BR9703475B1 - vetor recombinante autonomamente replicável em células de bactérias corineformes, bactéria corineforme geneticamente engenheirada, e, processo para a produção de l-lisina. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção "VETOR RECOMBINANTE AUTONOMAMENTE REPLICÁVEL EM CÉLULAS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, BACTÉRIA CORINEFORME GENETICAMENTE ENGENHEIRADA, E, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE L-LISINA".

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de L-Iisina por cultivo de um microorganismo obtido por modificação de uma bactéria corineforme usada para a produção fermentativa de aminoácidos ou similares por meio de uma técnica baseada em engenharia genética.

A L-lisina, que é usada como um aditivo para forragem, é habitualmente produzida por um processo fermentativo pelo uso de uma cepa mutante que produz L-lisina pertencente às bactérias corineformes. Várias bactérias que produzem L-lisina conhecidas atualmente são aquelas criadas por mutação artificial partindo das cepas do tipo selvagem pertencente às bactérias corineformes.

Como para as bactérias corineformes. são divulgados um vetor plasmideo que é autonomamente replicável em células bacterianas e tem um gene marcador de resistência a droga (ver patente norte- americana US 4.514.502), e um processo para introduzir um gene em células bacterianas (por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público N0 2-207791). É também divulgada uma possibilidade de cultivar uma bactéria que produz L-treonina ou L-isoleucina por uso das técnicas como descritas acima (ver as patentes norte-americanas US 4.452.890 e US 4.442.208). Como para o cultivo de uma bactéria que produz L-lisina, é conhecida uma técnica, em que um gene que participa da biossintese da L-lisina é incorporado a um vetor plasmideo para amplificar o gene em células bacterianas (por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público N°. 56-160997).

Os genes conhecidos para a biossintese da L-lisina incluem, por exemplo, um gene da dihidrodipicolinato redutase (Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N°. 7-75578) e um gene da diarainopimelato desidrogenase (Ishino, S. e outros, Nucleic Acids Res. . 15, 3917 (1987) ) , que são genes clonados que participam da biossíntese da L-lisina, assim como um gene da fosfoenolpirivato carboxilase (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N°. 60-87788), um gene da dihidrodipicolinato sintase (Pedido de Patente Japonesa Depositada N°. 6-55149), e um gene da diaminopimelato descarboxilase (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N0. 60-62994), cuja amplificação afeta a produtividade da L-lisina.

Como descrito acima, certos resultados bem sucedidos para melhorar a produtividade da L-lisina foram obtidos por meio de amplificação de genes para a biossíntese da L-lisina. Entretanto, a amplificação de alguns genes diminui a velocidade de crescimento de bactérias embora a amplificação melhore a produtividade da L-lisina, resultando na diminuição da taxa de produção de L-lisina.

Nenhum caso foi registrado em que o crescimento pretende ser melhorado aperfeiçoando um gene do mesmo modo para a biossíntese da L-lisina. Nas presentes circunstâncias, nenhum caso é conhecido para as bactérias corineformes, em que qualquer um foi bem sucedido no melhoramento notável no rendimento de L-lisina sem restrição do crescimento, combinando uma pluralidade de genes para a biossíntese da L-lisina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é melhorar a capacidade de produção da L-lisina sem diminuir a velocidade de crescimento de uma bactéria corineforme, por melhoria de uma pluralidade de genes para a biossíntese da L-lisina em combinação nas bactérias corineformes.

Quando é produzida uma substância objetiva fermentativamente pelo uso de um microorganismo, a velocidade de produção, assim como o rendimento da substância objetiva em relação a um material introduzido, é um fator extremamente importante. Uma substância objetiva pode ser produzida notavelmente com poucas despesas pelo aumento da velocidade de produção por uma unidade de equipamento de fermentação. Conseqüentemente, é industrialmente extremamente importante que o rendimento fermentativo e a velocidade de produção sejam compatíveis um com o outro. A presente invenção propõe uma solução para o problema como descrito acima de maneira a produzir fermentativamente a L-lisina pelo uso de uma bactéria corineforme.

O princípio da presente invenção é baseado no fato de que o crescimento de uma bactéria corineforme pode ser melhorado e a velocidade de produção de L-Iisina da mesma pode ser aperfeiçoado melhorando tanto uma seqüência de DNA que codifica para uma diaminopimelato desidrogenase (uma diaminopimelato desidrogenase é aqui citada como "DDC11 e um gene que codifica para uma proteína DDC é citado como "lysA", se necessário) e uma seqüência de DNA que codifica para uma diaminopimelato descarboxilase (uma diaminopimelato descarboxilase é aqui a seguir citada como "DDH" e um gene que codifica para uma proteína DDH é citado como "ddh", se necessário) comparado com o caso em que estas seqüências de DNA são cada uma melhorada isoladamente.

A saber, a presente invenção se baseia em um DNA recombinante autonomamente replicável em células de bactérias Corineformes7 compreendendo uma seqüência de DNA que codifica para uma .diaminopimelato desidrogenase e uma seqüência de DNA que codifica para uma diaminopimelato descarboxilase.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma bactéria corineforme que se prende a uma seqüência de DNA aperfeiçoada que codifica para uma diaminopimelato desidrogenase e uma seqüência de DNA aperfeiçoada que codifica para uma diaminopimelato descarboxilase.

Em um outro aspecto ainda, a presente invenção fornece um processo para produzir L-Iisina que compreende as etapas de cultivar a bactéria corineforme descrita acima em um meio para permitir que a L-Iisina seja produzida e acumulada em uma cultutra e coletar a L-Iisina da cultura.

As bactérias corineformes citada na presente invenção são um grupo de microorganismos còmo definido em BergevfS Manual of Determinative Bacterioloqy. 8a. edição, p. 599 (1974) , que são bastões não ácidos rápidos Gram-positivos aeróbicos que não têm capacidade de formação de esporo. As bactérias corineformes incluem bactérias pertencentes ao gênero Còrynebacterium, bactérias pertencentes ao gênero Brevibacterium que foram até agora classificadas no gênero Brevibacterium porém unidas como bactérias pertencentes gênero Còrynebacterium atualmente e as bactérias pertencentes ao gênero Brevibacterium intimamente relacionadas às bactérias pertencentes ao gênero Còrynebacterium.

De acordo com a presente invenção, pode ser melhorada a capacidade de produção de L-lisina pelas bactérias corineformes e a velocidade de crescimento também pode ser melhorada. A presente invenção pode ser aplicada a bactérias comuns que produzem L-lisina assim como a cepas com alta produtividade de L-lisina.

BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p2 99LYSA que contém lysA.

A Fig. 2 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p299LYSB que contém lysA e Brev.-ori.

A Fig. 3 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pPK4D que contém ddh e Brev.-ori.

A Fig. 4 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p399DL que contém ddh e lysA.

A Fig. 5 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pDL que contém ddh. lysA e Brev.-ori.

A Fig. 6 ilustra um processo de construção de um plasmídeo p3 99AKYB e p3 99AK9B cada um contendo lysC mutante.

A Fig. 7 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pDPRB que contém dapB e Brev.-ori.

A Fig. 8 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pDPSB que contém dapA e Brev.-ori.

A Fig. 9 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCRCAB que contém lysC, dapA e Brev.-ori.

A Fig. 10 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCB que contém lysC, dapB mutantes e Brev.-ori.

A Fig. 11 ilustra um processo de construção de um plasmídeo ρAB que contém dapA, dapB e Brev.-ori.

A Fig. 12 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCAB que contém lysC, dapA, dapB mutantes e Brev.-ori.

A Fig. 13 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCABL que contém lysC, dapA. dapB, lysA mutantes e Brev.- ori.

A Fig. 14 ilustra um processo de construção de um plasmídeo pCABDL que contém lysC. dapA. dapB. ddh. lysA mutantes e Brev.-ori.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será explicada em detalhe a seguir.

<1> preparação de genes para biossíntese da L-lisina usada para a presente invenção Os genes para biossíntese da L-lisina usados na presente invenção podem ser obtidos respectivamente preparando DNA cromossomal a partir de uma bactéria como um doador de DNA, construindo uma coleção de DNA cromossomal usando um vetor plasmídeo ou similar, selecionando uma cepa que guarda um gene desejado da coleção e recuperando, da cepa selecionada, o DNA recombinante no qual foi inserido o gene. 0 doador de DNA para o gene para a biossíntese da L-lisina usada na presente invenção não é especificamente limitada contanto que o gene desejado para a biossíntese da L-lisina expresse uma proteína de enzima que funcional em células de bactérias corineformes. Entretanto, o doador de DNA é de preferência uma bactéria corineforme.

Ambos os genes de IvsA e ddh que se originam das bactérias corineformes têm seqüências conhecidas. Conseqüentemente, eles podem ser obtidos realizando amplificação de acordo com o processo de reação em cadeia de polimerase (PCR; ver White, T. J. e outros, Trends Genet., 5, 185 (1989).

Cada um dos genes para a biossíntese da L-lisina usados na presente invenção pode ser obtido de acordo com certos processos como exemplificado a seguir.

(1) Preparação de lysA mutante

lysA pode ser isolado do cromossomo de uma bactéria corinef orme preparando DNA cromossomal de acordo com, por exemplo, um processo de Saito e Miura (H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963) e amplificando IvsA de acordo com o processo de reação em cadeia de polimerase (PCR; ver White, T. J. e outros, Trends Genet.. 5, 185 (1989) . O doador de DNA não é especificamente limitado, entretanto, ele é exemplificado por Brevibacterium lactofermentum ATCC cepa 13 869.

Nas bactérias corinef ormes, IvsA formam, um óperon juntamente com argS (gene arginil-tRNA sintase) e lysA existe a jusante de argS. A expressão de lysA é regulada por um promotor que existe a jusante de argS (ver Journal of Bacteriology. Nov., 7356- 7362 (1993) ) . As seqüências de DNA destes genes são conhecidas para Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990) ; Molecular and General Genetics. 212, 112-119 (1988)), à base dos quais podem ser preparados iniciadores de DNA para PCR. Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA's de 23-meros respectivamente tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N°. 1 na Listagem de Seqüência (correspondente aos números de nucleotídeo 11 a 33 em uma seqüência de nucleotídeo descrita em Molecular Microbiolocrv. 4(11) , 1819-1830 (1990)) e SEQ ID N°. 2 (correspondente aos números de nucleotídeo 13 70 a 13 92 em uma seqüência de nucleotídeo descrita em Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)).

No Exemplo descrito posteriormente, foi usado um fragmento de DNA contendo um promotor, arqS e IysA de forma a melhorar o IysA. Entretanto, arcfS não é essencial para a presente invenção. Pode ser permitido usar um fragmento de DNA em que IysA está ligado logo a jusante de um promotor.

Uma seqüência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo arqS e IvsA e uma seqüência de aminoácido deduzida para ser codificada pela seqüência de nucleotídeo são exemplificadas na SEQ ID N°. 3. Um exemplo de uma seqüência de aminoácido codificada por arqS é apresentado na SEQ ID N°. 4 e um exemplo de uma seqüência de aminoácido codificada por IysA é apresentado na SEQ ID N°. 5. Além dos fragmentos de DNA que codificam para estas seqüências de aminoácido, a presente invenção pode equivalentemente usar fragmentos de DNA que codificam para seqüências de aminoácido substancialmente as mesmas que a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°. 5, a saber seqüências de aminoácido que tenham mutação baseada, por exemplo, na substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos contanto que não haja influência substancial sobre a atividade DDC.

