JP2019047790A - L−アミノ酸を生産する微生物、及びそれを利用してl−アミノ酸を生産する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ファージ受容体が不活性化された、L−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物の提供。【解決手段】微生物のファージ受容体の活性を不活性化させることにより、L−アミノ酸の生産能が向上した組換え微生物、及びそれを利用するL−アミノ酸を生産する方法を提供し、該組換え微生物を利用して、高い効率でL−アミノ酸を生産することが可能である。【選択図】なし
Description
本発明は、L−アミノ酸を生産する組換え微生物、及び前記組換え微生物を利用したL−アミノ酸を生産する方法に関する。
アミノ酸など有用産物の量産のために、微生物を利用した多様な発酵方法が利用されており、かような微生物を利用した成功に至る発酵のために、菌株開発、発酵条件確立など、多様な技術が開発されてきた。特に、有用産物の量産のための宿主菌株開発のために、特定遺伝子の過発現または低発現を誘導する多くの試みが行われている。
一方、バクテリアを利用した発酵生産において、ファージ(phage)の汚染によって、有用産物の生産が低下する。ファージの汚染は、主にファージ受容体(phage receptor)を介して行われるが、ファージ受容体とは、ファージがバクテリア表面に付着することができるタンパク質、脂質多糖体などを意味する。大腸菌の場合、多様なファージによって攻撃を受け、それぞれのファージに対する受容体も研究が比較的良好になされている。しかし、ファージ受容体とL−アミノ酸生産性との関係については、十分な研究が進められていない実情である。
そのために、本発明者らは、大腸菌の弱みのうち一つである、ファージ汚染によるL−アミノ酸生産の低下という危険性を減らすために、ファージ受容体として周知の遺伝子を選択し、それぞれを不活性化させた後、それによるL−アミノ酸生産性に対する影響を確認することにより、それをL−アミノ酸生産菌株に適用し、本発明を完成するに至った。
本発明が解決しようとする課題は、ファージ受容体が不活性化された、L−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物を提供するものである。
本発明が解決しようとする課題はまた、前記微生物を利用したL−アミノ酸を生産する方法を提供するものである。
一様相は、NfrA、NfrB、またはNfrA及びNfrBの活性が不活性化された、L−アミノ酸を生産する組換え微生物を提供する。
一様相によるタンパク質NfrA、タンパク質NfrB、タンパク質Tsx、タンパク質FhuAからなる群から選択される1以上のタンパク質の活性が除去されるか低下された微生物は、L−アミノ酸生産のために利用される。
他の様相によるL−アミノ酸生産用組成物、またはL−アミノ酸を生産する方法によれば、L−アミノ酸を効率的に生産することができる。
一様相は、NfrA、NfrB、またはNfrA及びNfrBの活性が不活性化された、L−アミノ酸を生産する組換え微生物を提供する。
本明細書の用語「NfrA」は、バクテリオファージN4(bacteriophage N4)の受容体を構成するものであり、それは、バクテリアの細胞膜タンパク質でもあり、例えば、外膜(outer membrane)タンパク質の構成単位(subunit)でもある。前記タンパク質NfrAは、例えば、配列番号40のアミノ酸配列を含んでもよい。前記NfrAは、例えば、配列番号40のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるアミノ酸配列を有するものでもある。前記タンパク質NfrAを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号40のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質NfrAを暗号化する遺伝子配列は、例えば、nfrA遺伝子(NCBI Gene ID:12930896)配列でもあり、例えば、配列番号39のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
用語「NfrB」は、バクテリオファージN4(bacteriophage N4)の受容体を構成するものであり、それは、バクテリアの細胞膜タンパク質でもあり、例えば、内膜(inner membrane)タンパク質の構成単位(subunit)でもある。前記NfrBは、例えば、配列番号42のアミノ酸配列を含んでもよい。前記NfrBは、例えば、配列番号42のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるアミノ酸配列を有するものでもある。前記タンパク質NfrBを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号42のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質NfrBを暗号化する遺伝子配列は、例えば、nfrB遺伝子(NCBI Gene ID:12933943)配列でもあり、例えば、配列番号41のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
また、前記L−アミノ酸を生産する組換え微生物は、NfrA、NfrB、またはNfrA及びNfrBの活性が不活性化された微生物において、Tsx、FhuA、またはTsx及びFhuAの活性が追加して不活性化されたものでもある。
用語「Tsx」は、ヌクレオシドチャネル(nucleoside channel)、すなわち、ヌクレオシドに特異的であるチャネルを構成するものであり、ファージT6及びコリシンK(colicin K)の受容体を構成することができる。前記Tsxは、例えば、配列番号45のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるアミノ酸配列を含んでもよい。前記タンパク質Tsxを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号45のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、前記タンパク質Tsxを暗号化する遺伝子配列は、tsx遺伝子(NCBI Gene ID:12934188)配列でもあり、配列番号44のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
