ES2917498T3

ES2917498T3 - Microorganismo con productividad de L-lisina mejorada y método para producir L-lisina mediante el uso del mismo

Info

Publication number: ES2917498T3
Application number: ES15837358T
Authority: ES
Inventors: Lan Huh; Kwang Ho Lee; Hyung Joon Kim; Jun Ok Moon; Song-Gi Ryu
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-04
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2035-09-04
Also published as: JP6464260B2; DK3196300T3; WO2016036191A1; EP3196300A1; RU2668176C1; KR20160029964A; BR112017004368A2; CN106715688A; EP3196300A4; US20180037615A1; KR101755767B1; US10676512B2; JP2017525381A; EP3196300B1; CN111676205B; MY180044A; PL3196300T3; CN111676205A

Abstract

La presente divulgación se relaciona con un nuevo polipéptido de factor ARN de ARN polimerasa ARN modificado A (SIGA); un polinucleótido que codifica lo mismo; un microorganismo que contiene el polipéptido; y un método para producir L-lisina utilizando el microorganismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo con productividad de L-lisina mejorada y método para producir L-lisina mediante el uso del mismo Campo Técnico

La presente invención se refiere a un polipéptido novedoso de factor sigma A (SigA) de la ARN polimerasa modificado, un polinucleótido que codifica el mismo, un microorganismo que contiene el polipéptido y, un método para producir L-lisina mediante el uso del microorganismo.

Antecedentes de la técnica

Las cepas de microorganismos con mayor capacidad de producción pueden desarrollarse mediante el descubrimiento y la utilización adecuada de factores genéticos, que están directa/indirectamente implicados en las primeras etapas de la glucólisis, para la preparación de cepas que produzcan productos útiles tales como aminoácidos a gran escala. Los ejemplos representativos de las tecnologías que se usarán para este fin pueden incluir la ingeniería de maquinaria de transcripción global (gTME), que es un enfoque para regular la expresión de todos los genes en una célula mediante la inducción de mutagénesis aleatoria en las proteínas reclutadoras de la ARN polimerasa. Por ejemplo, un grupo de investigación en el Instituto de Tecnología de Massachusetts ha demostrado tener éxito en aumentar significativamente la capacidad de producción de tirosina en E. coli mediante el uso de la tecnología gTME (Patente de Estados Unidos Núm. 8735132).

La ARN polimerasa usada en la etapa de transcripción en microorganismos es una macromolécula que consiste de 5 subunidades pequeñas, es decir, dos factores a, un factor p, un factor p' y un factor u>, y su holoenzima se indica mediante a2pp'u>. Los factores sigma (a), junto con la holoenzima, son factores esenciales para la etapa de iniciación de la transcripción, que proporciona una especificidad de unión al promotor de la ARN polimerasa. Una cepa de Corynebacterium tiene 7 tipos de factores sigma (SigA, SigB, SigC, SigD, SigE, SigH y SigM) que regulan la transcripción de grupos de genes particulares de acuerdo con los cambios en el entorno externo (Journal of Biotechnology 154. 2011. 101-113). En particular, SigA es un regulador importante entre los factores sigma involucrados en la regulación de la mayoría de los genes de mantenimiento y genes centrales. De acuerdo con los informes de estudios anteriores, se hicieron intentos para mejorar la capacidad de producción de los materiales diana mediante mutagénesis aleatoria de SigA (Metabolic Engineering 9. 2007. 258-267) y también hubo un informe sobre el estudio del aumento de la capacidad de producción de L-lisina mediante el uso de una cepa de Corynebacterium (Publicación internacional núm. WO 2003-054179).

Descripción

Problema técnico

Dadas las circunstancias, los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un microorganismo que tenga capacidad de producción de L-lisina en una concentración aumentada sin inhibir el crecimiento de una célula hospedera. Como resultado, han confirmado que puede desarrollarse un microorganismo del género Corynebacterium con mayor capacidad de producción de L-lisina mediante la introducción de un tipo novedoso modificado de polipéptido de SigA de la ARN polimerasa en el microorganismo después del desarrollo del microorganismo, que se contempla de esta manera en la presente descripción.

Solución técnica

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Un objeto de la presente descripción es proporcionar un polipéptido modificado que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que tiene una actividad de sigma factor A de la ARN polimerasa, en el que una parte de los aminoácidos del polipéptido se sustituye de acuerdo con las reivindicaciones.

Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifique el polipéptido modificado de acuerdo con las reivindicaciones.

Un objeto adicional de la presente descripción es proporcionar un microorganismo transformado que codifica el polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones.

Un objeto adicional más de la presente descripción es proporcionar un método para producir L-lisina de acuerdo con las reivindicaciones, que incluye obtener un medio de cultivo al cultivar el microorganismo y recuperar L-lisina del medio de cultivo o del microorganismo cultivado.

Efectos Ventajosos de la Descripción

La presente descripción permite la confirmación de si cualquier polipéptido modificado que tenga un factor A sigma de la ARN polimerasa modificado puede regular positivamente la capacidad de producción de L-lisina. Adicionalmente, en base a lo anterior, el microorganismo capaz de expresar el polipéptido modificado correspondiente tiene una capacidad de producción de L-lisina extremadamente excelente. En consecuencia, se espera que el microorganismo proporcione los efectos de reducción de costes de producción, comodidad en la producción, etc., desde el aspecto industrial.