0 DNA pode ser sintetizado de acordo com um processo comum usando sintetizador de DNA modelo 3 80B produzido por Applied Biosystems e usando o processo de fosfoamidita (ver Tetrahedron Letters (1981) , 22., 1859) . PCR pode ser realizada usando DNA Thermal Cycler Model PJ2000 produzido por Takara Shuzo e usando Taq DNA polimerase de acordo com um processo projetado pelo fornecedor.

É preferível que IvsA amplificado por PCR esteja ligado com DNA vetor autonomamente replicável em células de E_;_ coli e/ou bactérias corineformes para preparar DNA recombinante e o DNA recombinante é introduzido de antemão em células de Ej. coli. Tal provisão torna fácil as operações a seguir. 0 vetor autonomamente replicável em células de coli é de preferência um vetor

plasmídeo que é de preferência autonomamente replicável em células de um hospedeiro, inclusive, por exemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG2 99, PHSG399, pHSG398 e RSF1010.

Quando um fragmento que tem uma capacidade de permitir que um plasmídeo seja autonomamente replicável em bactérias corineformes é inserido nestes vetores, eles podem ser usados como um chamado vetor pêndulo autonomamente replicável tanto em bactérias E. coli como corineformes.

Um tal vetor pêndulo inclui os seguintes.

Microorganismos que se prendem a cada um dos vetores e números de acesso em autoridades depositárias internacionais são apresentados em parênteses.

pHC4: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)

pAJ844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)

pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)

pAJ3148 s Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)

pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Estes vetores podem ser obtidos a paratir dos microorganismos depositados como a seguir. As células coletadas a uma fase de crescimento logarítmico foram lisadas usando lisozima e SDS, seguido por separação de um lisato por centrifugação a 30.000 χ g para obter um sobrenadante. Polietileno glicol é adicionado ao sobrenadante, seguido por fracionamento e purificação por meio de centrifugação de gradiente de densidade em equilíbrio de cloreto de césio- brometo de etídio.

O E. coli pode ser transformado por introdução de um plasmídeo de acordo còm, por exemplo, um pprocesso de D. M. Morrison (Methods in Enzymology. 68, 326, (1979)) ou um processo em que as células receptoras são tratadas com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade a DNA (Mandei, M. e Higa A., j. Mol.

Biol.. 53, 59 (1970).

(2) Preparação de ddh

Um fragmento de DNA que contém ddh pode ser preparado a partir de cromossomo de uma bactéria corineforme por meio de PCR. O doador de DNA não é especificamente limitado, entretanto, ele é exemplificado por Brevibacterium lactofermentum ATCC cepa 13869.

Um gene DDH é conhecido para Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. e outros, Nucleic Acids Res.. 15, 3917 (1987) ) , na base do qual podem ser preparados iniciadores para PCR.

Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA's dos 20-meros respectivamente tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID N°s. 6 e 7 na Listagem de Seqüência. A síntese de DNA, PCR e preparação de um plasmídeo que contém o ddh obtido pode ser realizada da mesma maneira que aquelas para IysA descrita acima.

Uma seqüência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo ddh e uma seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de nucleotídeo são ilustradas na SEQ ID N°. 8. É apresentada apenas uma seqüência de aminoácido na SEQ ID N°. 9. Além dos fragmentos de DNA que codificam para esta seqüência de aminoácido, a presente invenção pode equivalentemente usar fragmentos de DNA que codificam para seqüências de aminoácido substancialmente as mesmas que a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°. 9, a saber seqüências de aminoácido tendo mutação baseada, por exemplo, em substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos contanto que não haja influência substancial sobre a atividade DDH. <2> DNA recombinante e bactéria corineforme da presente invenção

A bactéria corineforme da presente invenção se prende a uma seqüência de DNA que codifica para diaminopimelato desidrogenase (IysA) e_uma seqüência de DNA que codifica para diaminopimelato desidrogenase (ddh) que são melhoradas. O termo "uma seqüência de DNA é melhorada" aqui refere-se ao fato de que a atividade intracelular de uma enzima encodificada pela seqüência de DNA é elevada, por exemplo, pelo aumento do número de cópia de um gene, usando um promotor forte, usando um gene que codifica para uma enzima que tem uma alta atividade específica ou combinando estes meios.

A bactéria corineforme a que as seqüências de DNA descritas acima é uma bactéria corineforme produtora de L-lisina, cujos exemplos incluem cepas do tipo selvagem produtoras de L- lisina e cepas mutantes artificiais e bactérias corineformes melhoradas em produtividade de L-lisina por engenharia genética. Até mesmo se a bactéria tiver baixa produtividade de L-lisina , a produtividade de L-lisina pode ser melhorada melhorando IvsA e ddh. Se a bactéria tiver alta produtividade de L-lisina, a eficiência de produção de L-lisina pode ser mais elevada melhorando IysA e ddh.

(1) Cepa produtora de L-lisina pertencente a bactéria corineforme

Exemplos de bactéria corineforme usada para introduzir IvsA e ddh incluem, por exemplo, as seguintes cepas produtoras de L-lisina: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 1580 6; Corynebaeterium callunae ATCC 15991; Corynebaeterium Qlutamicum ATCC 13032; (Brevibaeterium divarieatum) ATCC 402 0; (Brevibaeterium laetofermentum) ATCC 13869; (Corynebaeterium lilium) ATCC 15990; (Brevibaeterium flavum) ATCC 14067; Corynebaeterium melassecola ATCC 17 965; Brevibaeterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibaeterium immariophilum ATCC 14068; Brevibaeterium roseum ATCC 13825; Brevibaeterium thiogenitalis ATCC 19240; Mierobaeterium ammoniaphiIum ATCC 15354; Corynebaeterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

Sem ser as cepas bacterianas descritas acima, aquelas que podem ser usadas como um hospedeiro em que IysA e ddh devem ser melhorados incluem, por exemplo, cepas mutantes que têm capacidade de produzir L-Iisina derivadas das cepas mencionadas antes. Tais cepas mutantes artificiais incluem as seguintes: cepas mutantes resistentes S- (2-aminoetil) -cisteína (aqui a seguir abreviada como "AEC") ((Brevibaeterium laetofermentum AJ11082 (NRRL B-11470), Publicação da Patente Japonesa N°s. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57- 14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7-112438); cepas mutantes que requerem um aminoácido tal como L-homoserina para seu crescimento (Publicação da Patente Japonesa N°s. 48-28078 e 56-6499); cepas mutantes que exibem resistência a AEC e requerem aminoácidos tais como L- leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina e L-valina (Pat. U.S. N°s. 3.708.395 e 3.825.472); cepas mutantes que produzem L-Iisina que exibem resistência a DL-alfa-amino- épsilom-caprolactama, alfa-amino-laurillactama, análogo de aspartato, droga sulfa, quinóide e N-lauroilleucina; cepas mutantes que produzem L-Iisina que exibem resistência a inibidores de oxialoacetato descarboxilase ou enzimas do sistema respiratório (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N°s. 50-53588, 50- 31093, 52-02498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 e 56-39778 e Publicação da Patente Japonesa N°s. 53-43591 e 53-1833) ; cepas mutantes que produzem L-Iisina que requerem inositol ou ácido acético (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N0s. 55- 9784 e 56-8692); cepas mutantes que produzem L-lisina que exibem sensibilidade a ácido fluoropirúvico ou a temperatura não menor do que 34°C (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N0s. 55- 9783 e 53-86090); e cepas mutantes de produção pertencentes ao gênero Brevibacterium ou Corynebacterium que exibem resistência a etileno glicol e produzem L-lisina (Pat. U.S. N°. 4.411.997). (2) Bactérias corineformes produtoras de L-lisina que têm produtividade de L-lisina melhorada por recombinação genética

A velocidade de produção de L-lisina pode ser ainda melhorada melhorando lysA e ddh, se a bactéria corineforme foi melhorada na produção de L-lisina por engenharia genética, por exemplo, por introdução de um gene que codifica para uma enzima que tem uma mutação que causa dessensibilização em inibição de realimentação, o tipo selvagem de cuja enzima é sujeito a inibição de realimentação emtre enzimas que participam da biossíntese da L- lisina ou melhorando um gene para biossíntese da L-lisina sem ser lysA e ddh.

A bactéria corineforme melhorada em produtividade de L-lisina inclui uma bactéria corineforme que se prende a uma seqüência de DNA que codifica para uma aspartoquinase que é dessensibilizada em inibição de realimentação por L-lisina e L- treonina (uma aspartoquinase é aqui a seguir denominada "AK", um gene que codifica para uma proteína AK é aqui a seguir denominado "lysC" e um gene que codifica para uma proteína AK que é dessensibilizada em inibição de realimentação por L-lisina e L- treonina, se necessário e uma seqüência de DNA melhorada que codifica para uma dihidrodipicolinato redutase (uma dihidrodipicolinato redutase é aqui citada como "DDPR11, e um gene que codifica para uma proteína DDPR é aqui citada como "dapB", se necessário), e a bactéria corineformé ainda se prende a uma seqüência de DNA melhorada que codifica para uma dihidrodipicolinato sintase (uma dihidrodipicolinato sintase é aqui citada como "DDPS" e um gene que codifica para uma proteína DDPS é aqui a seguir denominado "dapA", se necessário). Cada um dos genes pára biossíntese da L-lisina usado na presente invenção pode ser obtido de acordo com certos processos como exemplificado a seguir.

(i) Preparação de mutante IvsC

Um fragmento de DNA contendo lysC mutante pode ser preparado a partir de uma cepa mutante em que a inibição de realimentação sinergística sobre a atividade AK por L-lisina e L- treonina é substancialmente dessensibilizada (Publicação Internacional N0. WO 94/25605). Uma tal cepa mutante pode ser obtida, por exemplo, de um grupo de células que se originam de uma cepa do tipo selvagem de uma bactéria corineforme sujeita a um tratamento de mutação por aplicação de um tratamento de mutação comum tal como irradiação ultravioleta e tratamento com um agente mutante tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina. Aatividade AK pode ser medida usando um método descrito por Miyajima, R. e outros, The Journal of Biochemistrv (1968), 63 (2). 139-148. Amais preferida como uma tal cepa mutante é representada por uma bactéria AJ3445 (ferm p-1944) que produz L-Iisina derivada de um tratamento de mutação de uma cepa do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (que tem seu presente nome mudado de Corynebacterium glutamicum).

Alternativamente, o mutante lysC também pode ser obtido por um tratamento de mutação in vitro de DNA de plasmídeo contendo lysC do tipo selvagem. Em um outro aspecto, é especificamente sabida informação sobre a mutação para dessensibilizar inibição sinergística de realimentação sobre AKpor L-lisina e L-treonina (Publicação Internacional N°. WO 94/25605.

Conseqüentemente, lysC mutante também pode ser preparado a partir de IysC do tipo selvagem na base da informação de acordo com, por exemplo, o método da mutagênese sítio-dirigida.

