TWI547558B - 生產ｌ－胺基酸的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法 - Google Patents
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Description
本發明涉及一種生產L-胺基酸之重組微生物及使用所述重組微生物生產L-胺基酸之方法。
已使用多種使用微生物之醱酵方法來大批量生產有用代謝物(例如胺基酸)，且此外，已研發出多種技術，包含菌株研發、醱酵條件建立或其類似技術，以成功使用微生物進行醱酵。具體言之，為了研發用於大批量生產有用代謝物之宿主菌株，已經進行了許多嘗試來誘導特定基因之過度表現或低表現。
然而，在使用細菌之醱酵生產中，由於噬菌體之污染，有用代謝物之生產可能減少。噬菌體之污染主要由噬菌體受體引起，所述噬菌體受體為能夠將噬菌體連接到細菌表面之蛋白質、脂質多醣或其類似物。在大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)之情
況下，大腸桿菌受多種噬菌體攻擊，且因此，針對每一噬菌體之受體之研究已相對成功。然而，有關噬菌體受體與L-胺基酸生產之間之關係的研究尚未充分進行。
就此而言，本發明的發明人選擇作為熟知噬菌體受體的基因，且接著，使每一基因失活以降低L-胺基酸生產減少之風險，所述風險被認為是大腸桿菌之脆弱性(vulnerability)。之後，確定對L-胺基酸生產之影響，且將基因之此類選擇及失活應用於L-胺基酸生產菌株，由此完成本發明。
本發明提供一種具有L-胺基酸生產能力及失活之噬菌體受體的重組微生物。
本發明提供一種使用所述微生物生產L-胺基酸之方法。
在一個態樣中，本發明提供一種生產L-胺基酸之重組微生物，其中使NfrA及NfrB中之至少一者失活。
如本文所用，術語「NrfA」是指形成噬菌體N4之受體之蛋白質，且可以為細菌之膜蛋白質。舉例而言，NrfA可以為外膜蛋白質之次單元。NfrA可包含例如SEQ ID NO：40之胺基酸序列。NfrA可包含例如SEQ ID NO：40之胺基酸序列或與SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的胺基酸序列。編碼NfrA
之基因之序列可包含編碼SEQ ID NO：40之胺基酸序列之多核苷酸序列。編碼NfrA之基因之序列可包含例如nfrA基因(NCBI基因號：12930896)之序列。舉例而言，編碼NfrA之基因之序列可包含SEQ ID NO：39之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：39之多核苷酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的多核苷酸序列。
如本文所用，術語「NfrB」是指形成噬菌體N4之受體之蛋白質，且可以為細菌之膜蛋白質。舉例而言，NfrB可以為內膜蛋白質之次單元。NfrB可包含例如SEQ ID NO：42之胺基酸序列。NfrB可包含例如SEQ ID NO：42之胺基酸序列或與SEQ ID NO：42之胺基酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的胺基酸序列。編碼NfrB之基因之序列可包含編碼SEQ ID NO：42之胺基酸序列之多核苷酸序列。編碼NfrB之基因之序列可包含例如nfrB基因(NCBI基因號：12933943)之序列。舉例而言，編碼NfrB蛋白質之基因之序列可包含SEQ ID NO：41之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：41之多核苷酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的多核苷酸序列。
另外，在生產L-胺基酸之重組微生物中，可以進一步使Tsx及FhuA中之至少一者失活。
如本文所用，術語「Tsx」是指形成核苷通道(亦即，對核苷具有特異性之通道)之蛋白質，且可以為形成噬菌體T6及大腸菌素K(colicin K)之受體之組分。Tsx可包含例如SEQ ID NO：
45之胺基酸序列或與SEQ ID NO：45之胺基酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的胺基酸序列。編碼基因Tsx之基因之序列可包含編碼SEQ ID NO：45之胺基酸序列之多核苷酸序列。編碼Tsx之基因之序列可包含例如tsx基因(NCBI基因號：12934188)之序列。舉例而言，編碼Tsx之基因之序列可包含SEQ ID NO：44之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：44之多核苷酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的多核苷酸序列。