Mejor Modo

Para lograr los objetos anteriores, en un aspecto, la presente descripción proporciona un polipéptido modificado que tiene una actividad novedosa de factor A sigma de la ARN polimerasa.

Como se usa en la presente descripción, el término "factor A sigma (SigA) de la ARN polimerasa" se refiere a un factor de iniciación de la transcripción que actúa junto con la ARN polimerasa, y es una proteína (SigA) correspondiente a uno de los factores sigma. Los factores sigma están implicados en la regulación de la transcripción al interactuar con el ADN aguas arriba (un elemento UP), que está presente aguas arriba de un promotor particular y varios factores de transcripción. En particular, SigA se conoce como un importante regulador que controla la mayoría de los genes centrales. La información sobre la proteína SigA puede obtenerse de una base de datos conocida como NCBI GenBank, por ejemplo, una proteína que tiene el núm. de acceso de NP_601117. Específicamente, la proteína SigA puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, pero la secuencia no se limita a esta, siempre que la proteína tenga la misma actividad que la proteína SigA de la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "un polipéptido modificado" se refiere a un polipéptido en el que se sustituye una parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de tipo salvaje. En la presente descripción, el polipéptido modificado se refiere a un polipéptido que tiene la actividad del factor A sigma (SigA) de la ARN polimerasa, en el que una parte de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene el factor A sigma (SigA) de la ARN polimerasa se sustituye de acuerdo con las reivindicaciones, por tanto, se obtiene una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. Es decir, la presente descripción sugiere un polipéptido modificado con SigA, que contribuye a la capacidad de producción de L-lisina, en lugar del polipéptido SigA de tipo salvaje.

Específicamente, el polipéptido modificado es un polipéptido que tiene una actividad de factor sigma A de la ARN polimerasa de acuerdo con las reivindicaciones, en el que al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos en las siguientes posiciones de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 se sustituye con otro aminoácido:

el aminoácido 136; el aminoácido 254; el aminoácido 268; el aminoácido 281; el aminoácido 381; el aminoácido 429; y los aminoácidos 445 a 495, con relación a la metionina iniciadora designada como el primer aminoácido.

Es decir, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido en el que al menos una posición entre las 57 posiciones de aminoácidos para la modificación (el 136, el 254, el 268, el 281, el 381, el 429 y del 445 al 495) se sustituye con otro aminoácido.

Más específicamente, entre los aminoácidos 445 a 495, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el aminoácido 447, el aminoácido 451, el aminoácido 455, el aminoácido 479, el aminoácido 483, el aminoácido 488 y el aminoácido 491 pueden sustituirse con otro aminoácido, pero no se limitan a ellos.

Específicamente, la sustitución de aminoácidos puede ser una combinación de al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos:

una sustitución del aminoácido 136 con glicina (D136G); una sustitución del aminoácido 254 con asparagina (I254N); una sustitución del aminoácido 268 con serina (A268S); una sustitución del aminoácido 281 con serina (T281S); una sustitución del aminoácido 381 con arginina (L381R); una sustitución del aminoácido 429 con arginina (Q429R); una sustitución del aminoácido 447 con histidina (L447H); una sustitución del aminoácido 451 por isoleucina (L451I); una sustitución del aminoácido 455 con valina (M455V); una sustitución del aminoácido 479 con arginina (K479R); una sustitución del aminoácido 483 con arginina (K483R); una sustitución del aminoácido 488 con treonina (S488T); y una sustitución del aminoácido 491 con arginina (Q491R), con respecto a la metionina iniciadora.

Más específicamente, el polipéptido puede ser un polipéptido modificado, en el que el aminoácido 136 y el aminoácido 281 están sustituidos con glicina y serina, respectivamente (D136G, T281S); el aminoácido 254 con asparagina (I254N); el aminoácido 268 con serina (A268S); el aminoácido 381 con arginina (L381R); el aminoácido 429 con arginina (Q429R); el aminoácido 447 con histidina (L447H); los aminoácidos 451 y 491 con isoleucina y arginina, respectivamente (L451I, Q491R); el aminoácido 455 con valina (M455V); el aminoácido 479 con arginina (K479R); el aminoácido 483 con arginina (K483R); y el aminoácido 488 con treonina (S488T); con relación a la metionina iniciadora de un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o se combina al menos un tipo entre las 11 sustituciones de aminoácidos anteriores.

De acuerdo con una modalidad ilustrativa de la presente descripción, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 a 22.

El polipéptido modificado de la presente descripción incluye, sin limitación, no solo las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 12 a 22, sino también las secuencias de aminoácidos que tienen una homología del 70 % o superior, específicamente del 80 % o superior, más específicamente del 90 % o superior, e incluso más específicamente del 99 %, a las secuencias de aminoácidos anteriores, en las que las proteínas han contribuido a la mejora de la capacidad de producción de L-lisina en comparación con la de la proteína SigA de tipo salvaje. Es obvio que cualquier secuencia de aminoácidos que tenga una actividad biológica sustancialmente igual o correspondiente a la proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de la proteína SigA modificada, además de la homología de secuencia anterior, también debe pertenecer al alcance de la presente descripción, aunque el aminoácido puede tener deleción, modificación, sustitución o adición en parte de la secuencia.

Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un grado de identidad entre dos secuencias diferentes de nucleótidos o residuos de aminoácidos en una región de comparación particular de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de un gen que codifica una proteína, después de alinear ambas secuencias a una coincidencia máxima. Cuando la homología es suficientemente alta, los productos de expresión del gen correspondiente pueden tener una actividad igual o similar. La homología puede determinarse mediante el uso de un programa de comparación de secuencias conocido en la técnica, por ejemplo, BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign™ (DNASTAR Inc.), etc.

Otro aspecto de la presente descripción incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado según las reivindicaciones o un vector que incluye el polinucleótido.

Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de cadena de nucleótidos extendida a lo largo por un enlace covalente de unidades de nucleótidos, es decir, una cadena de ADN o ARN que tiene al menos una longitud determinada, y más específicamente, se refiere a un fragmento de polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.

En la presente descripción, el gen que codifica la secuencia de aminoácidos del factor A sigma de la ARN polimerasa (SigA) es el gen rpoD y, específicamente, un gen derivado de Corynebacterium glutamicum. En base a la degeneración del codón, las secuencias de nucleótidos que codifican el mismo aminoácido y sus variantes pertenecen al alcance de la presente descripción y, específicamente, pueden estar representadas por la SEQ ID NO: 1, pero no se limitan a ella.

Adicionalmente, con respecto al polipéptido modificado, las secuencias de nucleótidos que codifican el mismo aminoácido y variantes del mismo pertenecen al alcance de la presente descripción en base a la degeneración de codones. Específicamente, puede incluirse cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de las secuencias de aminoácidos 12 a la 22 y variantes de las mismas, pero no se limita a ellas.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona una célula hospedera que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado según las reivindicaciones, y un microorganismo transformado con un vector que incluye el polinucleótido que codifica el polipéptido modificado de acuerdo con las reivindicaciones. Específicamente, la introducción puede realizarse mediante transformación, pero no se limita a ello.

Específicamente, el microorganismo que incluye el polipéptido modificado con SigA puede mejorar la capacidad de producir L-lisina sin inhibir el crecimiento de una célula hospedera y, por lo tanto, puede obtener L-lisina con un alto rendimiento en comparación con el microorganismo que incluye el polipéptido SigA de tipo salvaje.

Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a cualquier portador para clonar y/o transferir nucleótidos a una célula hospedera. Un vector puede ser un replicón que permita la replicación de un fragmento combinado con otro fragmento de ADN. El término "replicón" se refiere a cualquier unidad genética que actúa como una unidad de autorreplicación para la replicación del ADN in vivo, es decir, unidades genéticas aleatorias replicables por autorregulación (por ejemplo, plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas y virus). Como se usa en la presente descripción, el término "vector" puede incluir portadores virales y no virales para introducir nucleótidos en una célula hospedera in vitro, ex vivo o in vivo, y también puede incluir un ADN miniesférico. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido sin secuencia de ADN bacteriano. Adicionalmente, el vector puede incluir transposones (Annu Rev Genet. 2003; 37: 3-29) o cromosomas artificiales. Específicamente, el vector puede incluir los vectores pACYCl77, pACYC184, pCL1920, pECCGl17, pUC19, pBR322, pDZ y pMW118, pero no se limita a ellos.

Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducción de un gen a una célula hospedera, lo que permite, de esta manera, la expresión del gen en la célula hospedera. El gen transformado puede incluir, sin limitación, tanto un gen insertado en el cromosoma de una célula hospedera como un gen ubicado fuera del cromosoma, siempre que puedan expresarse en la célula hospedera.

Adicionalmente, el gen puede introducirse en una célula hospedera en forma de un casete de expresión, que es un constructo de polinucleótidos que incluye todos los elementos esenciales requeridos para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor conectado operativamente al gen, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. Adicionalmente, el polinucleótido puede introducirse en una célula hospedera tal como está o en la forma de un constructo de polinucleótido, y puede conectarse operativamente a una secuencia esencial para su expresión en la célula hospedera, pero no se limita a ello.

La célula hospedera o microorganismo puede ser cualquier célula hospedera o microorganismo que incluya un polinucleótido que codifique un polipéptido modificado, o que se transforme con un vector que incluya un polinucleótido que codifique un polipéptido modificado, por tanto puede expresarse el polipéptido modificado, y con el fin de la presente descripción, la célula hospedera o el microorganismo puede ser cualquier célula hospedera o microorganismo que pueda producir L-lisina al incluir el polipéptido modificado con SigA. Los ejemplos específicos del microorganismo pueden incluir cepas microbianas pertenecientes al género Escherichia, el género Serratia, el género Erwinia, el género Enterobacteria, el género Salmonella, el género Streptomyces, el género Pseudomonas, el género Brevibacterium, el género Corynebacterium, etc. y específicamente, un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium, y más específicamente, Corynebacterium glutamicum, pero sin limitarse al mismo.

