SK1192005A3 - Kmeň Escherichia coli, spôsob výroby L-treonínu použitím kmeňa Escherichia coli a rekombinantný plazmid pT7DeltapckA::loxpcat - Google Patents
Kmeň Escherichia coli, spôsob výroby L-treonínu použitím kmeňa Escherichia coli a rekombinantný plazmid pT7DeltapckA::loxpcat Download PDFInfo
- Publication number
- SK1192005A3 SK1192005A3 SK119-2005A SK1192005A SK1192005A3 SK 1192005 A3 SK1192005 A3 SK 1192005A3 SK 1192005 A SK1192005 A SK 1192005A SK 1192005 A3 SK1192005 A3 SK 1192005A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- threonine
- pcka
- gene
- inactivated
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 156
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 17
- 101150088738 pckA gene Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 101150067708 pckG gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 28
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 28
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 14
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004941 influx Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 4
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 4
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BCDGQXUMWHRQCB-UHFFFAOYSA-N aminoacetone Chemical compound CC(=O)CN BCDGQXUMWHRQCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- SAUCHDKDCUROAO-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-oxobutanoic acid Chemical compound CC(=O)C(N)C(O)=O SAUCHDKDCUROAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002667 Glycine hydroxymethyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- SAUCHDKDCUROAO-VKHMYHEASA-N L-2-amino-3-oxobutanoic acid Chemical compound CC(=O)[C@H](N)C(O)=O SAUCHDKDCUROAO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010043075 L-threonine 3-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka mikroorganizmu, ktorý produkuje L-treonín a spôsobu výroby L-treonínu použitím tohto mikroorganizmu. Konkrétnejšie sa predložený vynález týka mikroorganizmu, ktorý obsahuje inaktivovaný tak tdcBC, ako aj pckA gén na chromozóme, a má značne zlepšenú produktivitu L-treonínu vďaka inaktivácii týchto dvoch génov, a spôsobu výroby L-treonínu použitím takéhoto mikroorganizmu.
Doterajší stav techniky
L-treonín je známy ako esenciálna aminokyselina, ktorá sa široko používa ako aditívum do živočíšnych krmív a do potravín, a ako živočíšny rastový stimulátor, ako aj zložka medicínskych vodných roztokov a iných surovín pre medicínske produkty. L-treonín v súčasnosti vyrába len päť spoločností vo vyspelých krajinách, vrátane Ajinomoto Company v Japonsku, a je dva až trikrát drahší ako lyzín, o ktorom je známe, že je veľmi cenný vďaka jeho vysokej cene 5000 až 6000 dolárov za tonu na medzinárodnom trhu. Takže L-treonín má na svetovom trhu vysoký rastový potenciál.
L-treonín sa v súčasnosti vyrába len mikrobiálnymi fermentačnými technikami, najmä použitím mutantov odvodených zo štandardných mikroorganizmov, vrátane Escherichia coli, rodu Corynebacterium, rodu Brevibacterium, rodu Serratia a rodu Providencia. Príklady týchto mutantov zahŕňajú mutanty rezistentné voči aminokyselinovým analógom alebo liečivám, a ich auxotrofy na kyselinu diaminopimelovú, metionín, lyzín a izoleucín (japonská zverejnená prihláška vynálezu č. Heisei 2-219582; kórejská prihláška vynálezu č. 1998-32951; Appl. Microbiol. Biotechnol, 29:550-553, 1988). Avšak takéto mutantné kmene sú nevýhodné pretože majú nízku produktivitu L-treonínu a rastú len v médiách obohatených o drahú kyselinu diaminopimelovú alebo izoleucín,
-2keďže sú auxotrofné na kyselinu diaminopimelovú alebo izoleucín. Takže v prípade použitia mutantu vyžadujúceho pre rast kyselinu diaminopimelovú, vyžaduje táto fermentatívna produkcia L-treonínu vysoké náklady. Podobne, v prípade použitia izoleucínového auxotrofa, musí byť fermentačné médium pre tohto auxotrafa obohatené o nákladný izoleucín, čo vedie k zvýšeným produkčným nákladom pre L-treonín.
Tieto problémy je možné prekonať využitím izoleucínového presakujúceho mutantu, ako je opísaný v kórejskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 92-8365, ktorý nepotrebuje izoleucín v médiu a produkuje vyššie hladiny L-treonínu ako známe kmene. Avšak táto klasická mutačná metóda je aj časovo náročná a neefektívna pri selektovaní nových bakteriálnych kmeňov schopných produkovať vysoké hladiny L-treonínu a jej najväčšou nevýhodou je to, že zlepšovanie produktivity L-treonínu je pri nej limitované.
Vzhľadom na to boli namiesto využívania auxotrofov vyvinuté iné spôsoby masovej produkcie L-treonínu, ktoré využívajú rekombinantné L-treonín produkujúce mikroorganizmy, ktoré majú zvýšenú aktivitu enzýmov podieľajúcich sa na biosyntéze L-treonínu prostredníctvom techník metabolického inžinierstva. To znamená, že gény zodpovedajúce enzýmom podieľajúcim sa na metabolizme L-treonínu sa izolujú použitím genetických rekombinantných techník, klonujú sa do vhodných génových vehikúl a zavedú sa do mikrobiálnych mutantov, aby sa zlepšila produktivita L-treonínu týmito mutantami.