如本文所用，術語「FhuA」是指細菌外膜中轉運(Fe3+)含鐵色素或諸如白黴素(albomycin)及利福黴素(rifamycin)之抗生素的多功能蛋白質，且可以為噬菌體T1、T5以及phi80之受體。FhuA可包含例如SEQ ID NO：47之胺基酸序列或與SEQ ID NO：47之胺基酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的胺基酸序列。編碼FhuA之基因之序列可包含編碼SEQ ID NO：47之胺基酸序列之多核苷酸序列。編碼FhuA蛋白質之基因之序列可包含例如fhuA基因(NCBI基因號：12930751)之序列。舉例而言，編碼FhuA之基因之序列可包含SEQ ID NO：47之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：47之多核苷酸序列具有約80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、或95%或大於95%之序列一致性的多核苷酸序列。
如本文所用，術語「一致性」是指兩個胺基酸序列之間
的同一性，其可藉由所屬領域中熟知之方法，例如指定參數(諸如兩個胺基酸序列之間的評分、一致性以及類似性)之BLAST 2.0演算法來測定。
如本文所用，術語「重組微生物」是指經基因修飾之微生物。重組微生物可為經基因工程改造之微生物，且例如，可根據基因工程方法將外源性核酸引入微生物中，或可對微生物中內源性基因之序列或位置進行轉型。
如本文所用，術語「L-胺基酸」是指構成生物體之主體且胺基與羧酸基團連接至同一碳原子之蛋白質的基礎結構單元。舉例而言，L-胺基酸可由L-白胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-色胺酸以及L-甲硫胺酸所構成之族群中選出。舉例而言，L-胺基酸可為L-色胺酸或L-蘇胺酸。
如本文所用，術語「使酶或蛋白質失活(an enzyme or a protein is inactivated)」或「酶或蛋白質之失活(inactivation of an enzyme or a protein)」是指上述蛋白質完全不在微生物中表現之情況、上述蛋白質表現但不具有任何活性之情況或上述蛋白質表現但其活性比固有活性(intrinsic activity)弱之情況。如本文所用，術語「固有活性」是指微生物在天然狀態之活性，亦即，微生物最初存在之活性，或未經基因修飾之蛋白質之活性。
NfrA蛋白質、NfrB蛋白質、Tsx蛋白質以及FhuA蛋白質之失活可由分別編碼NfrA蛋白質、NfrB蛋白質、Tsx蛋白質以及FhuA蛋白質之基因之突變、缺失或破壞引起。如本文所用，術語「基因之突變、缺失或破壞(mutation,deletion,or disruption of
the genes)」是指基因之啟動子區或終止子區上之一部分或所有基因或調節因子突變、經取代、缺失或插入至少一個鹼基，使得基因不表現，或基因少量表現，或基因表現而不展示酶活性或具有降低之酶活性的情況。基因之突變、缺失或破壞可藉由基因操作，諸如同源重組、突變誘發或分子進化達成。當細胞包含多個相同基因或至少兩個同源基因時，細胞中可以缺失或破壞一個或大於一個基因。為了使本發明之一實施例中所提供之基因失活，可實施使用λ Red重組酶製造突變體之方法。
重組微生物會移除或降低每一本文提供之蛋白質或蛋白質組合之活性。因此，與未使蛋白質活性失活之情況相比，重組微生物可具有增強的L-胺基酸生產能力，且因此可適當地使用重組微生物達到生產L-胺基酸之目的。
重組微生物可為艾氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterbacter)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙雷菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)以及短桿菌屬(Brevibacterium)。舉例而言，重組微生物可為艾氏菌屬微生物。艾氏菌屬微生物可為大腸桿菌(E.coli)，例如KCCM11501P。KCCM11501P是藉由使用蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P)作為母菌株且缺失nfrA基因與nfrB基因而製備的KCCM10910P△nfrAB菌株。此處，發現大腸桿菌KCCM11501P中之糖消耗能力高於母菌株(KCCM10910P)中之糖消耗。KCCM11501P稱為『大腸桿菌CA03-8253P』，且接著，在2013年12月13日根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)寄存於韓國微生
物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(在下文中稱為『KCCM』)。
根據本發明之另一態樣，揭露一種生產L-胺基酸之方法，所述方法包含：培養生產L-胺基酸之重組微生物；及自培養產物收集L-胺基酸。
生產L-胺基酸之重組微生物之定義與上文所述相同。
L-胺基酸可由L-白胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-色胺酸以及L-甲硫胺酸所構成之族群中選出。舉例而言，L-胺基酸可為L-蘇胺酸或L-色胺酸。重組微生物之培養可根據所屬領域中熟知之適當培養基及培養條件達成。另外，所屬領域中具有通常知識者可根據所選微生物適當調節培養基及培養條件。培養方法可包含分批培養、連續培養、分批補料培養或其組合。
培養基可包含多種碳源、氮源以及微量元素成分。
