JP2017525381A - L−リジン生産能が向上した微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 - Google Patents

L−リジン生産能が向上した微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規な変異型RNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを含む微生物及び前記微生物を利用したL−リジンの生産方法に関する。

Description

本発明は、新規な変異型RNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドを含む微生物及び前記微生物を利用したL-リジンの生産方法に関する。
アミノ酸などの有用産物の大量生産のための菌株の開発のために、解糖経路(glycolysis)上の上位レベルで直接的または間接的に関与する遺伝的要因を見出して適切に利用すれば、より高い生産収率を有する菌株を開発することができる。代表的な技術としては、RNAポリメラーゼのリクルーティングタンパク質(recruiting protein)にランダムに突然変異を起こすことにより、細胞内のすべての遺伝子の発現を調節するgTME(global transcription machinery engineering)技術がある。一例として、マサチューセッツ工科大学(Massachusetts Institute of Technology)の研究グループは、gTME技術を利用して大腸菌でチロシンの生産量を大幅に増加させるのに成功した(特許文献1)。
微生物の転写段階で用いられるRNAポリメラーゼ(RNA polymerase)は、5つのサブユニットで構成された巨大分子であり、2つのアルファ因子(α)、ベータ(β)、ベータプライム(β’)及びオメガ因子(ω)で構成されており、完全酵素(holoenzyme)は、αββ’ωで表示される。これら完全酵素と共にシグマ因子(σ)は、RNAポリメラーゼのプロモーター結合特異性を付与する転写の開始段階に必須の要素である。コリネバクテリウム属の菌株は、7種のシグマ因子(SigA、SigB、SigC、SigD、SigE、SigH、SigM)を有しており、外部環境の変化に応じて特定の遺伝子グループの転写を調節する(非特許文献1)。特に、7種のシグマ因子のうち、SigAはほとんどのハウスキーピング遺伝子及びコア遺伝子を調節する主な調節因子であり、SigAにランダムに変異を与えて目的物質の生産性を向上させる研究が報告され(非特許文献2)、コリネバクテリウム属菌株を用いてL-リジン生産性を増加させた研究も報告されている(特許文献2)。
米国特許第8735132号明細書 国際公開特許第WO2003−054179号公報 韓国登録特許第10−0159812号公報 韓国登録特許第10−0924065号公報 韓国登録特許第10−0073610号公報
Journal of Biotechnology 154. 2011.101-113 Metabolic Engineering 9. 2007. 258-267 Annu Rev Genet. 2003;37:3-29. Chmiel;Bioprozesstechnik 1 Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag、Stuttgart、1991) Storhas;Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、1994) J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388 Binder et al. Genome Biology 2012、 13:R40
本発明者らは、宿主細胞の成長を阻害することなく高い濃度のL−リジンを生産する微生物を開発すべく鋭意努力した結果、新規な変異型RNAポリメラーゼのシグマ因子A(SigA)ポリペプチドを開発し、L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属に導入することにより、L−リジンの生産能が向上した菌株を開発することができることを確認し、本発明を完成した。
本発明の目的は、配列番号2のアミノ酸配列からなるRNAポリメラーゼシグマ因子A活性を有する、ポリペプチドの一部のアミノ酸を置換した変異型ポリペプチドを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記ポリペプチドを含むように形質転換された微生物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記微生物を培養して培養物を得る段階;及び前記培養物または微生物からL−リジンを回収する段階を含むL−リジンの生産方法を提供することにある。
本発明によりL−リジンの生産能力を上方調節することができる変異体RNAポリメラーゼシグマ因子Aの変異型ポリペプチドを確認することができる。また、これに基づいて当該変異型ポリペプチドを発現する微生物は、L−リジンの生産収率が著しく優れるため、産業的な面で生産の便宜性と共に製造原価低減などの効果を期待することができる。
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、新規なRNAポリメラーゼシグマ因子A活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本発明において、用語「RNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)」とは、RNAポリメラーゼと共に作用する転写開始因子としてシグマ因子(sigma factor)のいずれかに該当するタンパク質(SigA)である。シグマ因子は、特定のプロモーターの上流に存在するupstream DNA(UP element)と様々の転写調節因子が相互作用して転写調節に関与する。特に、シグマ因子A(SigA)は、コア遺伝子のほとんどを調節する主な調節因子として知られている。前記SigAタンパク質に関する情報は、NCBI GenBankのような公知のデータベースから得ることができ、その例としてAccession numberがNP_601117のタンパク質があり得る。具体的には、SigAタンパク質は配列番号2のアミノ酸配列を含むことができ、本発明のSigAと同様な活性を有する限り、これに限定されない。
