SK283369B6 - Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny - Google Patents

Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny Download PDF

Info

Publication number
SK283369B6
SK283369B6 SK204-96A SK20496A SK283369B6 SK 283369 B6 SK283369 B6 SK 283369B6 SK 20496 A SK20496 A SK 20496A SK 283369 B6 SK283369 B6 SK 283369B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
leu
phosphoenolpyruvate carboxylase
ala
glu
mutant
Prior art date
Application number
SK204-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK20496A3 (en
Inventor
Masakazu Sugimoto
Tomoko Suzuki
Hiroshi Hiroshi Matsui
Katsura Izui
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27320552&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK283369(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK20496A3 publication Critical patent/SK20496A3/sk
Publication of SK283369B6 publication Critical patent/SK283369B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Je opísaná mutantná fosfoenelpyruvátkarboxyláza pochádzajúca z mikroorganizmu patriaceho do rodu Eschrichia, ktorá nie je citlivá na spätnú inhibíciu kyselinou asparágovou, pričom sa selektuje prostredníctvom rezistencie voči zlúčenine vybranej zo skupiny, ktorá zahŕňa 3-brómpyruvát, beta-hydrazid kyseliny asparágovej a kyselinu DL-treo-beta-hydroxyasparágovú. Opisuje sa aj DNA kódujúca mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, mikroorganizmy transformované takouto DNA a spôsob výroby aminokyselín prostredníctvom týchto mikroorganizmov.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy, jej kódujúceho génu a spôsobu výroby aminokyseliny so zvláštnym zameraním na mutantný gén na desenzibilizáciu spätnej inhibície kyselinou asparágovou a jej použitia.
Doterajší stav techniky
Fosfoenolpyruvátkarboxyláza je enzým, ktorý sa vyskytuje takmer pri všetkých baktériách a rastlinách. Úloha tohto enzýmu spočíva v biosyntéze kyseliny asparágovej a glutámovej a v dodávaní C4 dikarboxylovej kyseliny do cyklu kyseliny citrónovej, aby sa dosiahla jej premena. Ale, pri fermentačnej produkcii aminokyseliny s použitím mikroorganizmov je málo údajov o účinkoch tohto enzýmu, ktoré nie sú objasnené. (Atsushi Yokota a Isamu Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455 až 463 (1988), Josef Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746 až 1752 (1991), Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269 až 274(1993).
Mimochodom, aminokyselina je zlúčenina, ktorá sa v bunkách vyskytuje ako súčasť proteínov, ale na zabezpečenie ekonomického energetického metabolizmu a látkového metabolizmu je jej produkcia presne regulovaná. Táto regulácia je v princípe spätnou reguláciou, v ktorej finálny produkt metabolického procesu inhibuje aktivitu enzýmu, ktorý katalyzuje predchádzajúci krok v tomto procese. Fosfoenolpyruvátkarboxyláza je tiež pri expresii svojej aktivity podrobená rôznym reguláciám.
Napríklad v prípade fosfoenolpyruvátkarboxylázy pri mikroorganizmoch patriacich do rodu Corynebacíerium alebo do rodu Escherichia je aktivita inhibovaná kyselinou asparágovou. Preto spomenutá biosyntéza aminokyseliny, na ktorej sa fosfoenolpyruvátkarboxyláza podieľa, je tiež inhibovaná kyselinou asparágovou.
V minulosti sa vyvinuli rôzne techniky na efektívnu produkciu pri fermentácíi aminokyselín a fermentačná produkcia sa používala pre leucín, izoleucín, tryptofán, fenylalanín a podobne s použitím mutantných kmeňov konvertovaných, aby boli necitlivé na spätnú reguláciu. Ale, nebola známa žiadna mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza konvertovaná, aby bola necitlivá proti inhibícii kyselinou asparágovou, ani žiadna snaha použiť ju na fermentačnú produkciu aminokyselín patriacich do skupiny kyseliny asparágovej a kyseliny glutámovej.
Na druhej strane ppc gén, ktorý je kódujúcim génom fosfoenolpyruvátkarboxylázy Escherichia coli, už bol klonovaný a tiež bola uňho stanovená sekvencia nukleotidov (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. a Katsuki, H., J. Biochem., 95, 909 až 916 (1984)).
Morikawa, M a ďalší (1971), Biochem. Biophys. Res. Com., zv. 45, č. 3, str. 689 - 694, opisujú použitie PEP-mínus kmeňa na získanie PEP revertanov.
Naide, A. a ďalší (1979), J. Biochem., zv. 85, č. 2, str. 423 - 432 opisujú PEP mutanty, ktoré boli inaktivované chemickým reakčným činidlom, a ktoré nemali žiadnu citlivosť proti alosterickému inhibítoru, L-aspartátu.
Kameshita, I. a ďalší (1978), J. Biochem., zv. 84, č. 4, str. 795 - 803, opisujú chemicky modifikované PEP mutanty, ktoré sú necitlivé proti L-aspartátu.
Predmetom predloženého vynálezu je poskytnutie mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy s podstatne desenzibilizovanou spätnou inhibíciou kyselinou asparágovou, kódujúceho génu a použitia tohto spôsobu.
Podstata vynálezu
Ako výsledok horlivého sledovania v oblasti zameranej na získanie spomenutej látky autori vynálezu zistili, že inhibícia kyselinou asparágovou je podstatne desenzibilizovaná nahradením aminokyseliny na Špecifickom mieste fosfoenolpyruvátkyrboxylázy Escherichia coli inou aminokyselinou, boli úspešní pri získaní génu kódujúceho takýto mutantný enzým a skompletizovali predkladaný vynález.
Menovite sa tento vynález týka mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy, ktorá pochádza z mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, má mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície kyselinou asparágovou, pričom uvedená mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza je rezistentná proti zlúčenine vybranej z β-hydrazidu kyseliny 3-brómpyruvátasparágovej a kyseliny DL-treo^-hydroxyasparágovej.
Predkladaný vynález ďalej poskytuje mikroorganizmy patriace do rodu Escherichia alebo koryneformných baktérií majúcich DNA fragment a spôsob výroby aminokyseliny, kde ktorýkoľvek z týchto mikroorganizmov je kultivovaný v preferovanom médiu a aminokyselina vybraná z L-lyzínu, L-treonínu, L-metionínu, L-izoleucínu, kyseliny L-glutámovej, L-arginínu a L-prolínu je oddelená od média.
Mimochodom, v tejto špecifikácii, DNA sekvencia kódujúca mutantnú fosfoenolpyruvátkyrboxylázu, alebo DNA sekvencia obsahujúca okrem toho aj promótor je iba pri tejto príležitosti označovaná ako „DNA sekvencia podľa tohto vynálezu“, „mutantný gén“ alebo „gén fosfoenolpyruvátkarboxylázy“.
Predložený vynález bude podrobnejšie vysvetlený ďalej.
1) Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza
Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa tohto vynálezu (ďalej jednoducho označená ako „mutantný enzým“) je fosfoenolpyruvátkarboxyláza mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, ktorý má mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície kyselinou asparágovou.
Takáto mutácia môže byť akákoľvek za predpokladu, že uvedená spätná inhibícia je podstatne desenzibilizovaná bez straty enzymatickej aktivity fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
Konkrétnejšie, príkladom môžu byť nasledujúce mutácie, pričom pri počítaní sa začína na N-konci fosfoenolpyruvátkarboxylázy:
(1) mutáciu na nahradenie 625. kyseliny glutámovej lyzínom;
(2) mutáciu na nahradenie 222. arginínu histidínom a 223. kyseliny glutámovej lyzinom;
(3) mutáciu na nahradenie 288. serínu fenylalaninom, 289. kyseliny glutámovej lyzinom, 551. metionínu izoleucínom a 804. kyseliny glutámovej lyzinom;
(4) mutáciu na nahradenie 867. alanínu treonínom;
(5) mutáciu na nahradenie 438. arginínu cysteínom; a (6) mutácia na nahradenie 620. lyzínu serínom.
Mimochodom, fosfoenolpyruvátkarboxyláza mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, sekvencia aminokyselín, ktorá je odvodená od génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy Escherichia coli (Fujita,N., Ishijima, S., Izui, K. a Katsuki, H. J. Biochem, 95, 909 až 916 (1984), je uvedená v sekvencií sekv. č.2 v Zozname sekvencií. Na doplnenie, celá nukleotidová sekvencia plazmidu pT2, ktorá obsahuje gén fosfoenolpyruvátkarboxylázy Escherichia coli, je uvedená v sekv. č.l spolu s aminokyselinovou sekvenciou.
Uvedené mutantné enzýmy sú kódované DNA sekvenciami podľa tohto vynálezu opísanými neskôr, ktoré sú produkované expresiou DNA sekvencií v Escherichia coli, a podobne.
2) DNA sekvencia podľa predkladaného vynálezu a mikroorganizmy, ktoré ju obsahujú
DNA sekvencia podľa tohto vynálezu predstavuje DNA sekvencie kódujúce uvedené mutantné enzýmy a má mutáciu na desenzibilizáciu spätnej inhibície fosfoenolpyruvátkarboxylázy kyselinou asparágovou v kódujúcich oblastiach v DNA fragmentoch kódujúcich fosfopyruvátkarboxylázu mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia.
Konkrétne, ako príklad možno uviesť DNA sekvenciu kódujúcu fosfoenolpyruvátkarboxylázu, ktorá má ktorúkoľvek z uvedených mutácií (1) až (6) vo vzťahu ku sekvencii sekv. č.l, ako príklad možno uviesť DNA sekvenciu s ktoroukoľvek z nasledujúcich mutácií:
i) mutácia na konverziu GGA s bázami č. 2109 až 2111 na AAA alebo AAG;
ii) mutácia na konverziu CGC s bázami č. 900 až 902 na CAT alebo CAC a GAA 903-905 na AAA alebo AAG;
iii) mutácia na konverziu TCT s bázami č. 1098 až 1100 na TTT alebo TTC, GAA s bázami t. 1101 až 1103 na AAA alebo AAG, ATG s bázami č. 1887 až 1889 na ATT, ATC alebo ATA a GAA s bázami č. 2646 až 2648 na AAA alebo AAG;
i v) mutácia na konverziu GCG s bázami č. 2835 až 2837 na ktorýkoľvek z ACT, ACC, ACA a ACG; a
v) mutácia na konverziu CGT s bázami č. 1548 až 1550 na TGT alebo TGC; a vi) mutácia na konverziu AAA s bázami č. 2094 až 2096 na TCT, TCC, TCA alebo TCG.
Takýto mutantný gén sa získa tak, že rekominantná DNA, ktorú možno získať ligovaním gcnu fosfoenolpyruvátkarboxylázy ako štandardného génu enzýmu alebo génu s inou mutáciou s vektorovou DNA adaptibilnou na hostiteľa, sa podrobí mutagenéze, aby sa uskutočnil skríning z transformantov pomocou rekombinantnej DNA. Alternatívne možno tiež pripustiť, že mikroorganizmus, ktorý produkuje štandardný enzým, sa podrobí mutagenéze, vytvorí sa mutantný kmeň, ktorý produkuje mutantný enzým a potom sa mutantný gén skrínuje v mutantnom kmeni. Na mutagenézu rekombinantnej DNA možno použiť hydroxylamín, a podobne. Ďalej, keď je samotný mikroorganizmus podrobený mutagenéze, možno použiť liečivo alebo spôsob obvykle používaný pri umelých mutáciách.
Ďalej, v súlade s metódami, ako napríklad prekrývacou extenznou metódou (Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. a Pease, L. R., Gene, 77, 51 až 59 (1989), miestne špecifickou mutačnou metódou (Kramer, W. a Frits, H. j., Meth. in Emzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987) a pod., možno spomenutý mutantný gén získať tiež zavedením mutácie ako napríklad nahradením aminokyseliny, inzerciou, deléciou a podobne do génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy ako génu štandardného enzýmu alebo ďalšou mutáciou. Tieto metódy založené na princípe, že nemutantná génová DNA sa použije ako templát a syntetická DNA obsahujúca chybné spárovanie v mieste mutácie sa použije ako jeden z primérov, aby sa syntetizovali komplementárne vlákna uvedenej génovej DNA, čím sa zavedie mutácia. Použitím týchto metód je možné spôsobiť uvedenú mutáciu na cielenom mieste.
Alternatívne, sekvencia, ktorá má štiepiace konce reštrikčného enzýmu na oboch zakončeniach a zahrnuje obe strany mutačného miesta, je syntetizovaná a vymieňaná za zodpovedajúcu časť nemutovaného génu, čím môže byť zavedená mutácia (kazetová mutačná metóda).
