ES2720032T3

ES2720032T3 - Microorganismos que producen L-aminoácidos y proceso para producir L-aminoácidos usando los mismos

Info

Publication number: ES2720032T3
Application number: ES15765883T
Authority: ES
Inventors: Ji Sun Lee; Chang Il Seo; Ki Yong Cheong; Eun Sung Koh; Do Hyun Kwon; Kwang Ho Lee
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2019-07-17
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: TWI547558B; AR099810A1; DK3119875T3; TW201538724A; EP3119875A1; US10202609B2; PL3119875T3; BR112016017281B1; UA114997C2; WO2015142020A1; KR20150109989A; EP3119875A4; JP2019047790A; CN105980544A; EP3119875B1; KR101608734B1; US20170044553A1; MY181143A; JP2017504359A; CN105980544B

Abstract

Un microorganismo recombinante del género Escherichia que produce L-aminoácido en el que al menos una de NfrA y NfrB está inactivada.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos que producen L-aminoácidos y proceso para producir L-aminoácidos usando los mismos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante que produce un L-aminoácido y un método para producir un L-aminoácido usando el microorganismo recombinante.

Técnica antecedente

Se han usado diversos procesos de fermentación usando microorganismos para producción en masa de metabolitos útiles, por ejemplo, aminoácidos, y asimismo, se han desarrollado una diversidad de técnicas incluyendo desarrollo de cepas, establecimiento de condiciones de fermentación, o similares, para la fermentación exitosa usando los microorganismos. En particular, para el desarrollo de una cepa hospedadora para producción en masa de metabolitos útiles, se han realizado muchos intentos de inducir sobreexpresión o expresión baja de un gen específico.

Sin embargo, en la producción fermentativa usando bacterias, la producción de metabolitos útiles puede reducirse debido a la contaminación de fagos. La contaminación de fagos está provocada principalmente debido a receptores de fagos, que son proteínas, polisacáridos lipídicos, o similares, que son capaces de unir fagos a una superficie bacteriana. En el caso de Escherichia coli (E. coli), E. coli es atacada por una diversidad de fagos y, en consecuencia, el estudio de receptores para cada uno de los fagos ha sido relativamente exitoso. Sin embargo, el estudio de la relación entre los receptores de fagos y la producción de L-aminoácidos no se ha llevado a cabo aún lo suficiente.

A este respecto, los inventores de la presente invención seleccionan genes que son receptores de fagos bien conocidos y, después, inactivan cada uno de los genes, para reducir el riesgo de la reducción de la producción de L-aminoácidos, considerándose el riesgo una vulnerabilidad de E. coli. A continuación, se confirma la influencia en la producción de L-aminoácidos, y dicha selección e inactivación de los genes se aplica a cepas productoras de L-aminoácidos, completando de esta forma la presente invención.

Divulgación de la invención

Problema técnico

La presente invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene capacidad de producción de L-aminoácidos y un receptor de fago inactivado.

La presente invención proporciona un método de producción de un L-aminoácido usando el microorganismo.

Solución al problema

En un aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante que produce L-aminoácido en el que al menos una de NfrA y NfrB están inactivadas.

El término "NrfA" como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína que forma un receptor para bacteriófago N4 y puede ser una proteína de membrana de bacterias. Por ejemplo, NrfA puede ser una subunidad de una proteína de membrana externa. La NfrA puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. La NfrA puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. Una secuencia de un gen que codifica la NfrA puede incluir una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. La secuencia del gen que codifica la NfrA puede incluir, por ejemplo, una secuencia de un gen nfrA (NCBI Gene ID: 12930896). Por ejemplo, la secuencia del gen que codifica la NfrA puede incluir una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 39, o una secuencia polinucleotídica que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 39.

El término "NrfB" como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína que forma un receptor para bacteriófago N4 y puede ser una proteína de membrana de bacterias. Por ejemplo, NrfB puede ser una subunidad de una proteína de membrana interna. La NfrB puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. La NfrB puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. Una secuencia de un gen que codifica la NfrB puede incluir una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. La secuencia del gen que codifica la NfrB puede incluir, por ejemplo, una secuencia de un gen nfrB (NCBI Gene ID: 12933943). Por ejemplo, la secuencia del gen que codifica la proteína NfrB puede incluir una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 41, o una secuencia polinucleotídica que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 41.