碳源可包含例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉以及纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸以及亞麻油酸；醇，諸如丙三醇及乙醇；以及有機酸，諸如乙酸，或其組合。重組微生物之培養可藉由使用葡萄糖作為碳源來執行。氮源可包含例如有機氮源，諸如蛋白腖(peptone)、酵母萃取物、肉汁(gravy)、麥芽萃取物、玉米漿(corn steep liquor，CSL)以及大豆粉；及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨以及硝酸銨；或其組合。培養基可包含磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。
另外，培養基可包含對應於磷源之含鈉鹽及諸如硫酸鎂或硫酸鐵等金屬鹽。另外，培養基可包含胺基酸、維生素以及適當前驅物。培養基或培養基之個別成分可分批或以連續方式添加至培養基中。
另外，在培養重組微生物期間，可按適當方式將諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸以及硫酸之化合物添加至培養基中以便調節培養基之pH。另外，在培養重組微生物期間，可使用諸如脂肪酸聚二醇酯(fatty acid polyglycol ester)之消泡劑以便抑制氣泡之產生。為了維持培養基之好氧條件，可將氧氣或含氧氣體(例如空氣)注入培養基中。此處，培養基之溫度通常可在約20℃到約45℃之範圍內。重組微生物之培養時間可持續直至獲得所需量之L-胺基酸，且舉例而言，重組微生物之培養可持續約10小時至約160小時。
如本文所用，術語「培養產物」是指含有重組微生物之培養液培養物、移除了微生物細胞之培養物上清液或所述培養產物之經稀釋溶液。培養基可更包含用於增加L-胺基酸之生產力之成分。舉例而言，組成物可更包含碳源、氮源或微量元素成分。
自培養產物收集L-胺基酸可藉由所屬領域中已知之適當培養方法，諸如分批培養、連續培養或分批補料培養執行，以便收集或回收培養產物中生產之L-胺基酸。
根據一態樣，可使用至少一種由NfrA蛋白質、NfrB蛋白質、Tsx蛋白質以及FhuA蛋白質所構成之族群中選出之蛋白質
之活性移除或降低之微生物生產L-胺基酸。
根據另一態樣，可使用生產L-胺基酸之方法以高效方式生產L-胺基酸。
在下文中，將參照以下實例進一步詳細地描述本發明。這些實例僅為達成說明之目的，且不意欲限制本發明之範疇。
為了製備具有失活之噬菌體受體之蘇胺酸生產菌株，將KCCM10910P菌株(韓國專利第10-0966324號)用作母菌株。接著，製備使每一噬菌體受體之基因失活之卡匣(cassette)，且接著使用其進行基因轉型。
為了製備具有失活之nfrA基因之蘇胺酸生產菌株，製備使nfrA基因失活之卡匣。所述卡匣使用一步失活(one step inactivation)法，其為使用由達特森克KA(Datsenko KA)等人(美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.),(2000)97：6640-6645)研發之λ Red重組酶構造突變體之技術。為了確定
卡匣插入基因中，將pUCprmfmloxC之耐氯黴素基因(chloramphenicol-resistant gene)用作標記物(韓國專利特許公開案第2009-007554號)。
藉由使用SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3之引子集獲得包含nfrA基因序列(SEQ ID NO：39)之一部分及pUCprmfmloxC之耐氯黴素基因之鹼基序列之一部分的1.1千鹼基對(kb)DNA片段。此處，藉由在以下條件下使用PCR預混合套組(亦即，百納公司(BIONEER company)之產品，在下文中，使用相同產品)執行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)(在下文中稱為「PCR」)：在95℃下變性30秒、在56℃下退火30秒以及在72℃下伸長1分鐘，持續27個循環。使PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，且接著溶離。之後，藉由在與上述相同的條件下使用溶離產物作為模板以及SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：4之引子集再次執行PCR，產生約1.2千鹼基對之DNA片段。使DNA片段在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，溶離且接著最終將其用於製備使nrfA基因失活之卡匣。
為了製備具有失活之nfrA基因之蘇胺酸生產菌株，製備根據達特森克KA等人(美國國家科學院院刊，(2000)97：6640-6645)研發之方法用pKD46質體轉型之蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P)作為勝任型菌株(competent strain)。接著，將製備的用於使nfrA基因失活之卡匣之DNA引入菌株中以進行轉型。
在LB板上選擇具有氯黴素抗性的所獲得之菌株。亦即，使用DNA序列位於使基因組失活之卡匣之nfrA同源序列之兩端
外部的SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之引子集選擇所得PCR產物之大小由2.8千鹼基對降至1.5千鹼基對之集落。