Pôvodcovia predloženej prihlášky vynálezu predtým vyvinuli spôsob vývoja kmeňa produkujúceho L-treonín použitím techník metabolického inžinierstva, ako je opísaný v kórejskej prihláške vynálezu č. 2001-6976. Podrobnejšie, vysoké výťažky L-treonínu sa môžu dosiahnuť využitím rekombinantného mikroorganizmu, ktorý má na chromozóme jednu alebo viacero kópií génu kódujúceho fosfoenolpyruvát karboxylázu (tu označovanú jednoducho ako „ppc“), ktorá katalyzuje vytváranie oxaloacetátu (OAA) ako prekurzora na biosyntézu L-treonínu z fosfoenolpyruvátu (PEP), a operón obsahujúci gény kódujúce tri enzýmy podieľajúce sa na biosyntéze L-treonínu zaspartátu, aspartokináza 1-homoserín dehydrogenázu (thrA), homoserín kinázu (thrB) a treonín syntázu (thrC).
-3L-treonín sa syntetizuje z aspartátu multi-krokovou dráhou, pričom aspartát sa vytvára z OAA konvertovanom prostredníctvom PPC z PEP. Biosyntéza Ltreonínu je inhibovaná, keď je prítomná glukóza v relatívne vysokých hladinách v médiu, v porovnaní s bakteriálnou rastovou rýchlosťou a celkovou rýchlosťou TCA cyklu. V takejto situácie je ppc génová expresia suprimovaná, zatiaľ čo expresia génu kódujúceho PEP karboxykinázu (tu označovaná jednoducho ako „pckA“), katalyzujúcu konverziu OAA na PEP, je zvýšená. Zvýšené hladiny pckA vedú k vytváraniu PEP z OAA, ako prekurzora aminokyselinovej biosyntézy, pričom z PEP sa syntetizujú ďalšie vedľajšie produkty (Goldie H. Medina V., Mol. Gen. Genet. 220(2):191-196, 1990; Dang a ďalší, E.coli and Salmonella, 1:191102, 1996). Preto by pckA gén mal byť v podstate inaktivovaný, aby sa produkoval L-treonín vo vysokých hladinách, prostredníctvom zrýchlenia toku metabolických dráh zodpovedných za syntézu L-treonínu.
Na druhej strane je známych niekoľko dráh L-treonínovej degradácie, ktoré zahŕňajú nasledujúce tri dráhy. Jednou je dráha iniciovaná treonín dehydrogenázou, ktorej výťažkom je a-amino-3-ketobutyrát. a-Amino-βketobutyrát sa buď konvertuje na acetyl-CoA a glycín, alebo spontánne degraduje na aminoacetón, ktorý sa konvertuje na pyruvát. Druhá dráha zahŕňa treonín dehydratázu, ktorej výťažkom je α-ketobutyrát, ktorý sa ďalej katabolizuje na propionyl-CoA a nakoniec na medziprodukt TCA cyklu, sukcinyl-CoA. Tretia dráha využíva treonín aldolázu (Neidhardt F.C. a ďalší, Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2. vyd. ASM press. Washington DC, str. 369-370). Spomedzi nich je treonín dehydratáza operón, ktorý sa exprimuje pri hypoxii a pri vysokých hladinách treonínu. Pôvodcovia predloženého vynálezu vyvinuli mikroorganizmus so zlepšenou produktivitou L-treonínu prostredníctvom špecifickej inaktivácie tohto operónového génu (tdcBC) prostredníctvom genetickej rekombinačnej techniky (kórejská prihláška vynálezu č. 2002-015380).
Na druhej strane medzinárodná zverejnená prihláška vynálezu č. WO
02/29080 A2 opisuje spôsob výroby L-treonínu použitím mikroorganizmu s defektným pckA génom, ktorý je pripravený zavedením rekombinantného vektora nesúceho čiastočne deletovaný pckA gén do štandardného kmeňa mikroorganizmu. Avšak tento mikroorganizmus je problematický vzhľadom na
-4produkčný výťažok L-treonínu, pretože sú v ňom stále aktivované dráhy na degradáciu a intracelulárny prítok syntetizovaného L-treonínu.
Na ceste k predloženému vynálezu, pôvodcovia uskutočnili intenzívny a dôkladný výskum spôsobov prípravy mikroorganizmu schopného produkovať vysoké hladiny L-treonínu aj keď rastie v médiu obsahujúcom vysoké koncentrácie glukózy a nedegradovať produkovaný L-treonín, s cieľom vyriešiť problémy vyskytujúce sa v stave techniky, čo viedlo k zisteniu, že keď sa genetickou rekombinantnou technikou inaktivuje pckA gén, mikroorganizmus s knockoutovaným tdcBC operónom, ktorý bol vyvinutý pôvodcami predloženého vynálezu, má zlepšenú L-treonínovú produktivitu v porovnaní s bežnými mikroorganizmami produkujúcimi L-treonín.
Cieľom predloženého vynálezu je preto poskytnúť mikroorganizmus schopný efektívne produkovať vysoké hladiny L-treonínu.
Podstata vynálezu
Na dosiahnutie vyššie uvedeného cieľa predložený vynález poskytuje nový kmeň E. coli, ktorý na chromozóme obsahuje inaktivované gény tdcBC a pckA.
V E. coli kmeni s inaktivovanými tdcBC/pckA génmi je pckA gén inaktivovaný zavedením cudzieho pckA génového fragmentu, obsahujúceho gén antibiotikovej rezistencie a väzobné miesta pre miestne špecifickú rekombinázu na oboch svojich koncoch, do E. coli kmeňa obsahujúceho inaktivovaný operón tdcBC, ktorý je spojený s degradáciou L-treonínu, a umožnením homologickej rekombinácie medzi cudzím pckA génovým fragmentom a pckA génom na chromozóme, aby sa inaktivoval chromozomálny pckA gén.