用語「FhuA」は、バクテリアの外膜タンパク質において、(Fe3+)フェリクローム、またはアルボマイシン(albomycin)及びリファマイシン(rifamycin)のような抗生物質を輸送するような多くの機能を行うタンパク質であり、ファージT1,T5及びファイ80(phi80)の受容体でもある。前記FhuAは、例えば、配列番号47のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるアミノ酸配列を含んでもよい。前記タンパク質FhuAを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号47のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質FhuAを暗号化する遺伝子配列は、例えば、fhuA遺伝子配列(NCBI Gene ID:12930751)でもあり、配列番号47のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
用語「相同性」は、2つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、点数(score)、同一性(identity)及び類似度(similarity)のような媒介変数(parameter)を計算するBLAST 2.0を利用する、当業者に周知の方法で決定される。
用語「組換え微生物(recombinant microorganism)」は、遺伝的に操作された微生物でもある。遺伝工学によって製造された微生物、例えば、遺伝工学方法によって微生物内に外因性(exogenous)核酸が導入されたり、微生物の内因性(endogenous)遺伝子の配列または位置が変形されたものでもある。
用語「L−アミノ酸」は、一般的に、アミノ基とカルボン酸基とが同一炭素原子に結合されている生物の本体を構成するタンパク質の基本構成単位を意味する。例えば、L−ロイシン、L−フェニルアラニン、L−リシン、L−トレオニン、L−バリン、L−イソロイシン、L−トリプトファン及びL−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、L−トリプトファンまたはL−トレオニンでもある。
本明細書で使用された用語、酵素またはポリペプチドの「不活性化」は、微生物中の言及されたタンパク質が全く発現されないか、あるいは発現されたとしても、全く活性を有さないこと、または内在的活性に比べて弱化されたことを意味する。用語「内在的活性」とは、微生物が天然の状態、すなわち、微生物が本来有していた、遺伝子変形を経ないタンパク質の活性を意味する。
前記タンパク質NfrA、タンパク質NfrB、タンパク質Tsx、タンパク質FhuAの活性が不活性化されるということは、前記タンパク質を暗号化する各遺伝子の変異、除去または破壊によるものでもある。前記「遺伝子の変異、除去または破壊」は、遺伝子が発現されないか、あるいは発現量が減少したり、発現したとしても、酵素活性を示さないか、活性が低下したりするように、遺伝子の一部または全部が、またはそのプローモーター、そのターミネーター領域などの調節因子の一部または全部が、変異、置換、削除されるか、あるいは遺伝子に1以上の塩基が挿入されることをいう。前記「遺伝子の除去または破壊」は、相同組換えのような遺伝子操作、突然変異誘発、分子進化を介して達成される。細胞が複数個の同じ遺伝子を含むか、あるいは2個以上の異なるポリペプチド同種相同遺伝子(paralog)を含む場合、1またはそれ以上の遺伝子が除去または破壊される。本発明の一具体例において、本発明が提示した遺伝子を不活性化させるために、ラムダレッド組換え酵素を利用した突然変異作製技法を使用することができる。
前記組換え微生物は、本発明で提示したタンパク質の活性を、それぞれまたは組み合わせて除去したり低下させたりすることにより、活性が不活性化される前より、L−アミノ酸生産性が向上し、L−アミノ酸生産用途で望ましく使用される。
前記組換え微生物は、エセルキア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterbacter)属、オウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物でもある。例えば、エセルキア属に属する微生物でもある。前記エセルキア属微生物は、大腸菌(Escherichia coli)でもあり、例えば、大腸菌KCCM11501Pでもある。前記大腸菌KCCM11501Pは、トレオニン生産菌株であるKCCM10910Pを親菌株にして、nfrA遺伝子及びnfrB遺伝子をいずれも欠損させた菌株(KCCM10910PΔnfrAB)であり、親菌株KCCM10910P対比で、糖消費能が上昇するということを確認した。前記菌株を「CA03−8253P」と命名した後、ブダペスト条約下で、2013年12月13日付けで、韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託し、寄託番号KCCM11501Pを受けた。
他の様相は、前記L−アミノ酸を生産する組換え微生物を培養する段階と、培養物からL−アミノ酸を回収する段階と、を含む、L−アミノ酸を生産する方法を提供する。
前記L−アミノ酸を生産する組換え微生物については、前述の通りである。
前記L−アミノ酸は、例えば、L−ロイシン、L−フェニルアラニン、L−リシン、L−トレオニン、L−バリン、L−イソロイシン、L−トリプトファン及びL−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、L−トレオニンまたはL−トリプトファンでもある。前記培養は、当業界に知られた適当な培地及び培養条件によってなされる。当業者であるならば、選択される微生物によって、培地及び培養条件を容易に調整して使用することができるであろう。培養方法は、回分式、連続式、流加式、またはそれらの組み合わせ培養を含んでもよい。
前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。
