KR101608734B1

KR101608734B1 - L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101608734B1
Application number: KR1020140033697A
Authority: KR
Inventors: 이지선; 서창일; 정기용; 고은성; 권도현; 이광호
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2016-04-04
Also published as: TWI547558B; JP2017504359A; EP3119875B1; KR20150109989A; EP3119875A4; BR112016017281A2; PL3119875T3; US10202609B2; MY181143A; AR099810A1; DK3119875T3; EP3119875A1; CN105980544B; ES2720032T3; US20170044553A1; TR201903145T4; CN105980544A; BR112016017281B1; WO2015142020A1; JP6490714B2

Abstract

미생물의 파지 수용체의 활성을 불황성화시킴으로써, L-아미노산의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하는 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 재조합 미생물을 이용하여 높은 효율로 L-아미노산을 생산하는 것이 가능하다.

Description

L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법 {Microorganisms producing L-amino acids and process for producing L-amino acids using the same}

본 발명은 L-아미노산을 생산하는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

아미노산 등 유용 산물의 대량생산을 위해 미생물을 이용한 다양한 발효 방법이 이용되고 있으며, 이러한 미생물을 이용한 성공적인 발효를 위해 균주개발, 발효조건 확립 등 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 특히 유용 산물의 대량생산을 위한 숙주 균주의 개발을 위해 특정 유전자의 과발현 또는 저발현을 유도하려는 많은 시도가 행해지고 있다.

한편 박테리아를 이용한 발효 생산에서 파지(phage)의 오염으로 인해 유용 산물의 생산이 감소할 수 있다. 파지의 오염은 주로 파지 수용체(Phage receptor)를 통해 이루어지는데, 파지 수용체란 파지가 박테리아 표면에 부착할 수 있는 단백질, 지질 다당체 등을 의미한다. 대장균의 경우, 다양한 파지에 의해 공격을 당하며 각각의 파지에 대한 수용체도 연구가 비교적 잘 되어 있다. 그러나 파지 수용체와 L-아미노산 생산성과의 관계에 대해서는 충분한 연구가 진행되지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 대장균 취약점 중 하나인 파지 오염으로 인한 L-아미노산 생산의 감소라는 위험성을 줄이기 위해, 파지 수용체로 잘 알려진 유전자들을 선택하여 각각을 불활성화시킨 후, 그에 의한 L-아미노산 생산성에 대한 영향을 확인함으로써 이를 L-아미노산 생산 균주에 적용하여 본 발명을 완성하게 되었다.

일 양상은 파지 수용체가 불활성화된, L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 미생물을 이용한 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 NfrA, NfrB,또는 NfrA 및 NfrB 의 활성이 불활성화된, L-아미노산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 명세서의 용어 "NfrA"는 박테리오파지 N4(bacteriophage N4)의 수용체를 구성하는 것으로, 이는 박테리아의 세포막 단백질일 수 있으며, 예를 들면 외막(outer membrane) 단백질의 구성단위(subunit)일 수 있다. 상기 단백질 NfrA는 예를 들면 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 NfrA는 예를 들면 서열번호 40의 아미노산 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 단백질 NfrA를 암호화하는 유전자 서열은 상기 서열번호 40의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질 NfrA를 암호화하는 유전자 서열은 예를 들면 nfrA 유전자(NCBI Gene ID:12930896) 서열일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

용어 "NfrB"는 박테리오파지 N4(bacteriophage N4)의 수용체를 구성하는 것으로, 이는 박테리아의 세포막 단백질일 수 있으며, 예를 들면 내막(inner membrane) 단백질의 구성단위(subunit)일 수 있다. 상기 NfrB는 예를 들면 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 NfrB는 예를 들면 서열번호 42의 아미노산 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 단백질 NfrB를 암호화하는 유전자 서열은 상기 서열번호 42의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질 NfrB를 암호화하는 유전자 서열은 예를 들면 nfrB 유전자(NCBI Gene ID:12933943) 서열일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 41의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

또한 상기 L-아미노산을 생산하는 재조합 미생물은 NfrA, NfrB 또는 NfrA 및 NfrB 활성이 불활성화된 미생물에서 Tsx, FhuA, 또는 Tsx 및 FhuA의 활성이 추가로 불활성화된 것일 수 있다.

용어 "Tsx"는 뉴클레오시드 채널(nucleoside channel), 즉 뉴클레오시드에 특이적인 채널을 구성하는 것으로, 파지 T6 및 콜리신 K(colicin K)의 수용체를 구성할 수 있다. 상기 Tsx는 예를 들면 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질 Tsx를 암호화하는 유전자 서열은 상기 서열번호 45의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단백질 Tsx를 암호화하는 유전자 서열은 tsx 유전자(NCBI Gene ID:12934188) 서열일 수 있으며, 서열번호 44의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

용어 "FhuA"는 박테리아의 외막 단백질에서 (Fe³ ⁺)페리크롬, 또는 알보마이신(albomycin) 및 리파마이신(rifamycin)과 같은 항생제를 수송하는 등의 여러 기능을 하는 단백질로 파지 T1, T5 및 파이80(phi80)의 수용체일 수 있다. 상기 FhuA는 예를 들면 서열번호 47의 아미노산 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질 FhuA를 암호화하는 유전자 서열은 상기 서열번호 47의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 단백질 FhuA를 암호화하는 유전자 서열은 예를 들면 fhuA 유전자 서열(NCBI Gene ID:12930751)일 수 있으며, 서열번호 47의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 예를 들면 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

용어 "재조합 미생물(recombinant microorganism)"은 유전적으로 조작된 미생물일 수 있다. 유전공학에 의해 제조된 미생물, 예를 들면 유전공학 방법에 의해 미생물 내로 외인성(exogenous) 핵산이 도입되거나, 미생물의 내인성(endogenous) 유전자의 서열 또는 위치가 변형된 것일 수 있다.

용어, "L-아미노산"은 일반적으로 아미노기와 카르복시기가 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는 생물의 몸을 구성하는 단백질의 기본 구성단위를 의미한다. 예를 들면 L-류신, L-페닐알라닌, L-라이신, L-쓰레오닌, L-발린, L-이소류신, L-트립토판 및 L-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들면 L-트립토판 또는 L-쓰레오닌일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 "불활성화"는 미생물 중의 언급된 단백질이 전혀 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 전혀 활성을 가지지 않는 것 또는 내재적 활성에 비해 약화된 것을 의미한다. 용어 "내재적 활성"이란 미생물이 천연의 상태, 즉 미생물이 본래 가지고 있었던, 유전자 변형을 거치지 않은 단백질의 활성을 의미한다.

상기 단백질 NfrA, 단백질 NfrB, 단백질 Tsx, 단백질 FhuA의 활성이 불활성화되는 것은 상기 단백질들을 암호화하는 각 유전자의 변이, 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 상기 "유전자의 변이, 제거 또는 파괴"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종 상동유전자(paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 본 발명이 제시한 유전자를 불활성시키기 위해 람다 레드 재조합효소를 이용한 돌연변이 제작 기법을 사용할 수 있다.

상기 재조합 미생물은 본 발명에서 제시한 단백질들의 활성을 각각 또는 조합하여 제거하거나 감소시킴으로써, 활성이 불활성화되기 전보다 L-아미노산 생산성이 증가되어, L-아미노산 생산 용도로 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 재조합 미생물은 에세르키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 예를 들면 에세르키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 상기 에세르키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 예를 들면 대장균 KCCM11501P일 수 있다. 상기 대장균 KCCM11501P는 쓰레오닌 생산균주인 KCCM10910P를 모균주로 하여 nfrA 유전자 및 nfrB 유전자를 모두 결손시킨 균주(KCCM10910PΔnfrAB)로, 모균주 KCCM10910P 대비 당소비능이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 균주를 'CA03-8253P'이라 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2013년 12월 13일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11501P를 부여받았다.

다른 양상은 상기 L-아미노산을 생산하는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 L-아미노산을 생산하는 재조합 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 L-아미노산은 예를 들면 L-류신, L-페닐알라닌, L-라이신, L-쓰레오닌, L-발린, L-이소류신, L-트립토판 및 L-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들면 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있다. 상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃일 수 있다.　배양기간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

용어 "배양물"은 상기 재조합 미생물을 포함한 배양원액일 수 있으며, 균체를 제거한 배양 상등액 또는 배양물의 희석액일 수 있다. 상기 조성물은 L-아미노산의 생산성을 증가시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면 탄소원, 질소원, 또는 미량의 원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양물로부터 생산된 L-아미노산을 수집 또는 회수할 수 있다.

일 양상에 따른 단백질 NfrA, 단백질 NfrB, 단백질 Tsx, 단백질 FhuA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 제거 또는 감소된 미생물은 L-아미노산 생산을 위해 이용될 수 있다.

다른 양상에 따른 L-아미노산 생산용 조성물 또는 L-아미노산을 생산하는 방법에 의하면, L-아미노산을 효율적으로 생산할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. KCCM10910P 기반 파지 수용체가 불활성화된 쓰레오닌 생산 균주 제작

파지 수용체가 불활성화된 쓰레오닌 생산 균주를 제작하기 위해 모균주로 KCCM10910P (한국 등록특허 제10-0966324호)를 사용하였으며, 각 파지 수용체에 관한 유전자의 불활성화용 카세트를 제작하여 형질전환시켰다.

1-1. nfrA 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

nfrA 유전자가 불활성화된 균주 제작을 위해, nfrA 불활성화용 카세트를 제작하였다. 이 카세트는 Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용한 것으로(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640 -6645) 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 pUCprmfmloxC의 클로람페니콜(Chloramphenicol) 유전자를 사용하였다 (대한민국 공개특허:2009-007554).

nfrA 유전자(서열번호 39)의 일부분과 pUCprmfmloxC 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 DNA를 얻기 위해 서열번호 2와 3 프라이머를 이용하여 약 1.1kb DNA 단편을 얻었다. 이를 위해 PCR premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였으며. 조건은 95℃에서 30초의 변성(denaturation), 56℃에서 30초의 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 27회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하고 수득하여 이를 주형으로 서열번호 1과 4의 프라이머를 이용하여 위와 같은 조건으로 PCR을 수행하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 얻었으며, 이를 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 용리하고 수득하여 최종적으로 nfrA 불활성화 카세트를 제작하였다.

nfrA가 불활성화된 쓰레오닌 균주를 제작하기 위하여 Datsenko KA 등이 개발한 방법 (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645)에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대상 쓰레오닌 생산균주 KCCM10910P을 컴피턴트한 상태로 제조 후, 상기 획득된 nfrA 불활성화 카세트 DNA를 도입하여 형질전환시켰다.