En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se introdujeron varias cepas de Corynebacterium glutamicum que tienen capacidad de producción de L-lisina (KCCM11016P, KFCC10750, KCCM10770P y CJ3P) con un polipéptido modificado que incluye cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 a 22, y se compararon sus productividades de L-lisina. Como resultado, se confirmó que todas las cepas introducidas con el polipéptido modificado mostraron una mayor cantidad de producción de L-lisina en comparación con la cepa que incluía el polipéptido SigA de tipo salvaje (Ejemplos 7 a 10 y Tablas 8 a 11). Estos resultados sugieren que el microorganismo que incluye el polipéptido modificado de la presente descripción es una cepa con mayor capacidad de producción de L-lisina y el microorganismo proporciona una ventaja económica de obtener L-lisina con alto rendimiento al cultivar el microorganismo.

Como tal, los presentes inventores designaron la cepa con mayor capacidad de producción de L-lisina, "KCCM11016P::SigA(L447H)", como "Corynebacterium glutamicum CA01-2277 " y lo depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos, reconocido como autoridad depositaria internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 22 de noviembre de 2013, con el Número de Acceso KCCM11479P.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir L-lisina, que incluye cultivar el microorganismo del género Corynebacterium descrito anteriormente y recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo.

Como se usa en la presente descripción, el término “cultivo” se refiere al crecimiento de un microorganismo en condiciones ambientales apropiadas y controladas artificialmente. El proceso de cultivo de la presente descripción puede realizarse en base al medio de cultivo apropiado y las condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Las condiciones específicas, tales como la temperatura de cultivo, el tiempo de cultivo, el pH del medio de cultivo, etc., pueden determinarse mediante conocimientos generales por parte de un experto en la técnica o el método convencional conocido en la técnica, y en consecuencia ajustarse apropiadamente. Específicamente, estos métodos de cultivo conocidos se describen en detalle en las referencias [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), y Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Adicionalmente, los métodos de cultivo pueden incluir cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo por lotes alimentados y, específicamente, el cultivo puede realizarse de forma continua en un proceso por lotes alimentados o por lotes alimentados repetidos, pero no se limita a ellos.

El medio usado en el cultivo debe satisfacer adecuadamente los requisitos para cepas específicas. Los ejemplos de las fuentes de carbono a usar en el medio pueden incluir azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acético, pero no se limitan a estos. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en combinación, pero no se limitan a ello. Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno a usar en el medio pueden incluir peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y urea; o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación, pero no se limitan a ello. Los ejemplos de las fuentes de fósforo a usar en el medio pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, las correspondientes sales que contienen sodio, etc., pero no se limitan a estos. Adicionalmente, el medio puede contener sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro necesarios para el crecimiento. Por último, los materiales esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden también contenerse además de los materiales descritos anteriormente. Adicionalmente, pueden usarse precursores adecuados para un medio de cultivo. Estas fuentes pueden añadirse a un cultivo de una manera apropiada durante el cultivo mediante un cultivo por lotes o un cultivo continuo, pero los métodos no se limitan a estos.

Adicionalmente, el pH del cultivo puede ajustarse mediante la adición de un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico, y ácido sulfúrico durante el cultivo de una manera apropiada. Durante el cultivo, puede añadirse un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graso para evitar la generación de espuma. Adicionalmente, puede inyectarse oxígeno o gas que contiene oxígeno al cultivo para mantener un estado aeróbico del cultivo; o puede inyectarse gas nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono sin la inyección de un gas para mantener un estado anaeróbico o microaeróbico del cultivo. La temperatura del cultivo puede estar generalmente en un intervalo de 27 °C a 37 °C, y específicamente de 30 °C a 35 °C. El cultivo puede continuarse hasta que se obtenga la cantidad deseada de los materiales útiles, y específicamente de 10 horas a 100 horas. La L-lisina puede liberarse en el medio de cultivo que se está cultivando o puede estar contenida en microorganismos.

Adicionalmente, con respecto al método de producción de L-lisina de la presente descripción, el método de recuperación de L-lisina a partir de un cultivo de microorganismos o un cultivo es ampliamente conocido en la técnica. Los métodos de recuperación de L-lisina pueden incluir filtración, cromatografía de intercambio de aniones, cristalización, HPLC, etc., pero no se limitan a ellos.

Descripción detallada de la descripción

De ahora en adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo con fines ilustrativos, y la descripción no pretende limitarse por estos Ejemplos.