Um fragmento de DNA contendo lysC pode ser preparado a partir do cromossomo dé um bactéria corineforme por meio de PCR. Iniciadores de DNA são exemplificados por DNA's de filamento simples de 23-mero e 21-mero tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID N0s. 10 e 11 na Listagem de Seqüência de forma a amplificar, por exemplo, uma região de aproximadamente 1.643 bp codificando para lysC baseado em uma seqüência conhecida paia Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology. (1991). 5 (5). 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990). 224. 317-324). Síntese de DNA, PCR e preparação de um plasmídeo que contém lysC obtido pode ser realizada da mesma maneira que aquelas para lysC descrita acima.

lysC do tipo selvagem é obtido quando lysC é isolado de uma cepa AK do tipo selvagem, embora lysC mutante seja obtida quando lysC é isolado de uma cepa AK mutante de acordo com o método como descrito acima. Um exemplo de uma seqüência de nucleotídeo de um fragmento de DNA que contém IvsC do tipo selvagem é mostrado na SEQ ID N°. 12 na Listagem de Seqüência. Uma seqüência de aminoácido de alfa-subunidade de uma proteína AK do tipo selvagem é deduzida da seqüência de nucleotídeo e é apresentada na SEQ ID N0 . 13 na Listagem de Seqüência juntamente com a seqüência de DNA. Apenas a seqüência de aminoácido é apresentada na SEQ ID N°. 14. Uma seqüência de aminoácido de beta-subunidade da proteína AK do tipo selvagem é deduzida da seqüência de nucleotídeo de DNA, e é apresentada na SEQ ID N0. 15 na Listagem de Seqüência juntamente com a seqüência de DNA. Apenas a seqüência de aminoácido é apresentada na SEQ ID N0 . 16. Em cada uma das subunidades, é usado GTG como um códon de iniciação e uma aminoácido correspondente é representado por metionina. Entretanto, esta representação refere- se a metionina, valina ou formilmetionina.

O mutante IysC usado na presente invenção não está especificamente limitado contanto que ele codifique para AK em que a inibição sinergística de realimentação por L-Iisina e L-treonina é dessensibilizada. Entretanto, o mutante IvsC é exemplificado por um que inclui mutação em que um 279°. resíduo de alanina como contado a partir no terminal-N é mudado em um resíduo de aminoácido sem ser alanina e sem ser aminoácido ácido na alfa-subunidade e um 30° resíduo de alanina é mudado para um resíduo de aminoácido sem ser alanina e sem ser aminoácido ácido na beta-subunidade na seqüência de aminoácido do AK do tipo selvagem. A seqüência de aminoácido AK do tipo selvagem inclui especificamente a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N0. 14 na Listagem de Seqüência como a alfa-subunidade e a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°. 16 na Listagem de Seqüência como a beta-subunidade.

Aqueles preferidos como o resíduo de aminoácido sem ser alanina e sem ser aminoácido ácido incluem resíduos de treonina, arginina, cisteína, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

O códon correspondente a um resíduo de aminoácido a ser substituído não é especificameante limitado para seu tipo contanto que ele codifique para o resíduo de aminoácido. Supõe-se que a seqüência de aminoácido de tipo selvagem AK possuído possa diferir ligeiramente dependendo da diferença em espécies bacterianas e cepas bacterianas. Os AK's que têm mutação baseada, por exemplo, em substituição, deleção ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido em uma ou mamis posições sem levar em conta a atividade da enzima como descrito acima, também podem ser usados para a presente invenção. Também podem ser usados outros AK's, que têm mutação baseada, por exemplo, em substituição, deleção ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido contanto ue nenhuma influência seja substancialmente exercida sobre a atividade AK e sobre a dessensibilização de inibição sinergísticas de realimentação por L-lisina e L-treonina.

Uma cepa AJ12 691 obtida por introdução de um plasmídeo IvsC mutante p399AK9B em uma cepa AJ12036 (FERM BP-734) como uma cepa do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum foi depositada em 10 de abril de 1992 sob um número de acesso de FERMP- 12918 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão), transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste em 10 de Fevereiro de 1995, e depositada sob um número de acesso de FERM BP- 4999.

(ii) Preparação de dapB

Um fragmento de DNA contendo dapB pode ser preparado a partir de cromossomo de uma bactéria corineforme por meio de PCR. O doador de DNA não é especificamente limitado, entretanto, ele é exemplificado por Brevibacterium lactofermentum ATCC cepa 13 869.

Uma seqüência de DNA que codifica para DDPR é conhecida para Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993)) em cuja base podem ser preparados iniciadores de DNA para PCR. Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA's de 23-meros respectivamente tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ

ID N°s. 17 e 18 na Listagem de Seqüência. A síntese de DNA, PCR e preparação de um plasmídeo que contém o dapB obtido podem ser realizadas da mesma maneira que aquelas para IysC descrito acima.

Uma seqüência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo dapB e uma seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de nucleotídeo são ilustradas na SEQ ID N°. 19. Apenas uma seqüência de aminoácido é apresentada na SEQ ID N°. 20. Além dos fragmentos de DNA que codificam para esta seqüência de, aminoácido, a presente invenção pode equivalentemente usar fragmentos de DNA que codificam para seqüências de aminoácido substancialmente as mesmas que a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°. 20, a saber seqüências de aminoácido tendo mutação baseada, por exemplo, na substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos contanto que não haja influência substancial sobre a atividade DDPR.

Uma cepa transformante AJ13107 obtida por introdução de um plasmídeo pCRDAPB que contém dapB obtido no Exemplo descrito mais adiante em cepa E. coli JMlO 9 foi depositada internacionalmente desde 26 de maio de 1955 sob um número de acesso de FERM BP-5114 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão), transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste. (iii) Preparação de dapA

Um fragmento de DNA que contém dapA pode ser preparado a partir do cromossomo de uma bactéria corineforme por meio de PCR. 0 doador de DNA não é especificamente limitado, entretanto ele é exemplificado por Brevibacterium lactofermentum ATCC cepa 13869.

Uma seqüência de DNA que codifica para DDPS é conhecida para Corvnebacterium glutamicum (ver Nucleic Acids Research. 18 (21) . 6421 (1990); EMBL N°. de acesso X53993), à base da qual podem ser preprados iniciadores de DNA para PCR. Tais iniciadores de DNA são especificamente exemplificados por DNA's dos 23-meros respectivamente tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N°s. 21 e 22 na Listagem de Seqüência. A síntese de DNA, PCR e preparação de um plasmídeo que contém o dapA obtido pode ser realizada da mesma maneira que aquelas para IysC descrita acima.

Uma seqüência de nucleotídeo de um fragmento de DNA contendo dapA e uma seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de nucleotídeo são exemplificadas na SEQ ID N° . 23. É apresentada apenas uma seqüência de aminoácido na SEQ ID N°. 24. Além dos fragmentos de DNA que codificam para esta seqüência de aminoácido, a presente invenção pode equivalentemente usar fragmentos de DNA que codificam para seqüências de aminoácido substancialmente as mesmas que a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°. 24, a saber seqüências de aminoácido tendo mutação baseada, por exemplo, em substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos contanto que não haja influência substancial sobre a atividade DDPS.

Uma cepa transformante AJ13106 obtida por introdução de um plasmídeo pCRDAPA que contém dapA obtido no Exemplo descrito mais adiante sobre cepa de E. coli JM109 foi depositada internacionalmente desde 26 de maio de 1955 sob um número de acesso de FERM BP-5113 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão), transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste.

Em uma modalidade especificada, de forma a melhorar IysA e ddh na bactéria corineforme que produz L-Iisina como descrito acima, os genes são introduzidos no hospedeiro pelo uso de um vetor plasmídeo, transposon ou vetor fago ou similar. Após a introdução, é de se esperar que se obtenha melhoria até certo ponto mesmo pelo uso de um vetor do tipo baixa cópia) Entretanto, é preferível usar um vetor do tipo cópia múltipla. Um tal vetor inclui, por exemplo, os vetores plasmídeo, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 e pAJ440 descritos acima. Além disso, os transposons derivado de bactéria corineforme são descritos em Publicação

Internacional N0s. WO 92/02627 e WO 93/18151; Publicação da Patente Européia N0. 445383; Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N0. 6-46867; Vertes, A. A. e outros, Mol. Microbiol.. 11, 739-746 (1994); Bonamy, C., e outros, Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994) ; Vertes, A. A. e outros, Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); Jagar, W. e outros, FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995); Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N°s. 7- 107976 e 7-327680 e similares.

Uma bactéria corineforme melhorada em IvsA e ddh de acordo com a presente invenção pode ser obtida, por exemplo, por introdução, em um hospedeiro bactéria corineforme, um DNA recombinante que contém IysA e ddh e que é autonomamente replicável em células de bactérias corineformes. 0 DNA recombinante pode ser obtido, por exemplo, inserindo IysA e ddh em um vetor tal como um vetor plasmídeo, transposon ou vetor fago como descrito acima.

Cada um dos genes de IysA e ddh pode ser sucessivamente introduzido no hospedeiro usando diferentes vetores respectivamente. Alternativamente, duas espécies dos genes podem ser introduzidas juntas usando um vetor simples. Quando são usados diferentes vetores, os genes podem ser introduzidos em qualquer ordem, entretanto, é preferível usar vetores que tenham um mecanismo estável de compartilhar e se prender ao hospedeiro e que são capazes de co-existir um com o outro.

No caso em que um plasmídeo é usado como um vetor, o DNA recombinante pode ser introduzido no hospedeiro de acordo com o método do pulso elétrico (Sugimoto e outros, (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N°. 2-207791. A amplificação de um gene usando transposon pode ser realizada introduzindo um plasmídeo que contém um transposon na célula hospedeira e induzindo a transposição do transposon.

Além disso, quando lysC, dapA e dapB são introduzidos na bactéria corineforme, cada um dos genes e lysA e ddh pode ser sucessivamente introduzido no hospedeiro usando diferentes vetores respectivamente ou, alternativamente, duas ou mais espécies dos genes podem ser introduzidas juntas usando um vetor simples.

<3> Método para produzir L-lisina

L-lisina pode ser eficientemente produzida cultivando, em um meio apropriado, a bactéria corineforme que compreende os genes melhorados para a biossíntese da L-lisina como descrito acima para permitir que a L-lisina seja produzida e acumulada em uma cultura e coletando a L-lisina da cultura.

0 meio a ser usado é exemplificado por um meio comum contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e opcionalmente outros componentes orgânicos.

Como a fonte de carbono, é possível usar açúcares tais como glicose, frutose, sacarose, melaço e hidrolisado de amido; e ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítricô e ácido succínico.

Como a fonte de nitrogênio , é possível usar sais inorgânicos de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio; nitrogênio orgânico tal como hidrolisado de soja; amônia gasosa; e amônia aquosa.

Como fontes de nutrientes orgânicos em traços, é desejável conter substâncias necessárias tais como vitamina B1 e L-homoserina ou extrato de levedura ou similar em quantidades apropriadas. Em vez destes acima, são adicionados, se necessário, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íon de ferro, íon de manganês etc.

O cultivo é de preferência realizado sob uma condição aeróbica durante cerca de 30 a 90 horas. A temperatura de cultivo é de preferência controlada a 25 °C até 3 7 0C e o pH é de preferência controlado a 5 até 8 durante o cultivo. As substâncias inorgânicas ou orgânicas, ácida ou alcalinas ou amônia gasosa ou similares podem ser usadas para ajuste de pH. A L-Iisina pode ser coletada de uma cultura por combinação de um método comum de resina de troca iônica, um método de precipitação e outros métodos conhecidos.

EXEMPLOS

A presente invenção será explicada mais especificamente a seguir com referência aos Exemplos.

Exemplo 1: Preparação de IysA a partir de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparação de IysA e construção de plasmídeo que contém IvsA

Foi usada uma cepa ATCC 13869 do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum como um doador de DNA cromossomal.