얻어진 균주는 클로람 페니콜 내성을 가지고 있는 LB 플레이트에서 선별하였다. 이는 지놈 상의 불활성화 카세트의 nfrA 상동 서열 양쪽 바깥 쪽의 DNA 서열을 갖는 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈가 2.8kb에서 1.5kb로 줄어드는 콜로니를 선별하였다.

클로람페니콜 내성을 가진 1차 재조합 균주는 pKD46을 제거한 후, pJW168을 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거한 (Gene, (2000) 247,255-264). 최종 균주는 프라이머 5와 6을 이용한 PCR을 통해 얻어진 DNA의 결과물이 0.4kb로 사이즈가 줄어드는 것을 확인하여 제작되었다. 이를 통해 nfrA 유전자가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주, KCCM10910PΔnfrA를 제작하였다.

1-2. nfrB 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

nfrB(서열번호 41) 유전자가 불활성화된 균주를 제작하기 위하여 nfrB 불활성화용 카세트를 제작하였다. nfrB 불활성화용 카세트는 상기 실시예 1-1의 nfrA 불활성화 카세트 제작과 같은 방법으로 제작되었으며, 서열번호 8, 9의 프라이머를 이용하여 약 1.1kb의 DNA 단편을 얻었고, 서열번호 7, 10을 이용하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 제작하였다.

nfrB가 불활성화된 쓰레오닌 균주의 제작 방법은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하여 nfrB가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주, KCCM10910PΔnfrB를 제작하였다.

1-3. nfrAB 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

nfrAB(서열번호 43) 유전자가 불활성화된 균주 제작을 위해, 상기 1-1에 기술된 nfrA 불활성화 카세트 제작과 같은 방법으로 nfrAB 불활성화용 카세트를 제작하였다. 사용 프라이머로 서열번호 2, 9를 이용하여 약 1.1kb의 DNA 단편을 얻었고, 서열번호 1, 10을 이용하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 제작하였다.

nfrAB가 불활성화된 쓰레오닌 균주의 제작 방법은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 5과 12의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하였으며, 최종적으로 nfrAB가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10910PΔnfrAB를 제작하였다.

1-4. tsx 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

tsx (서열번호 44) 유전자가 불활성화된 균주를 제작하기 위하여 상기 1-1에 기술된 nfrA 불활성화 카세트 제작과 같은 방법으로 tsx 불활성화용 카세트를 제작하였다. 사용 프라이머는 서열번호 13, 14을 이용하여, 약 1.1kb의 DNA 단편을 얻었고, 서열번호 15, 16을 이용하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 제작하였다.

tsx가 불활성화된 쓰레오닌 균주의 제작 방법은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 17과 18의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하였으며, 최종적으로 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10910P Δtsx를 제작하였다.

1-5. fhuA 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

fhuA (서열번호 46) 유전자가 불활성화된 균주를 제작하기 위하여 fhuA 불활성화용 카세트를 제작하였다. 이 카세트는 상기 기술된 기법인 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 이용하도록 제작되었으며, fhuA와 상동성을 갖는 염기서열의 DNA 단편을 얻기 위해 각각 서열번호 19와 20, 21과 22를 이용하여 PCR 결과물을 얻었다. 또한 클로람페니콜 내성을 갖는 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 획득하기 위해 서열번호 23과 24을 이용하여 PCR 결과물을 얻었다. 이렇게 얻은 세 개의 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리하여 수득하고, 이 세 개의 결과물을 주형으로 하여 서열번호 19와 22를 사용하여 PCR을 수행하여 fhuA 불활성화 카세트를 제작하였다

fhuA가 불활성화된 쓰레오닌 균주를 제작하기 위하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 25와 26의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하여 최종적으로 fhuA가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10910PΔfhuA를 제작하였다.

1-6. lamB 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

lamB 유전자(서열번호 48)가 불활성화된 균주를 제작하기 위하여 상기 실시예 1-1에서 기술된 방법으로 서열번호 27, 28을 이용하여 약 1.1kb의 DNA 단편을 얻었고, 서열번호 29, 30을 이용하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 제작하였다.

lamB가 불활성화된 쓰레오닌 균주의 제작 방법은 상기 실시예 1-1에 기술된 방법과 동일한 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 31과 32의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하여 최종적으로 lamB가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10910PΔlamB를 제작하였다.

1-7. btuB 유전자가 불활성화된 쓰레오닌 균주 제작

btuB 유전자(서열번호 50) 가 불활성화된 균주를 제작을 위해 상기 실시예 1-1에서 기술된 방법으로 btuB 불활성화용 카세트를 제작하였다. 사용 primer는 서열번호 33, 34을 이용하여 약 1.1kb의 DNA 단편을 얻었고, 서열번호 35, 36을 이용하여 약 1.2kb의 DNA 단편을 제작하였다.

btuB가 불활성화된 쓰레오닌 균주를 제작하기 위하여 쓰레오닌 균주의 제작 방법은 상기 실시예 1-1에 기술된 방법과 동일한 방법으로 이루어졌으며, 서열번호 37와 38의 프라이머를 이용하여 PCR 결과물의 사이즈를 확인하여, 최종적으로 btuB가 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10910PΔbtuB를 제작하였다.

실시예2 . 재조합 미생물의 L- 쓰레오닌 생산성 비교

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 미생물들을 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 배양하여 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였다.

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
KH₂PO₄	2 g
(NH₄)₂SO₄	27.5 g
MgSO₄·7H₂O	1 g
FeSO₄·7H₂O	5 mg
MnSO₄·4H₂O	5 mg
DL-메티오닌	0.15 g
효모 추출물	2 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

33℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 실시예 1에서 제작된 대장균 7종의 균주 및 KCCM10910P를 각각 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃ 200rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.

균주	사용당 (g/L)	L-쓰레오닌 (g/L)
균주	30hr	48hr
KCCM 10910P (모균주)	22	34.5
KCCM 10910P ΔnfrA	26	34.5
KCCM 10910P ΔnfrB	26	34.4
KCCM 10910P ΔnfrAB	26	34.4
KCCM 10910P Δtsx	25	34.4
KCCM 10910P ΔfhuA	24	34.5
KCCM 10910P ΔlamB	20	34.5
KCCM 10910P ΔbtuB	21	34.5

표 2에 기재된 바와 같이 nfrA, nfrB, nfrAB, tsx 및 fhuA 각 불활성화 균주는 모균주인 KCCM10910P 대비 당소모 속도가 향상되면서 48hr 수율이 떨어지지 않는 것을 확인하였다. 반면, lamB와 btuB 불활성화 균주는 모균주 대비 당소모 속도가 유사하거나 소폭 떨어지고, 48시간 배양시 쓰레오닌 농도도 모두 유사한 것을 확인하였다. nfrA, nfrB, 및 nfrAB 불활성화 균주들은 배양 결과가 동일하게 나타났으며, 두 유전자 중 어느 하나만 결손한 경우와 두 유전자를 동시에 결손한 경우 모두 같은 결과를 보이는 것을 확인하였다.

실시예3. 유효 변이 조합 균주 제작 및 L-쓰레오닌 생산능 비교

3-1 nfrAB, fhuA 동시 불활성화, nfrAB, tsx 동시 불활성화 및 nfrAB, tsx, fhuA 동시 불활성화 균주 제작

당 소비능이 증가된 nfrAB, fhuA, tsx의 불활성화 특징을 조합한 경우의 당 소모능 추가 향상 여부를 확인하기 위하여, KCCM10910PΔnfrABΔfhuA와 KCCM10910PΔnfrABΔtsx 및 KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA를 제작하였다. 이를 위하여 실시예 1-3 제작된 KCCM10910PΔnfrAB를 기반으로 실시예 1에서 제작한 방법과 같은 방법으로 fhuA및 tsx를 각각 동시 불활성화시킨 균주를 제작하였다(KCCM10910PΔnfrABΔfhuA 및 KCCM10910PΔnfrABΔtsx). 또한 KCCM10910PΔnfrABΔtsx를 기반으로 fhuA를 불활성화시켜, 최종적으로 KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA를 제작하였다.

표 2에서 확인한 바와 같이 nfrA, nfrB, nfrAB 불활성화 균주들은 그 효과가 동일하다고 판단되므로, 유효 변이 통합 균주 제작에서는 nfrAB가 불활성화를 기반으로 tsx, fhuA 불활성화를 진행하였다. 그러나 그 효과는 nfrA나 nfrB만 불활성화시킨 경우와 두 유전자 동시 불활성화시킨 경우 모두 동일할 것으로 생각할 수 있다.

3-2. 유효 변이 조합 균주의 L- 쓰레오닌 생산능 비교

앞에서 제작된 유효 변이 통합주의 L-쓰레오닌 생산능을 비교하기 위하여 표 1의 배지를 이용하여 앞에 기술된 방법과 동일하게 배양을 진행하였으며, 그 결과는 표 3과 같다

균주	사용당 (g/L)	L-쓰레오닌 (g/L)
균주	30hr	48hr
KCCM10910P (모균주)	22	34.5
KCCM10910P ΔnfrAB	26	34.4
KCCM10910P ΔnfrAB ΔfhuA	28	34.5
KCCM10910P ΔnfrAB Δtsx	28	34.4
KCCM10910P ΔnfrAB Δtsx ΔfhuA	29	34.5

당 소비능이 증가된 nfrAB, fhuA, tsx의 불활성화 특징을 조합하여 제작한 KCCM10910PΔnfrABΔfhuA 균주와 KCCM10910PΔnfrABΔtsx 균주, KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA 균주의 역가 평가 결과, nfrAB 단독 변이에 fhuA나 tsx를 추가로 불활성화시켰을 경우 당 소비능이 증가함을 확인하였다. 이에 당 소비능이 증가된 것으로 보이는 상기 형질 전환된 대장균 KCCM10910PΔnfrAB를 'CA03-8253P'로 명명하고 KCCM 11501P 으로 20013년 12월 13일에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하였다(수탁번호 KCCM 11501P).