Gén fosfbenolpyruvátkarboxylázy, ktorý je génom štandardného enzýmu alebo gén s inou mutáciou, ktorý má byť použitý na zavedenie mutácie, môže byť akýkoľvek za predpokladu, že je to gén kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxylázu mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, pre ktorý sa výhodne urči sekvencia báz, a ktorý je klonovaný. Ak nebol klonovaný, možno DNA fragment s obsahom génu amplifikovať a izolovať s použitím PCR metódy, po ktorej nasleduje použitie vhodného vektora, aby sa dosiahlo klonovanie.
Ako gén, ako je opísané, môže byť napr. uvedený gén Escherichia coli, ktorý je klonovaný a má určenú sekvenciu báz (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. a Katsuki, H., J. Biochem., 95,909 až 16 (1984). Sekvencia kódujúcej oblasti tohto génu je v sekv. č. 1 (nukleotidy č. 237 až 2888).
Skríning hostiteľa obsahujúceho mutantný gén možno vykonávať s použitím analogickej zlúčeniny kyseliny asparágovej. Analogická zlúčenina má výhodne nasledovné vlastnosti. Najmä má účinok inhibujúci rast mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, ktorý produkuje štandardnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, uvedený účinok inhibície rastu sa znovu nadobúda prítomnosťou kyseliny Lglutámovej alebo kyseliny L-asparágovej, a to inhibuje aktivitu štandardnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
Ak mutantný kmeň rezistentný na spomenutú analogickú zlúčeninu je vybraný z mikroorganizmu patriaceho do rodu Escherichia, napríklad Escherichia coli HB101 produkujúcej štandardnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu s použitím inhibície rastu mikroorganizmu ako indexu, je veľmi pravdepodobné, že sa získa hostiteľský mikroorganizmus, ktorý produkuje fosfoenolpyruvátkarboxylázu s desenzibilizovanou spätnou inhibíciou kyselinou asparágovou.
Ako všeobecná štruktúra inhibítora fosfoenolpyruvátkarboxylázy sa navrhuje základne poskytnutá štruktúra 4C dikarboxylovej kyseliny. Z takéhoto pohľadu boli predkladateľmi vynálezu sledované rôzne zlúčeniny. Escherichia coli HB101 bola kultivovaná v LB médiu, prenesená do M9 média (s obsahom tiamínu 20 pg/ml a Leu a Pro, každého v množstve 3 pg/ml) obsahujúceho ktorúkoľvek z kyselín DL-2-amino-fosfonomaslovej, brómjantárovej, meso-2,3-dibrómjatitárovej, 2,2-difluórjantárovej, 3-brómpyrohroznovej, a-ketomaslovej, α-ketoadipovej, DL-treo-B-hydroxyasparágovej, β-metylestcru kyseliny L-asparágovej, kyseliny α-metyl-DL-asparágovej, kyseliny 2,3-diaminomaslovej, alebo β-hydramidu kyseliny asparágovej a absorbancia média sa merala pri 660 nm v čase, čím sa monitoroval rast.
Ďalej, keď tieto zlúčeniny boli prítomné v ich koncentráciách inhibujúcich rast, sledovalo sa, či sa obnovila alebo neobnovila inhibícia pridaním nukleových kyselín (uridín, adenozín: každá 10 mg/dl), kyseliny glutámovej alebo aminokyselín patriacich do skupiny kyseliny asparágovej (Asp: 0,025 %, Met, Thr, Lyz každá: 0,1 %).
Záverom boli vybrané 3 zlúčeniny: 3-brómpyruvát (3BP) (1), asparagát-B-hydrazid (AHY) (2) a DL-treo-B-hydroxyasparagát (BHA) (3).
COOH
I c=o 1 (n
CH,Br
CONHNH, I
HÓH <2>
COOH
COOH
HCOH HJ^^H (3)
COOH
Inhibícia rastu Escherichia coli týmito analogickými zlúčeninami je znázornená na obr. 1 až 3. Ďalej, obnova rastu Escherichia coli, v prípade pridania uvedených substancií obnovujúcich inhibíciu jednotlivo alebo v zmesi 2 alebo 3 druhov je znázornená na obr. 4 až 6. Na doplnenie je ako kontrola na obr. 7 znázornený rast v prípade pridania substancie obnovujúcej inhibíciu v neprítomnosti inhibujúcej substancie. Mimochodom, na obr. 4 až 7 aditíva 1, 2 a 3 znázorňujú nukleové kyseliny, kyselinu glutámovú alebo aminokyseliny patriace do skupiny kyseliny asparágovej.
Ďalej sa sledovala inhibícia aktivity analogickej zlúčeniny na fosfoenolpyruvátkarboxylázu. Surový enzým bol pripravený z kmeňa Escherichia coli HB101 v súlade s metódou opísanou v The Joumal of Chemistry, Vol. 67, č. 4 (1970) a enzymatická aktivita sa merala v súlade s metódou opísanou v Eur. J. Biochem., 202, 797 až 803 (1991).
Escherichia coli HB101 kultivovaná v LB médiu bola rozdrvená a suspenzia bola centrifugovaná, aby sa získal supemantant, ktorý bol použitý ako surový roztok enzýmu. Meranie enzymatickej aktivity sa vykonávalo meraním zníženia absorbancie pri 340 nm, kým sa nechal pôsobiť acetylkoenzým A, známy tým, že ovplyvňuje aktivitu, pri koncentrácii 0, í mM v meracom systéme obsahujúcom 2 mM fosfoenolpyruvátu, 0,1 mM NADH, 0,1 M Tris-acetátu (pH 8,5), 1,5 U malátdehydrogenázy a surový enzým. Výsledky sú znázornené na obr. 8.
Podľa uvedených výsledkov je zrejmé, že uvedené 3 zlúčeniny inhibujú rast Escherichia coli, táto inhibícia nemôže byť obnovená samotnými nukleovými kyselinami, ale môže byť obnovená pridaním kyseliny glutámovej alebo aminokyselín patriacich do skupiny kyseliny asparágovej. Preto boli tieto analogické zlúčeniny označené ako selektívne inhibítory fosfoenolpyruvátkarboxylázy. Ako je uvedené v opísaných príkladoch, použitím týchto zlúčenín sa v predkladanom vynáleze môže selektovať Escherichia coli, ktorá produkuje mutantovú fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
Keď sa sleduje pomocou uvedených zlúčenín transformant, ktorý’ má cieľový mutantný gén enzýmu a je obnovená rekombinantná DNA, potom sa získa mutantný gén enzýmu. Alternatívne, v prípade mutagenézy samotného mikroorganizmu, keď mutantný kmeň, ktorý má cieľový mutantný gén enzýmu j c skrínovaný s použitím uvedených zlúčenín, sa z kmeňa izoluje DNA fragment obsahujúci cieľový mutovaný gén enzýmu a ten je ligovaný s vhodným vektorom, čím sa získa mutantný gén enzýmu.
V súlade s metódami, ako je prekrývacia extenzná metóda (Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. a Pease, L R., Gene, 77, 51 až 59 (1989), miestne špecifická mutačná metóda (Kramer, W. a Frits, h. j., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987) a pod., sa konverzia kodónu môže dosiahnuť aj zavedením mutácie ako napríklad nahradením aminokyseliny, inzerciou, deléciou a podobne do génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy ako génu štandardného enzýmu alebo génu s inou mutáciou. Tieto metódy založené na princípe, že nemutantná génová DNA sa použije ako templát a syntetická DNA obsahujúca chybné spárovanie v mieste mutácie sa použije ako jeden z printerov, aby sa syntetizovali komplementárne vlákna uvedenej génovej DNA, čím sa zavedie mutácia. Použitím týchto metód je možné spôsobiť uvedenú mutáciu na cielenom mieste.
Alternatívne, sekvencia, ktorá má štiepiace konce reštrikčného enzýmu na oboch zakončeniach a zahrnuje obe strany mutačného miesta, je syntetizovaná a vymieňaná za zodpovedajúcu časť nemutovaného génu, čím môže byť zavedená mutácia (kazetová mutačná metóda).
DNA fragment kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxylázu s mutáciou zavedenou, ako je uvedené, je exprimovaný s použitím vhodného hostiteľ-vektor systému, čím je možné produkovať mutantný enzým. Podobne, je možné cieľový mutantný enzým produkovať aj uskutočnením transformácie prostredníctvom integrácie DNA fragmentu podľa predkladaného vynálezu do chromozomálnej DNA hostiteľa.
Ako hostiteľa možno uviesť napríklad mikroorganizmy patriace do rodu Escherichia, napríklad Escherichia coli, koryneformné baktérie, a podobne. Koryneformné baktérie zahrnujú baktétie patriace do rodu Corynebacterium, baktérie patriace do rodu Brevibacterium, ktoré boli doteraz zatrieďované do rodu Brevibacterium, ale teraz sú spojené s baktériami patriacimi do rodu Corynebacterium a baktérie patriace do rodu Brevibacterium, ktoré sú blízko príbuzné s baktériami patriacimi do rodu Corynebacterium. Výhodní hostitelia na produkciu aminokyselín budú opísaní neskôr.
Na druhej strane je ako vektorová DNA výhodný plazmidový vektor a tie vektory, ktoré sú schopné sebareplikácie v hostiteľskej bunke. Keď je hostiteľom Escherichia coli, môžu byť ako príklady uvedené pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 a podobne. Alternatívne je možné použiť vektor z fágovej DNA.
Ďalej, ak je hostiteľom koryneformná baktéria, vektory, ktoré možno použiť a hostitelia, ktorí sú ich nosičom, sú uvedené v príkladoch. Depozitné čísla medzinárodných depozitov sú uvedené v zátvorkách.
pAJ655 Escherichia coli AJ 11882 (FERM BP-136)
Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATTC 39135) pAJl 844 Escherichia coli AJ 11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ600 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148 Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC
39137) pAJ440 Bacillus subtilis AJ 11901 (FERM BP-140)
Tieto vektory možno získať z depozitných mikroorganizmov nasledovne. Bunky zozbierané v logaritmickej fáze rastu sa podrobia bakteriolýze s použitím lyzozýmu a SDS, sú centrifugované pri 30000 ot./min., aby sa z lyzátu získal roztok supematantu, ku ktorému sa pridá polyetylénglykol, aby sa vykonala separácia a purifikácia vektorov pomocou centrifugácie v céziumchlorid-etídium rovnovážnom hustotnom gradiente.
Aby sa Escherichia coli transformovala rekombinantným vektorom získaným inzerciou DNA sekvencie podľa predkladaného vynálezu do spomenutého vektora, možno použiť metódu obvykle používanú na transformáciu Escherichia coli, ako aj metódu, pri ktorej sú bunky ošetrené chloridom vápenatým, aby sa zvýšila permeabilita DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977), a podobne.
Ďalej je na transformáciu koryneformných baktérií možná metóda, ktorá je spomenutá skôr, kde sú bunky ošetrené chloridom vápenatým alebo metóda, kde sa inkorporácia vykonáva v špecifickej fáze rastu, v ktorej bunky môžu inkorporovať DNA (správa v súvislosti s Bacillus subtilis od Duncana C. H. et al.). Inkorporáciu do bakteriálnych buniek možno ďalej dosiahnuť tvorbou protoplastov alebo sferoplastov DNA recipientov, ktoré ľahko inkorporujú plazmidovú DNA. Tieto sú známe pre Bacillus subtilis, Actinomyces a kvasinky (Chang, S. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Bibb a ďalší, Náture, 274, 398 (1978), Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978). Na doplnenie, metóda na transformovanie koryneformných baktérií je opísaná v japonskom zverejnenom patente č. 2-207791.
Na expresiu DNA sekvencie pri spomenutých hostiteľoch podľa predkladaného vynálezu možno použiť promótor, ako je lac, trp, PL, a podobne alebo iný, ktorý je v mikroorganizmoch účinný, alebo v prípade, že DNA sekvencia predkladaného vynálezu obsahuje promótor génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy, môže byť použitý tak, ako je. Alternatívne, keď je koryneformná baktéria použitá ako hostiteľ, možno tiež použiť známy trp promótor pochádzajúci z baktérie patriacej do rodu Brevibacterium (Japonský zverejnený patent č. 62-244382) a podobne.