Okrem toho predložený vynález poskytuje spôsob výroby L-treonínu použitím E. coli kmeňa s inaktivovanými tdcBC/pckA génmi.
Podrobný opis vynálezu
Ako rodičovský kmeň podľa predloženého vynálezu sa môže použi kmeň E. coli, ktorý obsahuje s degradáciou L-treonínu spojený operón, špecificky inaktivovaný genetickou rekombináciou, a ktorý má zlepšenú produktivitu L-5treonínu vďaka inaktivácii tohto operónu. Výhodným rodičovským kmeňom je E. coli kmeň TRN212 (prístupové číslo: KCCM-10353; kórejská prihláška vynálezu č. 2002-015380), ktorý bol vyvinutý pôvodcami predloženého vynálezu.
Predložený vynález sa vyznačuje prípravou nového E. coli kmeňa produkujúceho vysoké hladiny a vysoké výťažky L-treonínu, prostredníctvom inaktivácie pckA génu, podieľajúceho sa na inhibícii L-treonínovej syntézy, v rodičovskom E. coli kmeni, obsahujúcom inaktivovaný operón spojený s degradáciou L-treonínu (tdcBC). Inaktivácia tak génov tdcBC, ako aj génu pckA vedie k zabráneniu degradácie L-treonínu a k zabráneniu prúdenia L-treonínu do vnútra bunky, čo sú deje sprostredkúvané translačnými produktmi tdcBC operónu, a k zabráneniu inhibície L-treoninovej syntézy, ktorá je sprostredkúvaná translačným produktom pckA génu, čo vedie k vysokej úrovni produkcie Ltreonínu.
Preto predložený vynález poskytuje E. coli kmeň s inaktivovanými tdcBC/pckA génmi, ktorý je pripravený zavedením cudzieho pckA génového fragmentu, obsahujúceho gén antibiotikovej rezistencie a väzobné miesta pre miestne špecifickú rekombinázu na oboch svojich koncoch, do E. coli kmeňa obsahujúceho inaktivovaný operón tdcBC, ktorý je spojený s degradáciou Ltreonínu, a potom umožnením homologickej rekombinácie medzi cudzím pckA génovým fragmentom a pckA génom na chromozóme, aby sa inaktivoval chromozomálny pckA gén.
Okrem toho je pckA gén na chromozóme rodičovského E. coli kmeňa inaktivovaný odstránením génu antibiotikovej rezistencie, ktorý bol začlenený do chromozomálneho pckA génu prostredníctvom činnosti miestne špecifickej rekombinázy exprimovanej v bakteriálnom kmeni, a prostredníctvom prítomnosti jednej kópie väzobného miesta pre miestne špecifickú rekombinázu v chromozomálnom pckA géne.
Inaktivácia pckA génu na bakteriálnom chromozóme sa dosiahne homologickou rekombináciou s cudzím pckA génovým fragmentom. Cudzí pckA génový fragment sa inaktivuje tak, že sa doňho zavedie gén antibiotikovej rezistencie. Tento cudzí inaktivovaný pckA génový fragment sa zavedie do rodičovského E. coli kmeňa a potom sa nechá prebehnúť crossoverová
-6rekombinácia medzi pckA génom na bakteriálnom chromozóme a cudzím inaktivovaným pckA génovým fragmentom, aby sa inaktivoval pckA gén na bakteriálnom chromozóme. Prítomnosť génu antibiotikovej rezistencie v cudzom inaktivovanom pckA géne uľahčuje selekciu buniek s inaktivovaným pckA génom.
Neobmedzujúce príklady génu antibiotikovej rezistencie na použitie na inaktiváciu pckA génu zahŕňajú gén chloramfenikolovej rezistencie, gén kanamycínovej rezistencie, gén gentamycínovej rezistencie a gén ampicilínovej rezistencie.
V predloženom vynáleze sa na inaktiváciu chromozomálneho pckA génu používa pckA génový fragment obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie, ktorého oba konce sú napojené na loxP miesto. LoxP miesto je rozoznávané miestne špecifickou rekombinázou, Cre. Činnosťou Cre rekombinázy, exprimovanej v E. coli kmeni, sa z bakteriálneho chromozómu odstráni gén antibiotikovej rezistencie umiestnený medzi dvoma loxP miestami.
Expresia Cre rekombinázy v E. coli kmeni sa môže dosiahnuť spôsobom známym v oblasti. V predloženom vynáleze sa do E. coli kmeňa zavádza plazmid nesúci cre gén, pJW168, aby sa v ňom exprimoval Cre enzým.
V jednom uskutočnení predloženého vynálezu sa amplifikoval parciálny pckA gén prostredníctvom PCR, pri ktorej sa ako templát použila genomická DNA izolovaná z L-treonín produkujúceho E. coli kmeňa, obsahujúceho inaktivovaný tdcBC operón. Amplifikovaný parciálny pckA gén sa klonoval do pT7Blue vektora (Novagen Co.), čím sa získal rekombinantný vektor obsahujúci parciálny pckA gén, pT7Blue/pckA. Okrem toho sa z ploxpcatž plazmidu (Beatriz Palmeros a ďalší, Gene, 247:255-264, 2000) získal DNA fragment obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie a LoxP miesta, Ioxpcat2, a ligováI sa do pT7Blue/pckA pošitiepeného s Nrul, čím sa generoval rekombinantný plazmid obsahujúci pckA génový fragment zahŕňajúci gén chloramfenikolovej rezistencie a loxP miesta, pT7ApckA::loxpcat. Takže predložený vynález poskytuje rekombinantný plazmid, pripravený ako bolo opísané vyššie, pT7ApckA::loxpcat.
