SK284739B6 - Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents

Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu Download PDF

Info

Publication number
SK284739B6
SK284739B6 SK593-97A SK59397A SK284739B6 SK 284739 B6 SK284739 B6 SK 284739B6 SK 59397 A SK59397 A SK 59397A SK 284739 B6 SK284739 B6 SK 284739B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
leu
plasmid
gly
glu
Prior art date
Application number
SK593-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK59397A3 (en
Inventor
Hirano Seiko
Sugimoto Masakazu
Nakano Eiichi
Izui Masako
Hayakawa Atsushi
Yoshihara Yasuhiko
Nakamatsu Tsuyoshi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=15324210&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK284739(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK59397A3 publication Critical patent/SK59397A3/sk
Publication of SK284739B6 publication Critical patent/SK284739B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Je opísaný vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformných baktérií, koryneformné baktérie transformované týmto vektorom. Spôsob prípravy L-lyzínu kultiváciou mikroorganizmov, získaných modifikáciou koryneformných baktérií, použitých na fermentatívnu prípravu aminokyselín pomocou techniky, založenej na genetickom inžinierstve.

Description

Oblasť vynálezu
Vynález sa týka vektora autonómne replikovateľného v bunkách koryneformných baktérií a spôsobu prípravy L-lyzínu kultiváciou mikroorganizmov, získaných modifikáciou koryneformných baktérií, použitých na fermentatívnu prípravu aminokyselín a podobných látok, pomocou techniky, založenej na genetickom inžinierstve.
Doterajší stav techniky
L-lyzín, ktorý sa používa ako prísada do krmív, sa zvyčajne vyrába fermentačným spôsobom s použitím mutantných kmeňov, ktoré produkujú L-lyzín a ktoré patria ku koryneformným baktériám. V súčasnosti sú známe rôzne baktérie, ktoré produkujú L-lyzín a sú vytvorené umelou mutáciou, pri ktorej sa vychádza z divokých typov kmeňov, ktoré patria ku koryneformným baktériám.
Čo sa týka koryneformných baktérií, je zverejnený vektorový plazmid, ktorý je v bakteriálnych bunkách autonómne replikovateľný a má značkovací gén odolnosti proti liečivám (pozri patent USA číslo 4514502) a je zverejnený spôsob zavedenia génu do bakteriálnych buniek (napríklad prihláška japonského patentu číslo 2-207 791). Zverejnená je tiež možnosť pestovania baktérií, produkujúcich L-trconin alebo L-izoleucín použitím techniky, ako sa opisuje v (pozri patenty USA čísla 4 452 890 a 4 442 208). Na pestovania baktérií produkujúcich L-lyzín je známa technika, pri ktorej sú gény, zúčastňujúce sa na biosyntéze L-lyzínu začlenené do vektorového plazmidu, aby sa gén v bunkách amplifikoval (pozri napríklad prihlášku japonského patentu číslo 56-160 997).
Známe gény na biosyntézu L-lyzínu zahŕňajú napríklad dihydropikolinátový reduktázový gén (prihláška japonského patentu 7-75 578) a diaminopimelátový dehydrogenázový gén (Ishino, S. et al., Nucleic Acid Res., 15, 3917 (1987)), čo sú klonované gény, podielajúce sa na biosyntéze L-lyzínu, ďalej aj fosfoenolpyruvátový karboxylázový gén (japonský publikovaný patent číslo 6-55 149), a diaminopimelátový dekarboxylázový gén (prihláška japonského patentu 60-62 994), ktorých amplifikácia ovplyvňuje produktivitu tvorby L-lyzínu.
Ako už bolo uvedené, pomocou amplifikácie génov L-lyzínovej biosyntézy sa dosiahli určite úspešné výsledky pri zlepšení produktivity tvorby L-lyzínu. Amplifikácia niektorých génov však znižuje rýchlosť rastu baktérií, hoci zvyšuje produktivitu tvorby L-lyzínu, čoho celkovým výsledkom je zníženie rýchlosti tvorby L-lyzinu.
Nezaznamenal sa nijaký prípad snahy o zvýšenie rastu zosilňovaním génu biosyntézy L-lyzínu. V súčasných podmienkach nie je známy žiadny prípad s koryneformnými baktériami, v ktorom by sa niekomu podarilo významné zlepšenie výťažku L-lyzínu kombináciou rôznych génov L-lyzínovej biosyntézy bez potláčania ich rastu.
Podstata vynálezu
Podstatou tohto vynálezu je zlepšiť schopnosť produkovať L-lyzín bez zníženia rýchlosti rastu koryneformnej baktérie kombinovaným zosilnením rôznych génov L-lyzínovej biosyntézy v koryneformných baktériách.
Keď sa predmetná látka pripravuje fermentačnou cestou použitím mikroorganizmu, potom je výnimočne dôležitým faktorom rýchlosť produkcie, ako aj výťažok predmetnej látky vzťahovaný na východiskový materiál. Pred metná látka sa môže pripravovať významne nenákladným spôsobom zvýšením produkčnej rýchlosti na jednotku fermentačného zariadenia. Podľa toho je v priemysle mimoriadne dôležité, aby boli vzájomne zosúladené výťažok fermentácie a produkčná rýchlosť. Tento vynález navrhuje riešenie uvedeného problému fermentačným spôsobom produkcie L-lyzínu použitím koryneformných baktérii.
Tento vynález je založený na skutočnosti, že rast koryneformných baktérií možno zlepšiť a môže sa zlepšiť aj rýchlosť tvorby L-lyzínu, a to zosilnením DNA sekvencie, kódujúcej diaminopimelátovú dekarboxylázu (ak je to vhodné, tak sa diaminopimelátová dekarboxyláza v ďalšom texte označuje ako „DDC“ a gén, kódujúci DDC proteín sa v ďalšom označuje ako „lysA“) a zároveň aj DNA sekvencie, kódujúcej diaminopimelátovú dehydrogenázu (ak je to vhodné, tak sa v ďalšom texte diaminopimelátová dehydrogenáza označuje ako e„DDH“ a gén, kódujúci DDH proteín sa v ďalšom označuje ako „ddh“), na rozdiel od prípadu, v ktorom uvedené DNA sekvencie sa každá z nich zosilňuje jednotlivo.
Tento vynález je konkrétne založený na vektore autonómne replikovateľnom v bunkách koryneformných baktérií, obsahujúcom sekvenciu DNA kódujúcu diaminopimeíátová dehydrogenázu a sekvenciu DNA kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu.
Z iného hľadiska tento vynález uvádza koryneformné baktérie obsahujúce zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dehydrogenázu a zosilnenú sekvenciu DNA, kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu.
Ešte z ďalšieho hľadiska tento vynález predkladá spôsob prípravy L-lyzínu, zahŕňajúci stupeň kultivácie koryneformných baktérii, ako sa opisujú, v prostredí, ktoré umožňuje tvorbu L-lyzinu a jeho zhromažďovanie (akumuláciu) v kultúre a stupeň oddelenia L-lyzínu od kultúry.
V tomto vynáleze sa používaný výraz koryneformné baktérie vzťahuje na skupinu mikroorganizmov, ako je definované v Bergey's Manual of Determinativc Bacteriology, 8. vydanie, strana 599 (1974), ktoré sú gram-pozitivne, kyseline nie odolné, tyčinky, ktoré nemajú schopnosť vytvárať spóry.
Koryneformné baktéria zahŕňajú baktérie, ktoré prináležia k rodu Corynebacterium, baktérie, ktoré prináležia k rodu Brevivabacterium, ktoré boli doteraz zaraďované v rode Brevibacterium, ale v súčasnosti sa považujú za baktérie patriace do rodu Corynebacterium, a baktérie patriace k rodu Brevibacterium, veľmi blízke baktériám, patriacim k rodu Corynebacterium.
Podľa tohto vynálezu sa môže zlepšiť schopnosť koryneformných baktérií produkovať L-lyzin, môže sa zvýšiť tiež rýchlosť ich rastu. Tento vynález sa môže využiť aj na bežné, L-lyzín produkujúce baktérie, ako aj na kmene s vysokou produktivitou tvorby L-lyzínu.
Podrobný opis vynálezu
Vynález sa podrobne vysvetli v ďalšom texte.
Príprava génov L-lyzínovej biosyntézy, použitých pre tento vynález
Uvedené gény L-lyzínovej biosyntézy, použité v tomto vynáleze sa môžu získať jednak prípravou chromozomálnej DNA z baktérií ako donorov DNA, jednak konštrukciou chromozomálnej DNA knižnice použitím plazmidového vektora alebo podobným spôsobom, vypestovaním kmeňa obsahujúceho vyžadovaný gén z knižnice, a získaním (z uvedeného vybraného kmeňa) rekombinantnej DNA, do ktorej bol uvedený gén vložený. Donor génu L-lyzínovej bio syntézy, použitý v tomto vynáleze nie je špecificky vymedzený za predpokladu, že vyžadovaný gén L-lyzínovej biosyntézy exprimuje enzýmový proteín, ktorý pôsobí v bunkách koryneformných baktérií. Uvedeným donorom DNA však sú najmä koryneformné baktérie.
Sekvencie génov lysA a ddh, ktoré vznikajú v koryneformných baktériách, sú známe. Podľa toho sa môžu získať amplifikáciou spôsobom polymerázovej reťazovej reakcie (PCR); pozri White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Každý z génov L-lyzínovej biosyntézy, použitých v tomto vynáleze, možno získať spoľahlivými spôsobmi, doloženými príkladmi.
Príprava mutantného lysA lysA sa môže izolovať z chromozómov koryneformných baktérií prípravou chromozomálnej DNA, napríklad spôsobom, opísaným autormi Saito a Miura (H. Saito a K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) a amplifikáciou lysA polymerázovou reťazovou reakciou (PCR; pozri White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Donor DNA nie je špecificky obmedzený, ale ako príklad sa uvádza kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
V koryneformných baktériách tvorí lysA spolu s argS (arginyl-tRNA syntázový gén) operón a lysA jestvuje v smere od argS. Expresia lysA je regulovaná promótorom, nachádzajúcim sa proti smeru od argS (pozri Joumal of Bacteriology, Nov., 7356 až 7362 (1993)). DNA sekvencie týchto génov sú známe u Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology, 4 (11), 1819 až 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212, 112 až 119 (1988)), na základe čoho sa môžu pripraviť DNA primery pre PCR. Také DNA primery sú osobitne doložené príkladom 23-mérov DNA, ktoré majú nukleotidová sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 1 Zoznamu sekvencií (zodpovedajúce nukleotidovým číslam 11 až 33 v nukleotidovej sekvencii, opísanej v Molecular Microbiology, 4 (11), 1819 až 1830 (1990)) a v sekvencií SEQ ID NO: 2 Zoznamu sekvencií (zodpovedujúca nukleotidovým číslam 1370 až 1392 nukleotidovej sekvencie, opísanej v Molecular and Generál Genetics, 212, 112 až 119(1988)).
V ďalej opísaných príkladoch sa na posilnenie lysA použil fragment DNA, obsahujúci promótor, argS a lysA. Pre tento vynález však argS nie je nevyhnutný. Možno použiť DNA fragment, v ktorom je lysA ligovaný v polohe práve v smere od promótora.
Sekvencia nukleotidov fragmentu DNA, obsahujúceho argS a lysA a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, uvedenou v SEQ ID NO: 3. Príklad sekvencie aminokyselín, kódovanej argS je znázornený v SEQ ID NO: 4, a príklad sekvencie aminokyselín, kódovanej lysA je znázornený v SEQ ID NO: 5. Popri fragmentoch DNA, kódujúcich tieto aminokyselinové sekvencie, môže tento vynález rovnako použiť DNA fragmenty, kódujúce v podstate rovnaké aminokyselinové sekvencie, ako sú aminokyselinové sekvencie, znázornené v SEQ ID NO: 5, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú, napríklad, na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že to nemá vplyv na DDC účinnosť.
DNA môže byť syntetizovaná bežnými spôsobmi použitím DNA syntetizátora, napríklad modelu 380B (vyrábaného v Applied Biosystems) a použitím fosfoamiditínového spôsobu (pozri Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)). PCR sa môže vykonať použitím zariadenia DNA Thermal Cycler, modelu PJ2000, vyrábaného firmou Takara Shuzo a použitím Taq DNA polymerázy s zhode so spôsobom, udávaným dodávateľom.
Je výhodné, ak lysA, zosilnený PCR, je ligovaný s vektorom DNA, ktorý je autonómne replikovateľný v bunkách E. coli a/alebo koryneformných baktériách a pred tým je do buniek E. coli zavedená rekombinantná DNA. Takéto opatrenie uľahčuje ďalšiu prípravu. Autonómne replikovateľný vektor v bunkách E. coli je najmä plazmidový vektor, ktorý je výhodne autonómne replikovateľný v bunkách hostiteľa vrátane, napríklad, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 a RSF1010.
Ak sa fragment DNA, ktorý má schopnosť umožniť plazmidu, aby sa autonómne replikoval v koryneformných baktériách, vlož! do týchto vektorov, môžu sa potom použiť ako takzvaný kyvadlový autonómne replikovateľný vektor aj do E. coli, aj do koryneformných baktérií.
Uvedený kyvadlový vektor zahŕňa v ďalšom uvedené vektory pričom sa uvádzajú mikroorganizmy, ktoré obsahujú tieto vektory a v zátvorkách sú ich prístupové čísla v medzinárodných depozitároch.
pHC4: Escherichia coli AJ 12617 (FERM BP-3532) pAJ655:
Escherichia coli AJ 11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutaminicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844:
Escherichia coli AJ 11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutaminicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611:
Escherichia coli AJ 11884 (FERM BP-138) pAJ3148:
Corynebacterium glutaminicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440:
Bacillus subtilis AJ 11901 (FERM - BP-140).