실시예4 . KCCM -10132 기반 파지 수용체 불활성화 균주 제작 및 쓰레오닌 생산능 비교

4-1. KCCM -10132 기반 phage receptor 불활성화 균주 제작

실시예 1과 실시예 3과 같은 방법으로 실시예 1에서 제작된 7종의 불활성화 카세트를 이용하여 동일하게 KCCM-10132 균주를 기반으로 하여, 파지 수용체 불활성화 균주 10종을 제작하였다(표 4). KCCM-10132 균주는 한국등록특허제10-0270510호에 기술된 균주로 대장균 유래 쓰레오닌 생산능이 부여된 균주이다.

4-2. KCCM -10132 기반 phage receptor 불활성화 균주 제작 쓰레오닌 생산능 비교

실시예 2에 기술된 방법으로 표 1의 배지를 이용하여 실시예 4-1에서 제작된 KCCM-10132기반 파지 수용체 불활성화 균주 10종과 모균주 KCCM-10132의 쓰레오닌 생산능을 비교 평가 진행하였다.

균주	사용당 (g/L)	L-쓰레오닌 (g/L)
균주	30hr	48hr
KCCM-10132 (모균주)	32	20.2
KCCM-10132 ΔnfrA	35	20.2
KCCM-10132 ΔnfrB	35	20.1
KCCM-10132 ΔnfrAB	36	20.2
KCCM-10132 Δtsx	35	20.2
KCCM-10132 ΔfhuA	36	20.1
KCCM-10132 ΔlamB	31	20.2
KCCM-10132 ΔbtuB	30	20.1
KCCM-10132 ΔnfrAB ΔfhuA	38	20.2
KCCM-10132 ΔnfrAB Δtsx	38	20.1
KCCM-10132 ΔnfrAB Δtsx ΔfhuA	39	20.2

표 4에 기재된 바와 같이 nfrA, nfrB, nfrAB, tsx, fhuA 불활성화 균주는 모균주인 KCCM-10132 대비 당소모 속도가 향상되면서 48hr 수율이 떨어지지 않는 것을 확인하였다. 반면, lamB와 btuB 불활성화 균주는 모균주 대비 당소모 속도가 유사하거나 소폭 지연되었고 48시간 배양시 쓰레오닌 농도는 유사한 것을 확인하였다. 또한 nfrAB, fhuA와 nfrAB, tsx 동시 불활성화 균주, nfrAB, tsx, fhuA 동시 불활성화주는 nfrAB 단독 불활성화주 대비 당소모 속도가 개선되는 것으로 확인되었다.

실시예 5. KCCM11166P 기반 파지 수용체 불활성화 균주 제작 및 트립토판 생산능 비교

5-1. KCCM11166P 기반 phage receptor 불활성화 균주 제작

실시예 1에서 제작된 7종의 불활성화 카세트를 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 KCCM11166P (대한민국 등록특허 10-1261147)을 기반으로 하여 파지 수용체가 불활성화된 트립토판 생산 균주 7종을 제작하였다.

5-2. KCCM11166P 기반 phage receptor 불활성화 균주 제작 트립토판 생산능 비교

실시예 5-1에서 제작된 KCCM11166P 기반 파지 수용체가 불활성화된 트립토판 생산 균주 7종의 생산능을 평가하기 위해 표 5의 배지를 이용하여 진행하였다. 이를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 표 5에서와 같은 조성을 갖는 25ml의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 표 6에 나타내었다.

조성물	농도 (리터당)
포도당	60 g
K₂HPO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	10 g
MgSO₄·7H₂O	1 g
NaCl	1 g
구연산나트륨	5 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	40 g
페닐알라닌	0.15 g
타이로신	0.1 g
pH	6.8

균주	사용당 (g/L)	OD	L-트립토판 (g/L)
균주	33hr	48hr
KCCM11166P	56.8	14.0	7.2
KCCM11166P ΔnfrA	59.5	13.5	7.2
KCCM11166P ΔnfrB	59.5	13.5	7.2
KCCM11166P ΔnfrAB	59.5	13.5	7.2
KCCM11166P Δtsx	60.2	14.3	7.1
KCCM11166P ΔfhuA	59.5	13.7	7.1
KCCM11166P ΔlamB	57.0	14.0	7.2
KCCM11166P ΔbtuB	56.2	13.0	7.1

표 6에서 나타내는 바와 같이 nfrA, nfrB, nfrAB, tsx, fhuA의 결실의 경우 균주의 트립토판 생산량은 유사하고 당소모 속도가 증가한 것을 확인할 수 있다. 반면 lamb, btuB의 경우에는 트립토판 생산량이나 당소모 속도의 변화가 보이지 않았다.

실시예6. 유효 변이 조합 균주 제작 및 L-트립토판 생산능 비교

6-1. nfrAB , fhuA 동시 불활성화, nfrAB , tsx 동시 불활성화 및 nfrAB , tsx , fhuA 동시 불활성화된 L-트립토판 생산 균주 제작

당 소모능이 증가된 nfrAB, fhuA, tsx의 불활성화 특징을 조합한 경우의 당 소모능 추가 향상 여부를 트립토판 생산 균주에서 확인하기 위하여 KCCM11166PΔnfrABΔfhuA와 KCCM11166PΔnfrABΔtsx, KCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuA를 제작하였다.

6-2. 유효 변이 조합 균주의 L-트립토판 생산능 비교

상기 6-1에서 제작된 3종 균주의 L-트립토판 생산능을 비교하기 위하여 표 5의 배지를 이용하여 실시예 5에 기술된 방법과 동일하게 배양을 진행하였으며, 그 결과는 다음 표7과 같다.

균주	사용당 (g/L)	OD	L-트립토판 (g/L)
균주	33hr	48hr
KCCM11166P	56.8	14.0	7.2
KCCM11166P ΔnfrAB	59.5	13.5	7.2
KCCM11166P ΔnfrAB Δtsx	61.0	14.0	7.2
KCCM11166P ΔnfrAB ΔfhuA	60.5	13.8	7.1
KCCM11166P ΔnfrAB Δtsx ΔfhuA	62.0	14.0	7.2

제작된 유효 변이 조합 트립토판 생산 균주들의 역가 평가 결과, nfrAB 단독 변이에 fhuA와 tsx를 추가 불활성화시켰을 때 nfrAB 단독 변이 대비 당소모능이 증가함을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기술한 실시예 및 실험예 들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11501P