V inom uskutočnení predloženého vynálezu sa pckA génový fragment, obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie, ktorého oba konce sú napojené na loxP miesto, zaviedol do E. coli kmeňa TRN212 obsahujúceho tdcBC operón, ktorý bol inaktivovaný homologickou rekombináciou použitím génu kanamycínovej rezistencie, ktorý má na oboch svojich koncoch loxP miesto. Potom sa umožnilo uskutočnenie homologickej rekombinácie medzi pckA génom na bakteriálnom chromozóme a cudzím pckA génovým fragmentom, obsahujúcim gén chloramfenikolovej rezistencie a loxP miesta, čím sa získal rekombinantný E. coli kmeň obsahujúci na chromozóme inaktivované tak tcdBC gény, ako aj pckA gén. Tento rekombinantný E. coli kmeň bol označený ako „FTR2717“ a bol uložený v Kórean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 20. marca, 2003 pod prístupovým číslom KCCM-10475.
Rekombinantný E. coli FTR2717 kmeň má nasledujúce vlastnosti:
(1) je rezistentný voči treonínovým analógom, lyzínovým analógom, izoleucínovým analógom a metionínovým analógom, v porovnaní so štandardným kmeňom;
(2) jeho chromozóm obsahuje endogénny ppc gén a endogénny treonínový operón, obsahujúci gény thrA, thrB a thrC, ako aj jednu alebo viacero kópií exogénneho ppc génu a exogénnych thrA, thrB a thrC génov;
(3) zahŕňa operónové gény podieľajúce sa na degradácii L-treonínu, tdcBC, ktoré sú inaktivované; a (4) zahŕňa pckA gén podieľajúci sa na inhibícii L-treonínovej syntézy, ktorý je inaktivovaný, takže produkuje vysoké hladiny L-treonínu pri vysokej koncentrácii glukózy v médiu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Vyššie uvedené ciele, znaky a iné výhody predloženého vynálezu budú jasnejšie pochopené z nasledujúceho podrobného opisu spolu s priloženými výkresmi, na ktorých:
Obrázok 1 je schematické zobrazenie znázorňujúce proces klonovania pckA génu.
Obrázok 2 je schematické zobrazenie znázorňujúce proces prípravy rekombinantného mikroorganizmu, do ktorého sa zavádza pckA génový fragment, obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie (caŕ) a loxP miesta, ApckA::loxpcat.
-8A obrázok 3 je fotografia znázorňujúca výsledok Southern blotu, ktorým sa identifikuje zavedenie génu chloramfenikolovej rezistencie (caŕ) do pckA génu na chromozóme E. coli kmeňa produkujúceho L-treonín (dráha 1: rekombinantný kmeň selektovaný v prítomnosti chloramfenikolu, v súlade s predloženým vynálezom; dráha 2: rodičovský kmeň TRN212; a dráha 3: marker veľkostí).
Predložený vynález je možné lepšie pochopiť prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré sú uvedené na ilustráciu, ale nepredstavujú obmedzenie predloženého vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Klonovanie pckA génu
Pripravil sa rekombinantný vektor nesúci pckA gén (pozri obrázok 1). Najprv sa izolovala bakteriálna genomická DNA z L-treonín produkujúceho E. coli kmeňa obsahujúceho inaktivovaný tdcBC operón, TRN212 (prístupové číslo: KCCM1033), použitím QIAGEN Genomic-tip systému (QIAGEN Co.). Použitím izolovanej genomickej DNA ako templátu sa uskutočnila PCR, aby sa amplifikovala približne 1,5kb parciálna oblasť pckA génu. V PCR sa použila sada primerov, ktorá pozostáva z poprúdového primeru so SEQ ID NO:1 a z reverzného primeru so SEQ ID NO: 2. PCR podmienky zahŕňali 30 cyklov denaturácie pri 94 °C počas 30 sekúnd, anelácie pri 55 °C počas 30 sekúnd a predlžovania pri 72 °C počas 1 minúty a 30 sekúnd.
PCR produkty sa podrobili elektroforéze na 0,8% agarózovom géli a z gélu sa vyrezal 1,kb pás. Z tohto vyrezaného pásu sa purifikoval 1 ,kb DNA fragment použitím DNA Gólového purifikačného kitu (QIAGEN Co.), a klonoval sa do pT7Blu vektora (Novagen Co.), poštiepeného s EcoRV, prostredníctvom ligácie tupých koncov pri 16 °C, čím vznikol rekombinantný vektor obsahujúci parciálny pckA gén, pT7Blue/pckA. Potom sa E. coli NM522 kmeň transformoval s pT7Blue/pckA a rozotrel sa na tuhom médiu (LB: 1% NaCI, 1% tryptón, 0,5% kvasinkový extrakt) obsahujúcom ampicilín (100 mg/l), a nasledovalo inkubovanie pri 37 °C cez noc. Kolónie, ktoré vyrástli na tuhom médiu sa inokulovali do 3 ml
-9kvapalného média obsahujúceho ampicilín a nasledovalo inkubovanie cez noc pri 37 °C. Plazmidové DNA sa izolovala z kultivovaných baktérií použitím QIAGEN mini prep kitu (QIAGEN Co.) a analyzovala sa jej veľkosť. Analyzovala sa aj orientácia pckA génu reštrikčným mapovaním s Nrul a Stul. Potom sa plazmidové DNA poštiepila s Nrul, a podrobila sa elektroforéze na 0,7% agarózovom géli. Z gélu sa vyrezal približne 4,3kb pás a z tohto pásu sa purifikoval 4,3kb fragment.