自pKD46質體移除具有氯黴素抗性之初級重組菌株，且接著引入pJW168質體以自微生物細胞移除氯黴素標記物基因(基因(Gene),(2000)247,255-264)。接著，使用SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之引子集執行PCR以獲得0.4千鹼基對之DNA產物，表明最終獲得之菌株具有減小之DNA大小。因此，製備出具有失活之nfrA基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△nfrA)。
為了製備具有失活之nfrB基因(SEQ ID NO：41)之蘇胺酸生產菌株，以與實例1-1中製備使nfrA基因失活之卡匣相同之方式製備使nfrB基因失活之卡匣。藉由使用SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9之引子集獲得1.1千鹼基對之DNA片段，且接著，藉由使用SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：10之引子集來製備1.2千鹼基對之DNA片段。
製備具有失活之nfrB基因之蘇胺酸生產菌株的方法是藉由與實例1-1中所述相同之方法來實施，其中使用SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12之引子集以確定所得PCR產物之大小。因此，最終製備出具有失活之nfrB基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△nfrB)。
為了製備具有失活之nfrAB基因(SEQ ID NO：43)之蘇胺酸生產菌株，以與實例1-1中製備使nfrA基因失活之卡匣相同
之方式製備使nfrAB基因失活之卡匣。藉由使用SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：9之引子集獲得1.1千鹼基對之DNA片段，且接著，藉由使用SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：10之引子集來製備1.2千鹼基對之DNA片段。
製備具有失活之nfrAB基因之蘇胺酸生產菌株之方法是藉由與實例1-1中所述相同之方法來實施，其中使用SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：12之引子集來確定所得PCR產物之大小。因此，最終製備出具有失活之nfrAB基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△nfrAB)。
為了製備具有失活之tsx基因(SEQ ID NO：44)之蘇胺酸生產菌株，以與實例1-1中製備使nfrA基因失活之卡匣相同之方式製備使tsx基因失活之卡匣。藉由使用SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之引子集獲得1.1千鹼基對之DNA片段，且接著，藉由使用SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之引子集來製備1.2千鹼基對之DNA片段。
製備具有失活之tsx基因之蘇胺酸生產菌株之方法是藉由與實例1-1中所述相同之方法來實施，其中使用SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之引子集來確定所得PCR產物之大小。因此，最終製備出具有失活之tsx基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△tsx)。
為了製備具有失活之fhuA基因(SEQ ID NO：46)之蘇胺
酸生產菌株，根據上述一步失活法製備使fhuA基因失活之卡匣。為了獲得鹼基序列與fhuA基因之序列同源的DNA片段，使用SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之引子集以及SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之引子集，由此產生PCR產物。另外，為了獲得鹼基序列具有氯黴素抗性之DNA片段，使用SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24之引子集，由此產生PCR產物。因此，這三種所得PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，且接著溶離。藉由使用這三種溶離的PCR產物作為模板以及SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：22之引子集來執行PCR，以製備使fhuA基因失活之卡匣。
為了製備具有失活之fhuA基因之蘇胺酸生產菌株，藉由與實例1-1中所述相同之方法製備使fhuA基因失活之卡匣，其中使用SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26之引子集來確定所得PCR產物之大小。因此，最終製備出具有失活之fhuA基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△fhuA)。