前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物;大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪;パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸;グリセロール及びエタノールのようなアルコール;酢酸のような有機酸;またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培養は、グルコースを炭素源にして行われる。前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液(CSL)及び大豆ミールのような有機窒素源;尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源;またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培地は、リンの供給源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが培地に含まれてもよい。前記培地または個別成分は、培養液に回分式または連続式で添加される。
また、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を、微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のpHを調整することができる。また、培養中に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用し、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に、酸素または酸素含有ガス(例えば、空気)を注入することができる。培養液の温度は、一般的に20℃ないし45℃でもある。培養期間は、所望のL−アミノ酸の生成量が得られるまで持続することができ、例えば、10ないし160時間でもある。
用語「培養物」は、前記組換え微生物を含んだ培養原液でもあり、菌体を除去した培養上澄み液または培養物の希釈液でもある。前記組成物は、L−アミノ酸の生産性を向上させるための成分を追加して含んでもよい。例えば、炭素源、窒素源、または微量の元素成分を含んでもよい。
前記培養物から、L−アミノ酸を回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより、当該分野に公知の適する方法を利用して、培養物から生産されたL−アミノ酸を収集または回収することができる。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
実施例1.KCCM10910P基盤ファージ受容体が不活性化されたトレオニン生産菌株の作製
ファージ受容体が不活性化されたトレオニン生産菌株を作製するために、親菌株として、KCCM10910P(韓国登録特許第10−0966324号)を使用し、各ファージ受容体に係わる遺伝子の不活性化用カセットを作製して形質転換を行った。
ファージ受容体が不活性化されたトレオニン生産菌株を作製するために、親菌株として、KCCM10910P(韓国登録特許第10−0966324号)を使用し、各ファージ受容体に係わる遺伝子の不活性化用カセットを作製して形質転換を行った。
1−1.nfrA遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株作製
nfrA遺伝子が不活性化された菌株作製のために、nfrA不活性化用カセットを作製した。該カセットは、Datsenko KAらが開発したラムダレッド組換え酵素(lambda Red recombinase)を利用した突然変異作製技法である1段階不活性化(one step inactivation)方法を使用したものであり(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645)、遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、pUCprmfmloxCのクロラムフェニコール(Chloramphenicol)遺伝子を使用した(大韓民国公開特許:2009−007554)。
nfrA遺伝子が不活性化された菌株作製のために、nfrA不活性化用カセットを作製した。該カセットは、Datsenko KAらが開発したラムダレッド組換え酵素(lambda Red recombinase)を利用した突然変異作製技法である1段階不活性化(one step inactivation)方法を使用したものであり(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645)、遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、pUCprmfmloxCのクロラムフェニコール(Chloramphenicol)遺伝子を使用した(大韓民国公開特許:2009−007554)。
nfrA遺伝子(配列番号39)の一部分、及びpUCprmfmloxC遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するDNAを得るために、配列番号2と3のプライマーを利用して、約1.1kb DNA断片を得た。そのために、PCR premix kit(BIONEER社製、以下、同一である)を使用して、重合酵素連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)を行い、条件は、95℃で30秒の変性(denaturation)、56℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で1分の伸張(elongation)からなるサイクルを27回反復遂行した。前記PCR結果物を、0.8%アガロースゲルで電気泳動した後、溶離させて得て、それをテンプレートとして、配列番号1と4とのプライマーを利用して、前述のような条件でPCRを行い、約1.2kbのDNA断片を得て、それを0.8%アガロースゲルで電気泳動した後、溶離させて得て、最終的にnfrA不活性化カセットを作製した。
nfrAが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、Datsenko KAらが開発した方法(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645)によって、pKD46で形質転換された対象トレオニン生産菌株KCCM10910Pを、コンピテントな状態で製造した後、前記獲得されたnfrA不活性化カセットDNAを導入して形質転換させた。