Príklad 2: Konštrukcia rekombinantného vektora nesúceho inaktivovaný pckA gén a príprava E. co// kmeňa s inaktivovaným pckA génom
2-1) Konštrukcia rekombinantného vektora nesúceho inaktivovaný pckA gén
1,2kb DNA fragment, loxpcat, ktorý obsahuje gén chloramfenikolovej rezistencie majúci na oboch svojich koncoch loxP miesto, sa získal poštiepením ploxpcat2 (plazmid nesúci gén chloramfenikolovej rezistencie, ktorý má na oboch svojich koncoch loxP miesto; Beatriz Palmeros a ďalší, Gene, 247:25-264, 2000, Professor G. Gosset, University of Mexico) s Hincll. Tento 1,2kb DNA fragment sa ligoval do pT7Blue/pckA pripraveného v príklade 1, ktorý bol poštiepený s Nrul, prostredníctvom ligácie tupých koncov, čím vznikol približne 5,7kb rekombinantný vektor obsahujúci inaktivovaný pckA gén, pT7ApckA:: loxpcat (pozri obrázok 2).
2-2) Príprava E. coli kmeňa s inaktivovaným pckA génom pT7ApckA::loxpcat rekombinantný vektor, pripravený v príklade 2-1), sa zaviedol do E. coli NM22 kmeňa. Transformovaný NM22 kmeň sa rozotrel na tuhom médiu ((LB: 1% NaCI, 1% tryptón, 0,5% kvasinkový extrakt) obsahujúcom ampicilín a chloramfenikol, a nasledovalo inkubovanie pri 37 °C cez noc. Kolónie, ktoré vyrástli na tuhom médiu sa inokulovali do 3 ml kvapalného média obsahujúceho ampicilín a chloramfenikol, a nasledovalo inkubovanie cez noc pri 37 °C. Plazmidové DNA sa izolovala z kultivovaných baktérií použitím QIAGEN mini prep kitu, a analyzovala sa veľkosť a orientácia vloženého pckA génu. Potom sa plazmidové DNA dvojito poštiepila s Pstl a Kpnl, a podrobila sa elektroforéze na 0,7% agarózovom géli. Z gélu sa vyrezal 2,7kb pás a z tohto pásu sa purifikoval 2,7kb fragment (ApckA::loxpcat).
-10pckA génový fragment obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie, ktorý má na oboch svojich koncoch loxP miesto, ApckAJoxpcat, sa zaviedol do Ltreonín produkujúceho E. coli kmeňa, TRN212 (prístupové číslo: KCCM-10353), elektroporáciou. Potom sa transformovaný TRN212 kmeň rozotrel na tuhé médium obsahujúce chloramfenikol, aby sa vyselektovali len bunky rezistentné voči chloramfenikolu, čím sa vyselektovali bunky, v ktorých bol pckA gén na chromozóme nahradený cudzím pckA génovým fragmentom (ÄpckA::loxpcat). Pri selektovaných klonoch sa hodnotilo, či je špecificky knockoutovaný chromozomálny pckA gén, a to prostredníctvom Southern blot analýzy, rovnakým spôsobom ako v experimentálnom príklade 1, nižšie.
Selektované klony, ktoré boli prostredníctvom Southern blot analýzy identifikované ako majúce na chromozóme špecificky knockoutovaný pckA gén, sa transformovali s pJW168 plazmidom (dar od Prof. Guillermo Gosseta z University of Mexico), ktorý obsahuje cre gén kódujúci miestne špecifickú rekombinázu rozoznávajúcu loxP miesta. Transformované bunky sa kultivovali v kultivačnom médiu obsahujúcom 10 mM L-arabinózy, cez noc, aby sa odstránil gén chloramfenikolovej rezistencie začlenený do bakteriálneho chromozómu. Potom sa kultivačná tekutina nariedila 107-krát a rozotrela sa na LB tuhé médium s ampicilínom (100 mg/l), a nasledovalo inkubovanie cez noc pri 30 °C. Každá zo 100 kolónií vyrastených na tuhom médiu sa inokulovala do 3 ml LB kvapalného média obsahujúceho ampicilín a do 3 ml kvapalného média bez ampicilínu, a nasledovalo inkubovanie pri 30 °C cez noc. Determinovali sa kolónie, ktoré boli usmrtené v médiu obsahujúcom chloramfenikol, ale prežívali v médiu, ktoré neobsahovalo chloramfenikol. Pri takejto selekcii sa vybrali len klony, ktoré mali deletovaný gén chloramfenikolovej rezistencie.
Experimentálny príklad 1: Zhodnotenie knockoutu pckA génu na chromozóme prostredníctvom Southern blotu
TRN212 kmeň, ako rodičovský kmeň, a jeden z chloramfenikol rezistentných klonov vyselektovaných v príklade 2-2) sa kultivovali cez noc v 3 ml kvapalného média obsahujúceho chloramfenikol (1 mg/l). Potom sa
-11 z kultivovaných buniek vyizolovala genomická DNA použitím QIAGEN genomického kitu 20 a cez noc sa štiepila s EcoRV. Výsledné DNA fragmenty sa odseparovali na 0,7% agarózovom géli, podľa ich veľkosti. Po elektroforéze sa odseparované DNA fragmenty cez noc prenášali na nylonovú membránu (Biodyne B membrána, Young Sci.) prostredníctvom kapilárneho transferu (Molecular Cloning, zv. 1, str. ž.31-6.38). Membrána sa vysušila a potom sa vystavila UV svetlu (120 mJ/cm2, SpectroLinker™), aby sa imobilizovali DNA fragmenty na membráne (Molecular Cloning, zv. 1, str. 6.4). Výsledná membrána sa inkubovala v predhybridizačnom roztoku I (Roche #1093657) pri 55 °C, 2 hodiny, a cez noc sa hybridizovala s denaturovanom DNA sondou v hybridizačnej peci (BAMBINO 230300) pri 55 °C.