為了製備具有失活之lamB基因(SEQ ID NO：48)之蘇胺酸生產菌株，藉由與實例1-1中所述相同之方法製備使lamB基因失活之卡匣。藉由使用SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28之引子集獲得1.1千鹼基對之DNA片段，且接著，藉由使用SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30之引子集來製備1.2千鹼基對之DNA片段。
製備具有失活之lamB基因之蘇胺酸生產菌株之方法是藉由與實例1-1中所述相同之方法來實施，其中使用SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之引子集來確定所得PCR產物之大小。因此，
最終製備出具有失活之lamB基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△lamB)。
為了製備具有失活之btuB基因(SEQ ID NO：50)之蘇胺酸生產菌株，藉由與實例1-1中所述相同之方法製備使btuB基因失活之卡匣。藉由使用SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之引子集獲得1.1千鹼基對之DNA片段，且接著，藉由使用SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之引子集來製備1.2千鹼基對之DNA片段。
製備具有失活之btuB基因之蘇胺酸生產菌株之方法是藉由與實例1-1中所述相同之方法來實施，其中使用SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38之引子集來確定所得PCR產物之大小。因此，最終製備出具有失活之btuB基因之L-蘇胺酸生產菌株(KCCM10910P△btuB)。
在愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flask)中，在含有下表1中所示之組成的蘇胺酸滴度培養基(titer medium)中培養根據實例1製備之重組微生物。接著，確定重組微生物是否具有L-蘇胺酸生產能力。
將1個鉑環(platinum loop)的在恆溫箱中在33℃下於LB固體培養基中隔夜培養之7類實例1之大腸桿菌菌株及KCCM10910P菌株分別接種於25毫升含有上表1中所示組成之滴度培養基中，且接著在恆溫箱中在33℃下及200轉/分鐘下培養48小時。
如上表2中所示，確定分別具有失活之nfrA、nfrB、nfrAB、tsx以及fhuA基因之菌株之糖消耗速率高於母菌株(KCCM10910P)之糖消耗速率。亦確定在48小時之時段期間菌株之生產速率沒有降低。同時，確定分別具有失活之lamB及btuB基因之菌株之糖消耗速率與母菌株之糖消耗速率類似，或略慢於母菌株之糖消耗速率。亦確定在48小時之後，培養物之菌株中所示之L-蘇胺酸濃度均類似。分別具有失活之nfrA、nfrB及nfrAB基因之菌株產生相同培養結果。亦即，兩種基因之一缺失之情況以及兩種基因皆缺失之情況產生相同結果。
為了確定糖消耗能力增加的nfrAB、fhuA以及tsx基因之組合失活在L-蘇胺酸生產菌株中是否具有更強糖消耗能力之情況，製備KCCM10910P△nfrAB△fhuA菌株、KCCM10910P△nfrAB△tsx菌株以及KCCM10910P△nfrAB△tsx△fhuA菌株。為了製備這些菌株，以與實例1中所述相同之方式，根據實例1-3之KCCM10910P△nfrAB菌株製備分別具有失活之fhuA及tsx基因之菌株(產生KCCM10910P△nfrAB△fhuA及KCCM10910P△nfrAB△tsx菌株)。另外，根據KCCM10910P△nfrAB△tsx菌株製備具有失活之fhuA基因之菌株，由此最終製備出KCCM10910P△nfrAB△tsx△fhuA菌株。
如表2中所示，測定具有失活之nfrA、nfrB以及nfrAB基因之菌株彼此具有相同之作用。就此而言，在具有有效突變組合之菌株之製備中，藉由使用具有失活之nfrAB基因之菌株來製備具有失活之tsx及fhuA基因之菌株。然而，具有失活之tsx及fhuA基因之菌株的作用經測定與僅具有失活之nfrA基因、僅具有失活之nfrB基因或具有同時失活之nfrA及nfrB基因之菌株的作用相同。
為了比較以上製備的具有有效突變組合之菌株之L-蘇胺酸生產能力，以與上述相同之方式，使用含有上表1中所示組成之培養基培養菌株。結果展示於下表3中。
依據對KCCM10910P△nfrAB△fhuA菌株、KCCM10910P△nfrAB△tsx菌株以及KCCM10910P△nfrAB△tsx△fhuA菌株(分別根據糖消耗能力增加之nfrAB、fhuA以及tsx基因之組合失活製備)之效力測試結果，確定除nfrAB基因突變之外進一步使fhuA基因或tsx基因失活之菌株僅增加糖消耗能力。因此，展示增加之糖消耗能力之經轉型KCCM10910P△nfrAB菌株稱為『大腸桿菌CA03-8253P』，且接著在2013年12月13日寄存於韓國微生物培養中心(KCCM)(寄存編號：KCCM 11501P)。
以與實例1及實例3中所述相同之方式，根據7類實例1之失活卡匣，使用KCCM-10132菌株製備10類各自具有失活之噬菌體受體之菌株(參見下表4)。韓國專利第10-0270510號中揭露KCCM-10132菌株為來源於大腸桿菌之具有蘇胺酸生產能力之菌株。
藉由與實例2中所述相同之方法，將使用實例4-1之