得られた菌株は、クロラムフェニコール耐性を有しているLBプレートで選別した。それは、ゲノム上の不活性化カセットのnfrA相同配列両側外側のDNA配列を有する配列番号5と6とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズが2.8kbから1.5kbに小さくなるコロニーを選別した。
クロラムフェニコール耐性を有した一次組換え菌株は、pKD46を除去した後、pJW168を導入し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去する(Gene, (2000) 247, 255-264)。最終菌株は、プライマー5と6とを利用したPCRを介して得られたDNAの結果物が、0.4kbにサイズが小さくなることを確認して作製された。これを介して、nfrA遺伝子が不活性化されたL−トレオニン生産菌株、KCCM10910PΔnfrAを作製した。
1−2.nfrB遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
nfrB(配列番号41)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、nfrB不活性化用カセットを作製した。nfrB不活性化用カセットは、前記実施例1−1のnfrA不活性化カセット作製のような方法によって作製され、配列番号8,9のプライマーを利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号7,10を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
nfrB(配列番号41)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、nfrB不活性化用カセットを作製した。nfrB不活性化用カセットは、前記実施例1−1のnfrA不活性化カセット作製のような方法によって作製され、配列番号8,9のプライマーを利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号7,10を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
nfrBが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例1−1と同一方法によって行われ、配列番号11と12とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、nfrBが不活性化されたL−トレオニン生産菌株、KCCM10910PΔnfrBを作製した。
1−3.nfrAB遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
nfrAB(配列番号43)遺伝子が不活性化された菌株の作製のために、前記1−1において記述されたnfrA不活性化カセット作製のような方法で、nfrAB不活性化用カセットを作製した。使用プライマーとして、配列番号2,9を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号1,10を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
nfrAB(配列番号43)遺伝子が不活性化された菌株の作製のために、前記1−1において記述されたnfrA不活性化カセット作製のような方法で、nfrAB不活性化用カセットを作製した。使用プライマーとして、配列番号2,9を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号1,10を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
nfrABが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例1−1と同一方法によって行われ、配列番号5と12とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、最終的に、nfrABが不活性化されたL−トレオニン生産菌株KCCM10910PΔnfrABを作製した。
1−4.tsx遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
tsx(配列番号44)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、前記1−1において記述されたnfrA不活性化カセット作製のような方法で、tsx不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号13,14を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号15,16を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
tsx(配列番号44)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、前記1−1において記述されたnfrA不活性化カセット作製のような方法で、tsx不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号13,14を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号15,16を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
tsxが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例1−1と同一方法によって行われ、配列番号17と18とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、最終的に、L−トレオニン生産菌株KCCM10910PΔtsxを作製した。
1−5.fhuA遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