本発明において、用語「変異型ポリペプチド」とは、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列の一部または全体が置換されたものであり、本発明ではRNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部が置換されることにより、野生型(wild−type)のアミノ酸配列と一部異なる配列を有するRNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)活性を有するポリペプチドである。即ち、野生型であるSigAポリペプチドではなく、L−リジン生産能の向上に寄与するSigA変異型ポリペプチドを提示するものである。
具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、下記位置のアミノ酸のうち、一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、RNAポリメラーゼシグマ因子A活性を有する変異型ポリペプチドである。前記変異位置は、開始メチオニンを1番目のアミノ酸にし、そこから136番目のアミノ酸;254番目のアミノ酸;268番目のアミノ酸;281番目のアミノ酸;381番目のアミノ酸;429番目のアミノ酸;及び445番目〜495番目のアミノ酸であることができる。即ち、前記変異型ポリペプチドは、前記57個の変異の位置(136番目、254番目、268番目、281番目、381番目、429番目、445−495番目)のうち、一つ以上の位置が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドであることができる。
より具体的には、前記445番目〜495番目のアミノ酸のうち、447番目のアミノ酸;451番目のアミノ酸;455番目のアミノ酸;479番目のアミノ酸;483番目のアミノ酸;488番目のアミノ酸;及び491番目のアミノ酸からなるアミノ酸の中で、1種以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されることができるが、これに限定されない。
具体的なアミノ酸の置換は、下記13種のアミノ酸の置換のうち、1種以上が組み合わされたものであることができ、開始メチオニンから136番目のアミノ酸がグリシンで置換(D136G);254番目のアミノ酸がアスパラギンで置換(I254N);268番目のアミノ酸がセリンで置換(A268S);281番目のアミノ酸がセリンで置換(T281S);381番目のアミノ酸がアルギニンで置換(L381R);429番目のアミノ酸がアルギニンで置換(Q429R);447番目のアミノ酸がヒスチジンで置換(L447H);451番目のアミノ酸がイソロイシンで置換(L451I);455番目のアミノ酸がバリンで置換(M455V);479番目のアミノ酸がアルギニンで置換(K479R);483番目のアミノ酸がアルギニンで置換(K483R);488番目のアミノ酸がトレオニンで置換(S488T);及び491番目のアミノ酸がアルギニンで置換(Q491R)からなるものであることができる。
より具体的には、前記ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドの開始メチオニンから136番目及び281番目のアミノ酸が、それぞれグリシン及びセリンで置換(D136G、T281S);254番目のアミノ酸がアスパラギンで置換(I254N);268番目のアミノ酸がセリンで置換(A268S);381番目のアミノ酸がアルギニンで置換(L381R);429番目のアミノ酸がアルギニンで置換(Q429R);447番目のアミノ酸がヒスチジンで置換(L447H);451番目及び491番目のアミノ酸がそれぞれイソロイシン及びアルギニンで置換(L451I、Q491R);455番目のアミノ酸がバリンで置換(M455V);479番目のアミノ酸がアルギニンで置換(K479R);483番目のアミノ酸がアルギニンで置換(K483R);488番目のアミノ酸がトレオニンで置換(S488T);または前記11種のアミノ酸の置換のうち、1種以上が組み合わされたものである変異型ポリペプチドであることができる。
本発明の一具現例によれば、前記変異型ポリペプチドは、配列番号12〜22のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができる。
本発明の変異型ポリペプチドは、前記配列番号12〜22で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と70%以上、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列であり、野生型SigAタンパク質に比べてL−リジンの生産能の向上に寄与したタンパク質であれば制限なく含まれる。このような相同性を有する配列として、実質的に変異型SigAタンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明の範囲に含まれることは自明である。
本発明において、用語「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子のアミノ酸または塩基配列において、特定の比較領域で両配列を最大限に一致するように整列(align)させた後、配列間の塩基またはアミノ酸残基の同一な程度を意味する。相同性が十分に高い場合は、当該遺伝子の発現産物は同一または類似の活性を有することができる。前記配列同一性のパーセントは、公知となった配列比較プログラムを使用して決定することができ、一例として、BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc)などを挙げることができる。