DNA sonda sa pripravila nasledovne. Najprv sa použitím QIAGEN kitu izoloval ploxpcatž plazmid a poštiepil sa s Hincll, aby sa získal DNA fragment (približne 1,2 kb) obsahujúci gén chloramfenikolovej rezistencie majúci na oboch svojich koncoch loxP miesto. Tento 1,2kb fragment sa 5 minút varil vo vode a rýchlo sa ochladil na ľade, čím sa získala jednovláknová DNA. Jednovláknová DNA sa potom označila s DIG-UDP, použitím DIG značkovacieho a detekčného kitu (Roche #109367), inkubovaním cez noc pri 37 °C.
Po hybridizácii sa membrána premyla s premývacími roztokmi I a II (Roche #1093657), aby sa odstránili nešpecifický pripojené DNA molekuly. Umytá membrána sa maskovala použitím predhybridizačného roztoku II (Roche #1093657), pri laboratórnej teplote 30 minút, a potom reagovala s anti-DIG protilátkou špecificky naviazanou na DIG-UTP, pri laboratórnej teplote, 30 minút. Membrána sa premyla s premývacím roztokom III (Roche #1093657), aby sa odstránili nešpecifický pripojené anti-DIG protilátky, a vyvíjala sa použitím Značkovacieho a detekčného kitu (Roche #1093657), pri laboratórnej teplote, až kým sa neobjavili pásy. Výsledky sú znázornené na obrázku 3.
Ako je znázornené na obrázku 3, v prípade rodičovského kmeňa TRN212 sa nedetegovali žiadne pásy (dráha 2), pretože TRN212 kmeň neobsahoval gén chloramfenikolovej rezistencie. Na rozdiel od toho, chloramfenikol rezistentný kloň selektovaný v súlade s predloženým vynálezom vykázal približne 3,6kb pás (dráha
- 121). Z týchto výsledkov vyplýva, že selektované klony obsahujú na svojom chromozóme gén chloramfenikolovej rezistencie.
Príklad 3: Porovnanie vyselektovaných klonov z hľadiska výťažkov L-treonínu pri kultivovaní v Erlenmeyerových bankách
Spomedzi finálne vyselektovaných rekombinantných E. coli klonov podľa príkladu 2-2), z ktorých bol odstránený začlenený gén chloramfenikolovej rezistencie, sa u tridsiatich klonov hodnotila produktivita L-treonínu. Každý z nich sa kultivoval v Erlenmeyerovej banke obsahujúcej kultivačné médium pripravené podľa zloženia uvedeného nižšie, v tabuľke 1. Potom sa hodnotila kultivačná tekutina z hľadiska produkčných výťažkov L-treonínu. V stručnosti: po vyrastení každého z týchto tridsiatich klonov na LB tuhom médiu pri 32 °C sa pre každý kloň inokulovalo jedno očko jednotlivej kolónie do 25 ml kultivačného média a kultivovalo sa pri 32 °C 48 hodín pri 250 ot./min. Potom ako sa každá z kultivačných tekutín scentrifugovala, sa supernatant 250-krát nariedil s destilovanou vodou. Prostredníctvom HPLC sa merala koncentrácia L-treonínu v nariedenom supernatatne. Výsledky sú uvedené nižšie, v tabuľke 2.
Tabuľka 1
| Živiny | Množstvo na 1 I |
| Glukóza | 70 g |
| Síran amónny | 28 g |
| KH2PO4 | 1,0 g |
| MgSO4.7H2O | 0,5 g |
| FeSO4.7H2O | 5 mg |
| MnSO4.8H2O | 5 mg |
| Uhličitan vápenatý | 30 g |
| L-metionín | 0.15 g |
| Kvasinkový extrakt | 2g |
| pH (7,0) |
- 13Tabuľka 2
| Počet klonov | 2 | 5 | 14 | 9 |
| Produkčný výťažok L-treonínu | 20-23 | 23-24,5 | 24,5-26 | >26 |
Rodičovský kmeň TRN212 vykazoval L-treonínový produkčný výťažok 23 g/l. Spomedzi tridsiatich testovaných klonov sa našlo dvadsaťosem takých, ktoré mali lepšiu produktivitu L-treonínu ako TRN212 kmeň, ako je uvedené v tabuľke 2. Konkrétne, deväť klonov vykazovalo L-treonínový produkčný výťažok vyšší ako 26 g/l, čo je približne o 13,04 % vyšší výťažok ako výťažok TRN212 kmeňa. Spomedzi tridsiatich klonov sa vybral jeden kloň s najvyšším výťažkom L-treonínu (viac ako 26 g/l) a označil sa ako „FTR2717 (prístupové číslo: KCCM-10475)“.