Ďalej, ako je opísané, je akceptovateľné, že DNA sekvencia predkladaného vynálezu je inzertovaná do vektorovej DNA, ktoráje schopná samoreplikácie a je zavedená do hostiteľa, aby hostiteľovi umožňovala obsahovať ju ako plazmid a tiež je akceptovateľné, aby DNA sekvencia predkladaného vynálezu bola integrovaná do chromozómu mikroorganizmu pomocou metódy používajúcej transpozón (Berg, D. E. a Berg, C. M., Bio/Tcchnol., 1, 417 (1983), Mu fág (Japonský zverejnený patent č. 2-109985) alebo homologickú rekombináciu (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972). Na doplnenie, aby sa DNA predkladaného vynálezu integrovala do koryneformnej baktérie, je možné použiť plazmid citlivý na teplotu opísaný v japonskom zverejnenom patente č. 5-7491.
Keď je mikroorganizmus transformovaný DNA sekvenciou predkladaného vynálezu kultivovaný, ako je opísané a táto DNA sekvencia je exprimovaná, potom sa získa mutantný enzým. Pomocou merania aktivity po pridaní kyseliny asparágovej k enzymatickému reakčnému systému sa stáva zrejmým, či takto získaný mutantný enzým desenzibilizoval alebo nedesenzibilizoval spätnú inhibíciu kyselinou asparágovou. Na meranie enzymatickej aktivity možno použiť spektrometrickú metódu (Yoshinage, T., Izui, K. a Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747 až 750 (1970), a podobne.
Ďalej, DNA sekvencia podľa predkladaného vynálezu kóduje mutantný enzým, v ktorom spätná inhibícia kyselinou asparágovou je desenzibilizovaná, takže mikroorganizmus obsahujúci túto DNA sekvenciu môže byť použitý na účinnú fermentačnú produkciu aminokyselín skupiny kyseliny asparágovej a glutámovej, ako je opísané neskôr.
Escherichia coli AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909 a AJ 12910 s obsahom génov mutantných enzýmov získaných v opísaných príkladoch, boli uložené v Národnom ústave pre biologické vedy a humánnu technológiu Agentúry priemyselnej vedy a technológie (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, lbaraki-ken, Japonsko; zip kód 305), 3. augusta, 1993 pod depozitnými číslami FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 a FERM P-13777, prenesené z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 11. júla, 1994 pod depozitnými číslami FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, FERM BP-4737.
3) Spôsob produkcie aminokyselín
Aminokyseliny môžu byť produkované kultiváciou mikroorganizmu obsahujúceho DNA sekvenciu podľa predkladaného vynálezu vo výhodnom médiu a separáciou vzniknutých aminokyselín. Ako príklady takýchto aminokyselín možno uviesť L-lyzín, L-treonin, L-metionín, L-izoleucín, kyselinu L-glutámovú, L-arginín a L-prolín.
Výhodní hostitelia, do ktorých je zavedená DNA sekvencia podľa predkladaného vynálezu, aby bola použitá na produkciu každej z aminokyselín a kultivačná metóda sú uvedené v príkladoch.
(1) Hostitelia výhodní pri spôsobe produkcie aminokyselín podľa predkladaného vynálezu (i) Hostitelia výhodní na produkciu L-lyzínu
Ako hostiteľa výhodného na produkciu L-lyzinu podľa predkladaného vynálezu možno uviesť baktérie patriace do rodu Escherichia, výhodne Escherichia coli produkujúcu L-lyzín.
Konkrétne možno uviesť ako príklad mutantný kmeň, ktorý je rezistentný na analógy lyzínu. Takýmito analógmi lyzínu sú tie, ktoré inhibujú rast mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia, hoci supresia je celkom alebo čiastočne desenzibilizovaná za predpokladu, že L-lyzín koexistuje v médiu. Napríklad oxalyzín, hydroxamát lyzínu, S-(2-amino-etyl)-cysteín (ďalej skrátene ako „AEC“), γ-metyllyzín, α-chlorkaprolaktam a podobne. Mutantné kmene, ktoré sú rezistentné na tieto analógy lyzínu možno získať použitím obvyklej mutagenézy mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia. Konkrétne možno ako bakteriálny kmeň na produkciu L-lyzínu použiť Escherichia coli AJ11442 (v depozite ako FERM P-5084, pozri stĺpec vľavo dole na strane 471 Japonského zverejneného patentu č. 56-18596).
Na druhej strane možno v predkladanom vynáleze použiť rôzne umelé mutantné kmene koryneformných baktérií, ktoré sú použité ako baktérie produkujúce L-lyzín. Takýmito umelými mutantnými kmeňmi sú: AEC rezistentný mutantný kmeň; mutantný kmeň, ktorý požaduje pre svoj rast aminokyselinu, akou je L-homoserín (Japonské patentové publikácie č. 48-28078 a 56-6499); mutantný kmeň, ktorý má rezistenciu na AEC a vyžaduje aminokyselinu, akou je L-leucín, L-homoserín, L-prolín, L-serín, L-arginín, L-alanín, L-valín, a podobne (USA patenty č. 3708395 a 3825472); L-lyzín produkujúci mutantný kmeň, ktorý má rezistenciu na DL-a-amino-e-kaprolaktam, a-amino-lauryllaktam, chinoid a Λ'-lauroylleucín; L-lyzín produkujúci mutantný kmeň, ktorý má rezistenciu na inhibítor oxalacetátdekarboxylázy alebo na enzým respiračného systému (Japonské zverejnené patenty č. 50-53588, 50-31093, 52102498, 53-86089, 55-9783, 55-9759,56-32995 a 56-39778 a Japonské patentové publikácie č. 53-43591 a 53-1833); mutantný kmeň produkujúci L-lyzín, ktorý vyžaduje inozitol alebo kyselinu octovú (Japonské patenty č. 55-9784 a 56-8692); mutantný kmeň produkujúci L-lyzin, ktorý má citlivosť proti fluorpyruvátu alebo teplote nie nižšej ako 34 °C (Japonské patenty č. 55-9783 a 53-86090); a mutantný kmeň Brevibacterium alebo Corynebacterium, ktorý má rezistenciu na etylénglykol a produkuje L-lyzín (pozri žiadosť US patent poradové č. 333455).
Nasledujú príklady konkrétnych koryneformných baktérií, ktoré sa používajú na produkciu lyzínu:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM-BP277), pozri str. 525 v japonskom zverejnenom patente č. 60-62994;
Brevibacterium lactofermentum ATCC 39134, pozri stĺpec vpravo dole na str. 473 v japonskom zverejnenom patente č. 60-62994;
Brevibacterium lactofermentum AJ3463 (FERM-P1987), pozri japonská patentová publikácia č. 51-34477.
Okrem toho možno v predkladanom vynáleze použiť tým istým spôsobom aj divoké kmene koryneformných baktérií opísané neskôr.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
ATCC 13870
ATTC 15806
ATCC 15991
ATCC 13032
ATCC 13060 (Brevibacterium divaricatum) (Brevibacterium lactofermentum) (Corynebacterium lilium) Corynebacterium malassecola Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium roseum
Brevibacterium flavum
Brevibacterium thiogenitalis Microbacterium ammoniaphilum
ATCC 14020
ATCC 13969
ATCC 15990
ATCC 17965
ATCC 14066
ATCC 14068
ATCC 13825
ATCC 13826
ATCC 19240
ATCC 15354 (ii) Hostitelia výhodní na produkciu L-treonínu Escherichia coli B-3996 (RIA 1867), pozri japonský zverejnený patent é. 3-501682 (PCT);
Escherichia coli AJ 12349 (FERM-P9574), pozri stĺpec vľavo hore na str. 887 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ12351 (FERM-P9576), pozri stĺpec vpravo dole na str. 887 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458:
Escherichia coli AJ12352 (FERM P-9577), pozri stĺpec vľavo hore na str. 888 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ11332 (FERM P-4898), pozri stĺpec vľavo hore na str. 889 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ12350 (FERM P-9575), pozri stĺpec vľavo hore na str. 889 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ 12353 (FERM P-9578), pozri stĺpec vpravo hore na str. 889 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ12358 (FERM P-9764), pozri stĺpec vľavo hore na str. 890 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ12359 (FERM P-9765), pozri stĺpec vľavo hore na str. 890 v japonskom zverejnenom patente č. 2-458;
Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900), pozri stĺpec 6 na str. 201 v japonskej patentovej publikácii č. 1-29559;
Escherichia coli AJ11333 (FERM P/4899), pozri stĺpec 6 na str. 201 v japonskej patentovej publikácii 4. 1/29559;
Escherichia coli AJ11335 (FERM P-4901), pozri stĺpec 7 na str. 202 v japonskej patentovej publikácii č. 1-29559.
Nasledujúce bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady koryneformných baktérií:
Brevibacterium lactofermentum AJ11188 (FERM P-4190), pozri stĺpec vpravo hore na str. 473 v japonskom zverejnenom patente č. 60-87788;
Corynebacterium glutamicum AJ11682 (FERM BP-118), pozri stĺpec 8 na str. 230 v japonskej patentovej publikácii č. 2-31956;
Brevibacterium flavum AJ11683 (FERM BP-119), pozri stĺpec 10 na str. 231 v japonskej patentovej publikácii č. 231956.
(iii) Hostitelia výhodní na produkciu L-metionínu
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady na produkciu L-metionínu:
Escherichia coli AJ11457 (FERM P-5175), pozri stĺpec vpravo hore na str. 552 v japonskom zverejnenom patente č. 56-35992;
Escherichia coli AJ11458 (FERM P-5176), pozri stĺpec vpravo hore na str. 552 v japonskom zverejnenom patente č. 56-35992;
Escherichia coli AJ11459 (FERM P-5177), pozri stĺpce vpravo hore na str. 552 v japonskom zverejnenom patente č. 56-35992;
Escherichia coli AJ11539 (FERM P-5479), pozri stĺpec vľavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente č. 16-144092;
Escherichia coli AJ 11540 (FERM P-5480), pozri stĺpec vľavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente č. 56-144092;
Escherichia coli AJ 11541 (FERM P-5481), pozri stĺpec víavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente č. 56-144092;
Escherichia coli AJ 11542 (FERM P-5481), pozri stĺpec víavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente č. 56-144092.
(iv) Hostitelia výhodní na produkciu kyseliny L-asparágovej
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady na produkciu kyseliny L-asparágovej:
Brevibacterium flavum AJ3859 (FERM P-2799), pozri stĺpec vľavo hore na str. 524 v japonskom zverejnenom č. 51-61689;
Brevibacterium lactofermentum AJ3860 (FERM P-2800), pozri stĺpec vľavo hore na str. 524 v japonskom zverejnenom í. 51-61689;
Corynebacterium acetoacidophilum AJ3877 (FERM-P2803), pozri stĺpec vľavo hore na str. 524 v japonskom zverejnenom č. 51-61689;
Corynebacterium glutamicum AJ3876 (FERM P-2802), pozri stĺpec vľavo hore na str. 524 v japonskom zverejnenom č. 51-61689.
(v) Hostitelia výhodní na produkciu L-izoleucínu
Escherichia coli KX141 (VKPM B4781) (pozri 45. odstavec v japonskom zverejnenom patente č. 4-33027) je uvedená ako príklad baktérie patriacej do rodu Escherichia a Brevibacterium lactofermentum AJ12404 (FERM P-10141) (pozri stĺpce vľavo dole na str. 603 v japonskom zverejnenom patente č. 2-42988) a. Brevibacterium flavum AJ12405 (FERM P-10142) (pozri stĺpec vľavo dole na str. 524 v japonskom zverejnenom patente č. 2-42988) sú uvedené ako príklady koryneformných baktérií.
(vi) Hostitelia výhodní na produkciu kyseliny L-glutámovej
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady baktérií patriacich do rodu Escherichia:
Escherichia coli AJ12628 (FERM P-12380), pozri francúzska patentová publikácia č. 2 680 178 (1993);
Escherichia coli AJ 12624 (FERM P-123 79), pozri francúzska patentová publikácia č. 2 680 178 (1993).
SK 283369 Β6
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady koryneformných baktérií:
Brevibacterium lactofermentum AJ12745 (FERM BP-2922), pozri stĺpec vpravo dole na str. 561 v japonskom zverejnenom patente č. 3-49690;
Brevibacterium lactofermentum AJ12746 (FERM BP-2923), pozri stĺpec vľavo hore na str. 562 v japonskom zverejnenom patente č. 3-49690;
Brevibacterium lactofermentum AJ12747 (FERM BP-2924), pozri stĺpec vľavo hore na str. 562 v japonskom zverejnenom patente č. 3-49690;
Brevibacterium lactofermentum AJ12748 (FERM BP-2925), pozri stĺpec vľavo hore na str. 562 v japonskom zverejnenom patente č. 3-49690;
Brevibacterium flavum ATCC 14067, pozri tab. 1 na str. 3 japonského zverejneného patentu č. 5-3793;
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492, pozri tab. 1 na str. 3 japonského zverejneného patentu č. 5-3793.