本発明の他の一つの様態は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
本発明において、用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)で、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明において、RNAポリメラーゼシグマ因子A(SigA)のアミノ酸配列をコードする遺伝子はrpoD遺伝子であり、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム由来であり得る。遺伝暗号の縮退性(genetic code degeneracy)に起因し、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本発明に含まれ、具体的には配列番号1で表示されることができるが、これに限定されない。
また、変異型ポリヌクレオチドも遺伝暗号の縮退性(genetic code degeneracy)に起因し、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本発明に含まれる。具体的には、前記アミノ酸配列の12〜22のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体が含まれることができるが、これに限定されない。
本発明のもう一つの様態として、本発明は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及び前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物を提供する。具体的には、前記導入は、形質転換により行うことができるが、これに限定されない。
具体的にSigA変異型ポリペプチドを含む微生物は、野生型SigAポリペプチドを含む微生物に比べて宿主細胞の成長を阻害することなくL−リジンの生産能が向上するため、これら微生物からL−リジンを高収率で得ることができる。
本発明において、用語「ベクター」とは、宿主細胞に塩基のクローニング及び/または転移のための任意の媒介物を意味する。ベクターは、他のDNA断片が結合して、結合された断片の複製をもたらす複製単位(replicon)であり得る。「複製単位」とは、生体内でDNA複製の自己ユニットとして機能する、即ち、自らの調節により複製可能な任意の遺伝的単位(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)を意味する。前記「ベクター」とは、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞に塩基を導入するためのウイルス及び非ウイルス媒介物を含み、また、ミニサークルDNAを含むことができる。例えば、前記ベクターは、バクテリアDNA配列を有さないプラスミドであることができる。また、前記ベクターは、トランスポゾン(非特許文献3)、または人工染色体を含むことができる。具体的には、pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322、pDZ及びpMW118ベクターなどを使用することができ、これに限定されない。
本発明において、用語「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させるようにするものであり、形質転換された遺伝子は宿主細胞内で発現することができるものであれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものであっても、制限なく含まれる。
前記遺伝子は、自体的に発現されるのに必要なすべての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に動作可能に連結されているプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自体的に複製が可能な発現ベクターの形態であることができる。また、前記遺伝子は、その自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり得るが、これに限定されない。
前記宿主細胞または微生物は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型ポリペプチドを発現する細胞または微生物であり、本発明の目的上、前記宿主細胞または微生物は、SigA変異型ポリペプチドを含めてL−リジンを生産する微生物であれば、いずれのものでも可能である。具体的な例としては、エシェリキア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、エルウイニア(Erwinia)属、エンテロバクテリア(Enterobacteria)属、サルモネラ(Salmonella)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属などの微生物菌株が含まれることができ、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であることができ、より具体的な例としては、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であることができるが、これに限定されない。
本発明の一具体例では、L−リジンの生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムの種々の菌株(KCCM11016P、KFCC10750、KCCM10770P及びCJ3P)に配列番号12〜22のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドを導入して前記菌株のL−リジン生産能を比較した結果、前記変異型ポリペプチドを導入したすべての菌株で野生型SigAポリペプチドを含む菌株より多くのL−リジンを生産することを確認した(実施例7〜10及び表8〜11)。このような結果は、本発明の変異型ポリペプチドを含む微生物はL−リジンの生産能が向上した菌株であり、前記微生物を培養することにより、高収率のL−リジンを得ることができる経済的利益を示唆する。