Ejemplo 1: Obtención de un polipéptido modificado con SigA mediante el uso de una mutagénesis artificial

En este Ejemplo, se preparó una biblioteca de vectores para la inserción cruzada primaria dentro del cromosoma para obtener un SigA modificado mediante el siguiente método. Se realizó una PCR propensa a errores para el gen rpoD (SEQ ID NO: 1) que codifica Corynebacterium SigA (SEQ ID NO: 2) y, de esta manera, se obtuvieron fragmentos (1497 pb) de variantes del gen rpoD introducidas al azar con una modificación de la sustitución de nucleótidos. La PCR propensa a errores se realizó con el kit de mutagénesis aleatoria GenemorphII (Stratagene), mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde junto con el cebador 1 (SEQ ID NO: 3) y el cebador 2 (SEQ ID NO: 4). La PCR propensa a errores se realizó para que se pudieran introducir modificaciones en el fragmento del gen amplificado en una proporción de 0 a 4,5 mutaciones por 1 kb del fragmento amplificado. La PCR se realizó por un total de 30 ciclos bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 96 °C durante 30 s, hibridación a 53 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 2 min.

Tabla 1

Los fragmentos de genes amplificados se conectaron al vector pCR2.1-TOPO (de ahora en adelante, 'pCR2.1') mediante el uso del kit de clonación pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), se transformaron en E. coli DH5a y se sembraron en medio LB sólido. Se seleccionaron veinte de las colonias transformadas de esta manera y se analizaron sus secuencias de nucleótidos después de obtener sus plásmidos. Como resultado, se confirmó que se introdujeron mutaciones en diferentes lugares con una frecuencia de 1,5 mutaciones/kb. Los plásmidos se extrajeron de unas 20000 colonias de E. coli transformadas y se denominaron "biblioteca pCR2.1-rpoD(mt)". Luego, se preparó un plásmido que incluía el gen rpoD de tipo salvaje para usar como control. La PCR se realizó mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum A^tCC13032 como molde junto con el cebador 1 (SEQ ID NO: 3) y el cebador 2 (SEQ ID NO: 4), en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para la polimerasa, se usó la ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene), y el plásmido preparado como tal se denominó “pCR2.1-rpoD (WT)”.

Ejemplo 2: Preparación de una biblioteca de cepas modificadas con SigA con mayor capacidad de producción de L-lisina

La biblioteca pCR2.1-rpoD(mt) preparada mediante el uso de la cepa KCCM11016P (Patente de Corea Núm. 10 0159812) ya que la cepa original se transformó mediante recombinación de cromosomas homólogos, se sembró en medio complejo que contenía kanamicina (25 mg/l) y los componentes descritos a continuación, y se obtuvieron aproximadamente 25 000 colonias a partir del mismo. Las colonias se denominaron como “KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1” a “KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-25000”. Adicionalmente, el vector pCR2.1-rpoD(WT) preparado de esta manera se transformó en la cepa KCCM11016P para preparar la cepa control, y se denominó “KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT)”.

Los transformantes obtenidos de esta manera tendrán dos copias del gen rpoD en el cromosoma. Sin embargo, la biblioteca pCR2.1-rpoD(mt) y el vector pCR2.1-rpoD(WT) se insertan con fragmentos del gen rpoD sin ningún promotor y, por lo tanto, cuando se insertan en el cromosoma de una cepa mediante recombinación homóloga, solo se expresa una copia de las dos copias del gen rpoD capaz de expresar una proteína SigA modificada o de tipo salvaje.

Glucosa (10 g), peptona (10 g), extracto de carne de vacuno (5 g), extracto de levadura (5 g), infusión cerebrocorazón (18,5 g), NaCl (2,5 g), urea (2 g), sorbitol (91 g) y agar (20 g) (en base a 1 l de agua destilada).

Ejemplo 3: Cribado de una biblioteca de cepas modificadas con SigA con capacidad de producción de L-lisina mejorada

Aproximadamente 25000 colonias obtenidas en el Ejemplo 2 se inocularon respectivamente en medio selectivo (300 |jl) que contenía los componentes descritos más abajo y se cultivaron en una placa de 96 pocillos profundos a 32 °C a una velocidad de 1000 rpm durante 24 horas. La cantidad de producción de L-lisina durante el cultivo se analizó mediante un método de ninhidrina (J. Biol. química 1948. 176: 367 - 388). Al finalizar el cultivo, se hicieron reaccionar 10 j l del sobrenadante del cultivo y 190 j l de una solución de reacción de ninhidrina (63 % de glicerol, 27 % de reacción de ninhidrina (7,1 g/l en tampón de citrato 0,5 M, pH 5,5)) a 65 °C durante 30 minutos. La absorbancia a una longitud de onda de 570 nm se midió con un espectrofotómetro y se comparó con la del control, es decir, KCCM11016P lpCR2.1-rpoD(WT), y se seleccionaron alrededor de 935 cepas modificadas que mostraban una absorbancia con un aumento de al menos el 10 %. Otras colonias mostraron una absorbancia similar o reducida en comparación con la del control.

Glucosa (10 g), sulfato de amonio (5,5 g), MgSO4-7H2O (1,2 g), KH2PO4 (0,8 g), K2HPO4 (16,4 g), biotina (100 jg), tiamina HCl (1000 jg), calcio-ácido pantoténico (2000 jg ) y nicotinamida (2000 jg ) (en base a 1 l de agua destilada) El método anterior se realizó repetidamente para las 935 cepas seleccionadas y los 231 tipos principales de cepas con una capacidad de producción de L-lisina mejorada en un 15 % o más en comparación con la cepa KCCM11016P lpCR2.1-rpoD(WT).