(vii) Hostitelia výhodní na produkciu L-arginínu Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako baktérie patriace do rodu Escherichia:
Escherichia coli AJ11593 (FERM P-5616), pozri stĺpec vľavo hore na str. 468 v japonskom zverejnenom patente č. 57-5693;
Escherichia coli AJ11594 (FERM P-5617), pozri stĺpec vpravo hore na str. 468 japonského zverejneného patentu 4. 57-5693.
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady koryneformných baktérií:
Brevibacterium flavum AJ 12144 (FERM P-7642), pozri stĺpec 4 na str. 174 v japonskej patentovej publikácii č. 5-27388;
Corynebacterium glutamicum AJ12145 (FERM P-7643), pozri stĺpec 4 na str. 174 v japonskej patentovej publikácii č. 5-27388;
Brevibacterium flavum ATCC 21493, pozri tab. 1 na str. 3 japonského zverejneného patentu č. 5-3793;
Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, pozri tab. 1 na str. 3 v japonskom zverejnenom patente č. 5-3793.
(viii) Hostitelia výhodní na produkciu L-prolínu
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako baktérie patriace do rodu Escherichia:
Escherichia coli AJ 11543 (FERM P-5483), pozri stĺpec vľavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente ¢. 56-144093;
Escherichia coli AJ 11544 (FERM P-5484), pozri stĺpec vľavo dole na str. 435 v japonskom zverejnenom patente č. 56-144093.
Nasledovné bakteriálne kmene sú uvedené ako príklady koryneformných baktérií:
Brevibacterium lactofermentum AJ11225 (FERM P-4370), pozri stĺpec vľavo dole na str. 473 Japonskom patente č. 60-87888;
Brevibacterium flavum AJ11512 (FERM P-5332), pozri stĺpec 2 na str. 185 v japonskej patentovej publikácii č. 62-36679;
Brevibacterium flavum AJ11513 (FERM P-5333), pozri stĺpec 2 na str. 185 v japonskej patentovej publikácii č. 62-36679;
Brevibacterium flavum AJ11514 (FERM P-5334), pozri stĺpec 2 na str. 185 v japonskej patentovej publikácii č. 62-36679;
množstvo na zmiešanie g/dl
2,5 g/dl
0,2 g/dl
0,1 g/dl
0,05 g/dl pg/i
300 ug/1 mg/dl mg/dl
2,5 g/dl
Corynebacterium glutamicum AJ11522 (FERM P-5342), pozri stĺpec 2 na str. 185 v japonskej patentovej publikácii č. 62-36679;
Corynebacterium glutamicum AJ11522 (FERM P-5342), pozri stĺpec 2 na str. 185 v japonskej patentovej publikácii č. 62-36679.
(2) Kultivačná metóda
Spôsob na kultiváciu uvedených hostiteľov sa zvlášť neodlišuje od kultivačnej metódy pre mikroorganizmy produkujúce v prvom rade aminokyseliny. Najmä, použije sa riadne médium s obsahom uhlíkového zdroja, dusíkového zdroja a zdroja anorganických iónov a podľa želania organických stopových nutričných látok, ako sú aminokyseliny, vitamíny a podobne.
Ako zdroj uhlíka sa používa glukóza, sacharóza, laktóza a podobne, ako aj hydrolyzát škrobu, srvátka, melasa a podobné látky, ktoré ho obsahujú. Ako zdroj dusíka možno použiť plynný, tekutý amoniak, amóniovú soľ a podobne. Mimochodom, ak sa ako hostiteľ použije mutantný kmeň, ktorý' vyžaduje ako živnú látku aminokyseliny a podobne, je nevyhnutné vhodne pridať požadovanú živnú látku, ako sú aminokyseliny a podobne do média. Príklad média na produkciu lyzínu je uvedený v tab. 1 ako médium, ktoré má byť použité na produkciu aminokyselín. Mimochodom, pridá sa uhličitan vápenatý k ostatným zložkám po oddelenej sterilizácii.
Tabuľka 1
Zložka média glukóza (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O kvasinkový extrakt hydrochlorid tiamínu biotin
FeSO4.7H2O MnSO4.4H2O uhličitan vápenatý (pH 7,0)
Kultivácia prebieha dovtedy, kým tvorba a akumulácia aminokyselín nie je v podstatnej miere skončená pri vhodnom regulačnom pH a teplote média za prístupu vzduchu. Na zozbieranie takto nahromadených aminokyselín v kultivačnom médiu možno použiť obvyklý postup.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje inhibíciu rastu pomocou 3-brómpyruvátu.
Obr. 2 znázorňuje inhibíciu rastu pomocou asparagát-β-hydrazidu.
Obr. 3 znázorňuje inhibíciu rastu pomocou DL-treo-β-hydroxyasparagátu.
Obr. 4 znázorňuje účinky látok obnovujúcich inhibíciu na 3-brómpyruvát.
Obr. 5 znázorňuje účinky látok obnovujúcich inhibíciu na asparagát-p-hydrazid.
Obr. 6 znázorňuje účinky látok obnovujúcich inhibíciu na DL-treo-3-hydroxyasparagát.
Obr. 7 znázorňuje vplyvy na rast pomocou faktorov obnovujúcich rast.
Obr. 8 znázorňuje inhibíciu fosfoenolpyruvátkarboxylázy pomocou látok inhibujúcich rast.
Obr. 9 znázorňuje inhibíciu fosfoenolpyruvátkarboxylázy podľa predkladaného vynálezu pomocou kyseliny asparágovej.
Obr. 10 znázorňuje inhibíciu fosfoenolpyruvátkarboxylázy podľa predkladaného vynálezu pomocou kyseliny asparágovej.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predkladaný vynález je konkrétnejšie vysvetlený s odkazmi na príklady.
Príklad 1 Získanie mutovaného génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy
Mutovaný gén bol pripravený pomocou plazmidu pS2 získaného inzerciou génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy, ktorý bol klonovaný a určila sa jeho nukleotidová sekvencia do Sali miesta vektorového plazmidu pBR322. pS2 má gén rezistencie na ampicilín ako markerový gén liekovej rezistencie (Sabe, H. a ďalší Gene, 31, 279 až 283 (1984). Nukleotidová sekvencia génu fosfoenolpyruvátkarboxylázy obsiahnutá v pS2 je rovnaká ako v skôr uvedenom plazmide pT2.
pS2 DNA bola pri 75 °C ošetrená počas 2 hodin roztokom hydroxylamínu (20 μg/ml pS2 DNA, 0,05 M fosfátom sodným (pH 6,0), 1 mM EDTA, 0,4 M hydroxylamínu). Vzhľadom na vplyv pH na ošetrenie hydroxylamínom sa zmiešalo 80 μΐ 1 M hydroxylamín.HCl a 1 mM EDTA roztoku s upraveným pH na 6,0 prostredníctvom hydroxidu sodného, 100 μΐ 0,1 M fosfátu sodného (pH 6,0) a 1 mM roztok EDTA a TE (10 mM Tris-HCl, 1 Mm EDTA) tlmivého roztoku s obsahom 2 pg pS2 DNA, aby sa nakoniec doplnilo na 200 μΐ vodou.
Uvedený stav je stavom, pri ktorom majú transformanty prežívateľnosť 0,2 % na základe stavu pred ošetrením v médiu s obsahom ampicilínu, pričom Escherichia coli HB101 je po ošetrení transformovaná s pS2.
Escherichia coli 1IB101 bola transformovaná s pS2 ošetreným hydroxylamínom, ktorý bol nanesený na tuhé platňové médium s obsahom ampicilínu, aby sa získalo asi 10000 kolónií transformantov. Tieto boli suspendované v tekutom médiu a nanesené na tuhé platňové médium s obsahom ktoréhokoľvek z 3-brómpyruvátu (3BP), asparagátβ-hydroxamátu (AHX), asparagát-p-hydrazidu (AHY) a DL-treo-p-hydroxyasparagátu (βΗΑ) ako analógových zlúčenín kyseliny asparágovej v koncentrácii blízko minimálnej inhibičnej koncentrácii, aby sa získalo 103 až 105 buniek na jednej platni média a rastúce kolónie boli selektované.
Zo 100 takto získaných kmeňov rezistentných na analogickú zlúčeninu bola fosfoenolpyruvátkarboxyláza produkovaná každým z nich čiastočne puriflkovaná v súlade s postupom uvedeným v The Joumal of Biochemistry, zv., 67, č. 4 (1970) a sledovala sa inhibícia enzymatickej aktivity pri analogických zlúčeninách. Meranie enzymatickej aktivity sa vykonávalo opísaným spôsobom.
Ďalej sa izolovali plazmidy z bakteriálnych kmeňov produkujúcich mutantné enzýmy s aktivitami, ktoré neboli inhibované analogickými zlúčeninami a boli zavedené do Escherichia coli PCR1 ako fosfoenolpyruvátkarboxylázodeficientného kmeňa (Sabe, H. a ďalší, Gene, 31, 279 až 283 (1984)), aby sa potvrdila produkcia mutantých enzýTakto sa získalo 5 transformantov obsahujúcich gény mutantového enzýmu. Ako výsledok určovania bázových sekvencii týchto génov, mali 2 kmene rovnakú mutáciu a získali sa 4 druhy mutantných génov. Transformanty, ktoré ich nesú, boli označené ako AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909 a AJ12910 a boli uložené v Národnom ústave biologických vied a humánnej technológie Agentúry priemyslovej vedy a technológie 1-3, Higashi 1-chome, Tsukaba-shi, Ibarakiken, Japonsko; zip kód 305) 3. augusta, 1993 pod depozitnými číslami FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P13776 a FERM P-13777, prenesené z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody z 11. júla, 1994 a boli uložené pod depozitnými číslami v poradí FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, FERM BP-4737. Ďalej plazmidy, ktoré poskytovali, boli označené ako pBP5, pHA19, pBP122 a pR6. Mutácie poskytnuté génmi fosfoenolpyruvátkarboxylázy obsiahnuté v každom plazmide sú uvedené v tab. 2. Číselné hodnoty v tabuľke označujú nukleotidové čísla aminokyselinových čísiel v sekv. č.l.
Tabuľka 2
Transformant Plazmid Mutácia Amínokyselinová náhrada vyplývajúca z mutácie
AJ12907 pBP5 WG-A 625Glu-Lyz
AJ 12908 pHA19 901G-A 2i2Arg-His
903g-a J3Glu-Lyz
AJ 12909 pBP122 109$c γ 28žSer-Phe
11O|G-A 285Glu-Lyz
™G-A “'Met-Ile
2646G-A 8l)4Glu-Lyz
AJ12910 pR6 283Sg-a 867Ala-Thr
Okrem toho sa vykonávala selekcia AJ 12907 a AJ12909 v médiu obsahujúcom 500pg/ml 3BP, AJ12908 v médiu obsahujúcom 1000 gg/ml βΗΑ a AJ12910 v médiu obsahujúcom 500 pg/ml AHY.
Príklad 2
Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza
Citlivosť proti kyseline asparágovej sa sledovala pri fosfoenolpyruvátkarboxylázy produkovanej zo spomenutých transformantov. Tieto bakteriálne kmene sú deficientné na gén fosfoenolpyruvátkarboxylázy pochádzajúci od hostiteľa, takže produkovaná fosfoenolpyruvátkarboxyláza pochádza z plazmidu.
Ciltivosť proti kyseline asparágovej sa sledovala v súlade so známou metódou (Yoshinaga, T., Izui, K. a Katsuki, H., J.Biochem., 68, 747 až 750 (1970). Najmä, ako výsledok merania enzymatickej aktivity produkovanej každým z transfromantov majúcich pS2 v prítomnosti acetylkoenzýmu A, známeho tým, že ovplyvňuje aktivitu v systéme merania aktivity pri koncentrácii 0,1 mM alebo 1 mM, sa namerala citlivosť proti kyseline asparágovej, ako je uvedené na obr. 9 a 10.
Podľa výsledku je zrejmé, že divoký typ enzýmu stráca svoju aktivitu, keď je kyselina asparágová vo vysokej koncentrácii, kým mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa predkladaného vynálezu si svoju aktivitu v podstate udržuje stále.
mov.