Priemyselná využiteľnosť
Ako je opísané vyššie, predložený vynález poskytuje mikroorganizmus s inaktivovaným pckA génom, ktorý je pripravený zavedením génu antibiotikovej rezistencie do chromozomálnej DNA rodičovského E. coli kmeňa produkujúceho vysoké hladiny L-treonínu, a to do E. coli kmeňa obsahujúceho prostredníctvom DNA rekombinantnej techniky inaktivovaný tdcBC operón podieľajúci sa na degradácii L-treonínu. Keďže má inaktivovaný svoj chromozomálny tdcBC operón, dochádza k zabráneniu degradácie L-treonínu a k zabráneniu prúdenia L-treonínu do vnútra bunky. Okrem toho, vďaka inaktivácii pckA génu podieľajúceho sa na inhibícii L-treonínovej syntézy, má mikroorganizmus podľa predloženého vynálezu viac aktivovaných dráh pre biosyntézu L-treonínu. Preto je mikroorganizmus podľa predloženého vynálezu užitočný na masovú produkciu L-treonínu, keďže je schopný produkovať L-treonín vo vysokých hladinách a s vysokými výťažkami, aj v prítomnosti vysokých koncentrácií glukózy.
-14Zoznam sekvencii <110> CJ Corp.
<120> Mikroorganizmus s inaktivovanými tdcBC/pckA génmi a spôsob výroby Ltreonínu použitím tohto mikroorganizmu <150> KR10-2003-0021458 <151> 200-04-04 <160> 2 <170> Kopatentl 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Poprúdový primer pre PCR <400> 1 _________ _________ gttaacaccc ccaaaaagac 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Reverzný primer pre PCR
- 15<400> 2 gataaagagt tcgcagttcg t
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kmeň Escheríchia coli, vyznačujúci sa tým, že obsahuje inaktivované gény tdcBC a pckA.
- 2. Kmeň Escheríchia coli podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že pckA gén je inaktivovaný zavedením cudzieho pckA génového fragmentu obsahujúceho gén antibiotikovej rezistencie, ktorý má na svojich oboch koncoch väzobné miesta pre miestne špecifickú rekombinázu, do rodičovského Escheríchia coli kmeňa obsahujúceho operón spojený s degradáciou L-treonínu, tdcBC, ktorý je inaktivovaný, a potom umožnením homologickej rekombinácie medzi cudzím pckA génovým fragmentom a pckA génom na chromozóme, aby sa inaktivoval chromozomálny pckA gén.
- 3. Kmeň Escheríchia coli podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že pckA gén je inaktivovaný odstránením génu antibiotikovej rezistencie, ktorý je v ňom začlenený, prostredníctvom aktivity miestne špecifickej rekombinázy exprimovanej kmeňom Escheríchia coli, a prostredníctvom prítomnosti jednej kópie väzobného miesta pre miestne špecifickú rekombinázu v chromozomálnom pckA géne.
- 4. Kmeň Escheríchia coli podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že miestne špecifickou rekombinázou je FLP, Cre alebo XerC/D.
- 5. Kmeň Escheríchia coli podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c i sa tým, že kmeňom je Escheríchia coli FTR2717 (KCCM-10475) obsahujúci na chromozóme pckA gén inaktivovaný zavedením cudzieho pckA génového fragmentu obsahujúceho gén antibiotikovej rezistencie, ktorý má na oboch svojich koncoch loxP miesto, do Escheríchia coli kmeňa obsahujúceho operón spojený s degradáciou L-treonínu, tdcBC, ktorý je inaktivovaný.
- 6. Spôsob výroby L-treonínu, vyznačujúci sa tým, že sa používa kmeň Escherichia coli podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
- 7. Rekombinantný plazmid pT7ApckA::loxpcat, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje pckA génový fragment zahŕňajúci gén chloramfenikolovej rezistencie a loxP miesta, ktorý je pripravený klonovaním parciálneho pckA génu do pT7Blue vektora na produkciu pT7Blue/pckA plazmidu, získaním DNA fragmentu obsahujúceho gén chloramfenikolovej rezistencie a loxP miesta, Ioxpcat2, z ploxpcat2 plazmidu, a ligovaním loxpcat DNA fragmentu s pT7Blue/pckA plazmidom poštiepeným s Nrul.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2003-0021458A KR100498971B1 (ko) | 2003-04-04 | 2003-04-04 | 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법 |
| PCT/KR2004/000778 WO2004087895A1 (en) | 2003-04-04 | 2004-04-02 | tdcBC/pckA GENE-INACTIVATED MICROORGANISM AND METHOD OF PRODUCING L-THREONINE USING THE SAME |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK1192005A3 true SK1192005A3 (sk) | 2006-03-02 |
Family
ID=36117119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK119-2005A SK1192005A3 (sk) | 2003-04-04 | 2004-04-02 | Kmeň Escherichia coli, spôsob výroby L-treonínu použitím kmeňa Escherichia coli a rekombinantný plazmid pT7DeltapckA::loxpcat |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7485450B2 (sk) |
| EP (1) | EP1611232B1 (sk) |
| JP (1) | JP4334565B2 (sk) |
| KR (1) | KR100498971B1 (sk) |
| CN (1) | CN100372927C (sk) |
| AT (1) | ATE455844T1 (sk) |
| AU (1) | AU2004225550B2 (sk) |
| BR (1) | BRPI0409192A (sk) |
| DE (1) | DE602004025218D1 (sk) |
| ES (1) | ES2338555T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0501100A3 (sk) |
| MX (1) | MXPA05010725A (sk) |
| PL (1) | PL380072A1 (sk) |
| RU (1) | RU2339699C2 (sk) |
| SK (1) | SK1192005A3 (sk) |
| WO (1) | WO2004087895A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA200507688B (sk) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006033668A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-03-30 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| KR100858913B1 (ko) * | 2007-03-09 | 2008-09-17 | 한국과학기술원 | 부위특이적 변이에 의해 제조된 고수율의 ｌ－쓰레오닌생산균주 및 이를 이용한 ｌ－쓰레오닌의 제조방법 |