Además, en el microorganismo recombinante que produce un L-aminoácido, puede inactivarse adicionalmente al menos uno de Tsx y FhuA.

El término "Tsx" como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína formadora de un canal de nucleósidos, es decir, un canal específico para un nucleósido, y puede ser un componente que forma un receptor para fago T6 y colicina K. La Tsx puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. Una secuencia de un gen que codifica la Tsx puede incluir una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. La secuencia del gen que codifica la Tsx puede incluir, por ejemplo, una secuencia de un gen tsx (NCBI Gene ID: 12934188). Por ejemplo, la secuencia del gen que codifica la Tsx puede incluir una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 44, o una secuencia polinucleotídica que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 44.

La expresión "FhuA" como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína multifuncional en una membrana externa de bacterias que transporta (Fe3+) ferricromo o antibióticos, tal como albomicina y rifamicina, y puede ser un receptor para fagos T1, T5 y phi80. La FhuA puede incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47. Una secuencia de un gen que codifica la FhuA puede incluir una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47. La secuencia del gen que codifica la proteína FhuA puede incluir, por ejemplo, una secuencia de un gen fhuA (NCBI Gene ID: 12930751). Por ejemplo, la secuencia del gen que codifica la FhuA puede incluir una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 47, o una secuencia polinucleotídica que tiene aproximadamente 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más o 95 % o más identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 47.

El término "identidad" como se utiliza en el presente documento se refiere a igualdad entre dos secuencias de aminoácidos, que puede determinarse mediante un método que es bien conocido en la técnica, por ejemplo, el algoritmo BLASt 2.0 que define parámetros, tales como una puntuación, una identidad y una similitud entre dos secuencias de aminoácidos.

La expresión "microorganismo recombinante" como se utiliza en el presente documento se refiere a un microorganismo que está modificado genéticamente. El microorganismo recombinante puede ser un microorganismo que está modificado por ingeniería genética y, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede introducirse en un microorganismo según métodos de ingeniería genética, o puede transformarse una secuencia o localización de un gen endógeno en un microorganismo.

La expresión "L-aminoácido" como se utiliza en el presente documento se refiere a una unidad estructural básica de una proteína que constituye el cuerpo de un organismo y que tiene tanto un grupo amino como un grupo ácido carboxílico que se unen con el mismo átomo de carbono. Por ejemplo, el L-aminoácido puede seleccionarse del grupo que consiste en L-leucina, L-fenilalanina, L-lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptófano y L-metionina. Por ejemplo, el L-aminoácido puede ser L-triptófano o L-treonina.

La expresión "una enzima o una proteína se inactiva" o "inactivación de una enzima o una proteína" como se utiliza en el presente documento se refiere a un caso donde la proteína anteriormente descrita no se expresa en absoluto en un microorganismo, un caso donde la proteína anteriormente descrita se expresa, pero no tiene ninguna actividad, o un caso donde la proteína anteriormente descrita se expresa, pero la actividad de la misma es débil en comparación con la actividad intrínseca. La expresión "actividad intrínseca" como se utiliza en el presente documento se refiere a la actividad de un microorganismo en un estado natural, es decir actividad que existe originalmente en un microorganismo, o actividad de una proteína que no se ha modificado genéticamente.

La inactivación de la proteína NfrA, la proteína NfrB, la proteína Tsx y la proteína FhuA puede estar provocada por mutación, supresión o alteración de genes que codifican cada uno la proteína NfrA, la proteína NfrB, la proteína Tsx y la proteína FhuA. La expresión "mutación, supresión o alteración de los genes" como se utiliza en el presente documento se refiere a un caso donde una parte o todos los genes o factores reguladores en regiones promotoras o terminadoras de los genes se mutan, sustituyen, suprimen o insertan con al menos una base, de modo que los genes no se expresan o los genes se expresan en una cantidad pequeña, o los genes se expresan sin mostrar actividad enzimática o con actividad enzimática reducida. La mutación, supresión o alteración de los genes puede conseguirse por manipulación genética, tal como recombinación homóloga, mutagénesis o evolución molecular. Cuando una célula incluye una pluralidad de los mismos genes o al menos dos genes homólogos, uno o más genes pueden suprimirse o alterarse en la célula. Para inactivar los genes proporcionados en una realización de la presente invención, pueden llevarse a cabo métodos de fabricación de un mutante usando una Red recombinasa lambda.