fhuA(配列番号46)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、fhuA不活性化用カセットを作製した。該カセットは、前記記述された技法である1段階不活性化(one step inactivation)方法を利用するように作製され、fhuAと相同性を有する塩基配列のDNA断片を得るために、それぞれ配列番号19及び20、配列番号21及び22を利用して、PCR結果物を得た。また、クロラムフェニコール耐性を有する塩基配列を含むDNA断片を獲得するために、配列番号23と24とを利用して、PCR結果物を得た。そのようにして得た3つのPCR結果物を、0.8%アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動した後、溶離させて得て、該3つの結果物をテンプレートにして、配列番号19と22とを使用してPCRを行い、fhuA不活性化カセットを作製した。
fhuA(配列番号46)遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、fhuA不活性化用カセットを作製した。該カセットは、前記記述された技法である1段階不活性化(one step inactivation)方法を利用するように作製され、fhuAと相同性を有する塩基配列のDNA断片を得るために、それぞれ配列番号19及び20、配列番号21及び22を利用して、PCR結果物を得た。また、クロラムフェニコール耐性を有する塩基配列を含むDNA断片を獲得するために、配列番号23と24とを利用して、PCR結果物を得た。そのようにして得た3つのPCR結果物を、0.8%アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動した後、溶離させて得て、該3つの結果物をテンプレートにして、配列番号19と22とを使用してPCRを行い、fhuA不活性化カセットを作製した。
fhuAが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、前記実施例1−1と同一方法によって行われ、配列番号25と26とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、最終的に、fhuAが不活性化されたL−トレオニン生産菌株KCCM10910PΔfhuAを作製した。
1−6.lamB遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
lamB遺伝子(配列番号48)が不活性化された菌株を作製するために、前記実施例1−1で記述された方法で、配列番号27,28を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号29,30を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
lamB遺伝子(配列番号48)が不活性化された菌株を作製するために、前記実施例1−1で記述された方法で、配列番号27,28を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号29,30を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
lamBが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例1−1において記述された方法と同一方法によってなり、配列番号31と32とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、最終的に、lamBが不活性化されたL−トレオニン生産菌株KCCM10910PΔlamBを作製した。
1−7.btuB遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
btuB遺伝子(配列番号50)が不活性化された菌株作製のために、前記実施例1−1で記述された方法で、btuB不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号33,34を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号35,36を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
btuB遺伝子(配列番号50)が不活性化された菌株作製のために、前記実施例1−1で記述された方法で、btuB不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号33,34を利用して、約1.1kbのDNA断片を得て、配列番号35,36を利用して、約1.2kbのDNA断片を作製した。
btuBが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、トレオニン菌株の作製方法は、前記実施例1−1において記述された方法と同一方法によって行われ、配列番号37と38とのプライマーを利用して、PCR結果物のサイズを確認し、最終的に、btuBが不活性化されたL−トレオニン生産菌株KCCM10910PΔbtuBを作製した。
実施例2.組換え微生物のL−トレオニン生産性比較
前記実施例1で製造した組換え微生物を、表1のトレオニン力価培地を利用して、三角フラスコで培養し、L−トレオニン生産性を確認した。
前記実施例1で製造した組換え微生物を、表1のトレオニン力価培地を利用して、三角フラスコで培養し、L−トレオニン生産性を確認した。
33℃培養基でLB固体培地中で一晩中培養した実施例1で作製された大腸菌7種の菌株、及びKCCM10910Pを、それぞれ表1の25mL力価培地に1白金耳ずつ接種した後、それを33℃、200rpmの培養基で48時間培養した。
表2に記載されているようにnfrA、nfrB、nfrAB、tsx及びfhuAの各不活性化菌株は、親菌株であるKCCM10910P対比で、糖消耗速度が向上しながら、48時間収率が下がらないということを確認した。一方、lamBとbtuBとの不活性化菌株は、親菌株対比で、糖消耗速度が類似しているか、あるいは小幅下がり、48時間の培養時、トレオニン濃度も、いずれも類似しているということを確認した。nfrA、nfrB及びnfrABの不活性化菌株は、培養結果が同一に示され、2つの遺伝子のうちいずれか一つだけ欠損した場合と、2つの遺伝子が同時に欠損した場合とにおいて、いずれも同じ結果を示すということを確認した。
実施例3.有効変異組み合わせ菌株の作製、及びL−トレオニン生産能の比較
3−1.nfrAB、fhuA同時不活性化、nfrAB、tsx同時不活性化、及びnfrAB、tsx、fhuA同時不活性化菌株の作製