Tieto vektory možno získať z deponovaných mikroorganizmov nasledovne. Bunky oddelené vo fáze logaritmického rastu sa podrobia lýze použitím lyzozómu a SDS, nasleduje oddelenie od lyzátu odstredením pri 30 000 x g, aby sa získal supematant. Do supematantu sa pridá polyetylénglykol, nasleduje fŕakcionácia a čistenie pomocou odstreďovania s rovnovážnym gradientom hustoty roztoku chlorid cézny - etidiumbromid.
E. coli sa môže transformovať zavedením plazmidu, napríklad podľa spôsobu, ktorý opísal D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), alebo spôsobom, v ktorom sa na receptorové bunky pôsobí chloridom vápenatým, aby sa zvýšila priepustnosť pre DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Príprava ddh
Fragment DNA, ktorý obsahuje ddh možno pripraviť z chromozómov koryneformných baktérií pomocou PCR. DNA donor nie je špecificky vymedzený, ale je doložený príkladom kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869.
DDH gén je známy pri Corynebacterium glutaminicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), na základe čoho sa môžu pripraviť primery pre PCR. Také primery sú špecificky doložené príkladom 20-mérov DNA, ktoré majú sekvencie nukleotidov, uvedené v SEQ ID NO: 6 a 7 Zoznamu sekvencií. Syntézy DNA, PCR a príprava plazmidu, nesúceho získaný ddh sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako už uvedená príprava lysA.
Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho ddh a z nukleotidovej sekvencie odvodená aminokyselinová sekvencia sa uvádzajú v SEQ ID NO: 8. Samotná sekvencia aminokyselín je znázornená v SEQ ID NO: 9. Popri
DNA fragmentoch, kódujúcich túto aminokyselinovú sekvenciu, možno v tomto vynáleze rovnako použiť DNA fragmenty, kódujúce aminokyselinové sekvencie v podstate rovnaké, ako sú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 9, najmä sekvencie aminokyselín, ktoré majú mutáciu, založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín, za predpokladu, že to nemá podstatný vplyv na DDC účinnosť.
Rekombinantná DNA a koryneformné baktérie podľa tohto vynálezu
Koryneformné baktérie podľa tohto vynálezu obsahujú sekvenciu DNA, kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu (lysA) a DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dehydrogenázu (ddh), ktoré sú posilnené. Výraz „sekvencia DNA je posilnená“ sa v tomto texte vzťahuje na skutočnosť, že sa zvyšuje vnútrobunková účinnosť enzýmu kódovaného uvedenou DNA sekvenciou, napríklad zvýšením počtu kópii génu, použitím silného promótora, použitím génu, kódujúceho enzým, ktorý má vysoko špecifickú účinnosť, alebo kombináciou týchto spôsobov.
Koryneformné baktérie, ku ktorým sa vzťahujú uvedené DNA sekvencie, sú koryneformné baktérie, produkujúce L-lyzín. Príklady takých baktérii zahŕňajú kmene divokých typov baktérií, produkujúcich L-lyzín, umelé mutantné kmene a koryneformné baktérie, posilnené spôsobmi genetického inžinierstva na produkciu L-lyzínu. Aj keď baktérie majú nízku produktivitu tvorby L-lyzínu, možno ju zvýšiť zosilnením lysA a ddh. Ak majú baktérie vysokú produktivitu tvorby L-lyzínu, možno ďalej zvýšiť účinnosť posilnením lysA a ddh.
Kmeň produkujúci L-lyzin, ktorý patrí ku koryneformným baktériám
Príklady koryneformných baktérií, použitých na zavedenie lysA a ddh zahŕňajú napríklad ďalej uvedené kmene, produkujúce L-lyzín:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14066; Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Okrem uvedených bakteriálnych kmeňov sú použitelné ako hostiteľské také kmene, v ktorých sú lysA a ddh posilnené a zahŕňajú napríklad mutantné kmene, ktoré majú schopnosť produkovať L-lyzín, odvodené od uvedených kmeňov. Také umelé mutantné kmene zahŕňajú nasledovné: S-(2-aminoetyl)-cysteínu (ďalej označovaný skrátene ako „AEC“) rezistentné mutantné kmene (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470), japonský patent číslo 56-1 914, 56-1 915, 57-14 157, 57-14 158, 57-30 474, 58-10 075, 59-4 993, 61-35 840, 62-24 074, 62-36 673, 5-11 958, 7-112 437 a 7-112 438); mutantné kmene, ktoré pre svoj rast potrebujú aminokyselinu, ako je L-homoserín (japonský patent čísla 48-28 078 a 56-6 499); mutantné kmene, ktoré vykazujú rezistenciu proti ARC a potrebujú aminokyseliny, ako je L-leucín, L-homoserín, L-prolín, L-serín, L-arginín, L-alanin a L-valin (patenty USA číslo 3 708 395 a 3 825 472); mutantné kmene produkujúce L-lyzín, ktoré vykazujú rezistenciu proti DL-a-amino-e-kaprolaktámu, α-amino-lauryllaktámu, aspartátovým analógom, sulfónovým liečivám, chinoidom a N-lauroylleucínu; mutantné kmene produkujúce L-lyzín, ktoré vykazujú rezistenciu k inhibítorom oxyaloacetátovej dekarboxylázy alebo enzýmom dýchacieho systému (prihlášky japonských patentov čísla 50-53 588, 50-31 093, 52-102 498, 53-9 394, 53-86 089, 55-9 783, 55-9 759, 56-32 995 a 56-39 778, a japonské patenty čísla 53-43 951 a 53-1 833); mutantné kmene produkujúce L-lyzín, ktoré potrebujú inositol alebo kyselinu octovú (prihlášky japonských patentov čísla 55-9 784 a 56-8 692); mutantné kmene produkujúce L-lyzín, ktoré sú citlivé k fluórpyrohroznovej kyseline alebo na teplotu nie nižšiu ako 34 °C (prihlášky japonských patentov 55-9 783 a 53-86 090); a produkčné mutantné kmene, ktoré patria k rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, ktré vykazujú rezistenciu k etylénglykolu a produkujú L-lyzín (patent USA číslo 4 411 997).
Koryneformné baktérie produkujúce L-lyzín, ktoré majú zosilnenú produktivitu L-lyzínu genetickou rekombináciou
Produkčná rýchlosť L-lyzínu sa môže ďalej zvýšiť posilnením lysA a ddh, ak koryneformné baktérie boli na produkciu L-lyzínu zosilnené spôsobmi genetického inžinierstva. Môže sa to dosiahnuť napríklad vložením génu kódujúceho enzým, ktorý má mutáciu, ktorá spôsobuje znecitlivenie spätnej inhibície, pričom divoký typ uvedeného enzýmu je vystavený spätnej inhibícii medzi enzýmami, zúčastňujúcimi sa na biosyntéze L-lyzínu, alebo posilnením iného génu L-lyzínovej biosyntézy, ako je lysA a ddh.
Koryneformné baktérie, posilnené na L-lyzinovú produkciu zahŕňajú koryneformné baktérie, obsahujúce sekvenciu DNA, kódujúcu aspartokinázu, ktoré sú znecitlivené na spätnú inhibíciu L-lyzínom a L-trconínom (aspartokináza sa ďalej označuje ako „AK“, gén kódujúci AK proteín sa v ďalšom označuje ako „lysC“ a gén kódujúci AK proteín, ktorý je znecitlivený na spätnú inhibíciu L-lyzínom a L-treonínom) a zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu dihydropikolinátovú reduktázu (dihydropikolinátová reduktáza je ďalej označovaná ako „DDPR“, gén kódujúci DDPR protein sa ďalej označuje ako „dapB“, ak je to nevyhnutné), a koryneformné baktérie ďalej obsahujúce posilnenú sekvenciu DNA, kódujúcu dihydropikolinátovú syntázu (dihydropikolinátová syntáza sa v ďalšom označuje ako „DDPS“, gén kódujúci DDPS proteín sa ďalej označuje ako „dapA“, ak je to nevyhnutné). Každý z génov biosyntézy L-lyzínu, použitý v tomto vynáleze je získateľný spôsobmi, doloženými príkladmi v ďalšom texte.
Príprava mutantného lysC
DNA fragment, ktorý obsahuje mutantný lysC sa môže pripraviť z mutantného kmeňa, v ktorom je v podstate znecitlivená synergická spätná inhibícia AK aktivity L-lyzínom a L-treonínom (zverejnený medzinárodný patent WO 94/25605). Taký mutantný kmeň možno získať napríklad zo skupiny buniek, vznikajúcich z divokého typu kmeňa koryneformných baktérií, vystavených mutačnému účinku vplyvom bežného mutačného pôsobenia, ako je ožiarenie ultrafialovým svetlom alebo pôsobenie mutačného činidla, ako je N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín. AK aktivita sa môže merať použitím spôsobu, ktorý opísal Miyajima R. et al., The Joumal of biochemistry, 63 (2), 139 až 148 (1968). Ako mutantný kmeň je najvýhodnejší kmeň zastúpený L-lyzín produkujúcimi baktériami AJ3445 (FERM P-1944), odvodený mutačným pôsobením z divokého typu kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (ktorý má v súčasnosti zmenený názov Corynebacterium glutamicum).
Mutantný lysC je voliteľne získateľný in vitro mutačným pôsobením plazmidovej DNA, obsahujúcej divoký typ lysC. Z iného hľadiska je špecificky známa informácia o mutácii, ktorá vedie k znecitlivenniu synergickej spätnej inhibície AK L-lyzínom a L-treonínom (medzinárodný patent WO94/25605). Podľa nej sa môže lysC pripraviť tiež z divokého typu lysC na základe uvedenej informácie, napríklad polohové usmerneným spôsobom mutagenézy.
Fragment DNA, obsahujúci lysC, sa môže pripraviť z chromozómu koryneformných baktérii spôsobom PCR. Primery DNA možno doložiť príkladmi jednovláknovými 23-méru a 21-méru DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 10 a 11 Zoznamu sekvencií a zosilnené napríklad v oblasti 1643 bp, kódujúcej pre lysC, založenej na sekvencii známej u Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 až 1204 (1991); Mol. Gen. Genet. 224, 317 až 324 (1990)). Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu nesúceho získaný lysC sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako bol opísaný spôsob prípravy lysA.
Divoký typ lysC sa získa, ak sa lysC izoluje z divokého typu kmeňa AK, zatiaľ čo mutantný typ lysC sa získa, ak sa lysC izoluje z mutantného kmeňa AK v zhode so spôsobom, opísaným skôr.
Príklad nukleotidovej sekvencie divokého typu lysC je uvedený v SEQ ID NO: 12 Zoznamu sekvencií. Aminokyselinová sekvencia a-podjednotky divokého typu AK proteínu je odvodená z nukleotidovej sekvencie aje znázornená v SEQ ID NO: 13 Zoznamu sekvencií spolu s sekvenciou DNA. V SEQ ID NO: 14 je uvedená iba aminokyselinová sekvencia. Aminokyselinová sekvencia /3-podjednotky divokého typu AK proteínu je odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA a uvádza sa v SEQ ID NO: 15 Zoznamu sekvencií spolu so sekvenciou DNA. V SEQ ID NO: 16 sa uvádza iba aminokyselinová sekvencia. V každej z podskupín je použitý GTG ako iniciačný kodón a predstaviteľom zodpovedajúcej aminokyseliny je metionín. Predstaviteľom môže rovnako byť metionín, valín alebo formylmetionín.
V tomto patente použitý mutantný lysC nie je špecificky vymedzený za predpokladu, že kóduje AK, v ktorej je znecitlivená synergická spätná inhibícia L-lyzínom a L-treoninom. Mutantný lysC je však doložený príkladom, ktorý zahŕňa mutáciu, pri ktorej 279. alanínový zvyšok (počítaný od N-terminálu) je zmenený na aminokyselinový zvyšok iný, ako je alanínový a iný, ako je kyslá aminokyselina v podjednotke a, a 30. alanínový zvyšok je zmenený na aminokyselinový zvyšok iný ako alanínový a iný, ako je kyslá aminokyselina v 0-podjednotke v aminokyselinovej sekvencii divokého typu AK. Aminokyselinová sekvencia divokého typu AK špecificky zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 14 Zoznamu sekvencií ako α-podjednotku, a aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID NO: 16 Zoznamu sekvencií ako fl-podjednotku.
Výhodné aminokyselinové zvyšky iné ako alanín a iné ako kyslé aminokyseliny zahŕňajú treonínový, arginínový, cysteínový, fenylalanínový, prolínový, serínový, tyrozínový a valínový zvyšok.
Typ kodónu, zodpovedajúci substituovanému aminokyselinovému zvyšku, nie je špecificky vymedzený za predpokladu, že kóduje uvedený aminokyselinový zvyšok. Predpokladá sa, že aminokyselinová sekvencia vlastného divokého typu AK sa môže mierne odlišovať v závislosti od rozdielov medzi druhmi a kmeňmi baktérií. V tomto vynáleze sa môžu použiť tiež rôzne AK, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín v jednej alebo viacerých polohách, irelevantných vzhľadom na účinnosť enzýmu, ako sa opisuje. Možno použiť tiež ďalšie AK, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii iného jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov za prepokladu, že nemajú v podstate nijaký vpyv na účinnosť AK a na znecitlivenie synergickej spätnej inhibície L-lyzínom a L-treonínom.
Kmeň AJ12691, získaný vložením mutantného lysC plazmidu p399AK9B do kmeňa AJ12036 (FERM BP-734) ako divokého typu kmeňa Brevibacterium lactofermentum, bol uložený 10. apríla 1992 pod prístupovým číslom FERM P-12918 v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a Technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a prenesený na medzinárodné uloženie na základe Budapeštianskej dohody (Budapest Treaty) a 10. februára 1995 uložený pod prístupovým číslom FERM BP-4999.