El microorganismo recombinante retira o reduce la actividad de cada una de las proteínas proporcionadas en el presente documento o las proteínas en combinación. En consecuencia, el microorganismo recombinante puede tener capacidad de producción potenciada del L-aminoácido en comparación con el caso donde la actividad de las proteínas no está inactivada y, por tanto, el microorganismo recombinante puede usarse de forma apropiada para el fin de producir el L-aminoácido.

El microorganismo recombinante, puede ser un microorganismo del género Escherichia, el microorganismo del género Escherichia puede ser Escherichia coli (E. coli), por ejemplo, KCCM11501P. La KCCM11501P es una cepa KCCM10910PAnfrAB preparada usando una cepa productora de treonina (KCCM10910P) como una cepa original y realizar supresión de los genes tanto nfrA como nfrB. En este caso, se ha descubierto que la capacidad de consumo de azúcar en la E. coli KCCM11501P es mayor que en la cepa original (KCCM10910P). La KCCM11501P se denominó ’E. coli CA03-8253P' y, después, se depositó en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (en lo sucesivo en el presente documento, denominado ’KCCM’) el 13 de diciembre de 2013 según el tratado de Budapest.

Según otro aspecto de la presente invención, se desvela un método para producir el L-aminoácido, incluyendo el método: cultivar el microorganismo recombinante que produce el L-aminoácido; y recoger el L-aminoácido del producto de cultivo.

El microorganismo recombinante que produce el L-aminoácido se define igual que se ha descrito anteriormente.

El L-aminoácido puede seleccionarse del grupo que consiste en L-leucina, L-fenilalanina, L-lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptófano y L-metionina. Por ejemplo, el L-aminoácido puede ser L-treonina o L-triptófano. El cultivo del microorganismo recombinante puede conseguirse de acuerdo con un medio de cultivo apropiado y condiciones de cultivo que se conocen bien en la técnica. Además, un experto habitual en la materia puede ajustar de forma apropiada un medio de cultivo y condiciones de cultivo según el microorganismo seleccionado. El método de cultivo puede incluir un cultivo discontinuo, un cultivo continuo, un cultivo semicontinuo, o una combinación de los mismos.

El medio de cultivo puede incluir una diversidad de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno e ingredientes oligoelementos.

Las fuentes de carbono pueden incluir, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcohol, tal como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos, tales como ácido acético, o una combinación de los mismos. El cultivo del microorganismo recombinante puede realizarse usando glucosa como una fuente de carbono. Las fuentes de nitrógeno pueden incluir, por ejemplo, fuentes de nitrógeno orgánicas, tales como peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, agua de macerado de maíz (AMM) y harina de soja; y fuentes de nitrógeno inorgánicas, tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; o una combinación de los mismos. El medio de cultivo puede incluir, como una fuente de fósforo, dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato de potasio. Además, el medio de cultivo puede incluir sales que contienen sodio correspondientes a la fuente de fósforo y sales metálicas, tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, el medio de cultivo puede incluir aminoácidos, vitaminas y precursores apropiados. El medio o los ingredientes individuales del medio pueden añadirse al medio de cultivo de una manera discontinua o continua.

Además, pueden añadirse compuestos, tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico al medio de cultivo durante el cultivo del microorganismo recombinantes de una manera apropiada, para ajustar el pH del medio de cultivo. Además, pueden usarse agentes antiespumantes, tales como éster poliglicólico de ácidos grasos, durante el cultivo del microorganismo recombinante, para suprimir la producción de burbujas de aire. Para mantener las condiciones aeróbicas del medio de cultivo, puede inyectarse oxígeno o gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) en el medio de cultivo. En este caso, una temperatura del medio de cultivo puede estar habitualmente en un intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C. Un periodo del cultivo del microorganismo recombinante puede durar hasta que se obtenga una cantidad deseada del L-aminoácido y, por ejemplo, el cultivo del microorganismo recombinante puede durar de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 160 horas.