20131213

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganisms producing L-amino acids and process for producing <130> PN104120 <160> 51 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating nfrA <400> 1 atgaaggaga ataaccttaa tcgcgtcatc ggatggtctg gtttactgct gacgtcttta 60 ttgagtacca 70 <210> 2 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating nfrA <400> 2 gacgtcttta ttgagtacca gcgcactcgc agacaatatc ggcaccagcg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating nfrA <400> 3 aaccgttcgg gtgccattcg tcgctgtatt tgccgccatt aaagaatgag tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating nfrA <400> 4 gcggatatat tgcgccgcat cgaggtacag gttttgggca aaccagcctg aaccgttcgg 60 gtgccattcg 70 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating nfrA <400> 5 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating fhuA <400> 25 cttcaggaac gctcagattg c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating fhuA <400> 26 cggaatgatt cgtgtattcc t 21 <210> 27 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 27 acgaccgaag ctgccgccgt tgaaatcagc aggaacggct ttgccgaagt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 28 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 28 gtaatgtctg ctcaggcaat ggctgttgat ttccacggct atgcacgttc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 29 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 29 ttaccaccag atttccatct gggcaccgaa ggtccactcg tcgctgtcgc cacgaccgaa 60 gctgccgccg t 71 <210> 30 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 30 atgatgatta ctctgcgcaa acttcctctg gcggttgccg tcgcagcggg cgtaatgtct 60 gctcaggcaa t 71 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 31 cctacatttg acagccgttg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating lamB <400> 32 cacacaaagc ctgtcacagg 20 <210> 33 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 33 gtggttcaga aggtgtagct gccagacaag gtgtattccc gtcctgcagt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 34 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 34 gcccggatac tctcgtcgtt actgctaacc gttttgaaca gccgcgcagc taggtgacac 60 tatagaacgc 70 <210> 35 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 35 gactccggcg tcggtgggtt gtcggtctat aaacaccagc acggtgggac gtggttcaga 60 aggtgtagct 70 <210> 36 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 36 gctgacggcg tgttccgtca cggcattttc cgcttgggca caggatacca gcccggatac 60 tctcgtcgtt 70 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 37 atctggttct catcatcg 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for inactivating btuB <400> 38 gcataaatgt aatggagatc 20 <210> 39 <211> 2973 <212> DNA <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(2973) <223> nfrA <400> 39 atgaaggaga ataaccttaa tcgcgtcatc ggatggtctg gtttactgct gacgtcttta 60 ttgagtacca gcgcactcgc agacaatatc ggcaccagcg cagaagagct ggggctgagc 120 gattatcgcc attttgttat ttatccccgt ctcgataaag cgctgaaggc acagaaaaat 180 aacgacgaag caaccgccat ccgcgaattt gaatatatac accagcaggt gccggataat 240 attccgctga ctttatacct tgcggaagcc tatcgccatt ttggtcatga tgaccgggcg 300 cggctgttgc ttgaggatca actgaaacgt cacccaggag atgcccgact tgagcgcagt 360 ctggcggcta ttccggttga agtgaaaagc gttacgacag ttgaagaact gcttgcccag 420 caaaaagcgt gcgatgctgc gccgaccctg cgttgtcgca gtgaagtcgg gcagaatgcc 480 ctgcggctgg cacagttacc tgtcgccaga gcgcaactga acgatgcgac gtttgctgca 540 tcgccggaag gaaaaacgct gcgaaccgat ctgctgcaac gggcaatcta cctgaaacaa 600 tggtcccagg cagatacgct atacaatgaa gcacgccagc agaacacatt aagcgcggca 660 gaacgccgtc agtggtttga cgtgcttctt gccgggcagc tggacgatcg gatcctggca 720 ctgcaatcac aggggatctt caccgatcct cagtcatata ttacttacgc gaccgcgctg 780 gcttatcgtg gcgaaaaagc acgcctccag cattatctca ttgaaaataa gccactattt 840 accacggacg cacaagagaa aagttggctc tatctgttat ctaaatacag cgctaacccc 900 gttcaggcgt tggcgaatta tacggtacag tttgccgaca accgccagta tgttgttggc 960 gcgacgctac cggtgctgtt aaaagaaggt cagtacgacg cagcgcaaaa actgctcgcc 1020 accctccccg ccaatgaaat gcttgaggag cgttatgctg tcagcgtggc gacccgtaac 1080 aaggctgaag ctctgcgtct ggcacgattg ctgtatcagc aagaaccggc aaatcttacc 1140 cgcctggatc aactaacctg gcaactgatg cagaacgagc agtcacgcga agctgccgat 1200 ttattgctgc aacgctatcc tttccagggc gatgcgcgtg tcagccagac tttaatggcg 1260 cgactggcgt ctctgctgga aagtcatcct tacctggcaa cgccggcgaa ggtggcgatt 1320 ttatcgaaac ccttaccgct ggcggagcaa cgtcagtggc aaagtcagtt gccgggtatt 1380 gcagataatt gcccggcaat agttcgcttg ctgggcgata tgtcgccttc ctacgatgcc 1440 gccgcctgga accgtctggc aaagtgttat cgggacacgc tacccggtgt ggcgttgtat 1500 gcatggcttc aggccgaaca acgacaaccg agcgcctggc aacatcgtgc ggtagcctat 1560 caggcgtatc aggttgagga ctacgccacc gcactggcgg cctggcagaa aatcagtctt 1620 cacgacatga gcaatgagga tctgcttgct gctgccaata ccgcccaggc ggcaggaaat 1680 ggtgcggctc gcgatcgctg gctacaacag gcagaaaaac gtggactggg aagcaatgcc 1740 ctctactggt ggctgcatgc gcaacgttac attcctggtc agccggaact cgcactgaac 1800 gatctcacgc gctcaatcaa tattgcgcct tctgccaacg cttacgttgc gcgggcgaca 1860 atttatcgcc aacgtcataa tgtcccggcc gcggtgagtg atttgcgcgc cgcgctggaa 1920 ctggaaccga ataatagcaa cacccaggca gcgcttggtt acgccttgtg ggatagcggt 1980 gatatcgcac agtcgcggga aatgctcgaa ccggcgcata aagggcttcc ggacgatccg 2040 gcactgatcc gacaactggc ctacgtgaac cagcgtctgg atgacatgcc tgcgacgcag 2100 cactacgccc ggctggtgat tgatgacatt gataatcagg cgctgataac cccactgacc 2160 ccagaacaaa atcaacaacg cttcaatttc cgccgtttgc atgaggaggt cggtcgccgc 2220 tggacgttca gtttcgattc ttccatcggc ttgcgttccg gcgcaatgag taccgctaac 2280 aataatgtcg gcggcgcagc gccagggaaa agctatcgta gctacggaca actggaagcc 2340 gagtaccgca tcggacgcaa tatgctgctg gaaggcgacc tgctctcagt ttatagccgc 2400 gtctttgccg ataccggaga aaacggggtg atgatgccgg tgaaaaatcc gatgtccggc 2460 accggtctgc gctggaagcc gctgcgcgat cagatctttt tcatcgccgt cgaacagcag 2520 ttgccgctga acggccaaaa tggcgcatcc gataccatgc tgcgcgccag cgcctcattc 2580 tttaatggcg gcaaatacag cgacgaatgg cacccgaacg gttcaggctg gtttgcccaa 2640 aacctgtacc tcgatgcggc gcaatatatc cgccaggata ttcaggcgtg gacggcagat 2700 tatcgcgtca gctggcatca gaaggtagct aacggacaga ctattgagcc ttacgctcac 2760 gttcaggaca acggctatcg tgataaaggc actcagggcg cgcagcttgg cggagtcggg 2820 gtccgctgga atatctggac cggcgagacg cactacgacg cctggccgca caaagtcagt 2880 ctcggcgtcg agtatcaaca tacctttaag gcgattaatc aacgtaacgg agagcgcaac 2940 aacgcgtttc tcaccattgg agtgcactgg taa 2973 <210> 40 <211> 990 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr.W3110 <400> 40 Met Lys Glu Asn Asn Leu Asn Arg Val Ile Gly Trp Ser Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ser Ala Leu Ala Asp Asn Ile Gly Thr 20 25 30 Ser Ala Glu Glu Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Arg His Phe Val Ile Tyr 35 40 45 Pro Arg Leu Asp Lys Ala Leu Lys Ala Gln Lys Asn Asn Asp Glu Ala 50 55 60 Thr Ala Ile Arg Glu Phe Glu Tyr Ile His Gln Gln Val Pro Asp Asn 65 70 75 80 Ile Pro Leu Thr Leu Tyr Leu Ala Glu Ala Tyr Arg His Phe Gly His 85 90 95 Asp Asp Arg Ala Arg Leu Leu Leu Glu Asp Gln Leu Lys Arg His Pro 100 105 110 Gly Asp Ala Arg Leu Glu Arg Ser Leu Ala Ala Ile Pro Val Glu Val 115 120 125 Lys Ser Val Thr Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Gln Gln Lys Ala Cys 130 135 140 Asp Ala Ala Pro Thr Leu Arg Cys Arg Ser Glu Val Gly Gln Asn Ala 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ala Gln Leu Pro Val Ala Arg Ala Gln Leu Asn Asp Ala 165 170 175 Thr Phe Ala Ala Ser Pro Glu Gly Lys Thr Leu Arg Thr Asp Leu Leu 180 185 190 Gln Arg Ala Ile Tyr Leu Lys Gln Trp Ser Gln Ala Asp Thr Leu Tyr 195 200 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ctggacgatt tttttattga tgtcgtctac 120 tgggtacgcc gcattaaacg caagttgagt gtttatcgcc gctacccgcg aatgagttac 180 cgcgaactgt ataaaccaga tgaaaaaccg ttagcgatta tggttccggc gtggaatgaa 