Ejemplo 4: Análisis de capacidad de producción de L-lisina por KCCM1016P/pCR2.1-rpoD(mt)

Los 231 tipos de cepas seleccionadas en el Ejemplo 3 se analizaron con respecto a sus productividades de L-lisina después de cultivarlas mediante el siguiente método.

Cada una de las cepas se inoculó en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 25 ml de un medio de cultivo para siembra, respectivamente, y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 20 horas. Luego, cada uno de los matraces con deflectores de esquina de 250 ml que contenían 24 ml del cultivo, que contenía los componentes que se describen más abajo, se inoculó con 1 ml de un líquido de cultivo de semillas y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 72 horas. La concentración de L-lisina en cada cultivo se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

< Medio de cultivo para siembra (pH 7,0)>

Glucosa (20 g), peptona (10 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4'7H2O (0,5 g), biotina (100 |jg), tiamina HCl (1000 g), calcio-ácido pantoténico (2000 g) y nicotinamida (2000 g) (en base a 1 l de agua destilada)

Glucosa (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos macerados de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4'7H2O (0,5 g), biotina (100 jg), tiamina HCl (1000 jg), ácido calcio-pantoténico (2000 jg), nicotinamida (3000 jg y CaCO3 (30 g) (en base a 1 l de agua destilada)

Entre los 231 tipos de cepas seleccionados, se seleccionaron 17 tipos de cepas que mostraban una concentración de L-lisina aumentada de forma reproducible en comparación con el control, y el cultivo y el análisis se realizaron repetidamente. Los resultados del análisis de la concentración de L-lisina se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Como resultado del análisis de la concentración de L-lisina de las 17 cepas seleccionadas, se confirmó que la capacidad de producción de L-lisina de 15 cepas al excluir las dos cepas, es decir, KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-6589 y KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-18904, aumentó un 20 % como máximo en comparación con el control, la cepa KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT).

Ejemplo 5: Confirmación de mutaciones del gen rpoD en cepas seleccionadas de una biblioteca con mutagénesis artificial de SigA

Para confirmar las mutaciones introducidas en SigA en las 15 cepas que mostraban una capacidad de producción de L-lisina mejorada entre las 17 cepas seleccionadas en el Ejemplo 4, se analizaron las secuencias de nucleótidos de los mutantes rpoD. Para la determinación de las secuencias de nucleótidos, se realizó la PCR mediante el uso del cebador 1 (SEQ ID NO: 3) y el cebador 3 (SEQ ID NO: 5).

Tabla 3

La secuencia de nucleótidos del gen rpoD modificado se confirmó en base al NIH Genbank mediante el análisis de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos del gen rpoD modificado para cada una de las 15 cepas así obtenidas, y se confirmó la secuencia de nucleótidos de la SigA modificada. Los resultados del análisis de la secuencia de aminoácidos de SigA modificada de las 15 cepas así obtenidas se muestran en la Tabla 4 más abajo.

Tabla 4

Como resultado, se confirmó que se sustituyeron los aminoácidos en un intervalo de un mínimo de uno a un máximo de cuatro. En la Tabla 4 anterior, la figura representa el número de aminoácidos de SigA; la letra delante de la figura representa un aminoácido antes de la sustitución; y la letra después de la figura representa un aminoácido sustituido.

Ejemplo 6: Preparación de un vector para introducir un cromosoma modificado con rpoD para la producción de una cepa que tiene capacidad de producción de L-lisina en alta concentración

Para confirmar el efecto de la aplicación de la modificación SigA, que se confirmó en el Ejemplo 4, se preparó un vector capaz de introducir la modificación SigA en el cromosoma.

El cebador 4 (SEQ ID NO: 6), en el que se insertó un sitio de restricción EcoRI en el extremo 5', y el cebador 5 (SEQ ID NO: 7), en el que se insertó un sitio de restricción SalI en el extremo 3', se sintetizaron en base a las secuencias de nucleótidos informados. Luego, se realizó la PCR mediante el uso de cada uno de los cromosomas de los 15 tipos seleccionados como molde mediante el uso del par de cebadores, y de ese modo se amplificaron 15 tipos de fragmentos del gen rpoD(mt) modificado. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 2 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