(ii) Príprava dapB
DNA fragment, obsahujúci dapB sa môže pripraviť z chromozómov koryneformných baktérií pomocou PCR. DNA donornie je špecificky vymedzený, ale ako príklad sa uvádza kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Sekvencia DNA, kódujúca DDPR, je známa v Brevibacterium lactofermentum (Joumal of Bacteriology 175 (9), 2743 až 2749 (1993)) a na tomto základe sa môžu pripraviť primery pre PCR. Také primery DNA sú špecificky doložené príkladom 23-mérov DNA, alebo takými, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 21 a 22 Zoznamu sekvencií. Syntézy DNA, PCR a príprava plazmidu nesúceho získaný dapB sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza pri príprave lysC.
Nukleotidová sekvencia fragmentu DNA, obsahujúceho dapB a sekvencia aminokyselín, odvodená z nukleotidovej sekvencie sú uvedené v SEQ ID NO: 23. V SEQ ID NO 24 sa uvádza iba sekvencia aminokyselín. V tomto vynáleze sa môžu popri DNA fragmentoch, kódujúcich uvedenú aminokyselinovú sekvenciu tiež rovnocenne použiť fragmenty DNA, kódujúce v podstate rovnaké aminokyselinové sekvencie, ako sú uvedené v SEQ ID NO: 24, najmä pre aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substituúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že v podstate nemajú nijaký vplyv na účinnosť DDPR.
Transformovaný kmeň AJ13107, získaný vložením plazmidu pCRDAPB, nesúceho dapB (získaný spôsobom v ďalej uvedenom príklade), do kmeňa E. coli JM109 bol na základe Budapeštianskej dohody medzinárodne uložený od 26. mája 1995 pod prístupovým číslom FERM BO-5114 v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a Technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
Príprava dapB
DNA fragment, ktorý obsahuje dapB sa môže pripraviť z chromozómov koryneformných baktérii PCR spôsobom. DNA donor nie je špecificky vymedzený, ale ako príklad sa uvádza kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
DNA sekvencia, kódujúca DDPS, je známa v Corynebacterium glutamicum (pozri Nucleic Acid Research, 18 (21), 6421 (1990); EMBL accesion No. X53993), a na tomto základe môžu byť pripravené DNA primery. Také primery DNA sú špecificky doložené príkladom 23-mérov DNA, alebo takými, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 17 a 18 Zoznamu sekvencií. Syntézy DNA, PCR a príprava plazmidu nesúceho získaný dapA sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza pri príprave lysC.
Nukleotidová sekvencia DNA fragmentu, obsahujúceho dapA a sekvencia aminokyselín, odvodená z nukleotidovej sekvencie sú uvedené v SEQ ID NO: 19. V SEQ ID NO 20 sa uvádza iba sekvencia aminokyselín. V tomto vynáleze sa môžu popri DNA fragmentoch, kódujúcich uvedenú aminokyselinovú sekvenciu tiež rovnocenne použiť fragmenty DNA, kódujúce v podstate rovnaké aminokyselinové sekvencie, uvedené v SEQ ID NO: 20, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substituúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že v podstate nemajú nijaký vplyv na účinnosť DDPS.
Transformovaný kmeň AJ13106, získaný vložením plazmidu pCRDAPA, nesúceho dapA získaný spôsobom v ďalej uvedenom príklade, do kmeňa E. coli JM109, bol na základe Budapeštianskej dohody medzinárodne uložený od 26. mája 1995 pod prístupovým číslom FERM BO-5113 v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a Technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
Vo výhodnom uskutočnení na uvedené posilnenie lysA a ddh v opísaných koryneformných baktériách, produkujúcich L-lyzín, sú s použitím plazmidového vektora, transpozóna, alebo fágového vektora, alebo podobným spôsobom do hostiteľa vložené gény. Po tomto vložení sa očakáva, že v nejakom rozsahu nastane posilnenie ešte aj s použitím nízko kopírujúceho typu vektora. Výhodné je použitie násobne kopírujúceho typu vektora. Taký vektor napríklad zahŕňa plazmidové vektory pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 a pAJ440, opísané skôr. Popri tom sú transpozóny, odvodené z koryneformných baktérií opísané v medzinárodných patentoch WO 92/02627 a WO 93/18151; v európskom patente číslo 445 385; prihláške japonského patentu číslo 6-46 867; Vertes, A., A. et al., Mol. Microbiol., 11,739 až 746 (1994); Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571 až 581 (1994); Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397 až 405 (1994); Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1 až 6 (1995); prihlášky japonských patentov čísla 7-107 976 a 7-327 680 a ďalšie.
Koryneformné baktérie posilnené v lysA a ddh podľa tohto vynálezu sa môžu získať napríklad vložením (do hostiteľskej koryneformnej baktérie) rekombinantnej DNA, obsahujúcej lysA a ddh a ktorá je autonómne replikovateľná v bunkách koryneformných baktérii. Rekombinantnú DNA možno získať napríklad vložením lysA a ddh do vektora, ako je plazmidový vektor, transpozón alebo fágový vektor, ako sa opisuje skôr.
Každý z génov lysA a ddh sa môže do hostiteľ vložiť postupne použitím rôznych vektorov. Voliteľne sa môžu dva druhy génov vložiť spolu, použitím jedného vektora. Ak sa použijú rôzne vektory, uvedené gény sa môžu vkladať v akomkoľvek poradí, výhodné je však použiť vektory, ktoré majú v hostiteľovi stabilný mechanizmus zdieľania a nesenia a ktoré sú schopné spolu vzájomne koexistovať.
V prípade, že sa ako vektor použije plazmid, môže sa do hostiteľa vložiť rekombinantná DNA elektrickou pulznou metódou (Sugimoto et al., prihláška japonského patentu 2-207 791). Amplifikácia génu použitím transpozónu sa môže vykonať vložením plazmidu s transpozónom do hostiteľskej bunky a vyvolaním transpozície transpozóna.
Ak sa vkladajú mutantné lysC, dapB a dapA do koryneformných baktérií, potom sa gény lysA a ddh tiež môžu vkladať do hostiteľskej bunky použitím rôznych vektorov jednotlivo, alebo, voliteľne, dva alebo viac druhov génov sa môže vkladať spolu s využitím iba jedného vektora.
Spôsob prípravy L-lyzínu
L-lyzín sa môže hospodárne vyrábať kultiváciou koryneformných baktérií, ktoré obsahujú zosilnené gény L-lyzínovej biosyntézy, ako sa opisuje na produkciu a akumuláciu L-lyzínu, vo vhodnom prostredí (médiu), v kultúre, a oddelením L-lyzínu od kultúry.
Médium, ktoré sa má použiť, je napríklad bežné kultivačné prostredie, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne ďalšie organické zložky.
Ako zdroj uhlíka možno použiť cukry, ako je glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a škrobové hydrolyzáty; ďalej možno použiť organické kyseliny, ako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantárová.
Ako zdroj dusíka možno použiť anorganické soli, ako je síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; organický dusík, ako je sójový hydrolyzát; plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.
Čo sa týka zdrojov organickej mikrovýživy, vyžaduje sa, aby v dostatočných množstvách obsahovali látky, ako je vitamín B( a L-homoserín alebo kvasinkový extrakt alebo podobné látky. Ak treba, pridávajú sa v malých množsvách aj ďalšie, neuvedené látky, ako je fosforečnan draselný, síran horečnatý, ióny železa, ióny mangánu a podobné.
Kultivácia sa výhodne vykonáva v aeróbnych podmienkach počas 30 až 90 hodín. Teplota kultivácie je v priebehu kultivácie výhodne udržiavaná na 25 °C až 37 °C. pH sa v priebehu kultivácie výhodne udržiava na hodnotách 5 až 8. Na udržiavanie pH sa môžu použiť anorganické alebo organické látky, kyslé alebo zásadité látky, alebo plynný amoniak a iné podobné látky. L-lyzin sa môže od kultúry oddelovať viazaním bežným spôsobom na ionexovej živici, zrážacím spôsobom a ďalšími známymi spôsobmi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu p299LYSA, ktorý nesie gén lysA.
Obr. 2 znázorňuje spôsob koštrukcie plazmidu pLYSAB, ktorý nesie lysA a Brevi.-ori.
Obr. 3 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pPK4D, ktorý nesie ddh a Brevi.-ori.
Obr. 4 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu p399DL, ktorý nesie ddh a lysA.
Obr. 5 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pDL, ktorý nesie ddh, lysA a Brevi.-ori.
Obr. 6 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidov p399AKYB a p399AK9B, ktoré každý nesú mutantný lysC.
Obr. 7 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pDPRB, ktorý nesie dapB a Brevi.-ori.
Obr. 8 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pDPSB ktorý nesie dapA a Brevi.-ori.
Obr. 9 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCRCAB, ktorý nesie lysC, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 10 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCB, ktorý nesie mutantný lysC, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 11 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pAB, ktorý nesie dapA, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 12 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCAB, ktorý nesie mutantný lysC, dapA, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 13 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCABL, ktorý nesie mutantný lysC, dapA, dapB, laysA a Brevi.-ori.
Obr. 14 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCABDL, ktorý nesie mutantný lysC, dapA, dapB, ddh, laysA a Brevi.-ori.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Tento vynález sa podrobnejšie vysvetli v ďalšom texte odkazmi na príklady.
Príklad 1
Príprava lysA z Brevibacterium lactofermentum Príprava lysA a konštrukcia plazmidu nesúceho lysA
Ako chromozomálny DNA donor sa použil divoký typ kmeňa ATCC 13869 Brevibacterium lactofermentum. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13869 v zhode s bežnými postupmi. Fragment DNA, obsahujúci argS, lysA, a promótor obsahujúci operón sa ampliflkoval z chromozomálnej DNA v zhode s PCR. Na amplifikáciu sa použili DNA primery, alebo sa podobne použili syntetické 23-méry DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 1 a 2 Zoznamu sekvencií tak, aby sa amplifikovala oblasť približne 3,6 kb, kódujúca arginyl-tRNA syntázu a DDC na základe sekvencie známej v Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology, 4 (11), 1819 až 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212, 112 až 119 (1988)).
DNA sa syntetizovala bežným spôsobom s použitím modelu 380B DNA syntetizátora, vyrábaného v Applied Bisosystcms a použitím fosfoamiditínového spôsobu (pozri Tetrahedron Letters 22,1859 (1981)).
Gén sa ampliflkoval spôsobom PCR použitím modelu PJ2000 zariadenia DNA Thermal Cycler, vyrábaného formou Takara Shuzo a použitím Taq DNA polymerázy spôsobom, opísaným dodávateľom. Ako klonovací vektor na amplifikáciu génového fragmentu 3579 bp sa použil pHSG399. pHSG399 sa poštiepil s reštrikčným enzýmom Smal (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a podrobil sa ligách s DNA fragmentom, obsahujúcim amplifikovaný lysA. Plazmid, získaný uvedeným spôsobom, ktorý mal lysA pochádzajúci z ATCC 13869 sa označil ako p399LYSA.
DNA fragment, ktorý obsahoval lysA sa extrahoval štiepením p399LYSA s KpnI (vyrábaného firmou Takara Shuzo) a BamHI (vyrábaný firmou Takara Shuzo), Tento fragment DNA sa podrobil ligácii s pHSG299 poštiepeným s KpnI a BamHI. Získaný plazmid sa označil ako p299LYSA. Spôsob konštrukcie p299LYSA je znázornený na obr. 1.
DNA fragment (v ďalšom označený ako „Brevi.-ori“, ktorý má schopnosť spôsobiť, aby plazmid, autonómne replikovateľný v baktériách patriaci k rodu Corynebacterium, bol vložený do p299LYSA na prípravu plazmidov, nesúcich lysA, autonómne replikovateľných v baktériách, patriacich k rodu Corynebacterium. Brevi.-ori sa pripravil z plazmidového vektora pHK4 obsahujúceho Brevi.-ori a je autonómne replikovateľný v bunkách aj Escherichia coli aj v baktériách patriacich k rodu Corynebacterium. pK4 bol konštruovaný štiepením pHC4 s KpnI (vyrábaného firmou Takara Shuzo) a BamHI (vyrábaného firmou Takara Shuzo), extrakciou fragmentu Brevi.-ori a jeho ligáciou s pHSG298, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s KpnI a BamHI (pozri prihláška japonského patentu číslo 5-7491). pHK4 dáva hostiteľovi kanamycínovú rezistenciu. Escherichia coli HB101, obsahujúce pHK4 sa označili ako Escherichia coli AJ13136 a uložili sa 1. augusta 1995 pod prístupovým číslom FERM BO-5186 v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a Technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
pHK4 sa poštiepil s reštrikčným enzýmom BamHI a štepené konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (vyrábanej firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý udáva výrobca. Po vytvorení zarovnaných koncov sa ligoval fosforylovaný linker KpnI (vyrábaný Takaru Shuzo), aby sa dosiahla úprava tak, aby mohol byť DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori vyrezaný z pHK4 poštiepením iba s KpnI. Tento plazmid sa poštiepil s KpnI, a vytvorený DNA fragment Brevi -ori sa ligoval s p299LYSA, pred tým už tiež poštiepeným s KpnI, čím sa pripravil plazmid, nesúci lysA a autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pLYSAB. Spôsob konštrukcie plazmidu pLYSAB je znázornený na obr. 2.