240 acgggcgtca tcggcaatat ggccgagctg gcggcgacca cgctcgacta cgaaaactat 300 catatctttg ttggcaccta ccccaacgac cccgatactc agcgtgatgt tgacgaagtg 360 tgcgctcgct tcccgaatgt gcataaggta gtctgcgcgc gtcctggccc caccagcaaa 420 gccgactgtc tgaacaacgt gctggacgcc atcacccaat ttgagcgtag cgccaatttc 480 gcttttgctg gttttattct gcatgacgcc gaagatgtga tttcaccgat ggaattgcgt 540 ctgttcaact atctggtcga gcgtaaagat ctgattcaga tcccggtgta tccgttcgaa 600 cgcgaatgga cgcacttcac cagcatgact tacattgatg agttttcaga gctgcatggc 660 aaagatgttc cggtgcgtga agccctcgcc ggacaagtgc ccagcgcagg cgtcggcacc 720 tgtttcagcc gccgcgccgt gaccgcactg ttagctgacg gtgacggtat tgctttcgac 780 gtgcagagtc ttactgaaga ttacgacatt ggcttccgcc tgaaagaaaa aggtatgacg 840 gaaatttttg tccgttttcc ggtggtggac gaagccaaag aacgcgagca gcgtaaattt 900 ttacagcacg cgcggacatc aaacatgatc tgcgtgcgcg aatatttccc cgataccttt 960 tcgactgcgg ttcgacaaaa atcccgctgg atcatcggca ttgttttcca aggctttaaa 1020 acccataaat ggacctccag cctgacgctg aactactttc tctggcgcga ccgcaaaggg 1080 gcaatcagta actttgtcag cttcctcgcg atgctggtga tgatccagct tttgctgttg 1140 ctggcgtatg aaagtttgtg gcccgatgcc tggcatttcc tttctatttt cagcggcagc 1200 gcatggttaa tgaccctgct gtggctaaac tttggtttga tggttaaccg catcgtgcag 1260 cgggtgattt tcgttactgg ctactacggc ctgacgcagg ggctgctttc cgtcctgcgt 1320 cttttctggg gcaacctgat taacttcatg gccaactggc gcgcgctaaa acaggtactt 1380 caacacggcg atccacgtcg cgtggcgtgg gataaaacaa cgcatgactt ccccagcgtg 1440 actggcgata cccgctcgtt gcgcccgtta ggtcaaattc tgctggaaaa tcaggtcatc 1500 actgaagaac aactcgatac agcactgcgt aatcgcgtcg aaggtctacg cctgggcggt 1560 tcaatgctga tgcaggggct gattagcgcc gagcagctgg cacaggcgct ggcagagcaa 1620 aacggcgtgg cgtgggaatc catcgatgcc tggcagatcc cttcctcgct gattgccgaa 1680 atgccggcct ccgtggcgct gcattatgcg gtactgccgc tgcgtctgga aaatgacgag 1740 ttaattgtcg gcagtgaaga tggtattgac ccggtttcgc tggcggccct gacgcgtaaa 1800 gtcggacgca aagtgcgtta cgtcattgtt ctgcggggac aaattgtcac agggttacgt 1860 cactggtatg cacgccgacg cggtcacgat ccgcgggcaa tgttgtacaa tgcggttcag 1920 catcagtggc tcacggaaca gcaggccggt gaaatctggc ggcaatatgt gccgcatcag 1980 ttcctgttcg ccgaaatact gaccacgctc ggtcatatta atcgttcagc aattaacgtg 2040 ttgttattgc gccatgaacg cagttctctg ccgctcggca agtttttggt caccgaaggc 2100 gttatcagcc aggaaacgtt ggatcgcgtc ctgacaattc aacgcgaatt acaagtttcg 2160 atgcaatcac tattactcaa agcaggttta aacacagaac aggttgcgca actggagtcc 2220 gaaaatgaag gagaataa 2238 <210> 42 <211> 745 <212> PRT <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <400> 42 Met Asp Trp Leu Leu Asp Val Phe Ala Thr Trp Leu Tyr Gly Leu Lys 1 5 10 15 Val Ile Ala Ile Thr Leu Ala Val Ile Met Phe Ile Ser Gly Leu Asp 20 25 30 Asp Phe Phe Ile Asp Val Val Tyr Trp Val Arg Arg Ile Lys Arg Lys 35 40 45 Leu Ser Val Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Met Ser Tyr Arg Glu Leu Tyr 50 55 60 Lys Pro Asp Glu Lys Pro Leu Ala Ile Met Val Pro Ala Trp Asn Glu 65 70 75 80 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Val Ile Thr Glu Glu Gln Leu Asp Thr Ala Leu Arg Asn Arg 500 505 510 Val Glu Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Met Leu Met Gln Gly Leu Ile 515 520 525 Ser Ala Glu Gln Leu Ala Gln Ala Leu Ala Glu Gln Asn Gly Val Ala 530 535 540 Trp Glu Ser Ile Asp Ala Trp Gln Ile Pro Ser Ser Leu Ile Ala Glu 545 550 555 560 Met Pro Ala Ser Val Ala Leu His Tyr Ala Val Leu Pro Leu Arg Leu 565 570 575 Glu Asn Asp Glu Leu Ile Val Gly Ser Glu Asp Gly Ile Asp Pro Val 580 585 590 Ser Leu Ala Ala Leu Thr Arg Lys Val Gly Arg Lys Val Arg Tyr Val 595 600 605 Ile Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Thr Gly Leu Arg His Trp Tyr Ala 610 615 620 Arg Arg Arg Gly His Asp Pro Arg Ala Met Leu Tyr Asn Ala Val Gln 625 630 635 640 His Gln Trp Leu Thr Glu Gln Gln Ala Gly Glu Ile Trp Arg Gln Tyr 645 650 655 Val Pro His Gln Phe Leu Phe Ala Glu Ile Leu Thr Thr Leu Gly His 660 665 670 Ile Asn Arg Ser Ala Ile Asn Val Leu Leu Leu Arg His Glu Arg Ser 675 680 685 Ser Leu Pro Leu Gly Lys Phe Leu Val Thr Glu Gly Val Ile Ser Gln 690 695 700 Glu Thr Leu Asp Arg Val Leu Thr Ile Gln Arg Glu Leu Gln Val Ser 705 710 715 720 Met Gln Ser Leu Leu Leu Lys Ala Gly Leu Asn Thr Glu Gln Val Ala 725 730 735 Gln Leu Glu Ser Glu Asn Glu Gly Glu 740 745 <210> 43 <211> 6088 <212> DNA <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(6088) <223> nfrAB <400> 43 gtggactggc ttcttgatgt ttttgctacc tggctctacg gcttaaaagt aatcgcgata 60 acgttagcgg tcatcatgtt catcagcggg ctggacgatt tttttattga tgtcgtctac 120 tgggtacgcc gcattaaacg caagttgagt gtttatcgcc gctacccgcg aatgagttac 180 cgcgaactgt ataaaccaga tgaaaaaccg ttagcgatta tggttccggc gtggaatgaa 240 acgggcgtca tcggcaatat ggccgagctg gcggcgacca cgctcgacta cgaaaactat 300 catatctttg ttggcaccta ccccaacgac cccgatactc agcgtgatgt tgacgaagtg 360 tgcgctcgct tcccgaatgt gcataaggta gtctgcgcgc gtcctggccc caccagcaaa 420 gccgactgtc tgaacaacgt gctggacgcc atcacccaat ttgagcgtag cgccaatttc 480 gcttttgctg gttttattct gcatgacgcc gaagatgtga tttcaccgat ggaattgcgt 540 ctgttcaact atctggtcga gcgtaaagat ctgattcaga tcccggtgta tccgttcgaa 600 cgcgaatgga cgcacttcac cagcatgact tacattgatg agttttcaga gctgcatggc 660 aaagatgttc cggtgcgtga agccctcgcc ggacaagtgc ccagcgcagg cgtcggcacc 720 tgtttcagcc gccgcgccgt gaccgcactg ttagctgacg gtgacggtat tgctttcgac 780 gtgcagagtc ttactgaaga ttacgacatt ggcttccgcc tgaaagaaaa aggtatgacg 840 gaaatttttg tccgttttcc ggtggtggac gaagccaaag aacgcgagca gcgtaaattt 900 ttacagcacg cgcggacatc aaacatgatc tgcgtgcgcg aatatttccc cgataccttt 960 tcgactgcgg ttcgacaaaa atcccgctgg atcatcggca ttgttttcca aggctttaaa 1020 acccataaat ggacctccag cctgacgctg aactactttc tctggcgcga ccgcaaaggg 1080 gcaatcagta actttgtcag cttcctcgcg atgctggtga tgatccagct tttgctgttg 1140 ctggcgtatg aaagtttgtg gcccgatgcc tggcatttcc tttctatttt cagcggcagc 1200 gcatggttaa tgaccctgct gtggctaaac tttggtttga tggttaaccg catcgtgcag 1260 cgggtgattt tcgttactgg ctactacggc ctgacgcagg ggctgctttc cgtcctgcgt 1320 cttttctggg gcaacctgat taacttcatg gccaactggc gcgcgctaaa acaggtactt 1380 caacacggcg atccacgtcg cgtggcgtgg gataaaacaa cgcatgactt ccccagcgtg 1440 actggcgata cccgctcgtt gcgcccgtta ggtcaaattc tgctggaaaa tcaggtcatc 1500 actgaagaac aactcgatac agcactgcgt aatcgcgtcg aaggtctacg cctgggcggt 1560 tcaatgctga tgcaggggct gattagcgcc gagcagctgg cacaggcgct ggcagagcaa 1620 aacggcgtgg cgtgggaatc catcgatgcc tggcagatcc cttcctcgct gattgccgaa 1680 atgccggcct ccgtggcgct gcattatgcg gtactgccgc tgcgtctgga aaatgacgag 1740 ttaattgtcg gcagtgaaga tggtattgac ccggtttcgc tggcggccct gacgcgtaaa 1800 gtcggacgca aagtgcgtta cgtcattgtt ctgcggggac aaattgtcac agggttacgt 1860 cactggtatg cacgccgacg cggtcacgat ccgcgggcaa tgttgtacaa tgcggttcag 1920 catcagtggc tcacggaaca gcaggccggt gaaatctggc ggcaatatgt gccgcatcag 1980 ttcctgttcg ccgaaatact gaccacgctc ggtcatatta atcgttcagc aattaacgtg 2040 ttgttattgc gccatgaacg cagttctctg ccgctcggca agtttttggt caccgaaggc 2100 gttatcagcc aggaaacgtt ggatcgcgtc ctgacaattc aacgcgaatt acaagtttcg 2160 atgcaatcac tattactcaa agcaggttta aacacagaac aggttgcgca actggagtcc 2220 gaaaatgaag gagaataacc ttaatcgcgt catcggatgg tctggtttac tgctgacgtc 2280 tttattgagt accagcgcac tcgcagacaa tatcggcacc agcgcagaag agctggggct 2340 gagcgattat cgccattttg ttatttatcc ccgtctcgat aaagcgctga aggcacagaa 2400 aaataacgac gaagcaaccg ccatccgcga atttgaatat atacaccagc aggtgccgga 2460 taatattccg ctgactttat accttgcgga agcctatcgc cattttggtc atgatgaccg 2520 ggcgcggctg ttgcttgagg atcaactgaa acgtcaccca ggagatgccc gacttgagcg 2580 cagtctggcg gctattccgg ttgaagtgaa aagcgttacg acagttgaag aactgcttgc 2640 ccagcaaaaa gcgtgcgatg ctgcgccgac cctgcgttgt cgcagtgaag tcgggcagaa 2700 tgccctgcgg ctggcacagt tacctgtcgc cagagcgcaa ctgaacgatg cgacgtttgc 2760 tgcatcgccg gaaggaaaaa cgctgcgaac cgatctgctg caacgggcaa tctacctgaa 2820 acaatggtcc