La expresión "producto de cultivo" como se utiliza en el presente documento se refiere a un caldo de cultivo que contiene el microorganismo recombinante, un sobrenadante de cultivo del que se retira una célula microbiana o una solución diluida del producto de cultivo. El medio de cultivo puede incluir además un ingrediente para aumentar la productividad del L-aminoácido. Por ejemplo, la composición puede incluir además fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno o ingredientes oligoelementos.

La recogida del L-aminoácido del producto de cultivo puede realizarse mediante métodos de cultivo apropiados conocidos en la técnica, tales como un cultivo discontinuo, un cultivo continuo o un cultivo semicontinuo, para recoger o recuperar el L-aminoácido producido en el producto de cultivo.

Efectos ventajosos de la invención

Según un aspecto, puede usarse un microorganismo con actividad eliminada o reducida de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en NfrA y NfrB para producir un L-aminoácido. El microorganismo puede tener adicionalmente al menos uno de Tsx y FhuA inactivado.

Según otro aspecto, puede usarse un método para producir un L-aminoácido para producir un L-aminoácido de una manera eficaz.

Modo de la invención

En lo sucesivo en el presente documento, a presente invención se describirá en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son únicamente para fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1. Preparación de cepa productora de treonina que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM10910P

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un receptor de fago inactivado, se usó una cepa KCCM10910P (patente coreana n.° 10-0966324) como una cepa original. Después, se preparó un casete para inactivar un gen para cada receptor de fago y, después, se usó para permitir la transformación genética.

1-1. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen nfrA inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen nfrA inactivado, se preparó un casete para inactivar un gen nfrA. El casete usó un método de inactivación en una etapa, que es una técnica de construcción de un mutante usando Red recombinasa lambda desarrollada por Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645). Para confirmar la inserción del casete en el gen, se usó un gen resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC como un marcador (publicación abierta a inspección pública de patente coreana n.°: 2009-007554).

Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb que incluía una parte de una secuencia del gen nfrA (SEQ ID NO: 39) y una parte de una secuencia de bases del gen resistente a cloranfenicol de un pUCprmfmloxC usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 2 y 3. En este caso, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "PCR") usando un kit de premezcla de PCR (es decir, un producto de la compañía BIONEER, en lo sucesivo en el presente documento, se usó el mismo producto) en las siguientes condiciones: 27 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y elongación a 72 °C durante 1 minuto. El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y, después, se eluyó. A continuación, se realizó de nuevo PCR usando el producto eluido como un molde y un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 4 en las mismas condiciones descritas anteriormente, dando como resultado un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kb. El fragmento de ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %, se eluyó y, después, se usó finalmente para preparar el casete para inactivar el gen nrfA.

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene el gen nfrA inactivado, se preparó una cepa productora de treonina (KCCM10910P), que se transformó con un plásmido pKD46 según el método desarrollado por Datsenko KA ^{et al.} ^{(Proc Natl Acad Sci}Usa., ^{(2000) 97:6640-6645), como una cepa competente. Después, Se introdujo ADN del}casete preparado para inactivar el gen nfrA en la cepa para permitir la transformación.

La cepa obtenida se seleccionó en una placa de LB que tenía resistencia a cloranfenicol. Es decir, se usó un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6, que tiene una secuencia de ADN que queda fuera de dos extremos de una secuencia homóloga de nfrA del casete para inactivación genómica, para seleccionar de este modo colonias donde el tamaño del producto de PCR resultante se redujo de 2,8 kb a 1,5 kb.

La cepa recombinante primaria que tenía resistencia a cloranfenicol se retiró del plásmido pKD46 y, después, se le introdujo un plásmido pJW168 para retirar el gen marcador de cloranfenicol de las células microbianas (Gene, (2000) 247,255-264). Después, se realizó PCR usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6 para obtener un producto de ADN de 0,4 kb, lo que indica que la cepa finalmente obtenida tenía un tamaño de ADN reducido. En consecuencia, se preparó la cepa productora de L-treonina que tiene el gen nfrA inactivado (KCCM10910PAnfrA).