Stanovenie nukleotidovej sekvencie lysA z Brevibacterium lactofermentum
Pripravila sa plazmidová DNA plazmidu p299LYSA a stanovila sa nukleotidová sekvencia spôsobom, ktorý opísal Sanger et al. (napríklad F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977)). Stanovená sekvencia nukleotidov a z nej odvodená sekvencia aminokyselín, kódovaná nukleotidovou sekvenciou, sú uvedené v SEQ ID NO: 3. Čo sa týka nukleotidovej sekvencie, sekvencia aminokyselín kódovaná s argS a sekvencia aminokyselín, kódovaná s lysA sú uvedené v SEQ ID NO: 4 a 5.
Príklad 2
Príprava ddh z Brevibacterium lactofermentum
Amplifikáciou ddh génu z chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 sa získal ddh gén spôsobom PCR s použitím dvoch oligonukleotidových primerov (SEQ ID NO: 6, 7), pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie ddh génu Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acid Res. 15, 3917 (1987)). Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s EcoT221 a Aval a štepné konce sa zarovnali. Potom sa fragment vložil do polohy Smal plazmidu pMWl 19, aby sa získal plazmid pDDH.
Ďalej, pDDH sa poštiepil s Sali a EcoRI a nasledovalo zarovnanie koncov. Potom sa získaný fragment podrobil li gácii s plazmidom pUC18, ktorý už bol poštiepený s Smal. Takto získaný plazmid sa označil ako pUC18DDH.
Do pUC18DDH sa vložil Brevi.-ori, aby sa vytvoril plazmid, nesúci ddh, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. pHK4 sa poštiepil s reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHl, stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie sa vykonalo s použitím zarovnávacej súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) a vyznačeného postupu. Po zarovnaní sa ligoval fosforylovaný PstI linker (vyrábaný Takara Shuzo) tak, aby bol vložený do polohy PstI plazmidu pHSG299. Uvedeným spôsobom skonštruovaný plazmid sa označil ako pPK.4. Ďalej, plazmid pUC18DDH sa poštiepil s Xbal a KpnI a vzniknutý fragment sa ligoval s pPK4, ktorý už bol poštiepený s KpnI a Xbal. Týmto spôsobom sa pripravil plazmid, nesúci ddh, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Tento plazmid sa označil ako pPK4D. Postupnosť konštrukcie je znázornená na obr. 3.
Príklad 3
Konštrukcia plazmidu, nesúceho aj ddh aj lysA
Plazmid pUC18DDH nesúci ddh sa poštiepil s Ecol, potom sa zarovnali konce a ďalej sa poštiepil s Xbal a extrahoval sa DNA fragment, obsahujúci ddh. Tento ddh fragment sa podrobil ligácii s plazmidom p399LYSA, nesúcim lysA, ktorý bol pred tým poštiepený s BamHl a potom sa zarovnali konce a ďalej bol poštiepený s Xbal. Získaný plazmid sa označil ako p399DL. Postupnosť konštrukcie je znázornená na obr. 4.
Ďalej, do p399DL sa vložil Brevi.-ori. pHK4 sa poštiepil s Xbal a BamHl, stepné koče sa zarovnali. Po zarovnaní sa podrobil ligácii s fosforylovaným linkerom Xbal, aby sa dosiahla úprava tak, aby DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť vyrezaný z pHK4 poštiepením iba s Xbal. Tento plazmid sa poštiepil s Xbal, vzniknutý DNA fragment Brevi.-ori sa podrobil ligácii s p399DL, ktorý bol tiež už poštiepený s Xbal, aby sa vytvoril plazmid, obsahujúci ddh a lysA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pDL. Postupnosť konštrukcie pDL je znázornená na obr. 5.
Príklad 4
Príprava mutantných lysC, dapA a dapB z Brevibacerium lactofermentum
Príprava génu lysC divokého typu a mutantného génu lysC z Brevibactcrium lactofermentum
Príprava divokého typu a mutantného lysC a príprava plazmidov, ktoré sú ich nosičmi
Ako chromozomálne donory DNA sa použili kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a L-lyzin produkujúci mutantný kmeň AJ3445 (FERM P-1944), získaný z kmeňa ATCC 13 869 mutáciou. Kmeň AJ3445 bol podrobený mutácii tak, že lysC bol zmenený, aby vyvolal v podstate znecitlivenie inhibície lyzínom a treonínom (Journal of Biochemistry 68, 701 až 710 (1970)).
Z chromozomálnej DNA sa amplifikoval DNA fragment, obsahujúci lysC, pomocou spôsobu PCR (polymerázovou reťazcovou reakciou; pozri White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). Pokiaľ sa týka primerov použitých na amplifikáciu, syntetizovali sajednovláknové 23-méme a 21-méme DNA, ktoré majú nukleotidová sekvencie udané v SEQ ID NO: 10 a 11, aby sa amplifikovala oblasť 1643 bp, kódujúca lysC, na základe sekvencie známej v Coryne bacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 až 1204 (1991); a Mol. Gen. Genet. 224, 317 až 324(1990)).
Amplifikovaný génový fragment 1643 bp bol potvrdený elektroforézou na agarovom géli. Potom bol fragment vyrezaný z gélu a čistený v zhode so známymi postupmi a bol poštiepený s reštrikčnými enzýmami Nrul (vyrábaný firmou Takara Shuzo) a EcoRI (vyrábaný firmou Takara Shuzo).
Ako klonovací vektor pre génový fragment sa použil pHSG399 (pozri Takeshita, S. et al., Gene 61, 63 až 74 (1987)). pHSG399 sa poštiepil s reštrikčnými enzýmami Smal (vyrábaný firmou Takara Shuzo) a EcoRI. Potom sa podrobil ligácii s amplifikovaným lysC fragmentom. DNA sa ligovala použitím DNA ligačnej súpravy (vyrábanej firmou Takara Shuzo) postupom, uvedeným dodávateľom. Tak sa pripravili plazmidy, v ktorých lysC fragmenty, amplifikované z chromozómov Brevibacterium lactofermentum boli ligované s pHSG399. Plazmid nesúci lysC z ATCC13869 (kmeň divokého typu) bol označený ako p399AKY a plazmid nesúci lysC z AJ3463 (L-lyzín produkujúce baktérie) bol označený ako p399AK9.
Do pripraveného plazmidu p399AKY a p399AK9 bol vložený Brevi.-ori, aby sa vytvorili plazmidy nesúce lysC a boli autonómne replikovateľné v koryneformných baktériách.
pHK4 sa poštiepil s reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHl (vyrábanými firmou Takara Shuzo), štepné konce sa zarovnali. Zarovnávanie sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (vyrábanej firmou Takara Shuzo) spôsobom, udávaným dodávateľom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia fosforylovaného BamHl linkera (vyrábaného firmou Takara Shuzo) na úpravu tak, aby sa DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol z pHK4 vyrezať poštiepením s iba BamHl. Tento plazmid sa poštiepil s BamHl, vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p399AKY a p399AK9, ktoré tiež už boli pred tým ligované s BamHl, aby sa pripravili plazmidy, nesúce lysC, autonómne replikovateľné v koryneformných baktériách.
Plazmid, nesúci divoký typ lysC génu, pochádzajúceho z p399AKY sa označil ako p399AKYB a plazmid nesúci mutantný lysC, pochádzajúci z p399AK9 bol označený ako p399AK9B. Postupnosť konštrukcie p399AK9B a p399AKYB je znázornená na obrázku 6. Kmeň AJ12691, získaný vložením mutantného lysC plazmidu p399AK9B do kmeňa divokého typu Brevibacterium lactofermentum (kmeň AJ 12036, FERM BP-734) bol uložený 10. apríla 1992 pod prístupovým číslom FERM P-12918 v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a Technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) a prenesený 10. februára 1995 do medzinárodného uloženia na základe Budapeštianskej dohody a uložený pod prístupovým číslom FERM BP-4999.
Stanovenie nukleotidovej sekvencie divokého typu lysC a mutantného lysC z Brevibacterium lactofermentum
Na stanovenie nukleotidovej sekvencie divokého typu lysC a mutantného lysC sa z príslušných transformantov pripravili plazmid p399AKY, obsahujúci divoký typ lysC a plazmid p399AK9, obsahujúci mutantný lysC. Stanovenie nukleotidovej sekvencie sa vykonalo spôsobom, ktorý opi sal Sanger et al. (napríklad F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977)).
Nukleotidová sekvencia divokého typu lysC kódovaná plazmidom p399AKY je uvedená v SEQ ID NO: 12 Zoznamu sekvencií. Nukleotidová sekvencia mutantného lysC, kódovaného plazmidom p399AK9 mala na druhej strane v porovnaní s divokým typom lysC mutáciu iba jedného nukleotidu tak, že v SEQ ID NO: 12 bola 1051.G zmenená na A. Je známe, že lysC z Corynebacterium glutamicum má dve podjednotky (a a β), kódované v rovnakom čítacom rámci na rovnakom DNA vlákne (pozri Kalinowski, J. et al., Molecular Biology 5 (5), 1197 až 1204 (1991)). Podľa homológie sa usudzuje, že tu sekvenovaný gén má tiež dve podjednotky (a a β), kódované v rovnakom čítacom rámci na rovnakom vlákne DNA.
Sekvencia aminokyselín β-podjednotky divokého typu AK proteínu, odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA je uvedená v SEQ ID NO: 13 spolu s DNA sckvcnciou. V SEQ ID NO: 14 sa uvádza iba sekvencia aminokyselín. Sekvencia aminokyselín β-podjednotky divokého typu AK proteínu, odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA je uvedená v SEQ ID NO: 15 spolu s DNA. V SEQ ID NO: 16 je uvedená iba sekvencia aminokyselín. V každej podjednotke sa používa GTG ako iniciačný kodón a zodpovedajúca aminokyselina je reprezentovaná metionínom. Táto reprezentácia sa však vzťahuje na metionín, valin alebo formylmetionín.
Mutácia na sekvencií mutantného lysC znamená vznik substitúcie zvyšku aminokyseliny tak, že v aminokyselinovej sekvencií divokého typu AK proteínu (SEQ ID NO: 14, 16) je 279. alanínový zvyšok α-podjednotky zmenený na treonínový zvyšok, a 30. alanínový zvyšok β-podjednotky je zmenený na treonínový zvyšok.
Príprava dapB z Brevibacterium lactofermentum Príprava dapB a konštrukcia plazmidu nesúceho dapB
Ako chromozomálny DNA donor sa použil divoký typ kmeňa ATCC 13869 Brevibacterium lactofermentum. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13869 bežným spôsobom. DNA fragment, obsahujúci dapB sa amplifikoval z chromozomálnej DNA spôsobom PCR. Pokiaľ sa týka primerov, použitých na amplifíkáciu, syntetizovali sa 23-méme jednovláknové DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie udané v SEQ ID NO: 21 a 22 Zoznamu sekvencií, aby sa amplifikovala oblasť 2,0 kb, kódujúca DDPR, na základe sekvencie známej v Brevivacterium lactofermentum (pozri Joumal of Bacteriology, 157 (9), 2743 až 2749 (1993)). Syntéza DNA a PCR sa vykonali rovnako, ako sa uvádza v príklade 1. Ako klonovací vektor na amplifíkáciu génového fragmentu 2001 bp sa použil skript pCR (vyrábaný firmou Invitrogen) a bol podrobený ligácii s amplifikovaným fragmentom dapB. Tak sa skonštruoval plazmid, v ktorom sa fragment dapB s 2001 bp, amplifíkovaný z chromozómu Brevibacterium lactofermentum, podrobil ligácii so skriptom pCR. Podľa uvedeného postupu získaný plazmid, ktorý mal dapB, pochádzajúci z ATCC 13869 sa označil ako pCRDAPB. Transformantový kmeň AJ13107, získaný vložením pCRDAPB do kmeňa E. coli JM109 bol 26. mája 1995 medzinárodne uložený pod prístupovým číslom FERM BP-5114 v zmysle Budapeštianskej dohody v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a technológie Ministerstva medzinárodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód:
305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
Na prípravu plazmidu sa fragment o 1101 bp, obsahujúci stavebný gén z DDPR extrahoval digesciou pCRDAPB s EcoRV a Sphl. Tento fragment sa podrobil ligácii s pHSG399, ktorý bol pred tým poštiepený s HincII a Sphl. Pripravený plazmid sa označil ako p399DPR.
Aby sa skonštruoval plazmid nesúci dapB autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách, vložil sa do pripraveného plazmidu p399DPR Brevi.-ori. Na to sa pHK4 poštiepil s reštrikčným enzýmom Kpnl (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a štepné konce sa zarovnali. Zarovnávanie sa vykonalo použitím súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) podľa postupu, uvádzaného dodávateľom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia s BamHi linkerom (vyrábaným firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, aby sa fragment DNA, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol vyrezať z pHK4 poštiepením iba s BamHi. Tento plazmid sa poštiepil s p399DPR, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s BamHi, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci dapB autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pDPRB. Postupnosť krokov prípravy plazmidu pDPRB je znázornená na obr. 7.
Stanovenie nukleotidovej sekvencie dapB z Brevibacterium lactofermentum
Pripravil sa plazmid DNA z kmeňa AJ13107, obsahujúci p399DPR a jeho nukleotidová sekvencia sa stanovila rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1. Stanovená nukleotidová sekvencia a z toho odvodená sekvencia aminokyselín sú uvedené v SEQ ID NO: 23 Zoznamu sekvencií. V SEQ ID NO: 24 je uvedená iba sekvencia aminokyselín.