caggcagata cgctatacaa tgaagcacgc cagcagaaca cattaagcgc 2880 ggcagaacgc cgtcagtggt ttgacgtgct tcttgccggg cagctggacg atcggatcct 2940 ggcactgcaa tcacagggga tcttcaccga tcctcagtca tatattactt acgcgaccgc 3000 gctggcttat cgtggcgaaa aagcacgcct ccagcattat ctcattgaaa ataagccact 3060 atttaccacg gacgcacaag agaaaagttg gctctatctg ttatctaaat acagcgctaa 3120 ccccgttcag gcgttggcga attatacggt acagtttgcc gacaaccgcc agtatgttgt 3180 tggcgcgacg ctaccggtgc tgttaaaaga aggtcagtac gacgcagcgc aaaaactgct 3240 cgccaccctc cccgccaatg aaatgcttga ggagcgttat gctgtcagcg tggcgacccg 3300 taacaaggct gaagctctgc gtctggcacg attgctgtat cagcaagaac cggcaaatct 3360 tacccgcctg gatcaactaa cctggcaact gatgcagaac gagcagtcac gcgaagctgc 3420 cgatttattg ctgcaacgct atcctttcca gggcgatgcg cgtgtcagcc agactttaat 3480 ggcgcgactg gcgtctctgc tggaaagtca tccttacctg gcaacgccgg cgaaggtggc 3540 gattttatcg aaacccttac cgctggcgga gcaacgtcag tggcaaagtc agttgccggg 3600 tattgcagat aattgcccgg caatagttcg cttgctgggc gatatgtcgc cttcctacga 3660 tgccgccgcc tggaaccgtc tggcaaagtg ttatcgggac acgctacccg gtgtggcgtt 3720 gtatgcatgg cttcaggccg aacaacgaca accgagcgcc tggcaacatc gtgcggtagc 3780 ctatcaggcg tatcaggttg aggactacgc caccgcactg gcggcctggc agaaaatcag 3840 tcttcacgac atgagcaatg aggatctgct tgctgctgcc aataccgccc aggcggcagg 3900 aaatggtgcg gctcgcgatc gctggctaca acaggcagaa aaacgtggac tgggaagcaa 3960 tgccctctac tggtggctgc atgcgcaacg ttacattcct ggtcagccgg aactcgcact 4020 gaacgatctc acgcgctcaa tcaatattgc gccttctgcc aacgcttacg ttgcgcgggc 4080 gacaatttat cgccaacgtc ataatgtccc ggccgcggtg agtgatttgc gcgccgcgct 4140 ggaactggaa ccgaataata gcaacaccca ggcagcgctt ggttacgcct tgtgggatag 4200 cggtgatatc gcacagtcgc gggaaatgct cgaaccggcg cataaagggc ttccggacga 4260 tccggcactg atccgacaac tggcctacgt gaaccagcgt ctggatgaca tgcctgcgac 4320 gcagcactac gcccggctgg tgattgatga cattgataat caggcgctga taaccccact 4380 gaccccagaa caaaatcaac aacgcttcaa tttccgccgt ttgcatgagg aggtcggtcg 4440 ccgctggacg ttcagtttcg attcttccat cggcttgcgt tccggcgcaa tgagtaccgc 4500 taacaataat gtcggcggcg cagcgccagg gaaaagctat cgtagctacg gacaactgga 4560 agccgagtac cgcatcggac gcaatatgct gctggaaggc gacctgctct cagtttatag 4620 ccgcgtcttt gccgataccg gagaaaacgg ggtgatgatg ccggtgaaaa atccgatgtc 4680 cggcaccggt ctgcgctgga agccgctgcg cgatcagatc tttttcatcg ccgtcgaaca 4740 gcagttgccg ctgaacggcc aaaatggcgc atccgatacc atgctgcgcg ccagcgcctc 4800 attctttaat ggcggcaaat acagcgacga atggcacccg aacggttcag gctggtttgc 4860 ccaaaacctg tacctcgatg cggcgcaata tatccgccag gatattcagg cgtggacggc 4920 agattatcgc gtcagctggc atcagaaggt agctaacgga cagactattg agccttacgc 4980 tcacgttcag gacaacggct atcgtgataa aggcactcag ggcgcgcagc ttggcggagt 5040 cggggtccgc tggaatatct ggaccggcga gacgcactac gacgcctggc cgcacaaagt 5100 cagtctcggc gtcgagtatc aacatacctt taaggcgatt aatcaacgta acggagagcg 5160 caacaacgcg tttctcacca ttggagtgca ctggtaaatg cgtaagttca ttttcgtatt 5220 gctgacactg cttttggtca gccctttttc ctttgcgatg aaaggtatta tctggcaacc 5280 acaaaaccga gatagtcagg ttaccgatac ccagtggcag gggctgatga gtcagttacg 5340 tttgcaaggc ttcgataccc ttgttttgca atggacccgt tacggcgatg catttaccca 5400 gccagaacag cgcacgttat tgtttaagcg ggccgcagct gcgcaacagg ctggtctgaa 5460 gcttattgtc gggctgaacg ccgatccgga attttttatg caccagaaac agtcgtccgc 5520 agcgctggaa agctatctta atcgcctgct ggctgccgat ctccagcaag ccagattatg 5580 gagcgccgcg cctggcataa cgccggatgg ctggtacatc agcgcggaaa ttgacgacct 5640 gaactggcgc agcgaagccg cccgtcagcc tttgctaaca tggttaaaca acgcgcagcg 5700 gctgattagc gatgtttcag caaaaccggt ttatatcagt agttttttcg ccggaaacat 5760 gtcgcccgat ggctatcgcc aactgctgga acacgttaaa gcaaccggcg ttaatgtctg 5820 ggtacaggat ggcagcggcg tggataaact gaccgctgaa cagcgtgaac gttatttaca 5880 ggccagcgcc gattgccaaa gtcccgcccc tgccagcggc gttgtttatg aactttttgt 5940 cgccggcaaa ggcaaaacct ttacagcgaa accgaaaccg gacgcagaaa ttgcctcgct 6000 gttagcgaaa cgttcctctt gcggtaaaga cactctctat ttctctctgc gctatttgcc 6060 cgtcgcgcac ggcattctcg agtattaa 6088 <210> 44 <211> 885 <212> DNA <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(885) <223> tsx <400> 44 atgaaaaaaa cattactggc agccggtgcg gtactggcgc tctcttcgtc ttttactgtc 60 aacgcagctg aaaacgacaa accgcagtat ctttccgact ggtggcacca gagcgttaac 120 gttgtcggaa gctatcacac ccgtttcgga ccgcagatcc gcaacgatac ctaccttgag 180 tacgaagcat tcgctaaaaa agactggttc gacttctatg gttatgcgga tgcgccggta 240 ttcttcggcg gtaactccga tgctaaaggt atctggaacc acggttctcc gctgtttatg 300 gaaatcgaac cacgtttctc catcgacaag ctgaccaata ctgaccttag cttcggtccg 360 ttcaaagagt ggtacttcgc gaacaactac atttacgaca tgggtcgtaa taaagatggt 420 cgccagagca cctggtacat gggtctgggt accgatatcg acactggcct gccgatgagc 480 ctgtccatga acgtctatgc gaaataccag tggcagaact atggcgcagc gaacgaaaac 540 gagtgggacg gttaccgttt caaaattaaa tactttgtgc cgattaccga tctgtggggc 600 ggtcagctga gctacatcgg cttcaccaac ttcgactggg gttccgattt aggggatgac 660 agcggtaacg caatcaacgg tattaagacc cgtactaata actctatcgc ttccagccat 720 attctggctc tgaactacga tcactggcac tactctgtcg tagctcgtta ctggcacgac 780 ggtggtcagt ggaacgacga tgcagaactg aacttcggca acggcaactt caacgttcgc 840 tctaccggct ggggtggtta cctggtagta ggttacaact tctga 885 <210> 45 <211> 294 <212> PRT <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <400> 45 Met Lys Lys Thr Leu Leu Ala Ala Gly Ala Val Leu Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 Ser Phe Thr Val Asn Ala Ala Glu Asn Asp Lys Pro Gln Tyr Leu Ser 20 25 30 Asp Trp Trp His Gln Ser Val Asn Val Val Gly Ser Tyr His Thr Arg 35 40 45 Phe Gly Pro Gln Ile Arg Asn Asp Thr Tyr Leu Glu Tyr Glu Ala Phe 50 55 60 Ala Lys Lys Asp Trp Phe Asp Phe Tyr Gly Tyr Ala Asp Ala Pro Val 65 70 75 80 Phe Phe Gly Gly Asn Ser Asp Ala Lys Gly Ile Trp Asn His Gly Ser 85 90 95 Pro Leu Phe Met Glu Ile Glu Pro Arg Phe Ser Ile Asp Lys Leu Thr 100 105 110 Asn Thr Asp Leu Ser Phe Gly Pro Phe Lys Glu Trp Tyr Phe Ala Asn 115 120 125 Asn Tyr Ile Tyr Asp Met Gly Arg Asn Lys Asp Gly Arg Gln Ser Thr 130 135 140 Trp Tyr Met Gly Leu Gly Thr Asp Ile Asp Thr Gly Leu Pro Met Ser 145 150 155 160 Leu Ser Met Asn Val Tyr Ala Lys Tyr Gln Trp Gln Asn Tyr Gly Ala 165 170 175 Ala Asn Glu Asn Glu Trp Asp Gly Tyr Arg Phe Lys Ile Lys Tyr Phe 180 185 190 Val Pro Ile Thr Asp Leu Trp Gly Gly Gln Leu Ser Tyr Ile Gly Phe 195 200 205 Thr Asn Phe Asp Trp Gly Ser Asp Leu Gly Asp Asp Ser Gly Asn Ala 210 215 220 Ile Asn Gly Ile Lys Thr Arg Thr Asn Asn Ser Ile Ala Ser Ser His 225 230 235 240 Ile Leu Ala Leu Asn Tyr Asp His Trp His Tyr Ser Val Val Ala Arg 245 250 255 Tyr Trp His Asp Gly Gly Gln Trp Asn Asp Asp Ala Glu Leu Asn Phe 260 265 270 Gly Asn Gly Asn Phe Asn Val Arg Ser Thr Gly Trp Gly Gly Tyr Leu 275 280 285 Val Val Gly Tyr Asn Phe 290 <210> 46 <211> 2244 <212> DNA <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(2244) <223> fhuA <400> 46 atggcgcgtt ccaaaactgc tcagccaaaa cactcactgc gtaaaatcgc agttgtagta 60 gccacagcgg ttagcggcat gtctgtttat gcacaggcag cggttgaacc gaaagaagac 120 actatcaccg ttaccgctgc acctgcgccg caagaaagcg catgggggcc tgctgcaact 180 attgcggcgc gacagtctgc taccggcact aaaaccgata cgccgattca aaaagtgcca 240 cagtctattt ctgttgtgac cgccgaagag atggcgctgc atcagccgaa gtcggtaaaa 300 gaagcgctta gctacacgcc gggtgtctct gttggtacgc gtggcgcatc caacacctat 360 gaccacctga tcattcgcgg ctttgcggca gaaggccaaa gccagaataa ctatctgaat 420 ggcctgaagt tgcagggcaa cttctataac gatgcggtca ttgacccgta tatgctggaa 480 cgcgctgaaa ttatgcgtgg cccggtttcc gtgctttacg gtaaaagcag tcctggcggc 540 ctgttgaata tggtcagcaa gcgtccgacc accgaaccgc tgaaagaagt tcagtttaaa 600 gccggtactg acagcctgtt ccagactggt tttgacttta gcgattcgtt ggatgatgac 660 ggtgtttact cttatcgcct gaccggtctt gcgcgttctg ccaatgccca gcagaaaggg 720 tcagaagagc agcgttatgc tattgcaccg gcgttcacct ggcgtccgga tgataaaacc 780 aattttacct tcctttctta cttccagaac gagccggaaa ccggttatta