1-2. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen nfrB inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen nfrB inactivado (SEQ ID NO: 41), un casete para inactivar un gen nfrB se preparó de la misma manera que en la preparación del casete para inactivar el gen nfrA del Ejemplo 1-1. Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 8 y 9 y, después, se preparó un fragmento de ADN de 1,2 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 10.

Se llevó a cabo un método para preparar una cepa productora de treonina que tiene el gen nfrB inactivado por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 11 y 12 se usó para confirmar el tamaño del producto de PCR resultante. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene el gen nfrB inactivado (KCCM10910PAnfrB).

1-3. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen nfrAB inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen nfrAB inactivado (SEQ ID NO: 43), un casete para inactivar un gen nfrAB se preparó de la misma manera que en la preparación del casete para inactivar el gen nfrA del Ejemplo 1-1. Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 2 y 9 y, después, se preparó un fragmento de ADN de 1,2 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 y 10.

Se llevó a cabo un método para preparar una cepa productora de treonina que tiene el gen nfrAB inactivado por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 12 se usó para confirmar el tamaño del producto de PCR resultante. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene el gen nfrAB inactivado (KCCM10910PAnfrAB).

1-4. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen tsx inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen tsx inactivado (SEQ ID NO: 44), un casete para inactivar un gen tsx se preparó de la misma manera que en la preparación del casete para inactivar el gen nfrA del Ejemplo 1-1. Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 13 y 14 y, después, se preparó un fragmento de ADN de 1,2 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 15 y 16.

Se llevó a cabo un método para preparar la cepa productora de treonina que tiene el gen tsx inactivado por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 17 y 18 se usó para confirmar el tamaño del producto de PCR resultante. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene gen tsx inactivado (KCCM10910PAtsx).

1-5. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen fhuA inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen fhuA inactivado (SEQ ID NO: 46), un casete para inactivar un gen fhuA se preparó según el método de inactivación de una etapa descrita anteriormente. Para obtener un fragmento de ADN con una secuencia de bases que tiene homología con una secuencia del gen fhuA, se usaron un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 19 y 20 y un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 21 y 22, dando como resultado la producción de productos de PCR. Además, para obtener un fragmento de ADN con una secuencia de bases que tiene resistencia a cloranfenicol, se usó un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 23 y 24, dando como resultado la producción de un producto de PCR. En consecuencia, estos tres productos de PCR resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y, después, se eluyeron. Se realizó PCR usando estos tres productos de PCR eluidos como moldes y un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 19 y 22 para preparar un casete para inactivar el gen fhuA.

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene el gen fhuA inactivado, el casete para inactivar el gen fhuA se preparó por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 25 y 26 se usó para confirmar el tamaño de los productos de PCR resultantes. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene el gen fhuA inactivado (KCCM10910PAfhuA).

1-6. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen lamB inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen lamB inactivado (SEQ ID NO: 48), un casete para inactivar un gen lamB se preparó según el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1. Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 27 y 28 y, después, se preparó un fragmento de ADN de 1,2 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 29 y 30.

Se llevó a cabo un método para preparar la cepa productora de treonina que tiene el gen lamB inactivado por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 31 y 32 se usó para confirmar el tamaño del producto de PCR resultante. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene gen lamB inactivado (KCCM10910PAlamB).

1-7. Preparación de cepa productora de treonina que tiene gen btuB inactivado

Para preparar una cepa productora de treonina que tiene un gen btuB inactivado (SEQ ID NO: 50), un casete para inactivar un gen btuB se preparó según el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1. Se obtuvo un fragmento de ADN de 1,1 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 33 y 34 y, después, se preparó un fragmento de ADN de 1,2 kb usando un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 35 y 36.

Se llevó a cabo un método para preparar la cepa productora de treonina que tiene el gen btuB inactivado por el mismo método descrito en el Ejemplo 1-1, en donde un conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 37 y 38 se usó para confirmar el tamaño del producto de PCR resultante. En consecuencia, se preparó finalmente la cepa productora de L-treonina que tiene el gen btuB inactivado (KCCM10910PbtuB).

