WO1995006114A1 (fr) * | 1993-08-24 | 1995-03-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Allele de phosphenolpyruvate carboxylase, gene de cet allele et procede de production de l'acide amine |
| DE4400926C1 (de) * | 1994-01-14 | 1995-06-01 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
| KR20010006976A (ko) | 1999-04-09 | 2001-01-26 | 김대훈 | 홍채인식시스템 |
| DE19950409A1 (de) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Degussa | Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| EP1320626B1 (en) * | 2000-09-30 | 2009-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Fermentation process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
| KR100397423B1 (ko) * | 2001-02-13 | 2003-09-13 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| DE10144493A1 (de) * | 2001-09-11 | 2003-07-03 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coyneformer Bakterien |
| KR100451299B1 (ko) * | 2002-03-21 | 2004-10-06 | 씨제이 주식회사 | Ｌ―쓰레오닌의 제조방법 |
| KR100505797B1 (ko) * | 2002-10-11 | 2005-08-04 | 씨제이 주식회사 | 염색체 상의 ｆａｄＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 변이 미생물과 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| DE102004049692A1 (de) | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Siemens Ag | Vorrichtung zum Umschalten eines Telekommunikations-Endgerätes, Verwendungen und Verfahren |
-
2003
- 2003-04-04 KR KR10-2003-0021458A patent/KR100498971B1/ko active IP Right Grant
-
2004
- 2004-04-02 WO PCT/KR2004/000778 patent/WO2004087895A1/en active Application Filing
- 2004-04-02 BR BRPI0409192-2A patent/BRPI0409192A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-04-02 EP EP04725555A patent/EP1611232B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 AU AU2004225550A patent/AU2004225550B2/en not_active Expired
- 2004-04-02 HU HU0501100A patent/HUP0501100A3/hu unknown
- 2004-04-02 AT AT04725555T patent/ATE455844T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-02 US US10/817,044 patent/US7485450B2/en active Active
- 2004-04-02 CN CNB2004800086929A patent/CN100372927C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 DE DE602004025218T patent/DE602004025218D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-02 ES ES04725555T patent/ES2338555T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 SK SK119-2005A patent/SK1192005A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2004-04-02 JP JP2006500668A patent/JP4334565B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 MX MXPA05010725A patent/MXPA05010725A/es active IP Right Grant
- 2004-04-02 RU RU2005134209/13A patent/RU2339699C2/ru active
- 2004-04-02 PL PL380072A patent/PL380072A1/pl not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-09-23 ZA ZA200507688A patent/ZA200507688B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1768132A (zh) | 2006-05-03 |
| MXPA05010725A (es) | 2005-12-15 |
| US20040241831A1 (en) | 2004-12-02 |
| JP2006521789A (ja) | 2006-09-28 |
| US7485450B2 (en) | 2009-02-03 |
| SK1192005A3 (sk) | 2006-03-02 |
| PL380072A1 (pl) | 2006-12-27 |
| HUP0501100A3 (en) | 2010-01-28 |
| AU2004225550B2 (en) | 2006-09-28 |
| KR100498971B1 (ko) | 2005-07-04 |
| ES2338555T3 (es) | 2010-05-10 |
| EP1611232B1 (en) | 2010-01-20 |
| CN100372927C (zh) | 2008-03-05 |
| EP1611232A4 (en) | 2006-08-23 |
| BRPI0409192A (pt) | 2006-04-11 |
| WO2004087895A1 (en) | 2004-10-14 |
| EP1611232A1 (en) | 2006-01-04 |
| AU2004225550A1 (en) | 2004-10-14 |
| ATE455844T1 (de) | 2010-02-15 |
| RU2005134209A (ru) | 2006-03-20 |
| HUP0501100A2 (en) | 2007-06-28 |
| ZA200507688B (en) | 2006-09-27 |
| KR20040087188A (ko) | 2004-10-13 |
| JP4334565B2 (ja) | 2009-09-30 |
| DE602004025218D1 (de) | 2010-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2207376C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) | |
| ES2392825T3 (es) | Bacteria productora de L-treonina que pertenece al género Escherichia y método para producir L-treonina | |
| JP4427878B2 (ja) | 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| ES2382473T3 (es) | Procedimiento de producción de L-treonina usando un microorganismo que tiene el gen galR inactivado | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| JP4599726B2 (ja) | Ｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| US20130040347A1 (en) | Escherichia coli strain with enhanced l-threonine productivity and method of producing l-threonine using the same | |
| RU2288265C2 (ru) | Способ получения l-треонина | |
| WO2018077159A1 (zh) | 氨基酸衰减子的改造方法及其在生产中的应用 | |
| JP4599725B2 (ja) | Ｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| RU2339699C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА | |
| JP2005080659A (ja) | Ｌ−スレオニンの生産方法 | |
| KR100596372B1 (ko) | 염색체 상의 ｌｙｓＲ유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌생성 미생물, 그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 | |
| KR20050079343A (ko) | ｔｙｒＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 | |
| BamHI | S kkkk I |