Tabla 5

Los 15 tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR se trataron con Eco RI y Sal I para obtener los respectivos fragmentos de ADN y se unieron los fragmentos al vector pDZ (Patente de Corea Núm. 10-0924065) para introducir el cromosoma, que incluye sitios de restricción EcoRI y SalI en el mismo, transformado en E. coli DH5a, y esparcido en medio sólido LB que contiene kanamicina (25 mg/L). Las colonias transformadas con un vector insertado con un gen diana por PCR se seleccionaron y los plásmidos se obtuvieron por un método de extracción de plásmidos convencionalmente conocido. Los plásmidos se denominaron pDZ-SigA(D136G, T281S), pDZ-SigA(L381R), pDZ-SigA(M230T), pDZ-SigA(M455V), pDZ-SigA(S488T), pDZ-SigA(R279L), pDZ -SigA (I254N), pDZ-SigA (A268S), pDZ-SigA (L451I, Q491R), pDZ-SigA (Q429R), pDZ-SigA (K90E, K105Y, D250G, I254L), pDZ-SigA (L447H), pDZ -SigA(K483R), pDZ-SigA(K479R) y pDZ-SigA(D238V, N263S, E358D), respectivamente, según la modificación de la inserción en SigA de cada plásmido. Adicionalmente, como otro control para las variantes anteriores, se prepararon los cebadores 6 a 9 (SEQ ID NOS: 8 a 11) para la construcción de vectores para insertar el A414V modificado con SigA, que se informó que tiene un efecto de aumento de L-lisina capacidad de producción (publicación internacional WO 2003-054179), en el cromosoma. Luego, se realizó la PCR mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 junto con un par de cebadores del cebador 6 y el cebador 9 y un par de cebadores del cebador 7 y el cebador 8, respectivamente. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 1 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

Tabla 6

Como resultado, se obtuvieron fragmentos génicos con un tamaño de alrededor de 500 pb y los productos amplificados se unieron al vector pDZ mediante el uso del kit de clonación Infusion (Invitrogen). El vector preparado de esta manera se denominó pDZ-SigA(A414V).

Ejemplo 7: Preparación de la cepa KCCM11016P introducida con polipéptido modificado con SigA para cepas que tienen capacidad de producción de L-lisina en alta concentración y comparación de sus productividades de L-lisina Los 15 tipos de vectores introducidos con mutaciones novedosas preparados en el Ejemplo 6 y un tipo de vector introducido con una mutación notificada anteriormente se transformaron en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que es una cepa que produce L-lisina, mediante una recombinación de cromosomas homólogos en dos etapas. Luego, las cepas introducidas con las modificaciones de SigA fueron seleccionadas mediante el análisis de secuencias de nucleótidos. Las cepas introducidas con las modificaciones de SigA se denominaron KCCM11016P::SigA(D136G,T281S),KCCM11016P::SigA(L381R),KCCM11016P::SigA(M230T),KCCM11016P::SigA (M455V),KCCM11016P::SigA(S4881),KCCM11016P::SigA(R279L),KCCM11016P::SigA(I254N),KCCM11016P::SigA (A268S),KCCM11016P::SigA(L451I,Q491R),KCCM11016P::SigA(Q429R),KCCM11016P::SigA(K90E,K105Y,D250G, I254L),KCCM11016P::SigA(L447H),KCCM11016P::SigA(K483R),KCCM11016P::SigA(K479R),KCCM11016P::SigA (D238V, N263S, E358D) y KCCM11016P::SigA(A414V), respectivamente.

Las cepas se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4 y se analizaron sus concentraciones de L-lisina. Los resultados se muestran en la Tabla 7 más abajo.

Tabla 7

Como resultado, dos cepas novedosas introducidas con modificaciones (KCCM11016P::SigA(M230T) y KCCM11016P::SigA(R279L)) mostraron una capacidad de producción de L-lisina equivalente a la de la cepa original, mientras que las otras dos cepas novedosas introducidas con mutaciones (KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L) y KCCM11016P::SigA(D238V, N263S, E358D)) mostró una tasa de crecimiento significativamente baja y una cantidad significativamente reducida de producción de L-lisina. Sin embargo, las 11 cepas mutantes novedosas restantes mostraron un aumento máximo del 19 % en la producción de L-lisina en comparación con la cepa original, y también mostraron un aumento del 16 % en la producción de L-lisina en comparación con la de KCCM11016P::SigA(A414V), que es una cepa mutante introducida con SigA(A414V) informada anteriormente. Como tal, los presentes inventores designaron la cepa con una capacidad de producción de L-lisina mejorada, “KCCM11016P::SigA(L447H)”, como “Corynebacterium glutamicum CA01-2277” y la depositaron en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos, reconocido como una autoridad depositaria en virtud del Tratado de Budapest, el 22 de noviembre de 2013, con el Número de Acceso KCCM11479P.

Estos resultados sugieren que los 11 polipéptidos modificados novedosos con SigA tienen una excelente capacidad de producción de L-lisina.

Ejemplo 8: Preparación de la cepa KFCC10750 introducida con polipéptido modificado con SigA para cepas que tienen capacidad de producción de L-lisina en alta concentración y comparación de sus productividades de L-lisina Para confirmar el efecto de la introducción de los 11 tipos de variantes SigA, seleccionados en el Ejemplo 7, en otras cepas del género Corynebacterium glutamicum, las cepas introducidas respectivamente con cada uno de los 11 tipos de mutaciones SigA de Corynebacterium glutamicum KFCC10750 (KCCM11347P, Patente de Corea Núm. 10 0073610) que tienen capacidad de producción de L-lisina se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 7. Estas cepas se denominaron KFCC10750::SigA(D136G, T281S), KFCC10750::SigA(L381R), KFCC10750::SigA(M455V), KFCC10750::SigA(S4881), KFCC10750::SigA(I254N), KFCC10750::SigA(A268S), KFCC10750::SigA(L451I, Q491R), KFCC10750::SigA(Q429R), KFCC10750::SigA(L447H), KFCC10750::SigA(K483R) y KFCC10750::SigA(K479R), respectivamente. Adicionalmente, la cepa introducida con la mutación SigA(A414V), informada anteriormente, se preparó y se denominó “KFCC10750::SigA(A414V)".