Ejemplo 2. Comparación de la productividad de L-treonina entre microorganismos recombinantes

Los microorganismos recombinantes preparados según el Ejemplo 1 se cultivaron en un medio de titulación de treonina que contiene composiciones mostradas en la Tabla 1 posterior, en un matraz de Erlenmeyer. Después, se confirmó si los microorganismos recombinantes tenían capacidad de producción de L-treonina.

Tabla 1

T l 1

Se inoculó 1 asa de platino de cada uno de los 7 tipos de las cepas de E. coli del Ejemplo 1 y la cepa KCCM10910P que se cultivaron durante una noche en el medio sólido de LB en un incubador a 33 °C en 25 ml de un medio de titulación que contenía composiciones mostradas en la Tabla 1 anterior y, después, se cultivó en un incubador a 33 °C y a 200 rpm durante 48 horas.

Tabla 2

T l 2

Como se muestra en la Tabla 2 anterior, se ha confirmado que las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una los genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx y fhuA inactivados fueron mayores que la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original (KCCM10910P). También se confirmó que la tasa de producción de las cepas no se redujo durante un periodo de 48 horas. Al mismo tiempo, se confirmó que las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una los genes lamB y btuB inactivados fueron similares a la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original, o ligeramente más lentas que la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original. También se confirmó que las concentraciones de L-treonina mostradas en las cepas del cultivo después de 48 horas fueron todas similares. Las cepas que tenían cada una los genes nfrA, nfrB, y nfrAB inactivados dieron como resultado los mismos resultados de cultivo. Es decir, el caso donde se suprimió uno de los dos genes y el caso donde se suprimieron ambos genes generaron los mismos resultados.

Ejemplo 3. Preparación de cepas con combinación de mutaciones eficaz y comparación en la capacidad de producción de L-treonina de las mismas

3-1. Preparación de cepas que tienen genes nfrAB y fhuA inactivados simultáneamente, genes nfrAB y tsx inactivados simultáneamente y genes nfrAB, tsx y fhuA inactivados simultáneamente

Para confirmar si el caso donde la inactivación combinada de los genes nfrAB, fhuA, y tsx que tienen capacidad de consumo de azúcar aumentada tiene capacidad de consumo de azúcar adicional en las cepas productoras de L-treonina, se prepararon una cepa KCCM10910PAnfrABA fhuA, una cepa KCCM10910P AnfrABAtsx y una cepa KCCM10910PAnfrABAtsxA fhuA. Con el fin de preparar estas cepas, se prepararon cepas que tenían cada una los genes fhuA y tsx inactivados de acuerdo con la cepa KCCM10910PA nfrAB del Ejemplo 1-3 de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1 (dando como resultado las cepas KCCM10910P AnfrABAfhuA y KCCM10910PAnfrABAtsx). Además, se preparó una cepa que tenía el gen fhuA inactivado de acuerdo con la cepa KCCM10910PAnfrABAtsx, preparando de este modo finalmente una cepa KCCM10910PAnfrABA tsxAjhuA.

Como se muestra en la Tabla 2, se determinó que las cepas que tenían los genes nfrA, nfrB y nfrAB inactivados tenían los mismos efectos entre sí. A este respecto, en la preparación de cepas con combinaciones de mutaciones eficaces, las cepas que tenían los genes tsx y fhuA inactivados se prepararon usando la cepa que tenía el gen nfrAB inactivado. Sin embargo, se determinó que los efectos de las cepas que tenían los genes tsx y fhuA inactivados eran iguales que los efectos de la cepa que tenía solamente el gen nfrA inactivado, solamente el gen nfrB inactivado o los genes nfrA y nfrB inactivados simultáneamente.