糖消費能が上昇したnfrAB、fhuA、tsxの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんを確認するために、KCCM10910PΔnfrABΔfhuA、KCCM10910PΔnfrABΔtsx及びKCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。そのために、実施例1−3で作製されたKCCM10910PΔnfrABを基に、実施例1で作製したような方法で、fhuA及びtsxをそれぞれ同時不活性化させた菌株を作製した(KCCM10910PΔnfrABΔfhuA及びKCCM10910PΔnfrABΔtsx)。また、KCCM10910PΔnfrABΔtsxを基にfhuAを不活性化させ、最終的に、KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。
3−1.nfrAB、fhuA同時不活性化、nfrAB、tsx同時不活性化、及びnfrAB、tsx、fhuA同時不活性化菌株の作製
糖消費能が上昇したnfrAB、fhuA、tsxの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんを確認するために、KCCM10910PΔnfrABΔfhuA、KCCM10910PΔnfrABΔtsx及びKCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。そのために、実施例1−3で作製されたKCCM10910PΔnfrABを基に、実施例1で作製したような方法で、fhuA及びtsxをそれぞれ同時不活性化させた菌株を作製した(KCCM10910PΔnfrABΔfhuA及びKCCM10910PΔnfrABΔtsx)。また、KCCM10910PΔnfrABΔtsxを基にfhuAを不活性化させ、最終的に、KCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。
表2から確認されるように、nfrA,nfrB,nfrAB不活性化菌株は、その効果が同一であると判断されるので、有効変異組み合わせ菌株の作製においては、nfrABが、不活性化を基に、tsx,fhuA不活性化を進めた。しかし、その効果は、nfrAかnfrBだけ不活性化させた場合と、2つの遺伝子を同時不活性化させた場合とにおいて、いずれも同一であると見られる。
3−2.有効変異組み合わせ菌株のL−トレオニン生産能比較
前述のところで作製された有効変異統合株のL−トレオニン生産能を比較するために、表1の培地を利用して、前述のところにおいて記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、表3の通りである。
前述のところで作製された有効変異統合株のL−トレオニン生産能を比較するために、表1の培地を利用して、前述のところにおいて記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、表3の通りである。
糖消費能が上昇したnfrAB、fhuA、tsxの不活性化特徴を組み合わせて作製したKCCM10910PΔnfrABΔfhuA菌株、KCCM10910PΔnfrABΔtsx菌株及びKCCM10910PΔnfrABΔtsxΔfhuA菌株の力価評価の結果、nfrAB単独変異に、fhuAやtsxを追加して不活性化させた場合、糖消費能が上昇するということを確認した。ここで、糖消費能が上昇したように見える前記形質転換された大腸菌KCCM10910PΔnfrABを「CA03−8253P」と命名し、KCCM 11501Pとして、20013年12月13日に韓国微生物保存センター(KCCM:Korean Culture Center of Microorganisms)に寄託した(受託番号KCCM11501P)。
実施例4.KCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトレオニン生産能比較
4−1.KCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例1及び実施例3のような方法で、実施例1で作製された7種の不活性化カセットを利用して、同一にKCCM−10132菌株を基にして、ファージ受容体不活性化菌株10種を作製した(表4)。KCCM−10132菌株は、韓国登録特許第10−0270510号において記述された菌株であり、大腸菌由来トレオニン生産能が付与された菌株である。
4−1.KCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例1及び実施例3のような方法で、実施例1で作製された7種の不活性化カセットを利用して、同一にKCCM−10132菌株を基にして、ファージ受容体不活性化菌株10種を作製した(表4)。KCCM−10132菌株は、韓国登録特許第10−0270510号において記述された菌株であり、大腸菌由来トレオニン生産能が付与された菌株である。
4−2.KCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製トレオニン生産能比較
実施例2において記述された方法で、表1の培地を利用して、実施例4−1で作製されたKCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株10種と、親菌株KCCM−10132とのトレオニン生産能を比較評価進行した。
実施例2において記述された方法で、表1の培地を利用して、実施例4−1で作製されたKCCM−10132基盤ファージ受容体不活性化菌株10種と、親菌株KCCM−10132とのトレオニン生産能を比較評価進行した。
表4に記載されているように、nfrA,nfrB,nfrAB,tsx,fhuA不活性化菌株は、親菌株であるKCCM−10132対比で、糖消耗速度が向上しながら、48時間収率が下がらないということを確認した。一方、lamBとbtuBとの不活性化菌株は、親菌株対比で、糖消耗速度が類似しているか、あるいは小幅遅延し、48時間の培養時、トレオニン濃度は、類似しているということを確認した。また、nfrAB、fhuA、及びnfrAB、tsxの同時不活性化菌株、nfrAB,tsx,fhuAの同時不活性化菌株は、nfrAB単独不活性化菌株対比で、糖消耗速度が改善するということが確認された。
実施例5.KCCM11166P基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトリプトファン生産能比較
5−1.KCCM11166P基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例1で作製された7種の不活性化カセットを利用して、実施例1のような方法で、KCCM11166P(大韓民国登録特許10−1261147)を基にして、ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株7種を作製した。