Príklad 3
Fermentačná produkcia L-treonínu pomocou Escherichia coli so zavedenou mutantnou fosfoenolpyruvátkarboxylázou
Ako treonín-produkujúca baktéria Escherichia coli, kmeň B-3996 (japonský zverejnený patent č. 3-501682 (PCT)) má najväčšiu produkčnú schopnosť medzi doteraz známymi kmeňmi. Preto na základe hodnotenia mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy sa kmeň B-3996 použil ako hostiteľ. Tento B-3996 kmeň bol uložený vo Výskumnom ústave pre genetiku a pestovanie priemyslových mikroorganizmov pod registračným číslom RIA 1867. Ďalej, pBP5 bol vybraný na hodnotenie mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy v experimente.
Plazmid pBP5, ktorý mal mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, bol zavedený do Escherichia coli B-3996 v súlade s postupom podľa Hanahana (J. Mol. Biol., Vol. 106, str. 577 (1983)) a bol izolovaný transformant. Ako kontrola bola Escherichia coli B-3996 transformovaná tým istým spôsobom pS2 ako plazmidom, aby došlo k expresii génu divokého typu fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
Keď boli Escherichia coli B-3996 a transformanty z nej naočkované do 500 ml Sakaguchiho banky naplnenej 20 ml média, ktoré bolo zloženia, aké je uvedené v tab. 3 a boli kultivované pri 37 °C 40 hod., aby sa sledovalo produkované množstvo L-treonínu, získali sa výsledky uvedené v tab. 4. Mimochodom skôr uvedené médium bolo rozdelené na dva: glukózu a MgSO4.7H2O a ďalšie zložky a bolo upravené na pH 7,0 pomocou KOH a následne boli autoklávované pri 115 °C 10 minút a potom po ich zmiešaní bol pridaný oddelene sterilizovaný CaCO3 30 g/1.
Tabuľka 3 zložka množstvo na zmiešanie (g/1) glukóza40 (NH4)2SO416
KH2PO41
MgSO4.7H2O1
FeSO4.7H2O0,01
MnSO4.5H2O0,01 kvasinkový extrakt (Difco) 2 L-met0,5
CaCO330
Tabuľka 4 bakteriálny kmeň (g/1) množstvo produkovaného treonínu
Escherichia coli B-399615,7
Escherichia coli B-3996/pS215,8
Escherichia coli B-3996/pBP516,8
Ako bolo objasnené z výsledku, Escherichia coli B-3996/pBP5 majúca plazmid exprimujúci mutantný enzým s DNA sekvenciou podľa vynálezu mala zvýšenú schopnosť produkcie treonínu v porovnaní s Escherichia coli B-3996/pS2 obsahujúcou plazmid exprimujúci štandardný enzým.
Príklad 4
Fermentačná produkcia kyseliny L-glutámovej pomocou Escherichia coli so zavedenou mutantnou fosfoenolpyruvátkarboxylázou
Ako baktéria Escherichia coli produkujúca kyselinu glutámovú, má Escherichia coli AJ-12628 opísaná v japonskom zverejnenom patente č. 4-11461 najväčšiu produkčnú schopnosť medzi doteraz známymi baktériami. Preto na zá klade hodnotenia mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy sa kmeň AJ-12628 použil ako hostiteľ.
Tento AJ-12628 kmeň bol uložený v Národnom ústave pre biologické vedy a humánnu technológiu Agentúry pre priemyselnú vedu a technológiu pod registračným číslom FERM BP-385. Ďalej, pBP5 bol vybraný na hodnotenie mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy na experiment.
Plazmid pBP5, ktorý mal mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, bol zavedený do Escherichia coli AJ-12628 v súlade s postupom podľa Hanahana (J. Mol. Biol., zv. 106, str. 577 (1983) a bol izolovaný transformant. Tým istým spôsobom bol izolovaný transformant Escherichia coli AJ12628 s pS2.
Keď boli Escherichia coli AJ-12628 a transformanty z nej naočkované do 500ml Sakaguchiho banky naplnenej 20 ml média, ktoré malo zloženie, aké je uvedené v tab. 5 a boli kultivované pri 37 °C 36 hodín, aby sa sledovalo produkované množstvo kyseliny L-glutámovej, získali sa výsledky uvedené v tab. 6. Mimochodom uvedené médium bolo rozdelené na dve: glukózu a MgSO4.7H2O a ďalšie zložky a bolo upravené na pH 7,0 pomocou KOH a následne boli autoklávované pri 115 °C 10 minút a potom po ich zmiešaní bol pridaný oddelene sterilizovaný CaCOj 30 g/1.
Tabuľka 5 zložka množstvo na zmiešanie glukóza40 (NH4)2SO416
KH2PO41
MgSO4.7H2O1
FeSO4.7H2O0,01
MnSO4.5H2O0,01 kvasinkový extrakt (Difco) 2 CaCO330 (g/I)
Tabuľka 6
Bakteriálny kmeň
Escherichia coli AJ-12628
Množstvo produkovanej kyseliny glutámovej (g/1)
18,0
Escherichia coli AJ-12628/pS218,3
Escherichia coli AJ-12628/pBP5 19,6
Ako bolo objasnené z výsledku, Escherichia coli AJ-12628/pBP5, obsahujúca plazmid exprimujúci mutantný enzým s DNA sekvenciou podľa vynálezu mala zvýšenú schopnosť produkcie glutamátu v porovnaní s Escherichia coli 12628/pS2 obsahujúcou plazmid exprimujúci štandardný enzým.
Príklad 5
Produkcia L-lyzínu koryneformnou baktériou so zavedenou mutantnou fosfoenolpyruvátkarboxylázou.
Aby došlo k zavedeniu a expresii mutantného génu do koryneformnej baktérie, získal sa promótor pochádzajúci z baktérie patriacej do rodu Brevibacterium a bol ligovaný s mutantným génom, aby sa pripravil expresný typ plazmidu. Ďalej bol zavedený do baktérie patriacej do rodu Brevibacterium, aby došlo k produkcii L-lyzínu.
1) Získanie génu asparagokinázy (AK) pochádzajúceho z baktérie patriacej do rodu Brevibacterium
Chromozomálna DNA sa pripravila podľa obvyklej metódy z divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) divokého kmeňa (ATCC 13869). AK gén bol amplifikovaný z chromozomálnej DNA pomocou PCR (polymerázová reťazová reakcia; pozri White, T. J. a ďalší, Trends Genet., 5, 185 (1989)). Ako
DNA primery použité pri amplifikácii boli syntetizované oligonukleotid 23-mér (sckv. č.3) a oligonukleotid 21-mér (sekv. č. 4), aby ampliflkovali oblasť asi 1643 bp kódujúcu AK gén na základe sekvencie známej z Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197 až 1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317 až 324).
Syntéza DNA sa vykonávala v súlade s obvyklou fosfoamiditovou metódou (pozri Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) s použitím DNA syntetizátorového modelu 380B vyrobeného Applied Biosystems Co. V PCR reakcii bol použitý DNA thcrmal Cycler PJ2000 vyrobený Takara Shuzo Co., Ltd a amplifikácia génu sa vykonala použitím Taq DNA polymerázy podľa postupu uvedeného výrobcom.
Amplifikovaný génový fragment 1643 kb sa potvrdil elektroforézou na agarózovom géli, potom sa fragment odstrihnutý z gélu purifikoval obvyklým spôsobom, bol šticpený reštrikčnými enzýmami Nrul (vyrobenými Takara Shuzo Co., Ltd.) a EcoRI (ten istý výrobca). pHSG399 (pozri Takeshita, S. a ďalší; Gene (1987), 61, 63 až 74) bol použitý ako klonovací vektor pre génový fragment pHSG399 bol štiepený reštrikčným enzýmom Smal (vyrobeným Takara Shuzo Co., Ltd.) a reštrikčným enzýmom EcoRI a bol ligovaný s amplifikovaným AK génovým fragmentom.
Ligácia DNA sa uskutočňovala navrhnutým spôsobom s použitím DNA ligačnej súpravy (vyrobenej Takara Shuzo Co., Ltd). Takýmto spôsobom bol vyrobený plazmid, v ktorom pHSG399 bol ligovaný s AK génovým fragmentom amplifikovaným z chromozómu Brevibacterium. Plazmid, ktorý má AK gén pochádzajúci z ATCC 13869 ako divokého kmeňa bol označený ako p399AKY.
2) Určenie bázovej sekvencie AK génu Brevibacterium lactofermentum
Bol pripravený AK plazmid, p399AKY, a stanovila sa bázová sekvencia AK génu. Stanovenie sa previedlo podľa metódy Sanger a ďalší (F. Sanger a ďalší: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977), atď.). Výsledky znázorňujú sekv. č. 5 a sekv. č.7. DNA fragmenty majú dva otvorené čítacie rámce, ktoré zodpovedajú α-podjednotke a β-podjednotke AK. V sekv. č. 5 a sekv. č.7 sú spolu s aminokyselinovými sekvenciami zodpovedajúcimi každému čítaciemu rámcu uvedené nukleotidové sekvencie. V sekv. č. 6 a sekv. č. 8 sú uvedené iba aminokyselinové sekvencie, ktoré zodpovedajú každému otvorenému čítaciemu rámcu.
3) Príprava expresného plazmidu fosfoenolpyruvátkarboxylázy
Sali fragmenty, asi 4,4 kb, obsahujúce gény fosfoenolpyruvátkarboxylázy boli extrahované z pS2 ako plazmidu, ktorý· má štandardný gén fosfoenolpyruvátkarboxylázy a pBP5 ako plazmidu, ktorý má získaný gén mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy a boli inzertované do Sali miesta plazmidového vektora pHSG399 používaného vo všeobecnosti pre Escherichia coli. Vyrobené plazmidy boli označené ako pHS2 pre štandardný typ a pHBP5 pre mutant.
Aby sa PHS2 a pHB5 konvertovali na plazmidy na expresiu v Brevibacterium, zaviedli sa promótor a plazmidový počiatok replikácie fungujúce v Brevibacterium. Ako promótor bol génový fragment od 1. Nrul miesta až po 207. ApaLI miesto bázovej sekvencie, ktorá bola označená ako oblasť promótorov, extrahovaný z p399AKY a bol inzertovaný do Aval miesta umiestneného asi 60 bp pred štrukturálnymi génmi pHS2 a pHBP5, aby sa dosiahol správny smer transkripcie.
Ďalej, bol génový fragment umožňujúci autonómnu replikáciu plazmidu v Brevibacterium, najmä plazmidový počiatok replikácie, zavedený do miesta umiestneného na vektore. Génový fragment obsahujúci plazmidový počiatok replikácie bol extrahovaný z vektora pHC4 pre Brevibacterium (pozri odstavec č. 10 v japonskom zverejnenom patente č. 5-7491; Escherichia coli nesúca ten istý plazmid je uložená v Národnom ústave pre biologické vedy a hummánu technológiu Agentúry pre priemyslovú vedu a technológiu, ktorá má priradené číslo FERM P12215), miesta pre reštrikčné enzýmy na oboch zakončeniach boli modifikované na PstI miesta zavedením linkerov.
Tento fragment bol zavedený do PstI miesta vo vektorovej časti plazmidu pridaného s promótorom odvodeným od Brevibacterium. Skonštruované plazmidy exprimujúce fosfoenolpyruvátkarboxylázu boli označené ako pHS2B pre štandardný plazmid fosfoenolpyruvátkarboxylázy pochádzajúci z pS2 a ako pHBP5B pre mutantný plazmid fosfoenolpyruvátkarboxylázy pochádzajúci z pBP5.
4) Produkcia L-lyzínu s použitím expresívneho typu plazmidu fosfoenolpyruvátkarboxylázy
Pripravené pHS2B a pHBP5B boli zavedené do AJ3463 ako L-lyzin-produkujúcej baktérie Brevibacterium lactofermentum (pozri japonská patentová publikácia č. 51-34477). Na zavedenie génu sa použila transformačná elektropulzná metóda (pozri japonský zverejnený patent č. 2-207791). Kmeň hostiteľa a transformanty boli kultivované za trepania 72 hodín pri 31,5 °C v médiu produkujúcom lyzín, ktoré malo zloženie ako uvádza tab. 7. Spomenuté médium bolo pripravené tak, že zložky uvedené v tabuľke s výnimkou CaCO3, sa pridali do 1 1 vody, upravili sa na pH 8,0 hydroxidom draselným, nasledovalo autoklávovanie pri 115 °C 15 minút a potom sa pridal CaCO3, ktorý bol predtým sterilizovaný za tepla. Nahromadené množstvá L-lyzínu v médiu po kultivácii sú uvedené v tab. 8.