3-2. Comparación en la capacidad de producción de L-treonina de cepas con combinaciones de mutaciones eficaces

Para comparar la capacidad de producción de L-treonina de las cepas con combinación de mutaciones eficaces preparadas anteriormente, se usó un medio que contenía composiciones mostradas en la Tabla 1 anterior para cultivar cepas de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

T l

Como resultado de un ensayo de potencia en la cepa KCCM10910PAnfrABAfhuA, la cepa KCCM10910PAnfrABAtsx y la cepa KCCM10910PAnfrABAtsxAfhuA, cada una preparada de acuerdo con la inactivación combinada de los genes nfrAB, fhuA y tsx que tienen capacidad de consumo de azúcar aumentada, se confirmó que la cepa en la que el gen fhuA o el gen tsx se inactivó adicionalmente además de la mutación por el gen nfrAB solamente aumentó la capacidad de consumo de azúcar. En consecuencia, la cepa KCCM10910PAnfrAB transformada que mostraba capacidad de consumo de azúcar aumentada se denominó ’E. coli CA03-8253P' y, después, se depositó en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (KCCM) el 13 de diciembre de 2013 (N.° de registro: KCCM 11501P).

Ejemplo 4. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM-10132 y comparación en la capacidad de producción de treonina de la misma

4-1. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM-10132

Se prepararon 10 tipos de cepas que tenían cada una un receptor de fago inactivado usando una cepa KCCM-10132 (véase Tabla 4 posterior) de la misma manera que se ha descrito en los Ejemplos 1 y 3, de acuerdo con los 7 tipos de los casetes de inactivación del Ejemplo 1. La cepa KCCM-10132 se desveló en la patente coreana n.°: 10-0270510 como una cepa que tenía capacidad de producción de treonina procedente de E. coli.

4-2. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM-10132 y comparación en la capacidad de producción de treonina de la misma

Los 10 tipos de las cepas que tenían cada una el receptor de fago inactivado que se prepararon usando la cepa KCCM-10132 Del ejemplo 4-1 y la cepa original (KCCM-10132) se cultivaron en un medio que contenía las composiciones mostradas en la Tabla 1 por el mismo método que se describe en el Ejemplo 2. Después, las cepas cultivadas se evaluaron comparando la capacidad de producción de treonina de las mismas.

Tabla 4

[Tabla 4]

Como se muestra en la Tabla 4 anterior, se ha confirmado que las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una los genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx y fhuA inactivados fueron mayores que la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original (KCCM-10132). También se confirmó que la tasa de producción de las cepas no se redujo en un periodo de 48 horas. Al mismo tiempo, se confirmó que las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una los genes lamB y btuB inactivados fueron similares a la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original, o ligeramente más lentas que la velocidad de consumo de azúcar de la cepa original. También se confirmó que las concentraciones de L-treonina mostradas en las cepas del cultivo después de 48 horas fueron todas similares. También se confirmó que las cepas que tenían cada una los genes nfrAB, fhuA, nfrAB y tsx y los genes nfrAB, tsx y fhuA simultáneamente inactivados tenían velocidades de consumo de azúcar mejoradas en comparación con la velocidad de consumo de azúcar de la cepa que tiene solamente en gen nfrAB inactivado.

Ejemplo 5. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM11166P y comparación en la capacidad de producción de treonina de la misma

5-1. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado mediante el uso de KCCM11166P

Se prepararon 7 tipos de cepas productoras de triptófano que tenían cada una un receptor de fago inactivado usando un KCCM11166P (patente coreana n.°: 10-1261147) de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 1, de acuerdo con los 7 tipos de los casetes de inactivación del Ejemplo 1.

5-2. Preparación de cepa que tiene receptor de fago inactivado usando KCCM11166P y comparación en la capacidad de producción de treonina de la misma

Para evaluar la capacidad de producción de los 7 tipos de las cepas productoras de triptófano que tenían cada una el receptor de fago inactivado preparado usando la cepa KCCM11166P del Ejemplo 5-1, se usó un medio que contenía composiciones mostradas en la Tabla 5 a continuación. Es decir, las células microbianas se inocularon mediante un asa de platino y, después, se cultivaron durante una noche en el medio LB sólido. A continuación, se inoculó 1 asa de platino de cada una de las células microbianas en 25 ml de medio de titulación que contenía las composiciones mostradas en la Tabla 5 a continuación y, después, se cultivó en un incubador a 37 °C y a 200 rpm durante 48 horas. Los resultados obtenidos de la misma se muestran en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 5