ここで、本発明者らは前記L−リジン生産能が向上した菌株であるKCCM11016P::SigA(L447H)をコリネバクテリウム・グルタミクム「CA01−2277」と命名しており、2013年11月22日にブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託し、受託番号KCCM11479Pが与えられた。
本発明のもう一つの様態として、本発明は、記述された微生物を培養する段階及び培養された微生物または培養培地からL−リジンを回収する段階を含む、L−リジンを生産する方法を提供する。
本発明において、用語「培養」とは、前記微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当業界において公知の適当な培地及び培養条件により行うことができる。具体的な培養温度、培養時間及び培地のpHなどの条件は、当業者の一般的な知識または従来の公知となった方法により行うことができ、これにより適切に調節することができる。具体的には、これら公知の培養方法は、非特許文献4及び非特許文献5に詳しく記述されている。また、培養方法は回分式培養(batch culture)、連続式培養(cintinuous culture)及び流加式培養(fed-batch culture)が含まれ、具体的には、バッチ工程または注入バッチまたは反復注入バッチ工程(fed batch or repeated fed batch process)で連続式に培養することができるが、これらに限定されるものではない。
培養に使用される培地は、適切な方式で、特定の菌株の要件を満たさなければならず、前記培地で使用することができる炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸などが含まれることができる。これら物質は、単独または混合物として使用することができ、これに限定されない。使用することができる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどが含まれることができ、窒素源も、単独または混合物として使用することができ、これに限定されない。使用することができるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム−含有塩などが含まれることができる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されることができる。また、培養培地で適切な前駆体が使用されることができる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法により回分式または連続式で添加されることができるが、これに限定されない。
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のpHを調整することができる。培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしで、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は、通常27℃〜37℃、具体的には、30℃〜35℃である。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで継続することができ、具体的には10〜100時間であることができる。L−リジンは、培養培地中に排出されたり、微生物中に含まれていることができる。
また、本発明のL−リジンを生産する方法には、培養された微生物または培養培地からL−リジンを回収する方法は、当業界に広く知られている。前記L−リジン回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが使用されることができるが、これら例に限定されるものではない。
以下、本発明を下記例でより具体的に説明する。しかし、これら例は本発明の理解を助けるためのものであり、これらにより本発明が限定されるものではない。
実施例1:人工突然変異法を用いたSigA変異型ポリペプチドの確保
本実施例では、変異型SigAを獲得するために、下記方法で染色体内の1次交差挿入用ベクターのライブラリを作製した。コリネバクテリウムSigA(配列番号2)をコードするrpoD遺伝子(配列番号1)を対象に、Error−prone PCR法を行い、塩基置換変異がランダムに導入されたrpoD遺伝子変異体の断片(1497bp)を獲得した。前記Error−prone PCRは、GenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)を使用して行い、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のゲノムDNAを鋳型としてプライマー1(配列番号3)及びプライマー2(配列番号4)を使用した。増幅された遺伝子断片内に1kb当り0〜4.5個の変異が導入されるようにし、PCR条件は、変性96℃、30秒;アニーリング53℃、30秒;及び重合反応72℃、2分を30回繰り返した。
前記増幅した遺伝子断片をpCR2.1−TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)を用いてpCR2.1−TOPOベクター(以下、「pCR2.1」)に連結し、大腸菌DH5αで形質転換してカナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの20種を選別した後、プラスミドを獲得して塩基配列を分析した結果、1.5 mutations/kbの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約20,000個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをpCR2.1−rpoD(mt)ライブラリと命名した。