Tabuľka 7
zložka množstvo na zmiešanie v 1 i
glukóza 100 g
(NH4)2SO4 55 g
sójový koncentrát* 35 ml
kh2po4 1 g
MgSO4.7H2O 1 g
vitamín BI 20 g
biotín 5g
amid kyseliny nikotínovej 5 mg
FeSO4.7H2O 0,01 g
MnSO4.5H2O 0,01 g
CaCO3 50 g
* produkt Ajinomoto Co., Ltd. (výrobný názov: Márnenou)
Tabuľka 8
Bakteriálny kmeň Množstvo produkovaného lyzínu (g/1)
Brevibacterium lactofermentum AJ3463 20,0
Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B 22,0 Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B 25,0
Ako je uvedené vo výsledku, Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B nesúce plazmid exprimujúci mutantný enzým s DNA sekvenciou podľa vynálezu malo zvýšenú schopnosť produkcie lyzínu v porovnaní s Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B 12628/pS2 nesúcim plazmid exprimujúci štandardný enzým.
Priemyselná využiteľnosť
DNA sekvencia predkladaného vynálezu kóduje mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu a tento enzým je produkovaný mikroorganizmom, ktorý má uvedenú DNA sekvenciu.
Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza predkladaného vynálezu sa v podstate nepodrobuje inhibícii aktivity kyselinou asparágovou, takže môže byť využitá na fermentačnú produkciu aminokyselín vystavených regulácii biosyntézy prostredníctvom kyseliny asparágovej a podobne.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ: Ajinomoto Co. Inc.
(A) Meno:
(B) Ulica: 15-1, Kyobashi 1-chomc, Chuo-ku (C) Mesto: Tokyo (D) Štát:
(E) Krajina: Japonsko (F) ZIP: 104 (ii) Názov vynálezu: Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, jej gén a spôsob výroby aminokyselín.
(iii) Počet sekvencií: 8 (iv) Počítačom čitateľná forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Programové vybavenie: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:
(A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(C) Klasifikácia:
(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:
(A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(2) Informácie o sekv. č. 1:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 5186 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dve (D) Topológia: kruhová (ii) Molekulárny typ: iný, genomická DNA a vektorová DNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Escherichia coli (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokalizácia: 237..2888 (xi) opis sekvencie: sekv. č. 1:
TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ÄTTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA ATGACGTAÄA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT QCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAÄAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT
ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT RAT GTC AGT ATG CTC GGC 284
Met Asn Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly
1 S 10 15
AAA GXG CIG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 332
Lys Val Leu Gly Glu Thr íle LyB A8P Ala Leu Gly Glu His íle Leu
20 25 30
GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 380
Glu Arg Val Glu Thr íle Arg Lys Leu Ser Lys ser Ser Arg Ala Gly
35 40 45
AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TOG 428
Asn ASp Ala Asn Arg Gin Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gin Aan Leu Ser
50 55 60
AAC GAC GAG CTG CTG CCG GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 476
Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gin Phe Leu Aan
65 70 75 80
CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 524
Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gin Tyr His Ser íle Ser Pro Lys Gly Glu
85 90 95
GCT GCC AGC AAC OCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572
Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val íle Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
100 105 110
AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 620
Aen Gin Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr íle Lys Lys Ala Val Glu Ser
115 120 125
CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 668
Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu íle Thr Arg
130 135 140
CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 716
ÄTG Thr Leu íle His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lye Gin
145 150 155 160
CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 764
Leu Asp Asn LyB Asp íle Ala Asp Tyr Glu His Asn Gin Leu Met Arg
120
180
236
165 170 175
CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 812
Arg Leu Arg Gin Leu íle Ala Gin Ser Trp Hla Thr Asp Glu íle Arg
AAG CTG CGT 180 CCA AGC CCG GTA GAT 185 GAA GCC AAA TGG GGC 190 TTT GCC GTA 860
Lys Leu Arg Pro ser Pro val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val
GTG GAA 195 AAC AGC CTG TGG CAA 200 GGC GTA CCA AAT TAC 205 CTG CGC GAA CTG 908
val Glu Asn Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg G1U Leu
AAC 210 GAA CAA CTG GAA GAG 215 AAC CTC GGC TAC AAA 220 CTG CCC GTC GAA TTT 956
Asn Glu Gin Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe
225 GTT CCG 0TC CGT TTT 230 ACT TCG TGG ATG GGC 235 GGC GAC CGC GAC GGC 240 AAC 1004
Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
CCG AAC GCC ACT 245 GCC GAT ATC ACC CGC 250 CAC GTC CTG CTA CTC 255 AGC CGC 1052
pro Asn Val Thr Ala Asp íle Thr Arg His val Leu Leu Leu Ser Arg
TGG AAA GCC 260 ACC GAT TTG TTC CTG 265 AAA GAT ATT CAG GTG 370 CTG GTT TCT 1100
Tip Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp íle Gin Val Leu Val Ser
GAA CTG 27S TGG ATG GTT GAA GCG 280 AOC CCT GAA CTG CTG 285 GOG CTG GTT GGC 1148
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly
GAA 290 GAA GGT GCC GCA GAA 295 DCG TAT CGC TAT CPG 300 ATG AAA AAC CTG CGT 1196
G1U Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg cyr Leu Met Lys Asn Leu Arg
305 TCT CGC CTG ATG GCG 310 ACA CAG GCA TGG CTG 315 GAA GCG CGC CTG AAA 320 GTC 1244
Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly
GAA GAA CTG CCA 325 AAA CCA GAA GGC CTG 330 CTG ACA CAA AAC GAA 335 GAA CTG 1292
Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gin Asn Glu Glu Leu
TGG GAA CCG 340 CTC TAC GCT TGC TAC 345 CAG TCA CTT CAG GCG 350 TGT GGC ATG 1340
Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met
GGT ATT 355 ATC GCC AAC GGC GAT 360 CTG CTC GAC ACC CTG 365 CGC CGC GTG AAA 1988
Gly íle íle Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
TGT 970 TTC GGC GTA CCG CTG 375 GTC CGT ATT GAT ATC 380 CGT CAG GAG AGC ACG 1435
Cys Phe Gly val Pro Leu Val Arg íle Asp I1S Arg Gin Glu Ser Thr
385 CGT CAT ACC GAA GCG 390 CTG GOC GAG CTG ACC 395 CGC TAC CTC GGT ATC 400 GGC 1484
Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly íle Gly
GAC TAC GAA AGC 405 TGG TCA GAG GCC GAC 410 AAA CAG GCG TTC CTG 415 ATC CGC 1532
Asp Tyr Glu Ser Trp Ser G1U Ala Aap Lys Gin Ala Phe Leu íle Arg
GAA CTG AAC 420 TCC AAA CGT CCG CTT 425 CTG CCG CGC AAC TGG 430 CAA CCA AGC 1580
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser
GCC GAA 435 ACG COC GAA GTG CTC 440 GAT ACC TGC CAG GTG 445 ATT GOC GAA GCA 1628
Ala G1U Thr Arg □1U Val Leu Asp Thr Cys Gin Val íle Ala Glu Ala
CCG 450 CAA CGC TCC ATT GCC 4SS GCC TAC GTG ATC TCG 460 ATG GCG AAA ACG CCG 1676
Pro Gin Gly Ser íle Ala Ala Tyr Val íle Ser Met Ala Lys Thr Pro
470
47S
480
465
TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1724
Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly íle Gly
465 490 495
TTT GCG ATG CCT GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772
Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Aep Asp Leu Asn
500 505 510
AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820
Ker. Ala Asn Asp val Met Thr Gin Leu Leu Asn íle Asp Trp Tyr Arg
515 520 525
GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868
Gly Leu íle Gin Gly Lys Gin Met Val Met íle Gly Tyr Ser Asp Ser
530 535 540
GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1916
Ala Lys Asp Ala Gly val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gin Tyr Gin Ala
545 550 555 560
CAG GAT CCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTC ACG 1964
Gin Asp Ala Leu íle Lys Thr Cye Glu Lys Ala Gly íle G1U Leu Thr
565 570 575
TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012
Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser íle Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala
580 585 590
CAT GCG GOG CTG CTG TCA CAA coo CCA GCA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2060
Hlo Ala Ala Leu Leu Ser Gin Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595 600 605
CGC GTA ACC GAA CAG QCC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2108
Arg Val Thr Glu Gin Gly Glu Met íle Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
610 615 620
GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GCG GCG ATT CTG GAA 2156
Glu íle Thr Val Ser Ser Cys Ser Leu Tyr Thr Gly Ala íle Leu Glu
625 630 635 640
GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG COG AAA GAG AGC TCT CCT CGC ATT 2204
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ses Txp Arg Arg íle
645 650 6S5
ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GOC TAC GTA 2252
Met Asp Glu Leu Ser val íle Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670
CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG GCG GAA 2300
Arg G1U Asn Lys Aep Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro G1U
675 680 685
CAA GAA CTG ooc AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2346
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lya Arg Arg
690 695 700
CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTG GCC 2396
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala íle Pro Trp íle Phe Ala
705 710 715 720
TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCG TGG CTG GGT GCA GGT ACG 2444
Trp Thr Gin Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr
725 730 735
GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC CGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT 2492
Ala Leu am Lys val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Ala
740 745 750
ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG 2540
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu
755 760 765
ATG GTC TTC occ AAA OCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA 2588
Met val Phe Ala Lya Ala Asp Leu Trp Leu Ala GlU Tyr Tyr kap Gin
770 775 760
CGC i CTG I GTA 1 GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC 2636
Arg : Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn
2684
785 CTG Leu
CGAGGZGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G 5186 (2) Informácie o sekv. č. 2:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 883 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: sekv. č. 2:
790 795900
CAA GAA GAA GAC ATC AAA CTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC Gin Glu Glu Asp íle Lys Val Val Leu Ala íle Ala Asn Asp Ser 805 610815
CAT CTG ATG GGC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTAOGG
Hie Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp íle Ala Glu Ser íle Gin LeuArg
S20 825630
AAT ATT TAC ACC GAC CGG CTG AAC GTA TTG CAG GGC GAG TTG CTGCAC
Asn íle Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu LeuHis
835 840845
CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGCGTC
Arg Ser Arg Gin Ala Glu Lys Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro ArgVal
B5O 855B60
GAA CAA OCO TTA ATG GTC ACT ÄTT GCC GOG ATT GCG GCA GGT ATGCGT
Glu Gin Ala Leu Met Val Thr íle Ala Gly íle Ala Ala Gly MetArg
965 870 875880
AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAÄ CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG Asn Thr Gly GGTTTTCTGA AATACTTCTG TATTCAAATT CTGAATATAC ATAGGTTAAT GTCATGATAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GAGACAATAA CCCTGATAAA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA CCCAGAAACG CTGGTGAAAG CATCGAACTG GATCTCAACA TCCAATCATO AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC· ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGÄATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA GGAGCTAACC GC1TTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTQGGÄ ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC TGGATGGÄGG CGGATAÄAGT TGCAGGAOCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA QTTATCTACA CGACGGGGAG TCACGCAACT ATGGATGAAC QAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AÄAAGGATCT AGGTOAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAÄAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTQCCGG ATCÄAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCO CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTÄGTTAG GCCACCACTT CÄAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA A3ACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC QTGCACACAG CCCACCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA A3CGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTQACT TGAGCGTCGA TTTTTOTGAT GCTCGTCAGG GGQGCGGAGC CTÄTGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG CÄTTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGACTGQTG AATCCGTTAG
TTCTAACACC CTCGTTTTCA CTTCAGATAT CCTTAAGGGC TAATGGTTTC TTAGACGTCA GTTTATTTTT CTAAATACAT TGCTTCAATA ATATTQAAAA TTCCCTTTTT TGOGGCATľT TAAAAGATGC TGAAGATCAG GCGGTÄÄGAT CCTTGAOAGT
A7ATATTTCT CTCGTGÄTAC GGTGGCACTT TCAAATATGT AGGAAGAGTA TGCCTTCCTG TTGGGTGCAC TTTCGCCCCG GTATTATCCC
2732
2780
2928
2876
2925
GTCTGCATTT 3CCTATTTTT TTCGGGGAAÄ ATCCGCTCAT TGAGTATTCA TTTTTGCTCA GAGTGG3TTA AÄGAACGTTT GTATTGACGC
2985 3045 3105 3165 3225 3285 3345 3405 3465 3525 3585 3645 3705 3765 3825 3885 3945 4005 4065 4125 4185 4245 4305 4365 4425 4485 4545 4605 4665 4725 4785 4845 49C5 4965 5025 5025 5085 5145
Met Asn Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly
1 5 10 15
Lys Val Leu Gly Glu Thr íle Lye Aep Ala Leu Gly Glu Hiô íle Leu
20 25 30
Glu Arg Val G1U Thr íle Arg Lys Leu Ser Lye Ser Ser Arg Ala Gly
35 40 45
Asn Asp Ala Asn Arg Gin Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser
50 55 60
Asn Asp Glu Leu Leu Pro val Ala Arg Ala Phe Ser Gin Phe Leu Aen
6S 70 75 80
Leu Ala Aen Thr Ala Glu Gin Tyr His Ser íle Ser Pro Lys Gly Glu
85 90 95
Ala Ala ser Asn Pro Glu Val íle Ala Arg Thr Leu Arg Lye Leu Lys
1C0 105 110
Asn Gin Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr íle Lys Lys Ala Val Glu Ser
115 120 125
Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu íle Thr Arg
130 135 140
Arg Thr Leu íle His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cye Leu Lys Gin
145 153 155 160
Leu Aep Asn Lys Asp íle Ala Aep Tyr Glu His Asn Gin Leu Met • Arg
165 170 175
Arg Leu Arg Gin Leu íle Ala Gin Ser Trp His Thr Asp Glu íle Arg
180 185 190
Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala val
195 200 205
val Glu Aen Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu
210 215 220
Asn Glu Gin Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lye Leu Pre Val Glu Phe
225 230 235 Ž4C
Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly 31y Asp Arg Asp Gly Asr.