5−1.KCCM11166P基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例1で作製された7種の不活性化カセットを利用して、実施例1のような方法で、KCCM11166P(大韓民国登録特許10−1261147)を基にして、ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株7種を作製した。
5−2.KCCM11166P基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトリプトファン生産能比較
実施例5−1で作製されたKCCM11166P基盤ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株7種の生産能を評価するために、表5の培地を利用して進めた。そのために、菌体を白金耳で接種した後、LB固体培地で一晩培養し、表5のような組成を有する25mlのフラスコ力価培地に、1白金耳ずつ接種した。菌株接種後、37℃、200rpmで48時間培養し、そこから得られた結果を表6に示した。
実施例5−1で作製されたKCCM11166P基盤ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株7種の生産能を評価するために、表5の培地を利用して進めた。そのために、菌体を白金耳で接種した後、LB固体培地で一晩培養し、表5のような組成を有する25mlのフラスコ力価培地に、1白金耳ずつ接種した。菌株接種後、37℃、200rpmで48時間培養し、そこから得られた結果を表6に示した。
表6から分かるように、nfrA,nfrB,nfrAB,tsx,fhuA欠失の場合、菌株のトリプトファン生産量は、類似しており、糖消耗速度が速くなったということを確認することができる。一方、lamb、btuBの場合には、トリプトファン生産量や糖消耗速度の変化は見られなかった。
実施例6.有効変異組み合わせ菌株の作製及びL−トリプトファン生産能比較
6−1.nfrAB,fhuA同時不活性化、nfrAB,tsx同時不活性化、及びnfrAB,tsx,fhuA同時不活性化されたL−トリプトファン生産菌株の作製
糖消費能が上昇したnfrAB、fhuA、tsxの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんをトリプトファン生産菌株で確認するために、KCCM11166PΔnfrABΔfhuA、KCCM11166PΔnfrABΔtsx及びKCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。
6−1.nfrAB,fhuA同時不活性化、nfrAB,tsx同時不活性化、及びnfrAB,tsx,fhuA同時不活性化されたL−トリプトファン生産菌株の作製
糖消費能が上昇したnfrAB、fhuA、tsxの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんをトリプトファン生産菌株で確認するために、KCCM11166PΔnfrABΔfhuA、KCCM11166PΔnfrABΔtsx及びKCCM11166PΔnfrABΔtsxΔfhuAを作製した。
6−2.有効変異組み合わせ菌株のL−トリプトファン生産能比較
前記6−1で作製された3種菌株のL−トリプトファン生産能を比較するために、表5の培地を利用して、実施例5において記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、下記表7の通りである。
前記6−1で作製された3種菌株のL−トリプトファン生産能を比較するために、表5の培地を利用して、実施例5において記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、下記表7の通りである。
作製された有効変異組み合わせトリプトファン生産菌株の力価評価結果、nfrAB単独変異に、fhuAとtsxとを追加不活性化させたとき、nfrAB単独変異対比で、糖消耗能が上昇するということを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明が、その技術的思想や必須特徴を変更せずとも、他の具体的な形態で実施されるということを理解することができるであろう。それと係わり、本明細書で記述された実施例及び試験例は、全ての面において例示的なものであり、本発明の範囲を制限するものではないと理解されなければならない。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは、特許請求の範囲の意味、範囲及びその等価概念から導み出される全ての変更、または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
Claims (8)
- NfrA、NfrB、またはNfrA及びNfrBの活性が不活性化された、L−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 前記NfrAは、配列番号40のアミノ酸配列を含み、前記NfrBは、配列番号42のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 前記微生物は、Tsx、FhuA、またはTsx及びFhuAの活性が追加して不活性化されたことを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 前記Tsxは、配列番号45のアミノ酸配列を含み、前記FhuAは、配列番号47のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項3に記載のL−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 前記L−アミノ酸は、L−トレオニンまたはL−トリプトファンであることを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
培養物からL−アミノ酸を回収する段階と、
を含む、L−アミノ酸を生産する方法。 - 前記L−アミノ酸は、L−トレオニンまたはL−トリプトファンであることを特徴とする、請求項7に記載のL−アミノ酸を生産する方法。
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