KCCM-10132菌株製備的10類各自具有失活之噬菌體受體之菌株以及母菌株(KCCM-10132)培養於含有表1中所示組成之培養基中。接著，藉由比較其蘇胺酸生產能力來評估所培養之菌株。
如上表4中所示，確定分別具有失活之nfrA、nfrB、nfrAB、tsx以及fhuA基因之菌株之糖消耗速率高於母菌株(KCCM-10132)之糖消耗速率。亦確定在48小時之時段中菌株之生產速率沒有降低。同時，確定分別具有失活之lamB及btuB基因之菌株的糖消耗速率與母菌株之糖消耗速率類似，或略慢於母菌株之糖消耗速率。亦確定在48小時之後，培養物之菌株中所示之L-蘇胺酸濃度均類似。亦確定相比於僅具有失活之nfrAB基因之菌株的糖消耗速率，分別具有同時失活之nfrAB、fhuA、nfrAB以及tsx基因以及同時失活之nfrAB、tsx以及fhuA基因之菌株的糖消耗速率提高。
以與實例1中所述相同之方式，根據7類實例1之失活卡匣，使用KCCM11166P製備7類各自具有失活之噬菌體受體之色胺酸生產菌株(韓國專利第10-1261147號)。
為了評估使用實例5-1之KCCM11166P菌株製備的7類各自具有失活之噬菌體受體之色胺酸生產菌株的生產能力，使用含有下表5中所示組成之培養基。亦即，藉由鉑環接種微生物細胞，且接著在LB固體培養基中隔夜培養。隨後，將1個鉑環的每種微生物細胞接種於25毫升含有下表5中所示組成之滴度培養基中，且接著在恆溫箱中在37℃及200轉/分鐘下培養48小時。由此獲得之結果示於下表6中。
如上表6中所示，在nfrA、nfrB、nfrAB、tsx以及fhuA基因中之每一者缺失之情況下，確定分別具有失活之nfrA、nfrB、nfrAB、tsx以及fhuA基因之菌株中所生產之色胺酸之量類似，而分別具有失活之nfrA、nfrB、nfrAB、tsx以及fhuA基因之菌株的糖消耗速率略高於其他菌株。同時，在lamB及btuB基因中之每一者缺失之情況下，確定分別具有失活之lamB及btuB基因之菌株所生產之色胺酸的量或分別具有lamB及btuB基因失活之菌株之糖消耗速率無變化。
為了確定糖消耗能力增加的nfrAB、fhuA以及tsx基因之組合失活在色胺酸生產菌株中是否具有更強糖消耗能力之情況，製備KCCM11166P△nfrAB△fhuA菌株、KCCM11166P△nfrAB△tsx菌株以及KCCM11166P△nfrAB△tsx△fhuA菌株。
為了比較根據實例6-1製備之三類菌株之L-色胺酸生產能力，以與實例5中所述相同之方式，使用含有上表5中所示組成之培養基培養菌株。結果展示於下表7中。
依據對具有有效突變組合之色胺酸生產菌株之效力測試的結果，確定除nfrAB基因突變之外進一步使fhuA基因或/及tsx基因失活之菌株僅增加糖消耗能力。
應理解，本文中描述之例示性實施例應僅視為具有描述性意義，且並非出於限制之目的。每個實施例內之特徵或態樣的描述通常應視為可用於其他實施例中之其他類似特徵或態樣。儘管已參照圖式描述本發明之一個或超過一個實施例，但所屬領域中具有通常知識者應理解，在不背離如以下申請專利範圍所界定之本發明之精神和範疇的情況下，可以在其中對形式和細節進行各種改變。
[國內寄存資訊]
寄存機構：財團法人食品工業發展研究所
寄存日期：2015年6月16日
寄存編號：BCRC910681
[國外寄存資訊]
寄存機構：韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(國際)
寄存日期：2013年12月13日
寄存編號：KCCM11501P
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Claims (8)
- 一種生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中使NfrA及NfrB中之至少一者失活。
- 如申請專利範圍第1項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中所述NfrA包括SEQ ID NO：40之胺基酸序列並且所述NfrB包括SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中進一步使Tsx及FhuA中至少一者失活。
- 如申請專利範圍第3項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中所述Tsx包括SEQ ID NO：45之胺基酸序列並且所述FhuA包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中所述L-胺基酸為L-蘇胺酸或L-色胺酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物，其中所述重組微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
- 一種生產L-胺基酸之方法，所述方法包括：培養如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之生產L-胺基酸之艾氏菌屬之重組微生物；以及自培養物收集L-胺基酸。
- 如申請專利範圍第7項所述之生產L-胺基酸之方法，其中所述L-胺基酸為L-蘇胺酸或L-色胺酸。
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