245 250 255
Pro Asn Val Thr Ala Asp íle Thr Arg Hie Val Leu Leu Leu Ser Arg
260 26S 270
Tip Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp íle Gin Val Leu Val Ser
275 2B0 285
Glu Leu ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu val GLy
290 295 300
Glu G1U Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly
325 330 335
Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gin Asn Glu Glu Leu
340 34 5 350
Trp GlU Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met
355 350 365
Gly íle íle Ala Asn Gly ASP Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
970 375 38C
Cye Phe Gly Val Pro Leu Val Arg íle Asp íle Arg Gin Glu Ser Thr
385 390 395 400
Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly íle Gly
405 410 415
Asp Tyr G1U Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gin Ala Phe Leu íle Arg
420 42S 430
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser
435 440 445
Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Aep Thr Cys Gin Val íle Ala Glu Ala
450 455 460
Pro Gin Gly Ser íle Ala Ala Tyr Val íle Ser Met Ala Lys Thr Pro
465 470 475 480
Ser Asp Val Leu Ala Val HÍ3 Leu Leu Leu Lys G1U Ala Gly íle Gly
405 490 495
Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn
500 505 510
Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gin Leu Leu Aan íle Asp Trp Tyr Arg
515 520 525
Gly Leu íle Gin Gly Lys Gin Met Val Met íle Gly Tyr ser Aep Ser
530 535 540
Ala Lye Asp Ala Gly val wet Ala Ala Ser Trp Ala Gin Tyr Gin Ala
S45 S50 555 560
Gin Asp Ala Leu íle Lys Thr Cye Glu Lys Ala Gly íle Glu Leu Thr
565 570 575
Leu Phe HÍS Gly Arg Gly Gly Ser íle Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala
580 585 590
His Ala Ala Leu Leu Ser Gin Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595 600 605
Arg Val Thr G1U Gin Gly Glu Met íle Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
610 615 62 0
Glu íle Thr Val Ser Ser Cys Ser Leu Tyr Thr Gly Ala íle Leu Glu
625 630 635 640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ses Txp Arg Arg íle
645 650 655
Met Asp G1U Leu Ser Val íle Ser Cys Asp val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670
Arg Glu Asn Lye Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu
6 75 680 685
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg
690 695 700
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala íle Pro Trp íle Phe Ala
705 710 715 720
Trp Thr Gin Aen Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr
725 730 735
Ala Leu Gin Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Ala
74C 745 750
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe ser Thr Arg Leu Gly Met Lev Glu
755 760 765
Met val Phe Ala Lys Ala Aep Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gin
770 775 780
Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn
785 790 755800
Leu Gin Glu Glu Asp íle Lys Val Val Leu Ala íle Ala Asn AspSer
805 810815
His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp íle Ala Glu Ser íle Gin Leu Arg 820 825830
Asn íle Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu Leu His 835 840845
Arg Ser Arg Gin Ala Glu Lye Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro Arg Val 850 855860
Glu Gin Ala Leu Met Val Thr Tie Ala Gly íle Ala Ala Gly Met Arg 865 870 875880
Asn Thr Gly (2) Informácie o sekv. č. 3:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná syntetická DNA (iii) Hypotetická: nie (xi) opis sekvencie: sekv. č. 3:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 (2) Informácie o sekv. č. 4:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 21 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná syntetická DNA (iii) Hypotetická: nie (xi) opis sekvencie: sekv. č. 4:
ACGGATTCA ATCTTACGGC C 21
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Aan
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762
Ala Asp Val Cys Glu íle Tyr Ser Asp val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
17C 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 81C
Asp Pro Arg íle val Pro Asn Ala Gin Lya Leu Glu Lys Leu Ser Phe
105 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GGT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Zle Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GIT GAA TAC GCT OGT GCA TTC AAT GK3 CCA CTT ooc GTA CGC 906
Arg Ser Val Clu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT eoc GGC ACT TTG ATT GCC CGC TCT ATG GAG 954
Ser Ser Tyr Ser Αβπ Asp Pro Gly Thr Leu íle Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
GAT ATT CCT GTG OKA GAA OCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002
Asp íle Pro Val Glu G1U Ala val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lya
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC CTT CTG GGT ATT TCC GAT AAC CCA GGC GAC 1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT CCG TTG CTT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098
Ala Ala Lys val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle Asp
280 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146
Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser val Glu ÄBp Gly Thr Thr Asp íle
295 300 305 310
ACG TTC ACC TCC CCT CGC CCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu
315 320 325
RAG AAG CTT CAG GTT CAG GTC AAC TOG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242
Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn val Leu Tyr Asp Asp
390 335 340
CAG GTC GGC AAA GTC tcc CTC GTG GGT GGT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290
Gin Val Gly Lye Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
CGT GTT ACC GCA GAG TTG ATG C-AA GGT CTG coc GTT GTC AAC GTG AAC 1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met G1U Ala Leu Arg Asp Val Aan Val Asn
360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1385
íle Glu Leu íle Ser Thr Ser G1U íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg
375 380 385 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT CCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG GAG TTĽ CAG 1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin
395 400 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
410 41S 420
AGTTTTAAAG GAGTA67TTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTOCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAúGT TATGCGCACC CTTITGGAAG AGCOCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCG7TCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 (2) Informácie o sekv. č.5:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 1643 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulárny typ: genomická DNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Crynebacíerium glutamicum (C) Kmeň: ATCC13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: mat peptid (B) Lokalizácia: 217..1482 (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 5:
(2) Informácie o sekv. č. 6:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 421 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 6:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTrľTQTCTC ΑΑΑΤΑΤΤΑΑΛ TCGAATATCA ATATACOGTC TGTTTATTGC AACGCATCCC AOTGCCTGAC ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT GCAGAAAGAA AACACTCCTC TCGCTACGTA GACACACTTT ATAAAGOTAG AGTTOAGCOG GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAO GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234
Met Ala Leu Val Val Gin
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg íle Arg Asn val
10 15 2C
GCT GAA CGG ATC GTT occ ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330
Ala Glu Arg íle Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val val
2b 30 35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378
val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu G1U Leu Ala
40 45 50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT OCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426
Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTG GCC ATG GCT ATT GAG 474
Thr Ala Gly Glu Arg íle Ser Asn Α1» Leu val Ala Met Ala íle Glu
75 90 85
TCC CTT □GC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Pbe Thr Gly Ser Gin Ala Gly VaL
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570
Leu Thr Thr G1U Arg His Gly Asn Ala Arg íle val Asp Val Thr Pro
105 110 115
GGT COT GTG OGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTF GCT 618
Gly Arg Val Arg Q1U Ala Leu Asp Glu Gly Lys íle Cys íle Val Ala
Met Ala Leu val val Gin
Lye Tyr Gly Gly ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg íle Arg Aan Val
10 15 20
Ala Glu Arg íle Val Ala Thr Lye Lys Ala Gly Asn Asp Val Val val
25 30 35
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Ä8p Met Leu Leu
55 60 65 70
Thr Ala Gly Glu Arg íle Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala íle Glu
75 80 85
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
90 95 100
60 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg íle Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
120 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys íle Cys íle Val Ala
180 120 125 130
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg ABp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
Ala Asp Val Cys Glu íle Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
Asp Pro Arg íle Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lya Leu Ser Phe
185 190 195
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys íle Leu Val Leu
20C 205 210
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg val Arg
215 220 225 230
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu íle Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
Asp íle Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
Ser Glu Ala Lye Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys pro Gly Glu
26S 270 275
Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Aap Ala Glu íle Asn íle Asp
280 285 290
Met Val Leu Gin Asn Val ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle
295 300 305 310
Thr Phe Thr cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu
315 320 32S
Lys Lys Leu Gin val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Aep Aap
390 335 340
Gin Val Gly Lye Val Ser Leu Val Gly Ale Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
íle Glu Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg
375 380 385 390
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ale Leu His Glu Gin Phe Gin
395 400 405
Leu Gly Gly Glu ASP G1U Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
410 415 420
(2) Informácie o sekv. č. 7:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 1643 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulárny typ: genomická DNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Crynebacterium glutamicum (C) Kmeň: ATCC13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: mat peptid (B) Lokalizácia: 964..1482 (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 7:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC TÔTTTATTOG ÄACGCATCCC AGTGGCTGÄG GCAGAAAGAA ÄACACTCCTC TGGCTAGGTA GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC GGCQGTTCCT OOCTTGAGÄQ TGCGGAACGC ACCAAGAÄGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT 3AACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT TTGGGTCGTO GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CG1TGACGGT AATGCACAGA AGCTCGAAAA GCTCAGCTTO TCCAÄGATTT tggtgctgcg cagtgttgaa
AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60
ACGCATCCGC TAAAGCOCCA GGAACCCTGT120
GACÄCAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAOAAATAT240
ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300
GTCTGCTCCG CÄATGGGAGA CACCACGGAT360
CCCGTTCCGC CAGCTCSTGA AATGGATATG420
GCrCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTŤ460
CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC54 0
GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600
GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660
GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720
GTGTATACCG CTGÄCCCGCG CATCGTTCCT760
GAAGÄÄATGC TGGAACTTGC TGCÍGTTGGC840
TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTrGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960
CCT GTG Het 1 GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1009
Glu Glu Ala Val 5 Leu Thr Gly Val Ala 10 Thr Aep Lye ser Glu 15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lya Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Aen íle Asp Met Val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152
Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA GTC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys
65 70 75
CTT CAG GTT CAG CGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248
Leu Gin val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val
60 85 90 95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG CGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296
Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Het Lys Ser Hls Pro Gly Val
100 105 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Aen Val Asn Ila Glu
115 120 125
TTG ATT TCC AOC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392
Leu íle ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp
130 135. 14 0
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly
145 150 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GCC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490
Gly Glu A3p Glu Ala val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170 172
(2) Informácie o sekv. č. 8:
(i) Vlastnosti sekvencie:
(A) Dĺžka: 172 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 6:
Met 1 Glu Glu Ala Val 5 Leu Thr Gly Val Ala Thr 10 Asp Lys Ser O1U 15
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Aen íle Asp Met Val
35 40 45
Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe
50 55 60
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys
65 70 75
Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val
80 85 90 95
Gly Lys val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser HÍ5 Pro Gly Val
100 105 110
Thr Ala Glu Phe Met G1U Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn íle Glu
115 120 125
Leu íle Ser Thr Ser G1U íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp
130 135 140
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu Hla Glu Gin. Phe Gin Leu Gly
145 150 155
Gly u Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170 172

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    L Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza pochádzajúca z mikroorganizmu patriaceho do rodu Eschrichia, ktorá nie je citlivá na spätnú inhibíciu kyselinou asparágovou, pričom je rezistentná proti zlúčenine vybranej zo skupiny, ktorá zahŕňa 3-brómpyruvát, β-hydrazid kyseliny asparágovej a kyselinu DL-treo-P-hydroxyasparágovú.