cggctggttg 840 ccgaaagagg gaaccgttga gccgctgccg aacggtaagc gtctgccgac agactttaat 900 gaaggggcga agaacaacac ctattctcgt aatgagaaga tggtcggcta cagcttcgat 960 cacgaattta acgacacctt tactgtgcgt cagaacctgc gctttgctga aaacaaaacc 1020 tcgcaaaaca gcgtttatgg ttacggcgtc tgctccgatc cggcgaatgc ttacagcaaa 1080 cagtgtgcgg cattagcgcc agcggataaa ggccattatc tggcacgtaa atacgtcgtt 1140 gatgatgaga agctgcaaaa cttctccgtt gatacccagt tgcagagcaa gtttgccact 1200 ggcgatatcg accacaccct gctgaccggt gtcgacttta tgcgtatgcg taatgacatc 1260 aacgcctggt ttggttacga cgactctgtg ccactgctca atctgtacaa tccggtgaat 1320 accgatttcg acttcaatgc caaagatccg gcaaactccg gcccttaccg cattctgaat 1380 aaacagaaac aaacgggcgt ttatgttcag gatcaggcgc agtgggataa agtgctggtc 1440 accctaggcg gtcgttatga ctgggcagat caagaatctc ttaaccgcgt tgccgggacg 1500 accgataaac gtgatgacaa acagtttacc tggcgtggtg gtgttaacta cctgtttgat 1560 aatggtgtaa caccttactt cagctatagc gaatcgtttg aaccttcttc gcaagttggg 1620 aaggatggta atattttcgc accgtctaaa ggtaagcagt atgaagtcgg cgtgaaatat 1680 gtaccggaag atcgtccgat tgtagttact ggtgccgtgt ataatctcac taaaaccaac 1740 aacctgatgg cggaccctga gggttccttc ttctcggttg aaggtggcga gatccgcgca 1800 cgtggcgtag aaatcgaagc gaaagcggcg ctgtcggcga gtgttaacgt agtcggttct 1860 tatacttaca ccgatgcgga atacaccacc gatactacct ataaaggcaa tacgcctgca 1920 caggtgccaa aacacatggc ttcgttgtgg gctgactaca ccttctttga cggtccgctt 1980 tcaggtctga cgctgggcac cggtggtcgt tatactggct ccagttatgg tgatccggct 2040 aactccttta aagtgggaag ttatacggtc gtggatgcgt tagtacgtta tgatctggcg 2100 cgagtcggca tggctggctc caacgtggcg ctgcatgtta acaacctgtt cgatcgtgaa 2160 tacgtcgcca gctgctttaa cacttatggc tgcttctggg gcgcagaacg tcaggtcgtt 2220 gcaaccgcaa ccttccgttt ctaa 2244 <210> 47 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli str.K-12substr.W3110 <400> 47 Met Ala Arg Ser Lys Thr Ala Gln Pro Lys His Ser Leu Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ala Val Val Val Ala Thr Ala Val Ser Gly Met Ser Val Tyr Ala Gln 20 25 30 Ala Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Thr Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Gln Glu Ser Ala Trp Gly Pro Ala Ala Thr Ile Ala Ala Arg 50 55 60 Gln Ser Ala Thr Gly Thr Lys Thr Asp Thr Pro Ile Gln Lys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ser Ile Ser Val Val Thr Ala Glu Glu Met Ala Leu His Gln Pro 85 90 95 Lys Ser Val Lys Glu Ala Leu Ser Tyr Thr Pro Gly Val Ser Val Gly 100 105 110 Thr Arg Gly Ala Ser Asn Thr Tyr Asp His Leu Ile Ile Arg Gly Phe 115 120 125 Ala Ala Glu Gly Gln Ser Gln Asn Asn Tyr Leu Asn Gly Leu Lys Leu 130 135 140 Gln Gly Asn Phe Tyr Asn Asp Ala Val Ile Asp Pro Tyr Met Leu Glu 145 150 155 160 Arg Ala Glu Ile Met Arg Gly Pro Val Ser Val Leu Tyr Gly Lys Ser 165 170 175 Ser Pro Gly Gly Leu Leu Asn Met Val Ser Lys Arg Pro Thr Thr Glu 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Val Gln Phe Lys Ala Gly Thr Asp Ser Leu Phe Gln 195 200 205 Thr Gly Phe Asp Phe Ser Asp Ser Leu Asp Asp Asp Gly Val Tyr Ser 210 215 220 Tyr Arg Leu Thr Gly Leu Ala Arg Ser Ala Asn Ala Gln Gln Lys Gly 225 230 235 240 Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Ala Ile Ala Pro Ala Phe Thr Trp Arg Pro 245 250 255 Asp Asp Lys Thr Asn Phe Thr Phe Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Glu Pro 260 265 270 Glu Thr Gly Tyr Tyr Gly Trp Leu Pro Lys Glu Gly Thr Val Glu Pro 275 280 285 Leu Pro Asn Gly Lys Arg Leu Pro Thr Asp Phe Asn Glu Gly Ala Lys 290 295 300 Asn Asn Thr Tyr Ser Arg Asn Glu Lys Met Val Gly Tyr Ser Phe Asp 305 310 315 320 His Glu Phe Asn Asp Thr Phe Thr Val Arg Gln Asn Leu Arg Phe Ala 325 330 335 Glu Asn Lys Thr Ser Gln Asn Ser Val Tyr Gly Tyr Gly Val Cys Ser 340 345 350 Asp Pro Ala Asn Ala Tyr Ser Lys Gln Cys Ala Ala Leu Ala Pro Ala 355 360 365 Asp Lys Gly His Tyr Leu Ala Arg Lys Tyr Val Val Asp Asp Glu Lys 370 375 380 Leu Gln Asn Phe Ser Val Asp Thr Gln Leu Gln Ser Lys Phe Ala Thr 385 390 395 400 Gly Asp Ile Asp His Thr Leu Leu Thr Gly Val Asp Phe Met Arg Met 405 410 415 Arg Asn Asp Ile Asn Ala Trp Phe Gly Tyr Asp Asp Ser Val Pro Leu 420 425 430 Leu Asn Leu Tyr Asn Pro Val Asn Thr Asp Phe Asp Phe Asn Ala Lys 435 440 445 Asp Pro Ala Asn Ser Gly Pro Tyr Arg Ile Leu Asn Lys Gln Lys Gln 450 455 460 Thr Gly Val Tyr Val Gln Asp Gln Ala Gln Trp Asp Lys Val Leu Val 465 470 475 480 Thr Leu Gly Gly Arg Tyr Asp Trp Ala Asp Gln Glu Ser Leu Asn Arg 485 490 495 Val Ala Gly Thr Thr Asp Lys Arg Asp Asp Lys Gln Phe Thr Trp Arg 500 505 510 Gly Gly Val Asn Tyr Leu Phe Asp Asn Gly Val Thr Pro Tyr Phe Ser 515 520 525 Tyr Ser Glu Ser Phe Glu Pro Ser Ser Gln Val Gly Lys Asp Gly Asn 530 535 540 Ile Phe Ala Pro Ser Lys Gly Lys Gln Tyr Glu Val Gly Val Lys Tyr 545 550 555 560 Val Pro Glu Asp Arg Pro Ile Val Val Thr Gly Ala Val Tyr Asn Leu 565 570 575 Thr Lys Thr Asn Asn Leu Met Ala Asp Pro Glu Gly Ser Phe Phe Ser 580 585 590 Val Glu Gly Gly Glu Ile Arg Ala Arg Gly Val Glu Ile Glu Ala Lys 595 600 605 Ala Ala Leu Ser Ala Ser Val Asn Val Val Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr 610 615 620 Asp Ala Glu Tyr Thr Thr Asp Thr Thr Tyr Lys Gly Asn Thr Pro Ala 625 630 635 640 Gln Val Pro Lys His Met Ala Ser Leu Trp Ala Asp Tyr Thr Phe Phe 645 650 655 Asp Gly Pro Leu Ser Gly Leu Thr Leu Gly Thr Gly Gly Arg Tyr Thr 660 665 670 Gly Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Ala Asn Ser Phe Lys Val Gly Ser Tyr 675 680 685 Thr Val Val Asp Ala Leu Val Arg Tyr Asp Leu Ala Arg Val Gly Met 690 695 700 Ala Gly Ser Asn Val Ala Leu His Val Asn Asn Leu Phe Asp Arg Glu 705 710 715 720 Tyr Val Ala Ser Cys Phe Asn Thr Tyr Gly Cys Phe Trp Gly Ala Glu 725 730 735 Arg Gln Val Val Ala Thr Ala Thr Phe Arg Phe 740 745 <210> 48 <211> 1341 <212> DNA <213> Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(1341) <223> lamB <400> 48 atgatgatta ctctgcgcaa acttcctctg gcggttgccg tcgcagcggg cgtaatgtct 60 gctcaggcaa tggctgttga tttccacggc tatgcacgtt ccggtattgg ttggacaggt 120 agcggcggtg aacaacagtg tttccagact accggtgctc aaagtaaata ccgtcttggc 180 aacgaatgtg aaacttatgc tgaattaaaa ttgggtcagg aagtgtggaa agagggcgat 240 aagagcttct atttcgacac taacgtggcc tattccgtcg cacaacagaa tgactgggaa 300 gctaccgatc cggccttccg tgaagcaaac gtgcagggta aaaacctgat cgaatggctg 360 ccaggctcca ccatctgggc aggtaagcgc ttctaccaac gtcatgacgt tcatatgatc 420 gacttctact actgggatat ttctggtcct ggtgccggtc tggaaaacat cgatgttggc 480 ttcggtaaac tctctctggc agcaacccgc tcctctgaag ctggtggttc ttcctctttc 540 gccagcaaca atatttatga ctataccaac gaaaccgcga acgacgtttt cgatgtgcgt 600 ttagcgcaga tggaaatcaa cccgggcggc acattagaac tgggtgtcga ctacggtcgt 660 gccaacttgc gtgataacta tcgtctggtt gatggcgcat cgaaagacgg ctggttattc 720 actgctgaac atactcagag tgtcctgaag ggctttaaca agtttgttgt tcagtacgct 780 actgactcga tgacctcgca gggtaaaggg ctgtcgcagg gttctggcgt tgcatttgat 840 aacgaaaaat ttgcctacaa tatcaacaac aacggtcaca tgctgcgtat cctcgaccac 900 ggtgcgatct ccatgggcga caactgggac atgatgtacg tgggtatgta ccaggatatc 960 aactgggata acgacaacgg caccaagtgg tggaccgtcg gtattcgccc gatgtacaag 1020 tggacgccaa tcatgagcac cgtgatggaa atcggctacg acaacgtcga atcccagcgc 1080 accggcgaca agaacaatca gtacaaaatt accctcgcac aacaatggca ggctggcgac 1140 agcatctggt cacgcccggc tattcgtgtc ttcgcaacct acgccaagtg ggatgagaaa 1200 tggggttacg actacaccgg taacgctgat aacaacgcga acttcggcaa agccgttcct 1260 gctgatttca acggcggcag cttcggtcgt ggcgacagcg acgagtggac cttcggtgcc 1320 cagatggaaa tctggtggta a 1341 <210> 49 <211> 446 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr.W3110 <400> 49 Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala 20 25 30 Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe 35 40 45 Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu 50 55 60 Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp 65 70 75 80 Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln 85 90 95 Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln 100 105 110 Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly 115 120 125 Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr 130 135 140 Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly 145 150 155 160 Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly 165 170 175 Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr 180 185 190 Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro 195 200 205 Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe 225 230 235 240 Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val 245 250 255 Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser 260 265 270 Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile 275 280 285 Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser 290 295 300 Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile 305 310 315 320 Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg 325 330 335 Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly 340 345 350 Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr 355 360 365 Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser 370 375 380 Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys 385 390 395 400 Trp Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly 405 410 415 Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp 420 425 430 Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp 435 440 445 <210> 50 <211> 1845 <212> DNA <213> Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(1845) <223> btuB <400> 50 atgattaaaa aagcttcgct gctgacggcg tgttccgtca cggcattttc cgcttgggca 60 caggatacca gcccggatac tctcgtcgtt actgctaacc gttttgaaca gccgcgcagc 120 actgtgcttg caccaaccac cgttgtgacc cgtcaggata tcgaccgctg gcagtcgacc 180 tcggtcaatg atgtgctgcg ccgtcttccg ggcgtcgata tcacccaaaa cggcggttca 240 ggtcagctct catctatttt tattcgcggt acaaatgcca gtcatgtgtt ggtgttaatt 300 gatggcgtac gcctgaatct ggcgggggtg agtggttctg ccgaccttag ccagttccct 360 attgcgcttg tccagcgtgt tgaatatatc cgtgggccgc gctccgctgt ttatggttcc 420 gatgcaatag gcggggtggt gaatatcatc acgacgcgcg atgaacccgg aacggaaatt 480 tcagcagggt ggggaagcaa tagttatcag aactatgatg tctctacgca gcaacaactg 540 ggggataaga cacgggtaac gctgttgggc gattatgccc atactcatgg ttatgatgtt 600 gttgcctatg gtaataccgg aacgcaagcg cagacagata acgatggttt tttaagtaaa 660 acgctttatg gcgcgctgga gcataacttt actgatgcct ggagcggctt tgtgcgcggc 720 tatggctatg ataaccgtac caattatgac gcgtattatt ctcccggttc accgttgctc 780 gatacccgta aactctatag ccaaagttgg gacgccgggc tgcgctataa cggcgaactg 840 attaaatcac aactcattac cagctatagc catagcaaag attacaacta cgatccccat 900 tatggtcgtt atgattcgtc ggcgacgctc gatgagatga agcaatacac cgtccagtgg 960 gcaaacaatg tcatcgttgg tcacggtagt attggtgcgg gtgtcgactg gcagaaacag 1020 actacgacgc cgggtacagg ttatgttgag gatggatatg atcaacgtaa taccggcatc 1080 tatctgaccg ggctgcaaca agtcggcgat tttacctttg aaggcgcagc acgcagtgac 1140 gataactcac agtttggtcg tcatggaacc tggcaaacca gcgccggttg ggaattcatc 1200 gaaggttatc gcttcattgc ttcctacggg acatcttata aggcaccaaa tctggggcaa 1260 ctgtatggct tctacggaaa tccgaatctg gacccggaga aaagcaaaca gtgggaaggc 1320 gcgtttgaag gcttaaccgc tggggtgaac tggcgtattt ccggatatcg taacgatgtc 1380 agtgacttga tcgattatga tgatcacacc ctgaaatatt acaacgaagg gaaagcgcgg 1440 attaagggcg tcgaggcgac cgccaatttt gataccggac cactgacgca tactgtgagt 1500 tatgattatg tcgatgcgcg caatgcgatt accgacacgc cgttgttacg ccgtgctaaa 1560 cagcaggtga aataccagct cgactggcag ttgtatgact tcgactgggg tattacttat 1620 cagtatttag gcactcgcta tgataaggat tactcatctt atccttatca aaccgttaaa 1680 atgggcggtg tgagcttgtg ggatcttgcg gttgcgtatc cggtcacctc tcacctgaca 1740 gttcgtggta aaatagccaa cctgttcgac aaagattatg agacagtcta tggctaccaa 1800 actgcaggac gggaatacac cttgtctggc agctacacct tctga 1845 <210> 51 <211> 614 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 <400> 51 Met Ile Lys Lys Ala Ser Leu Leu Thr Ala Cys Ser Val Thr Ala Phe 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala Gln Asp Thr Ser Pro Asp Thr Leu Val Val Thr Ala 20 25 30 Asn Arg Phe Glu Gln Pro Arg Ser Thr Val Leu Ala Pro Thr Thr Val 35 40 45 Val Thr Arg Gln Asp Ile Asp Arg Trp Gln Ser Thr Ser Val Asn Asp 50 55 60 Val Leu Arg Arg Leu Pro Gly Val Asp Ile Thr Gln Asn Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gln Leu Ser Ser Ile Phe Ile Arg Gly Thr Asn Ala Ser His Val 85 90 95 Leu Val Leu Ile Asp Gly Val Arg Leu Asn Leu Ala Gly Val Ser Gly 100 105 110 Ser Ala Asp Leu Ser Gln Phe Pro Ile Ala Leu Val Gln Arg Val Glu 115 120 125 Tyr Ile Arg Gly Pro Arg Ser Ala Val Tyr Gly Ser Asp Ala Ile Gly 130 135 140 Gly Val Val Asn Ile Ile Thr Thr Arg Asp Glu Pro Gly Thr Glu Ile 145 150 155 160 Ser Ala Gly Trp Gly Ser Asn Ser Tyr Gln Asn Tyr Asp Val Ser Thr 165 170 175 Gln Gln Gln Leu Gly Asp Lys Thr Arg Val Thr Leu Leu Gly Asp Tyr 180 185 190 Ala His Thr His Gly Tyr Asp Val Val Ala Tyr Gly Asn Thr Gly Thr 195 200 205 Gln Ala Gln Thr Asp Asn Asp Gly Phe Leu Ser Lys Thr Leu Tyr Gly 210 215 220 Ala Leu Glu His Asn Phe Thr Asp Ala Trp Ser Gly Phe Val Arg Gly 225 230 235 240 Tyr Gly Tyr Asp Asn Arg Thr Asn Tyr Asp Ala Tyr Tyr Ser Pro Gly 245 250 255 Ser Pro Leu Leu Asp Thr Arg Lys Leu Tyr Ser Gln Ser Trp Asp Ala 260 265 270 Gly Leu Arg Tyr Asn Gly Glu Leu Ile Lys Ser Gln Leu Ile Thr Ser 275 280 285 Tyr Ser His Ser Lys Asp Tyr Asn Tyr Asp Pro His Tyr Gly Arg Tyr 290 295 300 Asp Ser Ser Ala Thr Leu Asp Glu Met Lys Gln Tyr Thr Val Gln Trp 305 310 315 320 Ala Asn Asn Val Ile Val Gly His Gly Ser Ile Gly Ala Gly Val Asp 325 330 335 Trp Gln Lys Gln Thr Thr Thr Pro Gly Thr Gly Tyr Val Glu Asp Gly 340 345 350 Tyr Asp Gln Arg Asn Thr Gly Ile Tyr Leu Thr Gly Leu Gln Gln Val 355 360 365 Gly Asp Phe Thr Phe Glu Gly Ala Ala Arg Ser Asp Asp Asn Ser Gln 370 375 380 Phe Gly Arg His Gly Thr Trp Gln Thr Ser Ala Gly Trp Glu Phe Ile 385 390 395 400 Glu Gly Tyr Arg Phe Ile Ala Ser Tyr Gly Thr Ser Tyr Lys Ala Pro 405 410 415 Asn Leu Gly Gln Leu Tyr Gly Phe Tyr Gly Asn Pro Asn Leu Asp Pro 420 425 430 Glu Lys Ser Lys Gln Trp Glu Gly Ala Phe Glu Gly Leu Thr Ala Gly 435 440 445 Val Asn Trp Arg Ile Ser Gly Tyr Arg Asn Asp Val Ser Asp Leu Ile 450 455 460 Asp Tyr Asp Asp His Thr Leu Lys Tyr Tyr Asn Glu Gly Lys Ala Arg 465 470 475 480 Ile Lys Gly Val Glu Ala Thr Ala Asn Phe Asp Thr Gly Pro Leu Thr 485 490 495 His Thr Val Ser Tyr Asp Tyr Val Asp Ala Arg Asn Ala Ile Thr Asp 500 505 510 Thr Pro Leu Leu Arg Arg Ala Lys Gln Gln Val Lys Tyr Gln Leu Asp 515 520 525 Trp Gln Leu Tyr Asp Phe Asp Trp Gly Ile Thr Tyr Gln Tyr Leu Gly 530 535 540 Thr Arg Tyr Asp Lys Asp Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Gln Thr Val Lys 545 550 555 560 Met Gly Gly Val Ser Leu Trp Asp Leu Ala Val Ala Tyr Pro Val Thr 565 570 575 Ser His Leu Thr Val Arg Gly Lys Ile Ala Asn Leu Phe Asp Lys Asp 580 585 590 Tyr Glu Thr Val Tyr Gly Tyr Gln Thr Ala Gly Arg Glu Tyr Thr Leu 595 600 605 Ser Gly Ser Tyr Thr Phe 610

Claims

L-아미노산 생산능을 갖는 미생물에서 NfrA, NfrB, 또는 NfrA 및 NfrB의 활성이 불활성화되어 L-아미노산 생산성이 향상된, L-아미노산을 생산하는 에세리키아(Escherichia) 속 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 NfrA는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 NfrB는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 것인 L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 Tsx, FhuA, 또는 Tsx 및 FhuA의 활성이 추가로 불활성화된 L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물.
청구항 3에 있어서, 상기 Tsx는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 FhuA는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인 L-아미노산을 생산하는 에세리키아 속 재조합 미생물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 L-아미노산을 생산하는 방법.