Las cepas se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4 y se analizaron sus concentraciones de L-lisina. Los resultados se muestran en la Tabla 8 más abajo.

Tabla 8

Como resultado, los 11 tipos de cepas introducidas con mutaciones novedosas mostraron un aumento máximo del 17 % en la producción de L-lisina en comparación con la cepa original, y también mostraron un aumento de alrededor del 14 % en la producción de L-lisina en comparación con la cepa original de KFCC10750::SigA(A414V), que es una cepa introducida con la mutación SigAA414V informada anteriormente.

Ejemplo 9: Preparación de la cepa KCCM10770P introducida con polipéptido modificado con SigA para cepas que tienen capacidad de producción de L-lisina en alta concentración y comparación de sus productividades de L-lisina Para confirmar el efecto de la introducción de los 11 tipos de variantes SigA, seleccionados en el Ejemplo 7, en otras cepas del género Corynebacterium glutamicum, las cepas introducidas respectivamente con modificaciones SigA de Corynebacterium glutamicum KFCC10770 (KCCM11347P, Patente de Corea Núm. 10-0924065) que tienen capacidad de producción de L-lisina se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 7. Estas cepas se denominaron KCCM10770P::SigA(D136G, T281S), KCCM10770P::SigA(L381R), KCCM10770P::SigA(M455V), KCCM10770P::SigA(S488T), KCCM10770P::SigA(I254N), KCCM10770P::SigA(A268S), KCCM10770P::SigA(L451I, Q491R), KCCM10770P::SigA(Q429R), KCCM10770P::SigA(L447H), y KCCM10770P::SigA(K483R), KCCM10770P::SigA(K479R), respectivamente. Adicionalmente, la cepa introducida con la mutación SigA(A414V), informada anteriormente, se preparó y se denominó “KFCC10770::SigA(A414V)”.

Las cepas se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4 y se analizaron sus concentraciones de L-lisina. Los resultados se muestran en la Tabla 9 más abajo.

Tabla 9

Como resultado, los 11 tipos de cepas introducidas con mutaciones novedosas mostraron un aumento máximo del 20 % en la producción de L-lisina en comparación con la cepa original, y también mostraron un aumento de alrededor del 16 % en la producción de L-lisina en comparación con la cepa original de KFCC10770::SigA(A414V), que es una cepa introducida con la mutación SigAA414V informada anteriormente.

Ejemplo 10: Preparación de la cepa CJ3P introducida con polipéptido modificado con SigA para cepas que tienen capacidad de producción de L-lisina en alta concentración y comparación de sus productividades de L-lisina

Claims

REIVINDICACIONES

Un polipéptido modificado que tiene una actividad de factor sigma A de la ARN polimerasa y que puede aumentar la producción de L-lisina cuando se expresa en un microorganismo, en donde al menos un aminoácido en las posiciones 136, 281, 254, 268, 381, 429, 447, 451, 491, 455, 479, 483 y 488 se sustituye con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2,

en donde el aminoácido en la posición 136 está sustituido con glicina y el aminoácido en la posición 281 está sustituido con serina; el aminoácido en la posición 254 está sustituido con asparagina; el aminoácido en la posición 268 está sustituido con serina; el aminoácido en la posición 381 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 429 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 447 está sustituido con histidina; el aminoácido de la posición 451 está sustituido con isoleucina y el aminoácido de la posición 491 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 455 está sustituido con valina; el aminoácido en la posición 479 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 483 está sustituido con arginina; y el aminoácido en la posición 488 está sustituido con treonina.

El polipéptido modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido modificado tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 12 a 22.

Un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado de acuerdo con la reivindicación 1.

Una célula hospedera que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene una mayor capacidad de producción de L-lisina, que comprende un polipéptido modificado que tiene una actividad de factor sigma A de la ARN polimerasa, en donde al menos un aminoácido en las posiciones 136, 281, 254, 268, 381, 429, 447, 451, 491, 455, 479, 483 y 488 se sustituye con otro aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde el aminoácido en la posición 136 está sustituido con glicina y el aminoácido en la posición 281 está sustituido con serina; el aminoácido en la posición 254 está sustituido con asparagina; el aminoácido en la posición 268 está sustituido con serina; el aminoácido en la posición 381 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 429 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 447 está sustituido con histidina; el aminoácido de la posición 451 está sustituido con isoleucina y el aminoácido de la posición 491 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 455 está sustituido con valina; el aminoácido en la posición 479 está sustituido con arginina; el aminoácido en la posición 483 está sustituido con arginina; y el aminoácido en la posición 488 está sustituido con treonina.

El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el microorganismo es Corynebacterium glutamicum.

Un método para producir L-lisina, que comprende:

(a) cultivar el microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 en un medio; y (b) recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del medio cultivado.