Príprava dapA z Brevibacterium lactofermentum Príprava dapA a konštrukcia plazmidu nesúceho dapA
Ako chromozomálny donor sa použil divoký typ kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13 869 bežným spôsobom. Pomocou PCR sa fragment DNA, obsahujúci dapA amplifíkoval z chromozomálnej DNA. Pokiaľ sa týka primerov použitých na amplifíkáciu, syntetizovali sa 23-méme jednovláknové DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie udané v SEQ ID NO: 17 a 18 Zoznamu sekvencií, aby sa amplifikovala oblasť 1,5 kb, kódujúca DDPS, na základe sekvencie známej v Corynebacterium glutamicum (pozri Nucleic Acid Research 18 (21, 6421 (1990); EMBL prístupové číslo X53993). Syntézy DNA a PCR sa vykonali rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v príklade 1. Ako klonovací vektor na zosilnenie génového fragmentu s 1411 bp sa použil pCRIOOO (vyrábaný firmou Invitrogen, pozri Bio/Technology 9, 657 až 663 (1991)) a bol podrobený ligácii s amplifikovaným fragmentom dapA. Ligácia DNA sa vykonala použitím DNA ligačnej súpravy (DNA Ligation Kit, firmy Takara a Shuzo) postupom, udávaným výrobcom. Tak sa skonštruoval plazmid, v ktorom fragment dapA s 1411 bp, amplifíkovaný z Brevibacterium lactofermentum, bol podrobený ligácii s pCRIOOO. Takto získaný plazmid, ktorý mal dapA pochádzajúci z ATCC 13869 sa označil ako pCRDAPA.
Transformantný kmeň AJ13106, získaný vložením pCRDAPA do kmeňa E. coli JM109 bol 26. mája 1995 medzinárodne uložený pod prístupovým číslom FERM BP5113 v zmysle Budapeštianskej dohody v Národnom ústave biologických vied a humánnych technológií Agentúry Priemyselných vied a technológie Ministerstva medziná rodného obchodu a priemyslu [National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry] (poštový kód: 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
Na konštrukciu plazmidu, nesúceho dapA, autonómne replikovateľného v koryneformných baktériách sa do pripraveného plazmidu pCRDAPA vložil Brevi.-ori. Na to sa pHK4 poštiepil s reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHI (vyrábanými firmou Takara Shuzo) a stepné konce sa zarovnali. Zarovnávanie sa vykonalo použitím súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) podľa postupu, uvádzaného dodávateľom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia s fosforylovaným linkerom Smal (vyrábaným firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, aby sa fragment DNA, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol vyrezať z pHK4 poštiepením iba s Smal. Tento plazmid sa poštiepil s Smal, vzniknutý DNA fragment Brevi.-ori sa podrobil ligácii s pCRDAPA, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s Smal, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci dapA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pDPSB. Postupnosť krokov prípravy plazmidu pDPSB (Kmr) je znázornená na obr. 8.
Stanovenie nukleotidovej sekvencie dapA z Brevibacterium lactofermentum
Z kmeňa AJ 13106 sa pripravil plazmid DNA, obsahujúci pCRDAPA a jeho nukleotidová sekvencia sa stanovila rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1. Stanovená nukleotidová sekvencia a z toho odvodená sekvencia aminokyselin sú uvedené v SEQ ID NO: 19 Zoznamu sekvencii. V SEQ ID NO: 20 je uvedená iba sekvencia aminokyselín.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie aj mutantný lysC aj dapA
Plazmid, nesúci mutantný lysC, dapA a replikačný začiatok z koryneformných baktérií sa konštruoval z plazmidu pCRDAPA, nesúceho dapA a plazmidu p399AK9B, nesúceho mutantný lysC a Brevi.-ori. Plazmid p399AK9B sa podrobil úplnej digescii s Sali a potom sa zarovnal. Potom sa vykonala ligácia tak, aby sa vytvoril plazmid, v ktorom je poloha Sali upravená na polohu Ecol. Získaný plazmid sa označil ako p399AK9BSE. Mutantný lysC a Brevi.-ori sa vyrezali ako jeden fragment čiastočným štiepením plazmidu p399AK9BSE s EcoRI. Tento fragment sa podrobil ligácii s pCRDAPA, ktorý bol už pred tým ligovaný s EcoRI. Získaný plazmid sa označil ako pCRCAB. Tento plazmid je autonómne replikovateľný v E. coli a v koryneformných baktériách a hostiteľovi poskytuje rezistenciu proti kanamycínu a nesie aj mutantný lysC aj dapA. Postupnosť konštrukcie plazmidu pCRCAB je znázornená na obr. 9.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie aj mutantný lysC aj dapA
Plazmid, nesúci mutantný lysC aj dapA sa konštruoval z plazmidu p399AK9, nesúceho mutantný lysC a z plazmidu p399DPR, nesúceho dapB. Fragment s 1101 bp, obsahujúci stavebný gén z DDPR sa extrahoval digesciou p399DPR s EcoRV a Sphl. Tento fragment sa podrobil ligácii s p399AK9, ktorý bol pred tým poštiepený s Sali a potom na koncoch zarovnaný a bol ďalej poštiepený s Sphl tak, aby sa záskal plazmid, ktorý nesie aj mutantný lysC aj dapB. Tento plazmid sa označil ako p399AKDDPR.
V ďalšom sa do získaného plazmidu p399AKDDPR vložil Brevi.-ori. S týmto cieľom sa poštiepil plazmid pHK4, obsahujúci Brevi.-ori s reštrikčným enzýmom KpnI (vyrábaným formou Takara Shuzo) a štepné konce sa zarovnali. Zarovnanie sa vykonalo použitím súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) podľa postupu, uvádzaného dodávateľom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia s fosforylovaným BamHI linkerom (vyrábaným firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, aby sa fragment DNA, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol vyrezať z pHK4 poštiepením iba s BamHI. Tento plazmid sa poštiepil s BamHI, a vzniknutý DNA fragment Brevi.-ori sa podrobil ligácii s p399AKDPR, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s BamHI, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci mutantný lysC a dapB autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pCB. Postupnosť krokov prípravy plazmidu pCB je znázornená na obr. 10.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie aj dapA aj dapB
Plazmid pCRDAPA, nesúci dapA, sa poštiepil s KpnI a EcoRI, aby sa extrahoval fragment DNA, obsahujúci dapA. Tento fragment sa podrobil ligácii s vektorovým plazmidom pHSG399, ktorý bol už pred tým poštiepený s KpnI a EcoEI. Získaný plazmid sa označil ako p399DPS.
Popri tom sa plazmid pCRDAPB, nesúci dapB poštiepil s SacII a EcoRI, aby sa extrahoval DNA fragment s 2,0 kb, obsahujúci oblasť, kódujúcu DDPR. Fragment sa ligoval s p399DPS, ktorý bol už pred tým poštiepený s SacII a EcoRI na konštrukciu plazmidu, ktorý nesie obidva, aj dapA aj DapB. Získaný plazmid sa označil ako p399AB.
V ďalšom sa do p399AB vložil Brevi.-ori. K tomu sa pHK4, nesúci Brevi.-ori poštiepil s reštrikčným enzýmom BamHI (vyrábaným formou Takara Shuzo) a štepné konce sa zarovnali. Zarovnanie sa vykonalo použitím súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) podľa postupu, uvádzaného výrobcom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia s fosforylovaným KpnI linkerom (vyrábaným firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, aby sa fragment DNA, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol vyrezať z pHK4 štiepením iba s KpnI. Tento plazmid sa poštiepil s KpnI, a vzniknutý DNA fragment Brevi.-ori sa podrobil ligácii s p399AB, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s KpnI, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci dapA aj dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pAB. Postupnosť krokov prípravy plazmidu pAB je znázornená na obr. 11.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie spolu mutantný lysC, dapA aj dapB
Na extrakciu dapA fragmentu sa poštiepil plazmid p399DPS s EcoRI a Sphl. Nasledovalo zarovnanie koncov. Získaný fragment sa podrobil ligácii s p399AK9, ktorý bol už pred tým poštiepený s Sali a vykonalo sa zarovnanie. Ligáciou sa získa plazmid p399CA, v ktorom koexistujú mutantný lysC a dapA.
Plazmid pCRDAPB, nesúci dapB sa poštiepil s EcoRI, zarovnali sa konce, nasledovala štiepenie s Sací, aby sa sa extrahoval DNA fragment s 2,0 kb, obsahujúci dapB. Plazmid p399CA, nesúci dapB a mutantný lysC sa poštiepil s Spel, zarovnali sa konce, a potom sa plazmid poštiepil s Sací a podrobil ligácii s extrahovaným fragmentom dapB, aby sa získal plazmid, ktorý nesie mutantný lysC, dapA a dapB. Tento získaný plazmid sa označil ako p399CAB
V ďalšom sa do p399CAB vložil Brevi.-ori. K tomu sa plazmid pHK4, nesúci Brevi.-ori poštiepil s reštrikčným enzýmom BamHI (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a štepné konce sa zarovnali. Zarovnanie sa vykonalo použitím súpravy DNA Blunting Kit (vyrábanej firmou Takara Shuzo) podľa postupu uvádzaného výrobcom. Po zarovnaní sa vykonala ligácia s fosforylovaným KpnI linkerom (vyrábaným firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, aby sa fragment DNA, zodpovedajúci časti Brevi.ori mohol vyrezať z pHK4 poštiepením iba s KpnI. Tento plazmid sa poštiepil s KpnI, a vzniknutý DNA fragment Brevi.-ori sa podrobil ligácii s p399CAB, ktorý bol pred tým tiež poštiepený s KpnI, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci spolu mutantný lasC, dapA aj dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pCAB. Postupnosť krokov prípravy plazmidu pCAB je znázornená na obr. 12.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie spolu mutatný lysC, dapA, dapB aj lysA
Plazmid p299LYSA, ktorý nesie lysA sa poštiepil s KpnI a BamHI a konce sa zarovnali. Potom sa extrahoval génový fragment lysA. Tento fragment sa podrobil ligácii s pCAB, ktorý už bol pred tým poštiepený s Hpal (vyrábaným firmou Takaro Shuzo) a zarovnaný, aby sa skonštruoval plazmid, ktorý nesie spolu mutantný lysC, dapA, dapB aj lysA a je autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pCABL. Postupnosť krokov konštrukcie tohto plazmidu pCABL je znázornená na obr. 13.
Poznamenáva sa, že génový fragment lysA je vložený do polohy Hpal v DNA fragmente, obsahujúcom uvedený dapB gén v pCASBL, ale poloha Hpal je umiestnená proti smeru od promótora dapB génu (nukleotidové čísla 611 až 616 v SEQ 1D NO: 19) a dapB gén nie je rozdelený.
Konštrukcia plazmidu, ktorý nesie spolu mutantný lysC, dapA, dapB, ddh a lysA
Plazmid pHSG299 sa poštiepil s Xbal a KpnI a potom sa podrobil ligácii s p399DL, nesúcim ddh, a lyA, ktorý bol predtým poštiepený s Xbal a KpnI. Skonštruovaný plazmid sa označil ako p299DL. Tento p299DL sa poštiepil s Xbal a KpnI a konce sa zarovnali. Po zarovnaní koncov sa extrahoval fragment DNA, nesúci ddh a lysA. Tento fragment sa podrobil ligácii s plazmidom pCAB, nesúcim spolu mutantný lysC, dapA a dapB, ktorý bol už pred tým poštiepený s Hpal a zarovnaný, aby sa vytvoril plazmid, ktorý nesie spolu mutantný lysC, dapA, dapB, ddh a lysA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pCABDL. Postupnosť krokov pri konštrukcii pCABDL je znázornená na obr. 14.
Príklad 5
Vloženie plazmidov, ktoré nesú gény pre biosyntézu L-lyzínu, do baktérií Brevibacterium lactofermentum, produkujúcich L-lyzín
Plazmidy, ktoré sú nositeľmi génov pre biosyntézu L-lyzínu, skonštruované tak, ako sa uvádza, najmä pLYSAB(Cm'), pPK4D(Cmr), p399AK9B(Cmr), pDPBS(Kmr), pDPRB(Cnf), pCRCAB(Kmr), pABfCnf), pDL(Cirľ), pCB(Ctrľ), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr) a pCABDL(Cmr) sa vložili do baktérií AJ 11082 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactofermentum. produkujúcich L-lyzín. Kmeň AJ11082 má takú vlastnosť, že je AEC rezistentný. Plazmidy sa vložili elektropulzným spôsobom (Sugimoto et al., prihláška japonského patentu číslo 2-207 791). Transformanty sa vyselektovali na základe rezistencie k liečivám pomocou markerov, ktoré majú rovnakú rezistenciu ako príslušné plazmidy. Transformanty sa selektovali na úplnom médiu, obsahujúcom 5 pg.mľ chloramfenikolu, ak sa vkladal plazmid, ktorý nesie gén rezistentný k chloramfenikolu, alebo sa transformanty selektovali na úplnom médiu, obsahujúcom 25 pg.mľ1 kanamycínu, ak sa vkladal plazmid, ktorý nesie gén rezistentný ku kanamycínu.
Príklad 6
Príprava L-lyzínu
Každý z transformantov, získaných v príklade 5, sa kultivoval v prostredí umožňujúcom produkciu L-lyzínu tak, aby sa mohla vyhodnotiť jeho produktivita tvorby L-lyzínu. Produkčné prostredie na prípravu L-lyzínu malo nasledovné zloženie.
Produkčné prostredie pre prípravu L-lyzínu
Rozpustili sa ďalej uvedeného zložky (s výnimkou uhličitanu vápenatého) a pomocou KOH sa nastavilo pH na hodnotu 8,0. Množstvá sú udávané na 1 dm3. Médium sa sterilizovalo pri 115 °C počas 15 minút, uhličitan vápenatý (50 g) sa už pred tým sterilizoval najmä horúcim vzduchom v suchom stave a pridal sa do sterilizovaného prostredia.