O DNA cromossomal foi preparado a partir da cepa ATCC 13 869 de acordo com um método comum. Um fragmento de DNA contendo argS, IysA e um promotor de um operon contendo os mesmos foi amplificado a partir do DNA cromossomal de acordo com PCR. Como para os iniciadores de DNA usados para amplificação, foram usados respectivamente DNA's sintéticos de 23-meros tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N°s. 1 e 2 na Listagem de Seqüência de maneira a amplificar uma região de aproximadamente 3,6 kb que codifica para arginil-tRNA sintase e DDC na base de uma seqüência conhecida para Corynebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990) e Molecular and General Genetics. 212. 112-119 (1988)).

O DNA foi sintetizado de acordo com um método comum usando sintetizador de DNA modelo 380B produzido por Applied Biosystems e usando o processo de fosfoamidita (ver Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).

O gene foi amplificado por PCR usando DNA Thermal Cycler Model PJ2000 produzido por Takara Shuzo e usando Taq DNA polimerase de acordo com um processo projetado pelo fornecedor. Foi usado pHSG399 como um vetor de clonagem para o fragmento de gene amplificado de 3.579 bp. pHSG399 foi digerido com uma enzima de restrição SmaI (produzida por Takara Shuzo) e foi ligada com o fragmento de DNA que contém IysA amplificado. Um plasmídeo obtido como descrito acima, que tinha IysA que se origina de ATCC 13 869, foi designado como p3 99LYSA. Um fragmento de DNA que contém lysA foi extraído digerindo p399LYSA com KpnI (produzido por Takara Shuzo) e BamHI (produzido por Takara Shuzo) . Este fragmento de DNA foi ligado com pHSG299 que foi digerido com KpnI e BamHI. Um plasmídeo obtido foi designado como p2 99LYSA. O processo de construção de p2 99LYSA é apresentado na Fig. 1.

Um fragmento de DNA (aqui a seguir denominado "Brevi.- ori") que tem uma capacidade de obter um plasmídeo autonomamente replicável em bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium foi introduzido em p2 99LYSA para preparar plasmídeos que contém lysA autonomamente replicável em bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium. Foi preparado Brevi.-ori a partir de um vetor plasmídeo pHK4 que contém Brevi.-ori e autonomamente replicável em células tanto de Escherichia coli como em bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium. pHK4 foi construído por digestão de pHC4 com KpnI (produzido por Takara Shuzo) e BamHI (produzido por Takara Shuzo), extraindo um fragmento Brevi.-ori e ligando-o com pHSG298 que também foi digerido com KpnI e BamHI (ver (Pedido de Patente Japonesa Depositada em Aberto N0 . 5-7491). pHK4 confere resistência à kanamicina a um hospedeiro. Escherichia coli HBOl preso a pHK4 foi designado como Escherichia coli AJ13136 e depositado em I0 de agosto de 1995 sob um número de acesso de FERM BP-5186 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão).

pHK4 foi digerido digerido com uma enzima de restrição BamHI e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado.

Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante KpnI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori podia ser excisado com pHK4 por digestão somente com KpnI. Este plasmídeo foi digerido com KpnI e o fragmento de DNA Brevi.-ori foi ligado com p2 99LYSA que também foi digerido com KpnI para preparar um plasmídeo que contém IysA autonomamente replicável em bactérias corineformes. 0 plasmídeo preparado foi designado ρLYSAB. O processo de construção de pLYSAB é apresentado na Fig. 2.

<2> Determinação de seqüência de nucleotídeo de lysA a partir de Brevibacterium lactofermentum

Foi preparado DNA de plasmídeo de p2 99LYSA e foi realizada a determinação da seqüência de nucleotídeo de acordo com um método de Sanger e outros (por exemplo, F. Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci.. 74, 5463 (1977)). Uma determinada seqüência de nucleotídeo e uma seqüência de aminoácido deduzida para ser codificada pela seqüência de nucleotídeo são apresentadas na SEQ ID N° . 3. Em relação à seqüência de nucleotídeo, são apresentadas uma seqüência de aminoácido codificada por argS e uma seqüência de aminoácido codificada por IysA nas SEQ ID N0 s. 4 e 5 respectivamente.

Exemplo 2; Preparação de ddh a partir de Brevibacterium lactofermentum

Foi obtido um gene ddh por amplificação do gene ddh proveniente de DNA cromossomal de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 de acordo com o método PCR usando dois iniciadores oligonucleotídeo (SEQ ID N0s. 6, 7) preparado à base de uma seqüência conhecida de nucleotídeo de um gene ddh de Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. e outros, Nucleic Acids Res. , 15, 3917 (1987)) . Um fragmento de DNA amplificado obtido foi digerido com EcoT22I e Aval e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. Depois disso, o fragmento foi inserido em um sítio SmaI de pMW119 para obter um plasmídeo pDDH.

A seguir, pDDH foi digerido com SalI e EcoRI. seguido por formação de extremidade inativa. Depois disso, um fragmento obtido foi ligado com pUC18 que foi digerido com SmaI. Um plasmídeo assim obtido foi designado pUC18DDH.

Brevi.-ori foi introduzido em pUC18DDH para construir um plasmídeo que contém ddh autonomamente replicável em bactérias corineformes. pHK4 foi digerido com enzimas de restrição KpnI e BamHI e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação de extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante PstI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) de modo que este fosse inserido em um sítio PstI de pHSG2 99. Um plasmídeo construído como descrito acima foi designado pPK4. A seguir puC18DDH foi digerido com XbaI e KpnI e um fragmento gerado foi ligado com pPK4 que foi digerido com KpnI e XbaI. Assim foi construído um plasmídeo que contém ddh autonomamente replicável em bactérias corineformes . Este plasmídeo foi designado pPK4D. O processo de construção de pPK4D é apresentado na Fig. 3.

Exemplo 3: Construção de Plasmídeo Contendo tanto ddh como IysA

O plasmídeo pUC18DDH que contém ddh foi digerido com EcoRI e então as extremidades tornadas inativas e ainda digeridas com XbaI para extrair um fragmento de DNA que contém ddh. Este fragmento ddh foi ligado com o plasmídeo p399LYSA que contém IysA que foi digerido com BamHI e então as extremidades inativas e ainda tendo sido digeridas com XbaI Um plasmídeo obtido foi designado p399DL. O processo de construção de p399DL é apresentado na Fig. 4.

A seguir Brevi.-ori foi introduzido no p399DL. pHK4 foi digerido com XbaI e BamHI e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. Após a formação da extremidade inativa foi ligado um ligante XbaI fosforilado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com XbaI. Este plasmídeo foi digerido com XbaI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p3 99DL que também foi digerido com XbaI para construir um plasmídeo que contém ddh e IysA autonomamente replicáveis em bactérias corineformes. 0 plasmídeo construído foi designado pDL. 0 processo de construção de pDL é apresentado na Fig. 5.

Exemplo 4: Preparação de IysC dapA e dapB Mutantes a partir de

Brevibacterium lactofermentum

<l> Preparação do Gene IvsC do Tipo Selvagem e do Gene IvsC Mutante a partir de Brevibacterium lactofermentum

(1) Preparação de IysCa do tipo selvagem e mutante e preparação de plasmídeos contendo os mesmos.

Uma cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, e uma cepa mutante produtora de L-Iisina AJ3445 (FERM P-1944) obtidas a partir da cepa ATCC 13 869 por um tratamento de mutação foram usadas como doadores de DNA cromossomal. A cepa AJ3445 tinha sido sujeita a mutação de modo que IysC foi mudado para envolver substancial dessensibilização de inibição conertada por lisina e treonina (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).

Um fragmento de DNA contendo IysC foi amplificado a partir de DNA cromossomal de acordo com o método PCR (reação reação em cadeia de polimerase; ver VJhite, T. J. e outros, Trends Genet. , 5., 185 (1989)). Como para os iniciadores de DNA usados para amplificação, foram sintetizados DNA's de filamento simples de 23- mero e 21-mero tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N°s. 10 e 11 de maneira a amplificar uma região de aproximadamente 1.643 pb para IvsC na base de uma seqüência conhecida para Corvnebacterium glutamicum (ver Molecular Microbiology, (1991) 5 (5), 1197-1204; e Mol. Gen. Genet.. 224. (1990) 317-324).

Um fragmento de gene amplificado de 1.643 pb foi confirmado por eletroforese com gel de agarose. Depois disso, o fragmento excisado do gel foi purificado de acordo com um método comum e foi digerido com enzimas de restrição NruI (produzidas por Takara Shuzo) e EcoRI (produzido por Takara Shuzo).

pHSG399 (ver Takeshita, S. e outros, Gene (1987), 61m 63-74) foi usado como um vetor de clonagem para o fragmento de gene. pHSG399 foi digerido com enzimas de restrição SmaI (produzidas por Takara Shuzo) e EcoRI e foi ligado com o fragmento IysC amplificado. DNA foi ligado usando DNA ligation kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Assim foram preparados plasmídeos, em que os fragmentos IysC amplificados provenientes de cromossomos de Brevibacterium lactofermentum foram ligados com pHSG399 respectivamente. Um plasmídeo que contém IysC proveniente de ATCC 13869 (cepa do tipo selvagem) foi designado p3 99AKY e um plasmídeo que contém IysC proveniente de AJ3463 (bactéria produtora de L-lisina) foi designado p3 99AK9.

Brevi.-ori foi introduzido nos p3 99AKY e p3 99AK9 preparados respectivamente para construir plasmídeos que contêm IysC autonomamente replicável em bactérias corineformes.

pHK4 foi digerido com enzimas de restrição KpnI e BamHI (produzidas por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. Após a formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com BamHI. Este plasmídeo foi digerido com BamHI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p3 99AKY e p3 99AK9 que também foram digeridos com BamHI para preparar plasmídeos que contenham IysC autonomamente replicável em bactérias corineformes.

Um plasmídeo que contém o gene IysC do tipo selvagem que se origina de p3 99AKY foi designado como p3 99AKYB e um plasmídeo que contém o gene IysC mutante que se origina de p3 99AK9 foi designado como p399AK9B. 0 processo de construção de p399AK9B e p399AKYB é apresentado na Fig. 6. Uma cepa AJ12691 obtida por introdução do plasmídeo IysC mutante p3 99AK9B em uma cepa do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum (cepa AJ12036, FERM BP- 734) foi depositada em 10 de abril de 1992 sob um número de acesso de FERM BP-12918 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) , transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste em 10 de fevereiro de 1995 e depositada sob um número de acesso de FERM BP-4999.

(2) Determinação de seqüências de nucleotídeo de IysC do tipo selvagem e IysC mutante a partir de Brevibacterium lactofermentum

O plasmídeo p3 99AKY que contém o IysC do tipo selvagem e o plasmídeo p3 99AK9 que contém o IysC mutante foram preparados a partir dos respectivos transformantes para determinar seqüências de nucleotídeo do tipo selvagem e IvsC's mutantes. A determinação da seqüência de nucleotídeo foi realizada de acordo com um método de Sanger e outros (por exemplo, F. Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci.. 74, 5463 (1977)).

A seqüência de nucleotídeo de IysC do tipo selvagem codificado por p399AKY é apresentada na SEQ ID Nc. 12 na Listagem de Seqüência. Por outro lado, a seqüência de nucleotídeo de IysC mutante codificada por p3 99AK9 tinha apenas mutação de um nucleotídeo tal que 1051st G foi mudado em A na SEQ ID N0 . 12 comparado com IvsC do tipo selvagem. É sabido que IysC de Corynebacterium glutamicum tem duas subunidades (alfa, beta) codificadas em um quadro de leitura idêntico sobre um filamento idêntico (ver Kalinowski, J. e outros, Molecular Microbioloqy. (1991) 5(5), 1197-1204). Julgando pela homologia, é de se esperar que o gene seqüenciado aqui também tenha duas subunidades (alfa, beta) codificadas em um quadro de leitura idêntico sobre um filamento idêntico de DNA.