Tabla 6

T l 1

Como se muestra en la Tabla 6 anterior, en el caso de la supresión de cada uno de los genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx y fhuA, se ha confirmado que las cantidades de triptófano producidas en las cepas que tenían cada una los genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx y fhuA inactivados fueron similares mientras que las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una los genes nfrA, nfrB, nfrAB, tsx y fhuA inactivados fueron ligeramente mayores que otras. Al mismo tiempo, en el caso de la supresión de cada uno de los genes lamB y btuB, se confirmó que las cantidades de triptófano producidas por las cepas que tenían cada una los genes lamB y btuB inactivados o las velocidades de consumo de azúcar de las cepas que tenían cada una la inactivación de genes lamB y btuB no cambiaron.

Ejemplo 6. Preparación de cepas con combinación de mutaciones eficaz y comparación en la capacidad de producción de L-triptófano de las mismas

6-1. Preparación de cepas productoras de L-triptófano que tienen genes nfrAB y fhuA inactivados simultáneamente, genes nfrAB y tsx inactivados simultáneamente y genes nfrAB, tsx y fhuA inactivados simultáneamente

Para confirmar si el caso donde la inactivación combinada de los genes nfrAB, fhuA y tsx que tienen capacidad de consumo de azúcar aumentada tiene capacidad de consumo de azúcar adicional en las cepas productoras de triptófano, se prepararon una cepa KCCM11166P AnfrAB A fhuA, una cepa KCCM11166PAnfrABAtsx y una cepa KCCM11166PAnfrABAtsxA fhuA.

6-2. Comparación en la capacidad de producción de L-triptófano de cepas con combinación de mutaciones eficaz

Para comparar la capacidad de producción de L-triptófano de los tres tipos de las cepas preparadas según el Ejemplo 6-1, se usó un medio que contenía composiciones mostradas en la Tabla 5 anterior para cultivar las cepas de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 5. Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

T l 71

Como resultado de un ensayo de potencia en las cepas productoras de triptófano con combinaciones de mutaciones eficaces, se confirmó que las cepas en las que el gen fhuA y/o el gen tsx se inactivó adicionalmente además de la mutación por el gen nfrAB solamente aumentó la capacidad de consumo de azúcar.

[Número de registro]

Institución depositaria: Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (internacional)

Número de registro: KCCM11501P

Fecha de depósito: 13 de diciembre de 2013

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO

INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA

FINES DE PROCEDIMIENTO DE PATENTE

FORMULARIO INTERNACIONAL

Para. CJ CheilJedang Corporation

CJ CHEILJEDANG CENTER. RECIBO EN EL CASO DE UN ORIGINAL expedido conforme a la Norma 7.1 de la AUTORIDAD 330. DONGHO-RO.

JUNG-GU, SEÚL 100-400, DEPOSITARIA INTERNACIONAL identificada en la parte inferior de esta página

REPÚBLICA DE COREA

1 Cuando rija la Norma 6.4(d), dicha fecha es la fecha en la que se adquirió el estado de autoridad depositaria internacional: cuando un depósito realizado fuera del Tratado de Budapest después de la adquisición del estado de autoridad depositaria internacional se convierte en un depósito bajo el Tratado de Budapest, dicha fecha es la fecha en la que el microorganismo fue recibido por la autoridad depositaria internacional.

Formulario BP/4 Página única

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo recombinante del género Escherichia que produce L-aminoácido en el que al menos una de NfrA y NfrB está inactivada.

2. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde la NfrA comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 y la NfrB comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

3. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde se inactiva adicionalmente al menos uno de Tsx y FhuA.

4. El microorganismo recombinante de la reivindicación 3, en donde la Tsx comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y la FhuA comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47.

5. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde el L-aminoácido es L-treonina o L-triptófano.

6. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante es Escherichia coli.

7. Un método para producir un L-aminoácido, comprendiendo el método:

cultivar el microorganismo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

recoger un L-aminoácido del cultivo.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el L-aminoácido es L-treonina o L-triptófano.