Glukóza 100 g (NH4)2SO4 55 g
KH2PO41 g
MgSO4.7H2O 1 g Biotín 500 pg Tiamín 2000 pg FeSO4.7H2O 0,01 g MnSO4.7H2O 0,01 g Nikotínamid 5 mg Proteínový hydrolyzát (Márnenou) 30 ml Uhličitan vápenatý 50 g
Každý z rôznych typov transformantov a pôvodný kmeň sa zaočkovali do média s uvedeným zložením. Kultivácia sa vykonala pri 31,5 °C s protismemým pretrepávaním. V tabuľke 1 sa uvádza množstvo vyprodukovaného L-lyzínu po 40 a po 72 hodinách kultivácie a rast po 72 hodinách (absorbancia - OD562). V tabuľke uvedený lysC* znamená mutantný lysC. Rast sa stanovoval kvantitatívne meraním absorbancie (OD) pri 560 nm po 101-násobnom riedení.
Tabuľka 1
Hromadenie L-lyzínu po 40- a 72-hodinovej kultivácii
Kmeň baktérii/plazmid Vložený gén Množstvo vytvoreného L-lyzínu P° Rast OD562/|0|
40 hodinách 72 hodinách
AJ11082 22,0 29,8 0,450
AJ11082/pLYSAB LysA 19,8 32,5 0,356
AJ11082/pPK4D Ddh 19,0 33,4 0,330
AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5 0,398
AJ11082/pDPSB dapA 18,7 33,8 0,410
AJ11082/pDPRB dapB 19,9 29,9 0,445
AJ11082/pCRCAB lysC*. dapA 19,7 36,5 0,360
AJ11082/pAB dapA, dapB 19,0 34,8 0,390
AJ11082/pDL lysA, ddh 23,3 31,6 0,440
AJ11082/pCB lysC*. dapB 23,3 35,0 0,440
AJ11082/pCAB lysC*. dapA, dapB 23,0 45,0 0,425
AJ11082/pCABL lysC*. dapA, dapB. lysA 26,2 46,5 0,379
AJ11082/pCABDL lysC1*. dapA, dapB. lysA ddh 26,5 47,0 0,409
Z tabuľky 1 je zrejmé, že pri posilnení jedným samostatným génom lysA, ddh, mutantným lysC, dapA alebo dapB je množstvo L-lyzínu po 72 hodinách väčšie alebo rovnaké, ako je produkcia východiskového kmeňa, ale množstvo vyprodukovaného L-lyzínu po 40 hodinách kultivácie bolo menšie ako pri východiskovom kmeni. Možno to vyjadriť tak, že rýchlosť tvorby L-lyzínu sa pri krátkych dobách kultivácie znížila. Podobne, ak sa posilnenie vykonalo mutatným lysC a dapA, alebo dapA a dapB v kombinácii vždy dvoch génov, bolo množstvo vyprodukovaného L-lyzínu po 72 hodinách kultivácie väčšie, ako vyprodukoval východiskový kmeň, ale množstvo L-lyzinu po 40 hodinách kultivácie bolo oproti východiskovému kmeňu nižšie. Rýchlosť produkcie L-lyzínu sa pri krátkodobej kultivácii znížila.
Ak sa na druhej strane posilňovalo kombináciou lysA a ddh, rast sa zvýšil, rýchlosť produkcie L-lyzínu sa pri krátkodobej kultivácii úspešne obnovila; akumulované množstvo L-lyzínu sa tiež zvýšilo aj pri dlhodobej kultivácii.
Tiež pri posilnenení kmeňa, v ktorom dapB bol spolu s mutantným lysC a v prípade, že kmeň v ktorom bol dapA a bol súčasne zosilnený uvedenými dvoma génmi, zvýšil sa rast a zvýšila sa aj rýchlosť produkcie L-lyzinu v porovnaní s východiskovým kmeňom. V prípade, že kmeň súčasne obsahoval uvedené tri gény a posilnil sa ďalej s lysA a ddh, zvýšila sa aj rýchlosť produkcie L-lyzínu a zvýšilo sa ďalej aj množstvo akumulovaného L-lyzínu.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné infomácie (i) Prihlasovateľ: Ajimoto Co., Ltd.
(ii) Názov vynálezu: Spôsob prípravy L-lyzínu (iii) Počet sekvencií: 24 (iv) Adresa pre korešpondenciu:
(A) Adresát:
(B) Ulica:
(C) Mesto:
(D) Krajina:
(E) ZIP:
(v) Počítačom čitateľný tvar:
(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release #1.0, verzia #1.30 (vi) Údaje o tejto prihláške (A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(C) Zatriedenie:
(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: JP 8 - 142 812 (B) Dátum podania: 05. júna 1996 (viii) Informácia o právnom zástupcovi:
(A) Meno:
(B) Registračné číslo:
(ix) Telekomunikačné informácie:
(A) Telefón: Telefax:
(2) Údaje o SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1: GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG (2) Údaje o SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA (2) Údaje o SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 3 579 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 533..2182 (ix) Znak:
(A) meno/kľúč: CDS (B) Lokácia : 2 188..3522 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
GTGGACCCG* CCATTCCGCC ÄGCCTCCACT GCMCCAGGT CCTKmG GTACATCGCT60
TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGttACCGA120
GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCCCC TTGGGCAGGG ACCT7GACAA AGCCCACGCT180
GATATCCCCA AGTGAGGGAT CAGAAFAGTG CATGGCCACG TCGA7GCTCC CACATTGAGC240
GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCACCGG ATGTTTTCTT CCGCTGCTCC300
AGTCCCCArT GATACCAAAA ACGCGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC360 εατπΤΑΠ gtcgaacggc GCAmcGGC tccaacgacg rrrwnTCT gggtcagtta420
CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAACGCAGCG ΑΤΤΤύΠΑΤΑ480
AGTATGGGľC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC- CC ATGS35
Het
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC CCG GTA GAG GTT 583
Thr Pre Ala Asp Leu Ala Thr Leu íle Lys Glu Thr Ala Val Glu Val
5 10 15
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631
Leu Thr Ser Arg Glu L«u Asp Thr Ser Val Leu Pro Clu Gin Val Val
20 25 30
GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA CAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 579
Vil Glu Are Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn íle
35 40 45
GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727
Ala Leu Gin Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu Ala
50 55 60 65
ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775
Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala íle Asp Ser Ala
70 75 80
GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA CCA 823
Glu íle Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn íle Arg Leu Ala Ala Ala Ala
85 90 95
CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GCC GAG ACT TTC GCA 871
Gin Gly Glu íle Val Ala Lys íle Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe Gly
100 105 L LO
AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC on TCT 915
Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser
115 120 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC 967
Ala Asn Pro Thr Cly Pro lle His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala
130 135 140 145
GTG CGT CAC TCT TTG GGT CCT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015
Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val
150 155 160
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin lle Asp Arg Phe
165 170 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111
Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Cly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
180 185 190
GGT TAT GCC GGC GAA TAC ATT AAG GAA AH GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159
Gly Tyr Gly Cly Glu Tyr íle Lys Giu íle Ala Glu Ala íle Val Glu
195 200 205
AAG CAT CCT GAA GCG no GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207
Lys His Pro Clu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu Leu
210 215 220 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255
Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ila Lys Ser Ser
230 235 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303
Leu His Glu Phe GLy Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
245 250 255
CTG TTC GAG TCC GGT GCC GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1361
Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val hu Lys Asp
260 265 270
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399
Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr
275 280 285
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447
Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val lle Lys Ser Asp Gly Asp
290 295 300 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495
Ala Ala Tyr íle Ala Gly Asp Ha Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser
310 315 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543
Arg Gly His Asn Leu Asn íle Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly
325 330 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591
Tyr 11« Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala hu Gly Tyr Lys Pro
340 345 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639
Glu Gly Val Glu Val Leu íle Gly Gin Met Vel Asn Leu Leu Arg Asp
355 360 365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG OGT GCA GGC ACC GTG CTC ACC CTA 1687
Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu
370 375 380 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735
Asp Asp Leu Val Glu Ale íle Gly íle Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu
390 395 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783
íle Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp He Asp Leu Cly Leu Trp
405 410 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831
Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly His
420 425 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879
Ala Arg Leu Cys Ser íle Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Cly Val Thr
435 <40 <45
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927
Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
450 455 460 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975
Leu íle Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala
470 475 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA ΠΑ GCT 2023
Asp Leu Ar« Glu Pro His Afí íle Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala
485 490 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CCT CCA AAG GIT 2071
Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His íle Leu Pro Lys Val
500 505 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119
Asp Glu Asp Thr Ala Pro lle His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala
515 520 625
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC CTT TCC 2167
Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser
530 535 540 545
GCA CCC GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214
Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu
550 1 5
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262
Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Yal Arg Gin Glu Asp Gly
10 15 20 25
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTC CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310
Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr
30 35 40
GGA A0C CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC CAT TTC CCT TCC CGC TGT 2358
Gly Thr Pro Leu Phe Yal Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
45 50 55
CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406
Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala
60 65 70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454
Sor Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr íle Ala Arg Trp Vai Asp Glu Glu
75 80 85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502
Gly Leu Ala Leu Asp íle Ala Ser íle Asn Glu Leu Gly íle Ala Leu
90 95 100 105
GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550
Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg íle Thr Ala His Gly Asn Asn Lys
110 115 120
GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598
Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val
125 130 L3S
GTG CTG GAC TCC CCA CAG GAA CTA GAA CTC TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646
Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu Leu Clu Leu Leu Asp Tyr Vel Ala Ala
L40 145 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG ttg ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694
Gly Glu Gly Lys íle Gin Asp Val Leu íle Arg Val Lys Pro Gly íle
155 160 165
GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742
Clu Ala His Thr His Glu Phe íle Ale Thr Ser His Glu Asp Gin Lys
170 175 180 185
TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790
Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala
190 195 200
GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838
Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val
205 210 215
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886
Gly Ser Gin Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg
220 225 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA GAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934
Val Leu Cly Leu Tyr Ser Gin íle His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu
235 240 245
CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982
Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly íle Ala Tyr Thr Ala Ala
250 255 260 265
CAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Sar Asp Leu Leu Thr Ala
270 275 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078
Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly íle Asp Ala Pro Thr Val Leu
285 290 295
GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126
Val Glu Pro Gly Arg Ala íle Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ue Tyr
300 305 310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
315 320 325
CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222
Arg Tyr íle Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn íle Arg Pro Ala
330 335 340 345
CTC TAC GCC TCC GAA TAC GAC CCC CGC GTA GTA TCC CCC TTC GCC GAA3270
Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu
350 355360
GGA CAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG CGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC3318
Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg íle Val Gly Ser His Cys Glu SerGly
365 370375
GAT ATC CTC ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC3366
Asp íle Leu íle Asn Asp Glu íle Tyr Pro Ser Asp íle Thr SerGly
380 385390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC CCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC3414
Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala MetSer
395 400405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT3462
Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val ArgAla
410 415 420425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC3510
Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp íleLeu
430 435440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC3562
Ser Leu Glu Ala
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG3579 (2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 550 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
íle Ala Leu Gin Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu
50 55 50
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala íle Asp Ser
65 70 75 80
Ala Glu íle Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn íle Arg Leu Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Gin Gly Glu íle Val Ala Lys íle Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val
115 120 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro íle His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
130 135 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys
145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin íle Asp Arg
165 170 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr íle Lys Glu íle Ala Glu Ala íle Val
195 200 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu
210 215 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Set
225 230 235 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
245 250 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gľy Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val Leu Lys
260 265 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ale Trp Trp Leu Arg Ser
275 280 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val íle Lys Ser Asp Gly
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr íle Ala Gly Asp íle Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn íle Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His
325 330 335
Gly Tyr íle Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys
340 345 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu íle Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg
355 360 36S
Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
370 375 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala íle Gly íle Asp Ala Ala Arg Tyr Ser
385 390 395 400
Leu Íle Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp íle Asp Leu Gly Leu
405 410 415
Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly
420 425 430
His Ala Arg Leu Cys Ser Ue Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val
435 440 445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Clu Gly
450 455 460
Asp Leu Ue Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala
465 470 475 480
Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg íle Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu
485 490 495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His íle Leu Pro Lys
500 505 510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ue His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ala Thr Arg Gin Thr LeU Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val
530 535 540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545 550
Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu íle Lys Glu Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin Val
20 25 30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
35 40 45
(2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 445 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
Met Ala Thr Val Glu Asn Ph® Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gin Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr íle Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp íle Ala
85 90 95
Ser 11® Asn Glu Leu Gly íle Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg íle Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys íle Gin Asp
145 150 155 160
Val Leu íle Arg Val Lys Pro Gly íle Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
íle Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys Phe Gly Ph® Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gin Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin
225 230 235 240
íle His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly íle Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly íle Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala 11®
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr íle Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr íle Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn íle Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
íle Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp íle Leu íle Asn Asp Glu
370 375 380
íle Tyr Pro Ser Asp íle Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
335 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 426 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp 11® Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
(2) Údaje o SEQ ID NO: 6 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Syntetic DNA“ (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6: CATCTAAGTA TGCATCTCGG (2) Údaje o SEQ ID NO: 7 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Syntetic DNA“ (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG (2) Údaje o SEQ ID NO: 8 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 1034 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómováDNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 61..1020 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
ATGCATCrCG GTAAGCTCCA CCACGACAGT GCCACCACA* TTTTGGAGCA TTACAAGAAC 60
ATG ACC AAC ATC CGC GTA CCT ATC CTG GCC TAC GGA AAC CTG GGA CCC 108
Met Thr Asn íle Arg Val Ala íle Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
L 5 10 15
AGC CTC GAA AAC CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA 156
Ser Val Glu Lys Leu íle Ala Lys Gin Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACC CCA GTC TTT CAT 204
íle Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
40 46
GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG 252
Val A]a Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG 300
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp íle Pro Glu Gin Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA 348
Gin Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp 11® Pro
85 90 95
CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT 396
Arg His Arg Gin Val Mat Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
10C 105 110
GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC 444
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser íle Asn Arg
115 120 125
GTC TAC GCA GCC GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG 492
Val Tyr Ala ALa Ala Val Leu Ala Glu His Gin Gin His Thr Phe Trp
130 135 140
GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT 540
Gly Pro Gly Leu Ser Gin Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg íle Pro
145 150 155 160
GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC CCC CTG 58B
Gly Val Gin Lys Ala Val Gin Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC 636
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gin Thr
180 185 190
CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC 684
His Lys Arg Cln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Clu Arg
195 200 205
ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC cr GGC TAC GAA 732
Tie Glu Asn Asp íle Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC TCC GAG CAC ACC 780
Val Glu Val Asn Phe íle Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
5 2W 235 240
GCC ATG CCA CAC GGT CGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT CGC 828
Gly Met Pro His Gly Gly His Val íle Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAC CTG GAC CGA AAC CCA GAT 876
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr íle Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG 924
Phe Thr Ala Ser Ser Gin íle Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
MG CAG CAG GGC CAA ACC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA 972
Lys Gin Gin Gly Gin Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC 1020
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu íle Ala Arg Asp Val
306 310 315 020
TAATTTAGCT CGAG 1034 (2) Údaje o sekvencii SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 320 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
Met Thr Asn íle Arg Val Ala íle Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 15 10
Ser Val Glu Lys Leu íle Ala Lys Gin Pre Asp Met Asp Leu Val Gly 20 2530 íle Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 4045
Val Ala Asp Val Asp LyS HÍS Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 5560
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp íle Pro Glu Glr> Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 7580
Gin Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp íle Pro 85 9095
Arg His Arg Gin VaL Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
1Ú0 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser íle Asn Arg
115 L20 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gin Gin His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gin Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ue Pro
145 150 155 160
Gly Val Gin Lys Ala Val Gin Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
L65 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu A La Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gin Thr
180 185 190
His Lys Arg Gin Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
L95 200 205
íle Glu Asn Asp íle Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe íle Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val íle Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr íle Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gin íle Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gin Gin Gly Gin Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu íle Ala Arg Asp Val