  2. 2. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa nároku 1, v ktorej je 625. kyselina glutámová nahradená lyzínom, pričom počítanie aminokyselín sa začína na N-konci fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
  3. 3. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa nároku 1, v ktorej je 222. arginín nahradený histidínom a 223. kyselina glutámová je nahradená lyzínom, pričom počítanie aminokyselín sa začína na N-konci fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
  4. 4. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa nároku 1, v ktorej je 288. serín nahradený fenylalanínom, 289. kyselina glutámová je nahradená lyzínom, 551. metionín je nahradený izoleucínom a 804. kyselina glutámová je nahradená lyzínom, pričom počítanie aminokyselín sa začína na N-konci fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
  5. 5. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa nároku 1, v ktorej je 867. alanín nahradený treonínom, pričom počítanie aminokyselín sa začína na N-konci fosfoenolpyruvátkarboxylázy.
  6. 6. DNA fragment, ktorý' kóduje mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
  7. 7. Mikroorganizmus, ktorý má prístupové číslo FERM BP-4734.
  8. 8. Mikroorganizmus, ktorý má prístupové číslo FERM BP-4735.
  9. 9. Mikroorganizmus, ktorý má prístupové číslo FERM BP-4736.
  10. 10. Mikroorganizmus, ktorý má prístupové číslo FERM BP-4737.
  11. 11. Mikroorganizmus patriaci do rodu Escherichia alebo ku koryneformným baktériám, ktorý je transformovaný prostredníctvom umožnenia integrácie DNA fragmentu podľa nároku 6 do chromozomálnej DNA.
  12. 12. Rekombinantná DNA vytvorená ligáciou DNA fragmentu podľa nároku 6 s vektorovou DNA, ktorá je schopná autonómne sa replikovať v bunkách baktérií patriacich do rodu Escherichia alebo v koryneformných baktériách.
  13. 13. Mikroorganizmus patriaci do rodu Escherichia alebo ku koryneformným baktériám, transformovaný s rekombinantnou DNA podľa nároku 12.
  14. 14. Spôsob selekcie E. coli, ktorá produkuje mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu s mutáciou na znecitlivenie spätnej inhibície fosfoenolpyruvátkarboxylázy kyselinou asparágovou, vyznačujúci sa tým,že zahŕňa krok kultivácie uvedenej E. coli v prítomnosti zlúčeniny vybranej zo skupiny, ktorá obsahuje 3-brómpyruvát, β-hydrazid kyseliny asparágovej a kyselinu DL-treo-β-hydroxyasparágovú.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m , že mutantnou fosfoenolpyruvátkarboxylázou je fosfoenolpyruvátkarboxyláza podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
  16. 16. Spôsob produkcie mutantnej fosfoenolpyruvátkarboxylázy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok izolácie fosfoenolpyruvátkarboxylázy z E. coli selektovanej spôsobom podľa nároku 14.
  17. 17. Spôsob produkcie DNA fragmentu, ktorý kóduje mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok izolácie DNA fragmentu, ktorý kóduje mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu z E. coli selektovanej spôsobom podľa nároku 14.
  18. 18. Spôsob produkcie mikroorganizmu majúceho mutantnú fosfoenolpyruvátkarboxylázu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa krok zavádzania DNA fragmentu produkovaného spôsobom podľa nároku 17 do mikroorganizmu patriaceho do rodu Eschericha alebo ku koryneformným baktériám.
  19. 19. Spôsob výroby aminokyseliny, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa nasledujúce kroky:
    kultiváciu mikroorganizmu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 11 alebo získaného spôsobom podľa nároku 18 vo vhodnom médiu; a oddelenie aminokyseliny vybranej zo skupiny, ktorá zahŕňa L-lyzín, L-treonín, L-metionín, L-izoleucín, kyselinu L-glutámovú, L-arginín a L-prolín, od média.
SK204-96A 1993-08-24 1994-08-17 Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny SK283369B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20977693 1993-08-24
JP20977593 1993-08-24
JP15387694 1994-07-05
PCT/JP1994/001365 WO1995006114A1 (fr) 1993-08-24 1994-08-17 Allele de phosphenolpyruvate carboxylase, gene de cet allele et procede de production de l'acide amine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK20496A3 SK20496A3 (en) 1996-11-06
SK283369B6 true SK283369B6 (sk) 2003-06-03

Family

ID=27320552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK204-96A SK283369B6 (sk) 1993-08-24 1994-08-17 Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5876983A (sk)
EP (1) EP0723011B1 (sk)
KR (2) KR100337959B1 (sk)
CN (1) CN1179043C (sk)
AT (1) ATE220099T1 (sk)
AU (1) AU682547B2 (sk)
BR (1) BR9407625A (sk)
CA (1) CA2169170C (sk)
CZ (1) CZ289051B6 (sk)
DE (1) DE69430919T2 (sk)
HU (1) HU219600B (sk)
MY (1) MY112250A (sk)
PL (1) PL181380B1 (sk)
SK (1) SK283369B6 (sk)
WO (1) WO1995006114A1 (sk)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6969782B2 (en) 1993-10-06 2005-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
JPH09285294A (ja) * 1996-04-23 1997-11-04 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
KR100697552B1 (ko) * 1997-07-18 2007-03-21 아지노모토 가부시키가이샤 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
SK284235B6 (en) * 1997-10-04 2004-11-03 Forschungszentrum Juelich Gmbh Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method
AU756507B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
US20030087381A1 (en) * 1998-04-13 2003-05-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
CA2325598A1 (en) 1998-04-13 1999-10-21 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
MXPA01006290A (es) * 1998-12-23 2002-04-17 Massachusetts Inst Technology Piruvato carboxilasa a partir de corynebacterium glutamicum.
CA2377488A1 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
US6599732B1 (en) 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
JP4254103B2 (ja) 1999-07-02 2009-04-15 味の素株式会社 シュークロースｐｔｓエンザイムｉｉをコードするｄｎａ
DE19931314A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin
CA2387605A1 (en) * 1999-10-13 2001-04-19 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. High yield protein expression system and methods
US6727411B2 (en) 1999-12-13 2004-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
ATE417094T1 (de) * 1999-12-24 2008-12-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung von l-aminosäure
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
BRPI0016995B1 (pt) 2000-01-21 2016-03-08 Ajinomoto Kk bactéria escherichia coli geneticamente modificada, e, método para produzir l-lisina
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US7368266B2 (en) 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
US20030115638A1 (en) * 2001-08-17 2003-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Plants having increased amino acids content and methods for producing the same
AU2003205041A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
KR100498971B1 (ko) * 2003-04-04 2005-07-04 씨제이 주식회사 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법
EP1735339A2 (en) * 2004-04-09 2006-12-27 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
KR100768748B1 (ko) 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
WO2007017710A1 (en) 2005-08-11 2007-02-15 Metabolic Explorer Process for the preparation of aspartate and derived amino acids like lysine, threonine, isoleucine, methionine, homoserine, or valine employing a microorganism with enhanced isocitrate lyase and/or malate synthase expression
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2126042A4 (en) * 2007-01-12 2010-08-04 Univ Colorado Regents COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE PRODUCTION TOLERANCE OF ORGANIC CHEMICALS FROM MICROORGANISMS
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
US8883453B2 (en) * 2007-04-30 2014-11-11 University Of Maryland Codon specific mutagenesis
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
US8048624B1 (en) 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
MX2012003604A (es) 2009-09-27 2012-09-12 Opx Biotechnologies Inc Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos.
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CA2781400A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Production of an organic acid and/or related chemicals
CN102781901B (zh) 2010-02-11 2016-08-03 梅塔玻利克斯公司 用于从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯生物质制备单体组分的方法
WO2012103263A2 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Finley Kenneth R Compositions and methods for malate and fumarate production
EP2668281A4 (en) 2011-01-25 2015-08-26 Cargill Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF SUCCINATE MANUFACTURE
EP2495317A1 (en) 2011-03-01 2012-09-05 Technische Universität Hamburg-Harburg Modified phosphoenolpyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum and uses thereof
US20140114082A1 (en) 2011-06-08 2014-04-24 Metabolix, Inc. Biorefinery Process For THF Production
WO2013023140A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Metabolix, Inc. Post process purification for gamma-butyrolactone production
WO2014018757A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Cargill Incorporated Yeast cells having reductive tca pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous nad(p)+ transhydrogenase enzyme
CN104718282A (zh) 2012-08-10 2015-06-17 Opx生物工艺学公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
US9512057B2 (en) 2013-03-15 2016-12-06 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid compositions
US20150057465A1 (en) 2013-03-15 2015-02-26 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
KR101773755B1 (ko) 2013-05-13 2017-09-01 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산의 제조법
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
CN106795483A (zh) 2013-07-19 2017-05-31 嘉吉公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
WO2015050234A1 (ja) 2013-10-02 2015-04-09 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
CN105132388B (zh) * 2015-09-06 2018-02-23 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
CN105907730B (zh) * 2016-05-11 2019-06-21 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用
CN110494566A (zh) 2017-02-02 2019-11-22 嘉吉公司 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞
MX2020002345A (es) * 2017-09-01 2020-07-13 Univ Niigata Metodo eficiente para producir ambreina.
CN116113699A (zh) * 2020-12-24 2023-05-12 武汉远大弘元股份有限公司 改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用
CN115806962A (zh) * 2021-09-15 2023-03-17 中国科学院天津工业生物技术研究所 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2223754B (en) * 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
JPH07108228B2 (ja) * 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド

Also Published As

Publication number Publication date
HU9600240D0 (en) 1996-03-28
BR9407625A (pt) 1997-01-21
WO1995006114A1 (fr) 1995-03-02
PL313119A1 (en) 1996-06-10
CA2169170C (en) 2007-01-09
CN1133615A (zh) 1996-10-16
AU8099194A (en) 1995-03-21
CA2169170A1 (en) 1995-03-02
ATE220099T1 (de) 2002-07-15
EP0723011B1 (en) 2002-07-03
US5919694A (en) 1999-07-06
KR100337959B1 (ko) 2002-11-23
CZ52496A3 (en) 1996-06-12
EP0723011A4 (en) 1996-05-21
PL181380B1 (pl) 2001-07-31
KR960704029A (ko) 1996-08-31
SK20496A3 (en) 1996-11-06
CZ289051B6 (cs) 2001-10-17
DE69430919T2 (de) 2003-02-27
HU219600B (hu) 2001-05-28
HUT73690A (en) 1996-09-30
US5876983A (en) 1999-03-02
EP0723011A1 (en) 1996-07-24
DE69430919D1 (de) 2002-08-08
CN1179043C (zh) 2004-12-08
AU682547B2 (en) 1997-10-09
MY112250A (en) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283369B6 (sk) Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny
US6221636B1 (en) Method for producing L-lysine
US8067210B2 (en) Method of producing lysine by culturing a host cell expressing a polynucleotide encoding a feedback resistant aspartokinase from corynebacterium
DK2726615T3 (en) VARIETIES OF THE PROMOTER IN THE GLYCERINALDEHYD-3 PHOSPHATE DEHYDROGENASE CODING GAP GEN
KR20200026881A (ko) 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도
SK284739B6 (sk) Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu
CZ390397A3 (cs) Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu
HU224492B1 (hu) Eljárás L-lizin előállítására
CA2318507A1 (en) Novel nucleotide sequences coding for the pgi gene
JP2015529459A (ja) フィードバック阻害が低下したまたはオフとなった酵素をコードする遺伝子を含有するベクターの製造方法、ならびにアミノ酸およびヌクレオチドを生産するための、その使用
KR20150003752A (ko) 피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제
TW200533748A (en) Gene variants coding for proteins of the metabolic pathway of fine chemicals
WO2023222510A1 (en) Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
US7141664B2 (en) Genes coding carbon metabolism and energy-producing proteins
JP3013711B2 (ja) 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法
JP3680324B2 (ja) 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法
EP3015547B1 (en) Rna polymerase sigma factor 32 variant and production method for l-threonine using a microorganism expressing the variant
WO2023151407A1 (zh) 苏氨酸生产菌株的构建方法
RU2133772C1 (ru) Модифицированная фосфоенолпируваткарбоксилаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli, рекомбинантная днк, способ получения аминокислоты (варианты), способ селекции клеток escherichia coli, способ получения модифицированной фосфоенолпируваткарбоксилазы, способ получения фрагмента днк и способ получения микроорганизма

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20130817