Uma seqüência de aminoácido da alfa-subunidade da proteína AK do tipo selvagem deduzida da seqüência de nucleotídeo de DNA é apresentada na SEQ ID N0. 13 juntamente com a seqüência de DNA. Apenas a seqüência de aminoácido é na SEQ ID N°. 14. Uma seqüência de aminoácido da beta-subunidade da proteína AK do tipo 40 selvagem deduzida da seqüência de nucleotídeo de DNA é apresentada na SEQ ID N°. 15 juntamente com DNA. Apenas a seqüência de aminoácido é apresentada na SEQ ID N°. 16. Em cada uma das subunidades, GTG é usado como um códon de iniciação e um aminoácido correspondente é representado por metionina. Entretanto, esta representação refere-se a metionina, valina ou formilmetionina.

Por outro lado, a mutação na seqüência de IvsC mutante significa ocorrência de substituição de resíduo de aminoácido tal que um 279° resíduo de alanina da alfa-subunidade é mudado para um resíduo de treonina e um 30° resíduo de alanina da beta-subunidade é mudado para um resíduo de treonina na seqüência de aminoácido da proteína AK do tipo selvagem (SEQ ID N0s. 14, 16).

<2> Preparação de dapB proveniente de Brevibacterium lactofermentum (1) Preparação de dapB e construção de plasmídeo que contém dapB

Uma cepa ATCC 13869 do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum foi usada como um doador de DNA cromossomal. Foi preparado DNA cromossomal a partir da cepa ATCC 13869 de acordo com um método comum. Um fragmento de DNA foi amplificado a partir do DNA cromossomal de acordo com PCR. Como para os iniciadores de DNA usados para amplificação, foram sintetizdos DNA's de 23-meros tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N0s. 17 e 18 na Listagem de Seqüência respectivamente de maneira a amplificar uma região de aproximadamente 2,0 kb que codifica para DPR na base de uma seqüência conhecida para Brevibacterium lactofermentum (ver Journal of Bacteriologv, 157 (9) , 2743-2749 (1993)). SintesedeDNA e PCR foram realizadas da mesma maneira como descrito no Exemplo 1. Foi usado pCR-Script (produzido por Invitrogen) como um vetor de clonagem para o fragmento gene amplificado de 2.001 bp e foi ligado com o fragmento dapB amplificado. Assim foi construído um plasmídeo, em que o fragmento dapB de 2.0001 bp amplificado do cromossomo de Brevibacterium lactofermentum foi ligado com pCR- Script. O plasmídeo obtido como descrito acima que tinha dapB que se origina de ATCC 13 869, foi designado ρCRDAPB. Uma cepa transformante AJ13107 obtida por introdução de pCRDAPB em cepa de E. coli JMlO9 foi depositada internacionalmente desde 26 de maio de 1955 sob um número de acesso de FERM BP-5114 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, ibaraki-ken, Japão), transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste.

Um fragmento de 1.101 bp contendo um gene estrutural de DDPR foi extraído digerindo pCRDAPB com EcoRV e SphI. Este fragmento foi ligado com pHSG300 que foi digerido com HincII e SphI para preparar um plasmídeo. 0 plasmídeo preparado foi designado p3 99DPR.

Brevi.-ori foi introduzido no P399DPR preparado para construir um plasmídeo que contém dapB autonomamente replicável em bactérias corineformes. pHK4 foi digerido com uma enzima de restrição KpnI (produzido por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com BamHI. Este plasmídeo foi digerido com BamHI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399DPR que também foi digerido com BamHI para preparar um plasmídeo que contém dapB autonomamente replicável em bactérias corineformes. O plasmídeo preparado foi designado pDPRB. O processo de construção de pDPRB é apresentado na Fig. 7. (2) Determinação de seqüência de nucleotídeo de dapB proveniente de Brevibacterium lactofermentum

O DNA do plasmídeo foi preparado a partir da cepa AJ13107 que se prende a p3 99DPR e sua seqüência de nucleotídeo foi determinada da mesma maneira como descrito no Exemplo 1. São apresentadas na SEQ ID N° . 19 uma seqüência de nucleotídeo determinada e uma seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de nucleotídeo. Apneas a seqüência de aminoácido é apresentado na SEQ ID N0. 20.

<3> Preparação de dapA proveniente de Brevibacterium lactofermentum (1) Preparação de dapA e construção de plasmídeo que contém dapA

Uma cepa do tipo selvagem de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 foi usada como um doador de DNA cromossomal. O DNA cromossomal foi preparado a partir da cepa ATCC 13 86 9 de acordo com um método comum. Um fragmento de DNA contendo dapA foi amplificado a partir do DNA cromossomal de acordo com PCR. Como para os iniciadores de DNA usados para amplificação, foram sintetizdos DNA's de 23-meros tendo seqüências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID N0s. 21 e 22 na Listagem de Seqüência respectivamente de maneira a amplificar uma região de aproximadamente 1,5 kb que codifica para DPS na base de uma seqüência conhecida para Corynebacterium glutamicum (ver Nucleic Acids Research. 18 (21). 6421 (1990); EMBL N0. de acesso X53993). A síntese de DNA e a PCR foram realizadas da mesma maneira como descrito no Exemplo 1. FoiusadopCR1000 (produzido por Invitrogen, ver Bio/Technolocrv, 9, 657-663 (1991)) como um vetor de clonagem para o fragmento gene amplificado de 1.411 e foi ligado com o fragmento dapA amplificado. A ligação de DNA foi realizada usando DNA ligation kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Assim foi construído um plasmídeo, em que o fragmento dapA de 1.411 amplificado do cromossomo de Brevibacterium lactofermentum foi ligado com pCR1000. 0 plasmídeo obtido como descrito acima, que tinha dapA que se origina de ATCC 13869, foi designado como pCRDAPA.

Uma cepa transformante AJ13106 obtida por introdução de pCRDAPA em cepa de E. coli JM109 foi depositada internacionalmente desde 2 6 de maio de 1955 sob um número de acesso de FERM BP-5113 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão), transferida para deposição internacional baseado no Tratado de Budapeste.

Brevi.-ori foi introduzido no pCRDAPA preparado para construir um plasmídeo que contém dapA autonomamente replicável em bactérias corineformes. pHK4 foi digerido com uma enzima de restrição KpnI e BamHI (produzidos por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante SmaI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com SmaI. Este plasmídeo foi digerido com SmaI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com pCRDAPA que também foi digerido com SmaI para preparar um plasmídeo que contém dapA autonomamente replicável em bactérias corineformes. 0 plasmídeo preparado foi designado pDPSB. 0 processo de construção de pDPSB (Kmr) é apresentado na Fig. 8.

(2) Determinação de seqüência de nucleotídeo de dapA proveniente de Brevibacterium lactofermentum

DNA de plasmídeo foi preparado a partir da cepa AJ13106 que se prende a ρCRDAPA e sua seqüência de nucleotídeo foi determinada da mesma manneira como descrito no Exemplo 1. Uma seqüência de nucleotídeo determinada e uma seqüência de aminoácido deduzda da seqüência de nucleotídeo são apresentadas na SEQ ID Nc .

23. Apenas a seqüência de aminoácido é apresentada na SEQ ID N°. 24.

<4> Construção de Plasmídeo Contendo Tanto lysC Mutante como dapA Um plasmídeo que contém lysC, dapA mutantes e origem de replicação de bactérias corineformes foi construído a partir do plasmídeo ρCRDAPA que contém dapA e o plasmídeo p3 99AK9B que contém lysC mutante e Brevi.-ori. p399AK9B foi completamente digerido com SalI e então a sua extremidade foi inativada. Um ligante EcoRI foi ligado para construir um plasmídeo em que o sítio SalI foi modificado a um sítio EcoRI. 0 plasmídeo obtido foi designado p399AK9BSE. 0 lysC mutante e Brevi.-ori. foram excisados como um fragmento digerindo parcialmente p3 99AK9BSE com EcoRI. Este fragmento foi ligado com pCRDAPA que foi digerido com EcoRI. Um plasmídeo obtido foi designado pCRCAB. Este plasmídeo é autonomamente replicável em E. coli e bactérias corineformes e ele fornece resistência a kanamicina a um hospedeiro, o plasmídeo contendo tanto IvsC mutante como dapA. 0 processo de construção de pCRCAB é apresentado na Fig. 9.

<5> Construção de Plasmídeo Contendo lysC Mutante e dapB

Um plasmídeo contendo lysC mutante e dapB foi construído a partir do plasmídeo p399AK9 que contém lysC mutante e o plasmídeo p399DPR que contém dapB. Um fragmento de 1.101 bp contendo um gene estrutural de DDPR foi extraído por digestão de p3 99DPR com EcoRV e SphI. Este fragmento foi ligado com p399AK9 que foi digerido com SalI e então sua extremidade inativada e tendo sido ainda digerido com SphI para construir um plasmídeo que contém IvsC mutante e dapB. Este plasmídeo foi designado p3 99AKDDPR.

A seguir, foi introduzido Brevi.-ori no P399AKDDPR obtido. 0 plasmídeo pHK4 contendo Brevi.-ori foi digerido com uma enzima de restrição KpnI (produzido por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante BamHI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter 40 modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com BamHI. Este plasmídeo foi digerido com BamHI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399AKDDPR que também foi digerido com BamHI para construir um plasmídeo que contém IvsC e dapB autonomamente replicável em bactérias corineformes. 0 plasmídeo construído foi designado pCB. 0 processo de construção de pCB é apresentado na Fig. 10.

<6> Construção de Plasmídeo Contendo dapA e dapB

O plasmídeo ρCRDAPA contendo dapA foi digerido com KpnI e EcoRI para extrair um fragmento de DNA contendo dapA e o fragmento foi ligado com o plasmídeo vetor pHSG3 99 que foi digerido com KpnI e EcoRI. Um plasmídeo obtido foi designado p399DPS.

Por outro lado, o plasmídeo pCRDAPB contendo dapB foi digerido com SacII e EcoRI para extrair um fragmento de DNA de 2,0 kb contendo uma região de codificação para DDPR e o fragmento foi ligado com p3 99DPS que foi digerido com SacII e EcoRI para construir um plasmídeo contendo dapA e dapB. 0 plasmídeo obtido foi designado p3 99AB.

A seguir, Brevi.-ori foi introduzido em p3 99AB. pHK4 contendo Brevi.-ori foi digerido com uma enzima de restrição BamHI (produzida por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante KpnI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com KpnI. Este plasmídeo foi digerido com KpnI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399AB que também foi digerido com KpnI para construir um plasmídeo que contém dapA e dapB autonomamente replicável em bactérias corineformes. 0 plasmídeo construído foi designado pAB.O processo de construção de ρAB é apresentado na Fig. 11.

<7> Construção de Plasmídeo Contendo IvsC. dapA e dapB Mutantes Juntos

p3 99DPS foi digerido com EcoRI e SphI seguido por formação de extremidade inativa para extrair um fragmento gene dapA. Este fragmento foi ligado com o p399AK9 que foi digerido com SalI e a extremidade tornada para construir um plasmídeo p3 99CA em 40 coexistiam IysC e dapA mutantes. O plasmídeo ρCRDAPB contendo dapB foi digerido com EcoRI e as extremidades inativas seguido por digestão com SacI para extrair um fragmento de DNA de 2,0 kb compreendendo dapB. O plasmídeo p3 99CA contendo dapA e IvsC mutantes foi digerido com SpeI e as extremidades tornadas inativas e foi depois disso digerido com SacI e ligado com o fragmento dapB extraído para obter um plasmídeo contendo IysC, dapA e dapB mutantes. O plasmídeo foi designado p3 99CAB.