305
310
315
320 (2) Údaje o SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Syntetic DNA“ (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) Údaje o SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvencie (A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (i i) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Syntetic DNA“ (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C (2) Údaje o SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 1643 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΛΑΤΑΤΤΛΛΛ TCGAATATCA ATATACCGTC 60
TGTTTaTTGC AACCCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCCC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACACTIT ATAAAGGTAG ACTTGAGCGG 1SO GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCCGAACCC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCACC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGÍCA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTCAGCC TATTTCTAAC GCTCTCGTCC CCATGGCTAT TCAGTCCCTT 480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTCGTG TGCTCACCAC CGACCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTCTTGA CGTCACACCG CGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTCCA TTGTTCCTGG TTTTCAGCGT GTTAATA.OG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTCGTTCTGA CACCACTCCA CTTGCGTTGG CAGCTCCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCCGA CCTTGACGGT CTGTATACCG CTGACCCGCC CATCGTTCCT 780 AATCCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC CAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACCCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCBC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TCATCCCCGC ACmCATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTCTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATÁA GCCAGGCGAG CCTGCCAACG TTTTCCGTGC CTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTCACAT CGTTCTCCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGCCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC CGACCCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTC GACCAATGTG CTTTACGACG ACCACCTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTCGGTG CTGGCATCAA GTCTCACCCA CGTGTTACCG CAGAGTTCAT GCAAGCTCTG 1320 CGCGATCTCA ACGTGAACAT CGAATTCATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAC ATGATCTGGA TGCTCCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGOCGTCGT 7TATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTACTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACOGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTCAA TTC 1643 (2) Údaje o SEQ ID NO: 13 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 1 643 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 217..1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:
TCCCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATAITAAA TCGAATATCA ATATACCGTC 60
TGTTTATTCG AACCCATCCC AGTGCCTCAG ACCCATCCGC TAAAGCCCCA CGAACCCTGT 120 GCAGAAACAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ΑΓ/AAGCTAG ACTTCACCM 180 GTAACTCTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTC GCC CTC GTC GTA CAC 234
Het Ala Leu Val Val Glr>
l5
ΑΑΛ ΤΛΤ GGC COT TCC TCG CTT CAC AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg íle Arg Asn Val
1520
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT330
Ala Glu Arg íle Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val ValVal
3035
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CIT CTA GAA CTT GCA378
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu LeuAla
4550
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG426
Ala AU Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met LeuLeu
60 6570
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG474
Thr Ala Gly Glu Arg íle Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala íleGlu
8085
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala GlyVal
95100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Íle Val Asp Val ThrPro
105 110U5
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GCT GCT618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys íle Cys íle ValAla
120 125130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Tbr LeuGly
135 140 145150
CCT GGT CGT TCT GAC ACC ACT CCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala LeuAsn
155 160US
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAJ ACC GCT762
Ala Asp Val Cys Glu íle Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr ThrAla
170 175180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC ACC TTC810
Asp Pro Arg íle Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu SerPhe
185 190195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys íle Leu ValLeu
200 205210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTI CGC GTA CGC906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg ValArg
215 220 225230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu íle Ala Gly Ser MetGlu
235 240245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG1002
Asp íle Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr AspLys
250 255260
TCC GM GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ΑΠ TCC GAT AAG CCA GGC GAG1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro GlyGlu
265 270275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC1098
Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íleAsp
280 285290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC1146
Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Aspíle
295 300 305310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG CAG ATC TTG1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg AU Met Glu íleLeu
315 320325
AAG AAG CTT CAC CTT CAC GGC AAC TGC ACC AAT GTG CTT TAC GAC CAC1242
Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr AspAsp
330 335340
CAC GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA1290
Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser HisPre
345 350355
GGT CTT ACC CCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC1338
Cly Val Thr AU Glu Phe Het Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT1386 íle Glu Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg
375 380 385390
CAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAGL434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin
395 400405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GCT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Vel Val Tyr Ala Gly Thr GlyArg
410 415420
AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TCT7GGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGOCAGGT TATGCGCACC CTTCTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTCTTCGTľ 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C1643 (2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 421 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:
Met A la L eu V al Val Gin Lys Tyr ' Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu A: rg I le A rg Asn Val Ala Glu Arg íle Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly A sn A sp V al Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu L eu L eu G Ílu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pre Ala i Arg
50 55 60
Glu M et A sp Met Leu 1 Leu Thr Ala Gly Glu Arg íle Ser Asn Ala t Leu
65 70 75 80
Val A la M let Ala Ue Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Sex ' Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
íle Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys íle Cys íle Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 1 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu íle Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg íle Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys íle Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
íle Ala Gly Ser Met Glu Asp íle Pro Val Glu Glu AU Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Pha Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu íle Asn Ue Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser VaL Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys Leu Gin VaL Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly AU
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn íle Glu Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg
370 375 380
íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp Asp Leu Asp Α1» Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420 (2) Údaje o SEQ IDNO: 15 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 1643 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómováDNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 964..1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:
TCGCGAAGrA GCACCTGTCA CTTrTGTCTC ΛΛΑΤΑΠΛΛΑ TCGAATATCA ATATACGGTC60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACCCATCCGC TAAAGCCCCA GCAACOTGT120
GCAGAAACAA AACACTCCTC TGGCTACGTA GACACACTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
GTAACTCTCA CCACGTACAT CCAAACGTGC ACAAAGGTGG CCCrCGTCCT ACAGAAATAT240
GGCGGTľCCT CGCTTGAGAG TGCCGAACGC AľTAGAAACC TCGCTGAACG CATCCTTCCC300
ACCAACAAGG CTCGAAATCA TCTCCTCGÍT CrCTGCTCCC CAATGGGACA CACCACCCAT360
GAACTTCTAG AACTICCACC GCCACTGAAT CCCCTTCCGC CACCTCCTCA AATGGATATC420
CTCCTGACTC CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCCTCG CCATCGCTAT TCAGTCCCTT4S0
GGCCCACAAG CTCAATCTTT CACTGOCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCACS40
GGAAACCCAC GCATTCTTGA CGTCACACCC GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCCA TCTCACCACG660
TTGGGTCGTG CTGGITCTCA CACCACTCCA GTTCCGTTGG CAXTGCTTT GAACGCTGAT720
GTGTGTCAGA TTTACTCGGA CGTrGACGGT GTGTATACCG CTGACCGCCG CATCGTTCCT780
AA1GCACACA AGCľCGAAAA GCTCAGCTTC GAACAAATGC TGGAACTTGC TCCTGTTGGC840
TCCAAGATTT TCGTCCTGCG C/GTGTTGAA TACCCTCCTG CATTCAATGT GCCACTICGC900
CTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCCGC ACTTTGATTC CCGGCTCTAT CCAGGATATT 960
CCT CTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAC TCC GAA1008
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
1 5 10 15
GCC AAA OTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
AAC GIT TTC CCT CCG TTG CCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104
Lys Val Phe Ars Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle Asp Met Val
40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152
Leu Gin Asr> Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe
50 55 60
ACC TGT CCT CGC GCT GAC GGA CGC CCT CCG ATC GAG ATC TTC AAG AAG 1200
Thr Cys Pro Are Ala Asp Gly Arg Ať< Ala Met Glu íle Leu Lys Lys
65 70 75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTC CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248
Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Víl
SO 85 90 95
GGC AAA CTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATC AAG TCT CAC CCA CGT GTT 1296
Gly Lys Val Ser Lett Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110
ACC GCA GAG TTC ATG CAA GCT CTC CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344
Thr Ala Glu Phe liet Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn íle Glu
115 120 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAC ATC CGC ΑΠ TCC GTG CTG ATC CCT GAA GAT 1392
Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp
130 135 140
GAT CTG GAT CCT GCT GCA CGT GCA TTC CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440
Asp Leu Asp Ala Ale Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Pho Gin Leu Gly
145 150 155
GCC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAACTTTTAA 1490
Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 |?o
ACGACTAGTT TTACAATCAC CACCATCCCA CTTGTTGCTC CAACCGGCCA CGTCGGCCAC 1550 CTTATCCCCA CCCTTTTCCA ACACCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610
TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC (2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 172 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys Leu
65 70 ?5 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
S5 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn íle Glu Leu
115 120 125
íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly
145 150 155 1 .60
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170 (2) Údaje o SEQ ID NO: 17 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17: GTCGACGGATCGCAAATGGC AAC (2) Údaje o SEQ ID NO: 18 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG (2) Údaje o SEQ IDNO: 19 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 1411 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 311..1213 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:
CTCTCGATAT CCAGAGAGAA CCAGCGCCAC GCTHTTCGC TGATTTTCAG ATTGAAACTT60
TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAACCC CCTATCTCAT GGACTTTTAA CGCAAACCrC120
ACACCÍACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC180
CTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGrTC TTATOGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT240
GCAAAAGTTC TTAGGTnTT TGCGGGGT’G TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC300
CTT GAAC TCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA CAG CAC 349
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His
1 5 10
TTC GGC ACC CTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA 397
Phe Gly Thr Val Gly Val Ale Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly
15 20 25
GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTC GTT GAT 445
Asp Ile Asp íle Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp
30 35 40 45
AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA 493
Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro
50 55 60
ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG 541
Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu
65 70 75
GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC 589
Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn
80 85 90
ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA CCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA 637
Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala
95 100 105
GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG 685
Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gin Glu
110 115 120 125
GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA 733
Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro
130 135 140
ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA CGT ATT CCA ATT GAG TCT 781
Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Íle Pro Ile Glu Ser
145 150 155
GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG CTC AAG 829
Asp Thr Het Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys
160 165 170
GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACC 877
Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr
17S 180 185
GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925
Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu
190 J 95 200 205
GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973
Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro
210 215 220
ACA GCA CTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC CTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val
225 230 235
CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069
Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gin
240 245 250
GGT CGC CTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA CCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117
Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gin
255 260 265
GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA ΛΑΤ GAG 1165
Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Fro Ile Met Ala Pro Asn Glu
270 275 280 285
CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213
Gin Glu Leu Glu Ala Leu Arg Clu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300
TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCCGCC GGAAGGnAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273 AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG CCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333 CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGCATGC1G CGCAAGGTGC 1393 TCAAGGATCC CAACATTC 1411 (2) Údaje o sekvencií SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 301 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu Hl s Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Ala Ala Gly Arg Clu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
100 L05 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gin Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly ArS Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe íle Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225 230 235 240
Clu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gin Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gin Gly Ile Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro íle Met Ala Pro Asn Glu Gin Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asi p Me t Ly s Lys A la C ly V ľal Leu
290 29 5 3 >00
(2) Údaje o SEQ 1DNO:21 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA (2) Údaje o SEQ ID NO: 22 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 23 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /desc=„Synthetic DNA“ (iv) Anti-sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT (2) Údaje o SEQ ID NO: 23 (i) Charakteristika sekvencie (A) DÍžka: 2001 párov báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómováDNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znak:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 730..1473 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:
GGMCCCCM TCGATACCre GiUCGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT60
GACGTTGAGG AACGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG120
ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTCGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC180
TC6CGTGAAC GrrrarGCT CGCCAACGCC GATGCCAGCG ATCGAOTAT CGGAGTCACC240
AACTTGACCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACCCCGCCA AAGCAGTGGG300
GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GCGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC360
ATCTGAAGCC GTGCGAGTTG TGGTGACCCG CTTAGCGGTT TCAG7TTCTG TCACAACTGG420
AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTCA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA480
AGAGGCCGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT540
AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT CTGTCATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT600
GATGAACAAT CGTTAACAAC ACaGACCAAA ACGGICAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT660
TCTGAATGGG TACGTCTACA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCHCGCCCC ACGAAAATGA720
AGGAGCATA ATG GGA ATC AAC GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA CGC CGT768
Met Gly íle Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg
5 10
GIT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG Val Gly Gin Thr íle Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu 15 20 25
CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CIT CTC GTA GAC
Leu Val Ala Glu íle Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp
30 35 40 45
AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC nc ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG
Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met
50 55 60
GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCľ GCG GTT GTT GGA
Gly Asn Leu Glu Phe Cys íle Asn Asn Gly íle Ser Ala Val Val Gly
65 70 75
ACC ACC CGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAC GTT CGC GCC TGG CTT
Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gin Val Arg Ala Trp Leu
85 90
816
864
912
960
1008
GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GIT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC 1056
Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Íle Ala Pro Asn Phe Ala Ue
95 100 105
TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC T7C nc 1104
Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gin Ala Ala Arg Phe Phe
110 115 120 125
GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA 1152
Glu Ser Ala Glu Val íle Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala
130 135 L40
CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC 1200
Pro Ser Gly Thr Ala íle His Thr Ala Gin Gly íle Ala Ala Ala Arg
145 150 155
AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT 1248
Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gin Pro Asp Ala Thr Glu Gin Ala Leu
160 165 170
GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA CAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC 1296
Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly 11» Pro Val His Ala Val
175 180 185
CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC CAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG 1344
Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gin Val íle Phe Gly Thr Gin
190 195 200 205
GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT 1392
Gly Gin Thr Leu Thr íle Lys C ln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe
210 215 220
GCA CCA GGT GTC TTG CTG GCT CTC CGC AAC ATT GCA CAC CAC CCA GGC 1440
Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn íle Ale Glr> His Pro Gly
22S 230 235
CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GCC CTG TAAAGGC' ľCA TTTCAGCAGC 1493
Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
240 245
GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC CAACAACTTA AATTGACCGT 1553 GGACTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGC7GAT GTTGAGTGGT CA/CTGATGT 1613 TCAGGGCGCG GAACCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACCAAA CTTTTGATAA 1673 GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTCCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733 CACTGCTTTG CTTCAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGC/TTT CTCGCTCCGC 1793 CACCCATGAA TTGGTCCCAC ACCCCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT 1853
GCACAGCGCA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGäTC CGCAGTTGCG 1913
TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGCATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC 1973
GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG 2001 (2) Údaje o sekvencii SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 248 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín
(X :i) Opis sekvencie: : SEQ1 DNO: 24:
Met Gly íle Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gin
1 5 10 15
Thr Íle Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ue Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys íle Asn Asn Gly íle Ser Ala Val Val Gly Thr Thr ciy
65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gin Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu íle Ala Pro Asn Phe Ala íle Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gin Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val íle Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala íle His Thr Ala Gin Gly íle Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145 150 155 160
Gly Met Asp Ala Gin Pro Asp Ala Thr Glu Gin Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly íle Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gin Val íle Phe Gly Thr Gin Gly Gin Thr
195 200 205
Leu Thr íle Lys Gin Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn íle Ala Gin His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Vektor, autonómne replikovateľný v bunkách koryneformných baktérií, obsahujúci sekvenciu DNA, kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu a sekvenciu DNA, kódujúcu diaminopimelátovú dehydrogenázu.