| KR101608734B1 (ko) | 2014-03-21 | 2016-04-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 |
| CN116606785A (zh) * | 2022-02-08 | 2023-08-18 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其应用与构建方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU875663A1 (ru) * | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| SK283369B6 (sk) * | 1993-08-24 | 2003-06-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny |
| DE4400926C1 (de) * | 1994-01-14 | 1995-06-01 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
| KR20010006976A (ko) | 1999-04-09 | 2001-01-26 | 김대훈 | 홍채인식시스템 |
| DE19950409A1 (de) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Degussa | Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE10109690A1 (de) * | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| CN1246468C (zh) * | 2000-09-30 | 2006-03-22 | 德古萨股份公司 | 使用肠细菌科菌株发酵生产l－氨基酸的方法 |
| KR100397423B1 (ko) * | 2001-02-13 | 2003-09-13 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| DE10144493A1 (de) * | 2001-09-11 | 2003-07-03 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coyneformer Bakterien |
| KR100451299B1 (ko) * | 2002-03-21 | 2004-10-06 | 씨제이 주식회사 | Ｌ―쓰레오닌의 제조방법 |
| KR100505797B1 (ko) * | 2002-10-11 | 2005-08-04 | 씨제이 주식회사 | 염색체 상의 ｆａｄＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 변이 미생물과 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| DE102004049692A1 (de) | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Siemens Ag | Vorrichtung zum Umschalten eines Telekommunikations-Endgerätes, Verwendungen und Verfahren |
-
2003
- 2003-04-04 KR KR10-2003-0021458A patent/KR100498971B1/ko active IP Right Grant
-
2004
- 2004-04-02 AT AT04725555T patent/ATE455844T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-02 BR BRPI0409192-2A patent/BRPI0409192A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-04-02 DE DE602004025218T patent/DE602004025218D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-02 RU RU2005134209/13A patent/RU2339699C2/ru active
- 2004-04-02 AU AU2004225550A patent/AU2004225550B2/en not_active Expired
- 2004-04-02 EP EP04725555A patent/EP1611232B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 MX MXPA05010725A patent/MXPA05010725A/es active IP Right Grant
- 2004-04-02 ES ES04725555T patent/ES2338555T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 US US10/817,044 patent/US7485450B2/en active Active
- 2004-04-02 JP JP2006500668A patent/JP4334565B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 CN CNB2004800086929A patent/CN100372927C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-02 PL PL380072A patent/PL380072A1/pl not_active Application Discontinuation
- 2004-04-02 WO PCT/KR2004/000778 patent/WO2004087895A1/en active Application Filing
- 2004-04-02 SK SK119-2005A patent/SK1192005A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2004-04-02 HU HU0501100A patent/HUP0501100A3/hu unknown
-
2005
- 2005-09-23 ZA ZA200507688A patent/ZA200507688B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA05010725A (es) | 2005-12-15 |
| JP4334565B2 (ja) | 2009-09-30 |
| BRPI0409192A (pt) | 2006-04-11 |
| CN100372927C (zh) | 2008-03-05 |
| RU2339699C2 (ru) | 2008-11-27 |
| ATE455844T1 (de) | 2010-02-15 |
| AU2004225550B2 (en) | 2006-09-28 |
| AU2004225550A1 (en) | 2004-10-14 |
| DE602004025218D1 (de) | 2010-03-11 |
| EP1611232A1 (en) | 2006-01-04 |
| EP1611232A4 (en) | 2006-08-23 |
| ZA200507688B (en) | 2006-09-27 |
| HUP0501100A2 (en) | 2007-06-28 |
| RU2005134209A (ru) | 2006-03-20 |
| JP2006521789A (ja) | 2006-09-28 |
| HUP0501100A3 (en) | 2010-01-28 |
| PL380072A1 (pl) | 2006-12-27 |
| WO2004087895A1 (en) | 2004-10-14 |
| EP1611232B1 (en) | 2010-01-20 |
| US20040241831A1 (en) | 2004-12-02 |
| CN1768132A (zh) | 2006-05-03 |
| KR20040087188A (ko) | 2004-10-13 |
| ES2338555T3 (es) | 2010-05-10 |
| KR100498971B1 (ko) | 2005-07-04 |
| US7485450B2 (en) | 2009-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4810781B2 (ja) | Ｌ−グルタミン酸、ｌ−プロリン又はｌ−アルギニンの生産能を有する細菌及びｌ−グルタミン酸、ｌ−プロリン又はｌ−アルギニンの製造法 | |
| RU2207376C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) | |
| US8486670B2 (en) | Method of producing L-threonine using Escherichia coli strain with phosphoenolpyruvate carboxylase promoter replaced with cysteine synthase promoter | |
| JP5319489B2 (ja) | アミノ酸産生の代謝工学 | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| CN113322218A (zh) | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 | |
| CN109402034A (zh) | 只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用 | |
| RU2288265C2 (ru) | Способ получения l-треонина | |
| KR20090075549A (ko) | 향상된 ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌의 생산 방법 | |
| SK1192005A3 (sk) | Kmeň Escherichia coli, spôsob výroby L-treonínu použitím kmeňa Escherichia coli a rekombinantný plazmid pT7DeltapckA::loxpcat | |
| US7863435B2 (en) | L-threonine importer from Corynebacterium and a preparation method of a strain producing L-threonine | |
| EP2397545B1 (en) | Method for producing amino acid | |
| US20090298138A1 (en) | Microorganism producing l-threonine having an inactivated lysr gene, method for producing the same and method for producing l-threonine using the microorganism | |
| JP5297804B2 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JPWO2013154182A1 (ja) | アミノ酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC9A | Refused patent application |