A seguir, Brevi.-ori foi introduzido em p3 99CAB. O plasmídeo pHK4 contendo Brevi.-ori foi digerido com uma enzima de restrição BamHI (produzida por Takara Shuzo) e as extremidades clivadas foram tornadas inativas. A formação da extremidade inativa foi realizada usando DNA Blunting kit (produzido por Takara Shuzo) de acordo com um método projetado. Após a formação da extremidade inativa, foi ligado um ligante KpnI fosforilado (produzido por Takara Shuzo) foi ligado para obter modificação de modo que o fragmento de DNA correspondente à porção Brevi.-ori pudesse ser excisado de pHK4 por digestão apenas com KpnI. Este plasmídeo foi digerido com KpnI e o fragmento de DNA Brevi.-ori gerado foi ligado com p399CAB que também foi digerido com KpnI para construir um plasmídeo que contém IysC, dapA e dapB junros autonomamente replicável em bactérias corineformes. O plasmídeo construído foi designado pCAB. O processo de construção de pCAB é apresentado na Fig. 12.

<8> Construção de Plasmídeo Contendo lysC, dapA, dapB e lysA Mutantes Juntos

O plasmídeo p2 99LYSA contendo lysA foi digerido com KpnI e BamHI e as extremidades tornadas e então foi extraído um fragmento de gene lysA. Este fragmento foi ligado com pCAB que foi digerido com HapI (produzido por Takara Shuzo) e a extremidade tornada inativa para construir um plasmídeo contendo lysC. dapA, dapB e lysA juntos autonomamente replicável em bactérias corineformes. O plasmídeo construído foi designado pCABL. O processo de construção de pCABL é apresentado na Fig. 13. É observado que o fragmento gene lysA é inserido em um sítio HpaI em um fragmento de DNA contendo o gene dapB em pCABL, entretanto, o sítio HpaI está localizado a montante de um promotor para o gene dapB (números de nucleotídeo 611 a 616 na SEQ ID N°. 19) e o gene dapB não está dividido.

<9> Construção de Plasmídeo Contendo lysC. dapA. dapB. ddh e lysA Mutantes Juntos

pHSG2 99 foi digerido com XbaI e KpnI e foi ligado com p399DL contendo ddh e IysA que foram digeridos com XbaI e KpnI. Um plasmídeo construído foi designado p299DL. p299DL foi digerido com XbaI e KpnI e as extremidades tornadas inativas. Após a formação da extremidade inativa, foi extraído um fragmento de DNA contendo ddh e lysA. Este fragmento de DNA foi ligado com o plasmídeo pCAB contendo lvsC, dapA e dapB juntos que foram digeridos com HpaI e suas extremidades tornadas inativas para construir um plasmídeo contendo lysC. dapA, dapB, lysA e ddh mutantes juntos autonomamente replicáveis em bactérias corineformes. O plasmídeo construído foi designado pCABDL. O processo de construção de pCABDL é apresentado na Fig. 14.

Exemplo 5; Introdução de Plasmídeos Contendo Genes para Biossíntese da L-Iisina em Bactérias Produtoras de L-lisina de Brevibacterium lactofermentum

Os plasmídeos que contêm os genes para a biossíntese da L-Iisina construídos como descrito acima, a saber pLYSAB (Cmr), pPK4D (Cmr), p3 99AK9B (Cmr), pDPSB (Kmr), pDPRB (Cmr), pCRCAB (Kmr), ρAB (Cmr), pDL (Cmr), pCB (Cmr), pCAB (Cmr), pCABL (Cmr) e pCABDL (Cmr) foram introduzidos em uma bactéria produtora de L-Iisina AJllO 82 (NRRL B-11470) de Brevibacterium lactofermentum respectivamente. A cepa AJ11082 tem a propriedade de resistência a AEC. Os plasmídeos foram introduzidos de acordo com um método do pulso elétrio (Sugimoto e outros, Pedido de Patente Japonesa Deositada em Aberto N°. 2-207.791). Foram selecionados transformantes baseados nos marcadores de resistência a droga possuídos pelos respectivos plasmídeos. Foram selecionados transf ormantes em um meio completo contendo 5 /ig/ml de cloranfenicol quando foi introduzido um plasmídeo contendo um gene de resistência a cloranf enicol ou foram selecionados transformantes em um meio completo contendo 25 /zg/ml de kanamicina quando foi introduzido um plasmídeo contendo um gene de resistência a kanamicina.

Exemplo 6 : Produção de L-Iisina

Cada um dos transformantes obtidos no Exemplo 5 foi cultivado em um meio produtor de L-Iisina para avaliar a sua produtividade de L-lisina. O meio produtor de L-lisina tinha a seguinte composição.

[meio produtor de L-lisina] Os componentes a seguir sem ser carbonato de cálcio (por litro) foram dissolvidos para fazer ajuste a pH 8,0 com KOH. O meio foi esterilizado a 115°C durante 15 minutos e foi adicionado carbonato de cálcio (50 g) que foi esterilizado separadamente em ar quente em um estado seco ao meio esterilizado.

Glicose 100 g

(NH4)2SO4 55 g

KH2PO4 1 g

MgSO4. 7 H2O 1 g

Biotina 500 μg

Tiamina 20 00 μg

FeSO4. 7 H2O 0,01 g

MnSO4. 7 H2O 0,01 g

Nicotinamida 5 mg

Hidrolisado de proteína

(Mamenou) 30 ml

Carbonato de cálcio 50 g

Cada um dos vários tipos dos transformantes e da cepa parental foi inoculado ao meio que tem a composição descrita acima para realizar cultivo a 31,5 0C com agitação reversível. A quantidade de L-lisina produzida após 40 ou 72 horas de cultivo, e o crescimento após 72 horas (OD562) são apresentados na Tabela 1. Na tabela, lysC* representa o lysC mutante. 0 crescimento foi quantitativamente determinado medindo OD a 560 nm após diluição de 101 vezes. TABELA 1

Acúmulo de L-Iisina após Cultivo durante 40 ou 72 Horas

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Como mostrado acima, quando IysA, ddh, IysC mutante, dapA ou dapB foi melhorado isoladamente, a quantidade de L-Iisina produzida após 72 horas de cultivo era maior do que ou equivalente àquela produzida pela cepa parental, entretanto, a quantidade de L-Iisina produzida após 40 horas de cultivo era menor do que aquela produzida pela cepa parental. A saber, a velocidade de produção de L-Iisina foi diminuída no cultivo por um curto período. Similarmente, quando IysC e dapA mutantes ou dapA e dapB foram melhorados em combinação, a quantidade de L-Iisina produzida após 72 horas de cultivo era maior do que aquela produzida pela cepa parental, entretanto, a quantidade de L-Iisina produzida após 40 horas de cultivo era menor do que aquela produzida pela cepa parental. Assim, a velocidade de produção de L-Iisina era diminuída.

Por outro lado, quando somente IysA e ddh foram melhorados em combinação, o crescimento foi melhorado, a velocidade de produção de L-lisina foi restaurada com sucesso no curto período de cultivo e a quantidade acumulada de L-lisina também foi melhorada no cultivo por um longo período.

Além disso, no caso da cepa em que dapB foi melhorado juntamente com lysC mutante, e no caso da cepa em que dapA assim como estes genes foram melhorados simultaneamente, o crescimento foi melhorado a velocidade de produção de L-lisina foi aumentada comparada com a cepa parental. No caso da cepa em que estes três genes foram melhorados simultaneamente, tanto a velocidade de produção de L-lisina como a quantidade de L-lisina acumulada foram ainda melhoradas melhorando ainda mais lysA e ddh. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: AJINOMOTO CO. LTD.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE L-LISINA"

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 24

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO:

(B) RUA:

(C) CIDADE:

(E) PAÍS:

(F) CEP:

(v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS

(D) PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versão #1,30

(vi) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE NORMAL:

(A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE:

(B) DATA DO DEPÓSITO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vii) DADOS DO PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR

(A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: JP 8-142812

(B) DADA DO DEPÓSITO: 05 DE JUNHO DE 1996

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O ADVOGADO/ AGENTE:

NOME:

(B) NÚMERO DE REGISTRO;

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE:

(B) TELEFAX:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2 3 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /deSC="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 1:

CTGGACGCGA CCATTCCGCG AGG 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 2:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 2:

CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 3579 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 533..2182 (ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 2188..3522

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 3: GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60

TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120

GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180

GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240

GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300

AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360

CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420

CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480

AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535

Met 1

ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583 Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val

5 10 15

TTG ACC ..TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631 Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val

20 25 30

GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679 Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile

35 40 45

GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727 Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala

50 55 60 65

ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775 Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala

70 75 80

GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823 Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala

85 90 95

CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871 Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly

100 105 110

AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919 Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser

115 120 125 GCA AAC CCA Ala Asn Pro 130

GTG GGT GAC Val Gly Asp

ACC CGC GAA Thr Arg Glu

GCT TTG TCC Ala Leu Ser 180

GGT TAT GGC Gly Tyr Gly 195

AAG CAT CCT Lys His Pro 210

TTC CGC GCT Phe Arg Ala

CTG CAT GAG Leu His Glu

CTG TTC GAG Leu Phe Glu 260

AAC GGC AAC Asn Gly Asn

275 GAA TTC GGC Glu Phe Gly 290

GCA GCC TAC Ala Ala Tyr

ACC GGA Thr Gly

TCT TTG Ser Leu 150 TAC TAC Tyr Tyr 165

CTT CTT Leu Leu

GGC GAA Gly Glu

GAA GCG Glu Ala

GAA GGC Glu Gly 230 TTC GGC Phe Gly 245

TCC GGT Ser Gly

CTG TAC Leu Tyr

GAT GAC Asp Asp

ATC GCT Ile Ala 310

CCT ATT Pro Ile 135

GGT CGT Gly Arg

TTC AAC Phe Asn

GCA GCG Ala Ala

TAC ATT Tyr Ile 200 TTG GCT Leu Ala 215

GTG GAG Val Glu

ACC GAT Thr Asp

GCG GTG Ala Val

GAA AAC Glu Asn 280 AAA GAC Lys Asp 295

GGC GAT Gly Asp

CAC CTT His Leu

GTG CTG Val Leu

GAT CAC Asp His 170 GCG AAG Ala Lys 185

AAG GAA Lys Glu

TTG GAG Leu Glu

ATG ATG Met Met

TTC GAT Phe Asp 250 GAC AAG Asp Lys 265

GAG GGC Glu Gly

CGC GTG Arg Val

ATC GCG Ile Ala

GGC GGA Gly Gly 140 GAG GCT Glu Ala 155

GGT CGC Gly Arg

GGC GAG Gly Glu

ATT GCG Ile Ala

CCT GCC Pro Ala 220 TTC GAG Phe Glu 235

GTC TAC Val Tyr

GCC GTG Ala Val

GCT TGG Ala Trp

GTG ATC Val Ile 300 TAC GTG Tyr Val 315

ACC CGC Thr Arg

TCC GGC Ser Gly

CAG ATC Gln Ile

CCA ACG Pro Thr 190 GAG GCA Glu Ala 205

GCA ACC Ala Thr

CAC ATC His Ile

TAC CAC Tyr His

CAG GTG Gln Val 270 TGG CTG Trp Leu 285

AAG TCT Lys Ser

GCT GAT Ala Asp

TGG GCT GCC 967 Trp Ala Ala 145

GCG AAA GTG 1015 Ala Lys Val 160

GAT CGT TTC 1063

Asp Arg Phe

175

CCA GAA GAC 1111 Pro Glu Asp

ATC GTC GAA 1159 Ile Val Glu

CAG GAG CTT 1207 Gln Glu Leu 225

AAA TCT TCC 1255 Lys Ser Ser 240

GAG AAC TCC 1303

Glu Asn Ser

255

CTG AAG GAC 1351 Leu Lys Asp

CGT TCC ACC 1399 Arg Ser Thr

GAC GGC GAC 1447 Asp Gly Asp 305

AAG TTC TCC 1495 Lys Phe Ser 320 CGC GGA Arg Gly

TAC ATC Tyr Ile

GAA GGC Glu Gly 355 GGC AAG Gly Lys 370

GAT GAC Asp Asp

ATC CGT Ile Arg

GAA TCC Glu Ser

GCT CGT Ala Arg 435 GAG GAA Glu Glu 450

CTC ATC Leu Ile

GAC CTA Asp Leu

GGA ACT 35 Gly Thr

30

CAC AAC His Asn 325 GCG CGC Ala Arg 340

GTT GAA Val Glu

GCA GTG Ala Val

CTC GTT Leu Val

TCC TCC Ser Ser 405 CAG TCC Gln Ser 420

CTG TGC Leu Cys

GGC GCA Gly Ala

CGC ACA Arg Thr

CGT GAA Arg Glu 485 TTC CAC Phe His 500

CTA AAC ATC Leu Asn Ile

CTG AAG GCA Leu Lys Ala

GTC CTG ATT Val Leu Ile 360

CGT ATG TCC Arg Met Ser

375 GAA GCA ATC Glu Ala Ile 390

GTG GAT TCT Val Asp Ser

TCC GAC AAC Ser Asp Asn

TCC ATC GCG Ser Ile Ala 440

GAC CTA TCT Asp Leu Ser

455 CTC GGA GAG Leu Gly Glu 470

CCA CAC CGC Pro His Arg

CGC TTC TAC Arg Phe Tyr

TAC ATG Tyr Met 330 GCG GCG Ala Ala 345

GGC CAG Gly Gln

AAG CGT Lys Arg

GGC ATC Gly Ile

TCC CTG Ser Leu 410 CCT GTG Pro Val 425

CGC AAG Arg Lys

CTA CTG Leu Leu

TTC CCA Phe Pro

ATT GCC Ile Ala 490 GAT TCC Asp Ser 505

TTG GGT GCT Leu Gly Ala

GCG GCA CTT Ala Ala Leu

ATG GTG AAC Met Val Asn 365

GCA GGC ACC Ala Gly Thr

380 GAT GCG GCG Asp Ala Ala 395

GAT ATC GAT Asp Ile Asp

TAC TAC GTG Tyr Tyr Val

GCA GAG ACC Ala Glu Thr 445

ACC CAC GAC Thr His Asp

460 GCA GTG GTG Ala Val Val 475

CGC TAT GCT Arg Tyr Ala

TGC CAC ATC Cys His Ile

GAC CAC CAT GGT Asp His His Gly 335

GGC TAC. AAG CCA Gly Tyr Lys Pro 350

CTG CTT CGC GAC Leu Leu Arg Asp

GTG GTC Val Val

CGT TAC Arg Tyr

CTC GGC Leu Gly 415 CAG TAC Gln Tyr 430

TTG GGT Leu Gly

CGC GAA Arg Glu

AAG GCT Lys Ala

GAG GAA Glu Glu 495 CTT CCA Leu Pro 510

ACC CTA Thr Leu 385 TCC CTG Ser Leu 400

CTG TGG Leu Trp

GGA CAC Gly His

GTC ACC Val Thr

GGC GAT Gly Asp 465 GCC GCT Ala Ala 480

TTA GCT Leu Ala

AAG GTT Lys Val

1543

1591

1639

1687

1735

1783

1831

1879

1927

1975

2023

2071 GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119 Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala

515 520 525

GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167

Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser 530 535 540 545

GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214

Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu

550 1 5

CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262 Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly 10 15 20 25

GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310 Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr 30 35 40

GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358 Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys

45 50 55

CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406

Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala 60 65 70

TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454 Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu 75 80 85

GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502 Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu 90 95 100 105

GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550 Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys 110 115 120

GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598 Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val

125 130 135

GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646 Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala 140 145 150 GGT Gly

GAA Glu 170 TTC Phe

GCC Ala

GGT Gly

GTG Val

CCT Pro 250 GAA Glu

GTC Val

GTT Val

GAA Glu

CGT Arg 330

GAA GGC Glu Gly 155

GCA CAC Ala His

GGA TTC Gly Phe

AAC AAC Asn Asn

TCC CAG Ser Gln 220 TTG GGC Leu Gly 235

GAA CTG Glu Leu

GAA CCA Glu Pro

GGA AAA Gly Lys

GAG CCC Glu Pro 300 GTC GGC Val Gly 315

TAC ATC Tyr Ile

AAG ATT Lys Ile

ACC CAC Thr His

TCC CTG Ser Leu 190 GCA GAA Ala Glu 205

GTG TTC Val Phe

CTG TAC Leu Tyr

GAT CTC Asp Leu

CTC AAC Leu Asn 270 ATG GCA Met Ala 285

GGC CGC Gly Arg

ACC ACC Thr Thr

GCC GTG Ala Val

CAG GAC GTG Gln Asp Val 160

GAG TTC ATC Glu Phe Ile 175

GCA TCC GGT Ala Ser Gly

AAC CTG AAC Asn Leu Asn

GAC GCC GAA Asp Ala Glu 225

TCA CAG ATC Ser Gln Ile

240 GGT GGC GGA Gly Gly Gly 255

GTC GCA GAA Val Ala Glu

GCG GAA CTA Ala Glu Leu

GCT ATC GCA Ala Ile Ala 305

AAA GAC GTC Lys Asp Val

320 GAC GGA GGC Asp Gly Gly 335

TTG ATC Leu Ile

GCC ACT Ala Thr

TCC GCA Ser Ala 195 CTG GTT Leu Val 210

GGC TTC Gly Phe

CAC AGC His Ser

TAC GGC Tyr Gly

GTT GCC Val Ala 275 GGC ATC Gly Ile 290

GGC CCC Gly Pro

CAC GTA His Val

ATG TCC Met Ser

CGC GTA Arg Val 165 AGC CAC Ser His 180

TTC GAA Phe Glu

GGC CTG Gly Leu

AAG CTG Lys Leu

GAA CTG Glu Leu 245 ATT GCC Ile Ala 260

TCC GAC Ser Asp

GAC GCA Asp Ala

TCC ACC Ser Thr

GAC GAC Asp Asp 325 GAC AAC Asp Asn 340

AAG CCA GGC ATC Lys Pro Gly Ile

GAA GAC Glu Asp

GCA GCA Ala Ala

CAC TGC His Cys 215 GCA GCA Ala Ala 230

GGC GTT Gly Val

TAT ACC Tyr Thr

CTG CTC Leu Leu

CCA ACC Pro Thr 295 GTG ACC Val Thr 310

GAC AAA Asp Lys

CAG AAG Gln Lys 185 AAA GCC Lys Ala 200

CAC GTT His Val

GAA CGC Glu Arg

GC-C CTT Ala Leu

GCA GCT Ala Ala 265 ACC GCA Thr Ala 280

GTG CTT Val Leu

ATC TAC Ile Tyr

ACC CGC Thr Arg

ATC CGC CCA GCA Ile Arg Pro Ala 345

2694

2742

2790

2838

2886

2934

2982

3030

3078

3126

3174

3222 CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270 Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu

350 355 360

GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318 Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly

365 370 375

GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366 Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly

380 385 390

GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser

395 400 405

TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462 Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala

410 415 420 425

GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu

430 435 440

TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562

Ser Leu Glu Ala

445

GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579

(2) INFORMAÇAO PARA. SEQ. ID N° . 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 550 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 4:

Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu

15 10 15

Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val

20 25 30

Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn

35 40 45 Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys VaJ Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu

50 55 60

Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser 65 70 75 80

Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe

100 105 110

Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val

115 120 125

Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala

130 135 140

Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys 145 150 155 160

Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg

165 170 175

Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu

180 185 190

Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val

195 200 205

Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu

210 215 220

Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser 225 230 235 240

Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn

245 250 255

Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys

260 265 270

Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser

275 280 285

Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly

290 295 300

Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe 305 310 315 320

Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His 325 330 335 Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lvs

340 345 350

Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg 355 360 365

Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr

370 375 380

Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser 385 390 395 400

Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu

405 410 415

Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly

420 425 430

His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val 435 440 445

Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly

450 455 460

Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480

Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu

485 490 495

Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys

500 505 510

Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala 515 520 525

Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val

530 535 540

Ser Ala Pro Glu Lys Met 545 550

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 445 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 5: Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro

15 10 15

Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val

20 25 30

Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val

35 40 45

Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe

50 55 60

Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys

65 70 75 80

Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala

85 90 95

Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser

100 105 110

Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala

115 120 125

Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu

130 135 140

Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp

145 150 155 160

Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe

165 170 175

Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu

195 200 205

Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala

210 215 220

Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln

225 230 235 240

Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly

245 250 255

Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala

260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu

275 2S0 285

Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile

290 295 300

Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320

Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly

325 330 335

Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp

340 345 350

Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg

355 360 365

Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu

370 375 380

Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400

Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr

405 410 415

Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu

420 425 430

Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 6:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: .23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 6 CATCTAAGTA TGCATCTCGG

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2 0 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico (C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 7

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 2O

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: 10 (A) COMPRIMENTO: 1034 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869 (ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 61..1020

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 8 ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60

ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC 108 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg

AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA 156 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly

ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT 204 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp GTC Val

TGC Cys 65 CAG Gln

CGC Arg

GCA Ala

GTC Val

GGC Gly 145 GGC Gly

GAA Glu

CAC His

ATC Ile

GTC Val 225

GCC GAC Ala Asp 50 ATG GGC Met -Gly

TTC GCC Phe Ala

CAC CGC His Arg

CTG GTC Leu Val 115 TAC GCA Tyr Ala 130

CCA GGT Pro Gly

GTT CAA Val Gln

AAG GCC Lys Ala

AAG CGC Lys Arg 195 GAA AAC Glu Asn 210

GAA GTC Glu Val

GTG GAC Val Asp

TCC GCC Ser Ala

TGC ACC Cys Thr 85

CAG GTC Gln Val 100

TCT ACC Ser Thr

GCG GCA Ala Ala

TTG TCA Leu Ser

AAG GCA Lys Ala 165 CGC CGC Arg Arg 180

CAA TGC Gln Cys

GAC ATC Asp Ile

AAC TTC Asn Phe

AAG CAC GCC Lys His Ala 55

ACC GAC ATC Thr Asp Ile 70

GTA GAC ACC Val Asp Thr

ATG AAC GAA Met Asn Glu

GGC TGG GAT Gly Trp Asp 120

GTC TTA GCC Val Leu Ala 135

CAG GGC CAC Gln Gly His 150

GTC CAG TAC Val Gln Tyr

GGC GAA GCC Gly Glu Ala

TTC GTG GTT Phe Val Val 200

CGC ACC ATG Arg Thr Met

215 ATC GAC GAA Ile Asp Glu 230

GAC GAC Asp Asp

CCT GAG Pro Glu

TAC GAC Tyr Asp 90

GCC GCC Ala Ala 105

CCA GGA Pro Gly

GAG CAC Glu His

TCC GAT Ser Asp

ACC CTC Thr Leu 170 GGC GAC Gly Asp 185

GCC GAC Ala Asp

CCT GAT Pro Asp

GCA ACC Ala Thr

GTG GAC Val Asp 60

CAG GCA Gln Ala

75 AAC CAC Asn His

ACC GCA Thr Ala

ATG TTC Met Phe

CAG CAG Gln Gln 140 GCT TTG Ala Leu 155

CCA TCC Pro Ser

CTT ACC Leu Thr

GCG GCC Ala Ala

TAC TTC Tyr Phe 220 TTC GAC Phe Asp 235

GTG CTG TTC CTG Val Leu Phe Leu

CCA AAG Pro Lys

CGC GAC Arg Asp

GCC GGC Ala Gly 110 TCC ATC Ser Ile 125

CAC ACC His Thr

CGA CGC Arg Arg

GAA GAC Glu Asp

GGA AAG Gly Lys 190 GAT CAC Asp His 205

GTT GGC Val Gly

TTC GCG Phe Ala 80

ATC CCA Ile Pro 95 AAC GTT Asn Val

AAC CGC Asn Arg

TTC TGG Phe Trp

ATC CCT Ile Pro 160 GCC CTG Ala Leu 175

CAA ACC Gln Thr

GAG CGC Glu Arg

TAC GAA Tyr Glu

TCC GAG CAC ACC Ser Glu His Thr 240

252

300

348

396

444

492

540

588

636

684

732

780 GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC 828 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Glv Asp Thr Gly Glv 245 250 255

TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT 876 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270

TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG 924 Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285

AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA 972 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300

TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC 1020 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320

TAATTTAGCT CGAG 1034

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 3 20 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 9:

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15

Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30

Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45

Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60

Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80

Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val

100 105 110

Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

115 120 125

Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp

130 135 140

Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro

145 150 155 160

Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu

165 170 175

Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr

180 185 190

His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg

195 200 205

Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu

210 215 220

Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr

225 230 235 240

Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly

245 250 255

Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp

260 265 270

Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met

275 280 285

Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro

290 295 300

Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val

305 310 315 320

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2 3 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 10:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 2 3

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 11:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 11: ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1643 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 12

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCAC.G 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020 GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080 GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140 GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200 CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260 CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320 CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380 ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440 GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500 TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560 CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1643 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 217...1482

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 13:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234

Met Ala Leu Val Val Gln 1 5

AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val

10 15 20

GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val

25 30 35

GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala

40 45 50

GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70

ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu

75 80 85

TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100

CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro

105 110 115

GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130

GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150

CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn

155 160 165 GCT GAT Ala Asp

GAC CCG Asp Pro

GAA GAA Glu Glu 200 CGC AGT Arg Ser 215

TCG TCT Ser Ser

GAT ATT Asp Ile

TCC GAA Ser Glu

GCT GCC Ala Ala 280 ATG GTT Met Val 295

ACG TTC Thr Phe

AAG AAG Lys Lys

CAG GTC Gln Val

GTG TGT Val Cys 170 CGC ATC Arg Ile 185

ATG CTG Met Leu

GTT GAA Val Glu

TAT AGT Tyr Ser

CCT GTG Pro Val 250 GCC AAA Ala Lys 265

AAG GTT Lys Val

CTG CAG Leu Gln

ACC TGC Thr Cys

CTT CAG Leu Gln 330 GGC AAA Gly Lys 345

GAG ATT Glu Ile

GTT CCT Val Pro

GAA CTT Glu Leu

TAC GCT Tyr Ala 220 AAT GAT Asn Asp 235

GAA GAA Glu Glu

GTA ACC Val Thr

TTC CGT Phe Arg

AAC GTC Asn Val 300 CCT CGC Pro Arg 315

GTT CAG Val Gln

GTC TCC Val Ser

TAC TCG Tyr Ser

AAT GCA Asn Ala 190 GCT GCT Ala Ala 205

CGT GCA Arg Ala

CCC GGC Pro Gly

GCA GTC Ala Val

GTT CTG Val Leu 270 GCG TTG Ala Leu 285

TCC TCT Ser Ser

GCT GAC Ala Asp

GGC AAC Gly Asn

CTC GTG Leu Val 350

GAC GTT Asp Val 175

CAG AAG Gln Lys

GTT GGC Val Gly

TTC AAT Phe Asn

ACT TTG Thr Leu 240 CTT-ACC Leu Thr 255

GGT ATT Gly Ile

GCT GAT Ala Asp

GTG GAA Val Glu

GGA CGC Gly Arg 320 TGG ACC Trp Thr 335

GGT GCT Gly Ala

GAC GGT Asp Gly

CTG GAA Leu Glu

TCC AAG Ser Lys 210 GTG CCA Val Pro 225

ATT GCC Ile Ala

GGT GTC Gly Val

TCC GAT Ser Asp

GCA GAA Ala Glu 290 GAC GGC Asp Gly 305

CGT GCG Arg Ala

AAT GTG Asn Val

GGC ATG Gly Met

GTG TAT ACC GCT Val Tyr Thr Ala 180

AAG CTC AGC TTC Lys Leu Ser Phe 195

ATT TTG GTG CTG Ile Leu Val Leu

CTT CGC Leu Arg

GGC TCT Gly Ser

GCA ACC Ala Thr 260 AAG CCA Lys Pro 275

ATC AAC Ile Asn

ACC ACC Thr Thr

ATG GAG Met Glu

CTT TAC Leu Tyr 340 AAG TCT Lys Ser 355

GTA CGC Val Arg 230 ATG GAG Met Glu 245

GAC AAG Asp Lys

GGC GAG Gly Glu

ATT GAC Ile Asp

GAC ATC Asp Ile 310 ATC TTG Ile Leu 325

GAC GAC Asp Asp

CAC CCA His Pro

762

810

858

906

954

1002

1050

1098

1146

1194

1242

1290 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn

360 365 370

ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390

GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln

395 400 405

CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg

410 415 420

AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 421 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 14:

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Aln Arg Ala

385

390

395

400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405

Ala Gly Thr Gly Arg

420

410

415

(2) INFORMAÇÃO PARA. SEQ. ID N0. 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1643 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 964...1482

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 15:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240

GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300

ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360

GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420

CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480

GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540

GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600

AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660

TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720

GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780

AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840

TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCiiGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15

GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala

20 25 30

AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val

35 40 45

CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe

50 55 60

ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys

65 70 75

CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95

GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val

100 105 110

ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125

TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140

GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly

145 150 155

GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170

AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 172 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 16:

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala

1 5 10 15

Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys

20 25 30

Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu

35 40 45

Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr

50 55 60

Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80

Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly

85 90 95

Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr

100 105 110

Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu

115 120 125

Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp

130 135 140

Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly 145 150 155 160

Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 17:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 17:

GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 18:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM

(Xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 18:

GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1411 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 311...1213

CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60 TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120 ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC 180 GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT 240 GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC 349

Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His 1 5 10

TTC GGC ACC GTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA 397 Phe Gly Thr Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly 15 20 25

GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT 445 Asp Ile Asp Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp 30 35 40 45

AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA 493 Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro

50 55 60

ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG 541 Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu 65 70 75

GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC 589 Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn

80 85 90

ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA 637 Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala 95 100 105

GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG 685 Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu 110 115 120 125

GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA 733 Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro

130 135 140

ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT 781 Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser 145 150 155

GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829 Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys 160 165 170 GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877 Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr

175 180 185

GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925 Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu 190 195 200 205

GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973 Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro

210 215 220

ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021 Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val

225 230 235

CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA 1069 15 Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln 240 245 250

GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117 Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln 255 260 265

2 0 GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG 1165 Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu 270 275 280 285

CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213 Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 25 290 295 300

TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273 AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333 CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393 TCAAGGATCC CAACATTC 1411

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 20:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 3 01 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 20: Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Pho Gly Thr

1 5 LO 15

Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp

20 25 30

Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu

35 40 45

Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr

50 55 60

Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly 65 70 75 80

Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr

85 90 95

Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu

100 105 110

Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu

115 120 125

Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu

130 135 140

Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met 145 150 155 160

Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys

165 170 175

Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala

180 185 190

Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly

195 200 205

Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu

210 215 220

Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg 225 230 235 240

Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu

245 250 255

Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn

260 265 270

Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu 275 280 285

Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu 290 295 300 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 21:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 21:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N0. 22:

(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucléico

(A) DESCRIÇÃO: /desc="DNA sintético"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N°. 22:

CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N°. 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2001 pares base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) ASPECTO DO FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA genômico

(vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(ix) ASPECTO:

(A) NOME/ CHAVE: CDS

(B) LOCAÇÃO: 730..1473

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ. ID N0. 23: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT 60

GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG 120

ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180

TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240

AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300

GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360

ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG 420

AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA 480

AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT 540

AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT 600

GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT 660

TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA 720

AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg

1 5 10

GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG 816

Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu

15 20 25

20 CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC 864

Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp

30 35 40 45

AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG 912

Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met

50 55 60

GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA 960

Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly

65 70 75

ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT 1008

Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln VaL Arg Ala Trp Leu

80 85 90 GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC 1056 Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile

95 100 105

TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC 1104 Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe 110 115 120 125

GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA 1152 Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala

130 135 140

CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA C-GC 1200 Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg

145 150 155

AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT 1248 15 Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu 160 165 170

GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC 1296 Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val

175 180 185

CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG 1344 Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln 190 195 200 205

GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT 1392 Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe

210 215 220

GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC 1440 Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly

225 230 235

CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC 1493 Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

240 245

GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT 1553 GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT 1613 TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA 1673 35 GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733 CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793 GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT 1853 GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG 1913 TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC 1973 GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG 2001

(2) INFORMAÇÃO PARA. SEQ. ID N°. 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 248 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA:: SEQ. ID N°. 24:

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln

15 10 15

Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala

20 25 30

Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala

35 40 45

Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu

50 55 60

Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80

Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys

85 90 95

Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val

100 105 110

Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala

115 120 125

Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly

130 135 140

Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160

Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser

180 185 190

Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 193 200 205

Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly

210 215 220

Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240

Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 245

Claims (4)

1. Vetor recombinante autonomamente replicável em células de bactérias corineformes, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de DNA que codifica uma diaminopimelato descarboxilase e uma seqüência de DNA que codifica uma diaminopimelato desidrogenase, em que a dita seqüência de DNA que codifica uma diaminopimelato descarboxilase compreende os nucleotideos 2188 a 3522 de SEQ ID N0:3, e a dita seqüência de DNA que codifica uma diaminopimelato desidrogenase compreende os nucleotideos 61 a -1020 de SEQ ID NO:8.

2. Bactéria corineforme geneticamente engenheirada, caracterizada pelo fato de que as atividades intracelulares da diaminopimelato descarboxilase e diaminopimelato desidrogenase são aumentadas pelo aumento do número de cópias de seus genes, usando-se um promotor forte, ou uma combinação dos mesmos, em que o dito gene que codifica uma diaminopimelato descarboxilase compreende os nucleotideos 2188 a 3522 de SEQ ID NO:3, e o dito gene que codifica uma diaminopimelato descarboxilase compreende os nucleotideos 61 a 1020 de SEQ ID NO: 8.

3. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação -2, caracterizada pelo fato de ser transformada pela introdução do vetor recombinante como definido na reivindicação 1.

4. Processo para a produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de cultivar a dita bactéria corineforme, como definida em qualquer uma das reivindicações 2 e 3, em um meio para permitir que a L-lisina seja produzida e acumulada em uma cultura, e coletar a L-lisina da cultura.