  2. 2. Vektor podľa nároku 1, v ktorej uvedená sekvencia DNA, kódujúca diaminopimelátovú dekarboxylázu kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 5 Zoznamu sekvencii, alebo aminosekvenciu v podstate rovnakú, ako je aminokyselinová sekvencia, uvedená v SEQ ID NO: 5.
  3. 3. Vektor podľa nároku 1, v ktorej uvedená sekvencia DNA, kódujúca diaminopimelátovú dehydrogenázu kóduje aminokyselinovú sekvenciu vyznačenú v SEQ ID NO: 9 Zoznamu sekvencii, alebo aminokyselinovú sekvenciu v podstate rovnakú, ako je aminokyselinová sekvencia vyznačená v SEQ ID NO: 9.
  4. 4. Koryneformná baktéria, v ktorej sú vnútrobunkové aktivity tak diaminopimelátovej dekarboxylázy, ako aj diaminopimelátovej dehydrogenázy zvýšené prostredníctvom zvýšenia počtu kópií DNA sekvencií kódujúcich tieto enzýmy, použitím silného promótora alebo ich kombináciou.
  5. 5. Koryneformná baktéria, podľa nároku 4, ktorá ja transformovaná vložením vektora podľa nároku 1.
  6. 6. Spôsob prípravy L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa krok kultivácie uvedenej koryneformnej baktérie podľa nároku 4 v prostredí, ktoré umožňuje produkciu a akumuláciu L-lyzinu v kultúre, a krok oddelenia L-lyzínu od kultúry.
  7. 7. Spôsob prípravy L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa krok kultivácie uvedenej koryneformnej baktérie podľa nároku 5 v prostredí, ktoré umožňuje produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre, a krok oddelenia L-lyzínu od kultúry.
SK593-97A 1996-06-05 1997-05-12 Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu SK284739B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14281296A JP4035855B2 (ja) 1996-06-05 1996-06-05 Ｌ−リジンの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK59397A3 SK59397A3 (en) 1997-12-10
SK284739B6 true SK284739B6 (sk) 2005-10-06

Family

ID=15324210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK593-97A SK284739B6 (sk) 1996-06-05 1997-05-12 Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6090597A (sk)
EP (1) EP0811682B2 (sk)
JP (1) JP4035855B2 (sk)
CN (2) CN1908174B (sk)
BR (1) BR9703475B1 (sk)
DE (1) DE69727260T3 (sk)
DK (1) DK0811682T4 (sk)
ES (1) ES2214567T5 (sk)
HU (1) HU223764B1 (sk)
PL (1) PL186081B1 (sk)
SK (1) SK284739B6 (sk)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU705550B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
IL120923A0 (en) * 1997-05-27 1997-09-30 Amylum Nv A combined process for the production of lysine and its salts and of a further weak acid and a salt thereof
KR20010031152A (ko) * 1997-10-17 2001-04-16 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 내염성의 메탄올 이용성 바실러스를 사용한 라이신의 생산방법
JP2003135066A (ja) * 1999-03-19 2003-05-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BR0012020A (pt) 1999-07-02 2002-07-02 Ajinomoto Kk Proteìna, e, dna
AU2223601A (en) * 1999-12-24 2001-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acid and novel gene
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
US6833329B1 (en) * 2000-06-22 2004-12-21 Micron Technology, Inc. Methods of forming oxide regions over semiconductor substrates
US6660657B1 (en) * 2000-08-07 2003-12-09 Micron Technology, Inc. Methods of incorporating nitrogen into silicon-oxide-containing layers
EP1368367B1 (en) 2001-02-08 2017-05-03 Archer-Daniels-Midland Company Polynucleotide constructs for increased lysine production
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
EP1881076A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-23 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids
WO2009109102A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Global Bil-Chem Technology Group Company Limited Recombinant microorganism and method for producing l-lysine
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
EP2302066A4 (en) 2008-07-09 2012-02-08 Ajinomoto Kk METHOD FOR PRODUCING AMINOHYDROXYBENZOIC ACID
WO2013062029A1 (ja) 2011-10-25 2013-05-02 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
WO2013065772A1 (ja) 2011-11-02 2013-05-10 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
EP2748340B1 (en) 2011-11-02 2016-06-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of proteins
WO2014126260A1 (ja) 2013-02-18 2014-08-21 味の素株式会社 タンパク質の沈殿による製造方法
RU2013119826A (ru) 2013-04-29 2014-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Коринеформная бактерия и способ получения гетерологичных гибридных белков
CN104946731B (zh) * 2014-03-28 2019-12-20 中国中医科学院中药研究所 快速检测金银花的pcr试剂盒及检测方法
DE102014208199A1 (de) 2014-04-30 2015-11-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940039A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems
ES2778037T3 (es) 2014-04-30 2020-08-07 Evonik Operations Gmbh Procedimiento para la producción de L-aminoácidos bajo empleo de una bacteria alcalífila
JP6729600B2 (ja) 2015-11-12 2020-07-22 味の素株式会社 Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法
CN108291243A (zh) 2015-11-27 2018-07-17 赢创德固赛有限公司 生产l-甲硫氨酸的方法
JP7020403B2 (ja) 2016-05-02 2022-02-16 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
AU2017347016B2 (en) 2016-10-21 2021-09-23 Ajinomoto Co., Inc. Secretory production method for protein
JP7159867B2 (ja) 2016-10-21 2022-10-25 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
EP3601583A1 (en) 2017-03-28 2020-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing rna
EP3456833A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-20 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
WO2019078095A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING ALPHA-HYDROXYLANTIC PEPTIDYLGLYCIN MONOOXYGENASE ACTIVITY
BR112020012044A2 (pt) 2017-12-26 2020-11-24 Ajinomoto Co., Inc. método para produzir glicina ou um sal da mesma, e, bactéria produtora de glicina.
JP7367667B2 (ja) 2018-02-20 2023-10-24 味の素株式会社 Ｒｎａサイレンシングを誘導する方法
JP7439749B2 (ja) 2018-04-20 2024-02-28 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
AU2019364829A1 (en) 2018-10-25 2021-06-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of protein
JPWO2020090979A1 (ja) 2018-10-31 2021-09-24 味の素株式会社 抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
EP3960870A4 (en) 2019-03-29 2023-06-07 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF ALLOLACTOSE
JPWO2020226087A1 (sk) 2019-05-08 2020-11-12
JPWO2021085405A1 (sk) 2019-10-28 2021-05-06
JPWO2021112249A1 (sk) 2019-12-06 2021-06-10
JPWO2021177392A1 (sk) 2020-03-04 2021-09-10
EP4223129A1 (en) 2020-09-29 2023-08-09 Ajinomoto Co., Inc. Mutant transglutaminase
CA3211636A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 Daesang Corporation Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same
CN112921012B (zh) * 2021-03-18 2022-10-11 江南大学 谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用
EP4368722A1 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of unnatural-amino-acid-containing protein
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861722A (en) * 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JPH0611230B2 (ja) * 1985-06-14 1994-02-16 協和醗酵工業株式会社 新規組換え体プラスミド
JPH07112431B2 (ja) † 1985-09-06 1995-12-06 味の素株式会社 遺伝子発現調節法
JP2708168B2 (ja) † 1988-02-23 1998-02-04 昭和電工株式会社 微生物の改良
JP2817172B2 (ja) * 1989-03-07 1998-10-27 味の素株式会社 発酵法によるｌ―リジンの製法
US5426052A (en) * 1989-04-10 1995-06-20 Regents Of The University Of Minnesota Bacillus MGA3 diaminopimelate decarboxylase gene
JP2967996B2 (ja) * 1989-06-06 1999-10-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―トリプトファンの製造法
DE3943117A1 (de) * 1989-12-27 1991-07-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna
EP0469517A3 (en) * 1990-07-30 1992-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing l-glutamic acid
FR2665711B1 (fr) † 1990-08-08 1993-08-13 Centre Nat Rech Scient Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue.
WO1992003546A1 (en) † 1990-08-23 1992-03-05 Exogene Corporation Enhancement of production of native products in corynebacterium by expression of cloned bacterial hemoglobin
JPH07108228B2 (ja) † 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
US5693781A (en) † 1991-06-03 1997-12-02 Mitsubishi Chemical Corporation Promoter DNA fragment from coryneform bacteria
DE69331255T2 (de) † 1992-03-11 2002-08-22 Ajinomoto Kk Transponierbares-element aus dem bakterium vom genus brevibakterium
DE4208785A1 (de) † 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
JPH05284970A (ja) * 1992-04-07 1993-11-02 Mitsubishi Petrochem Co Ltd ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用
JP3473042B2 (ja) 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
JPH0775579A (ja) * 1993-09-08 1995-03-20 Mitsubishi Chem Corp ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用
JPH07140614A (ja) † 1993-11-12 1995-06-02 Fuji Photo Film Co Ltd ハロゲン化銀カラー感光材料
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
AU705550B2 (en) † 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
CN100540668C (zh) 1999-04-19 2009-09-16 协和发酵生化株式会社 新型脱敏型天冬氨酸激酶
DE10359660A1 (de) † 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag Psod-Expressionseinheiten

Also Published As

Publication number Publication date
EP0811682A3 (en) 1998-06-10
DE69727260D1 (de) 2004-02-26
HU223764B1 (hu) 2005-01-28
JPH09322774A (ja) 1997-12-16
BR9703475A (pt) 1998-09-29
EP0811682B1 (en) 2004-01-21
DE69727260T2 (de) 2004-10-14
SK59397A3 (en) 1997-12-10
ES2214567T5 (es) 2017-08-24
DK0811682T4 (en) 2017-06-12
PL320324A1 (en) 1997-12-08
HUP9700851A3 (en) 2000-08-28
CN1908174A (zh) 2007-02-07
JP4035855B2 (ja) 2008-01-23
EP0811682A2 (en) 1997-12-10
CN1171442A (zh) 1998-01-28
PL186081B1 (pl) 2003-10-31
HUP9700851A2 (hu) 1999-06-28
CN1908174B (zh) 2010-05-26
ES2214567T3 (es) 2004-09-16
US6090597A (en) 2000-07-18
HU9700851D0 (en) 1997-06-30
DE69727260T3 (de) 2017-08-24
DK0811682T3 (da) 2004-05-17
BR9703475B1 (pt) 2012-02-22
EP0811682B2 (en) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK284739B6 (sk) Vektor autonómne replikovateľný v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu
US6221636B1 (en) Method for producing L-lysine
US8183017B2 (en) Method of producing L-lysine
EP0854189B1 (en) Method for producing L-lysine
JP4168463B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20170512