その後、対照群として使用するための野生型のrpoD遺伝子を有するプラスミドを作製した。プライマー1(配列番号3)及びプライマー2(配列番号4)を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のゲノムDNAを鋳型とし、前記のような条件でPCRした。ポリメラーゼはPfuUltraTM高−信頼DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用し、それにより製作されたプラスミドをpCR2.1−rpoD(WT)と命名した。
実施例2:L−リジン生産能が増加したSigA変異株ライブラリ製作
KCCM11016P(特許文献3)菌株を親菌株にして、前記製作されたpCR2.1−rpoD(mt)ライブラリを相同染色体組換えにより形質転換し、カナマイシン(25mg/l)及び下記のような成分が含まれた複合平板培地に塗抹して、約25,000個のコロニーを確保した。これをKCCM11016P/pCR2.1−rpoD(mt)−1〜KCCM11016P/pCR2.1−rpoD(mt)−25000と命名した。また、前記製作されたpCR2.1−rpoD(WT)ベクターをKCCM11016P菌株に形質転換して対照群菌株を製作し、KCCM11016P/pCR2.1−rpoD(WT)と命名した。
前記確保した形質転換体は、染色体上に2コピーのrpoD 遺伝子を有することになるが、pCR2.1−rpoD(mt)ライブラリ及びpCR2.1−rpoD(WT)ベクターは、プロモーターを有していないrpoD遺伝子断片が挿入されているため、菌株の染色体内へ相同組換えにより挿入された場合、2コピーのrpoD遺伝子のうち1コピーのみが発現され、変異型または野生型のSigAタンパク質を発現させることができる。
<複合平板培地(pH7.0)>
グルコース10g、ペプトン10g、牛肉抽出物5g、酵母抽出物5g、ブレインハートインフュージョン18.5g、NaCl 2.5g、尿素2g、ソルビトール91g、寒天20g(蒸留水1リットル基準)
実施例3:L−リジン生産能が増加したSigA変異株ライブラリスクリーニング
前記実施例2で確保された約25,000個のコロニーをそれぞれ下記のような成分が含まれた300μlの選別培地に接種し、96−ディープウェルプレートで32℃、1000rpmで約24時間培養した。培養中に生産されたL−リジンの生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた(非特許文献6)。培養が完了した後、培養上層液10μlとニンヒドリン反応溶液190μl(63%のグリセロール、27%のニンヒドリン溶液(7.1g/L in 0.5M citrate buffer pH5.5))とを65℃で30分間反応させた。その後、570nmの波長で分光光度計を用いて吸光度を測定して、対照群であるKCCM11016P/pCR2.1−rpoD(WT)菌株の吸光度と比較し、10%以上増加した吸光度を示す約935個の変異菌株のコロニーを選別した。その他のコロニーは対照群に比べて類似または減少した吸光度を示した。
<選別培地(pH8.0)>
グルコース10g、硫酸アンモニウム 5.5g、MgSO・7HO 1.2g、KHPO 0.8g、KHPO 16.4g、ビオチン100μg、チアミンHCl1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド2000μg(蒸留水1リットル基準)
前記で選別された935種の菌株を対象にして前記方法を繰り返し行い、KCCM11016P/PCR2.1−rpoD(WT)菌株に比べてL−リジン生産能が15%以上向上した変異菌株の中から上位231種を選別した。
実施例4:KCCM11016P/pCR2.1− rpoD(mt)L−リジン生産能の分析
前記実施例3で選別した231種の菌株のL−リジン生産能を以下のような方法で培養して分析した。
下記成分が含まれた種培地25mlを含有する250mlのコーナー−バッフルフラスコに各菌株を接種して、30℃で20時間、200rpmで振とう培養した。その後、下記成分が含まれた生産培地24mlを含有する250mlのコーナー−バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種して、30℃で72時間、200rpmで振とう培養した。HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)を用いてL−リジンの濃度を分析した。
<種培地(pH7.0)>
グルコース20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KHPO 4g、KHPO 8g、MgSO・7HO 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド2000μg(蒸留水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
グルコース100g、(NHSO 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KHPO 1g、MgSO・7HO 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド3000μg、CaCO 30g(蒸留水1リットル基準)。
前記で選別された231種の変異菌株のうち、対照群に比べてL−リジン濃度が再現性のあるように増加した17種の菌株を選別して前記培養及び分析を繰り返し、分析されたL−リジンの濃度は、下記表2の通りである。
前記選別された17種の菌株のL−リジン濃度の分析結果、17種の選別株の中、2種(KCCM11016P/pCR2.1−rpoD(mt)−6589、KCCM11016P/pCR2.1−rpoD(mt)−18904)を除外した15種の選別株のL−リジン生産能が対照群KCCM11016P/pCR2.1−rpoD(WT)菌株に比べて最大20%増加することを確認した。
実施例5:SigA人工突然変異ライブラリ選別株のrpoD遺伝子変異の確認
前記実施例4で選別した17種のうち、対照群に比べてL−リジン生産能が増加した15種の菌株のSigAに導入された変異を確認するために、rpoD変異体の塩基配列を分析した。塩基配列を決定するためにプライマー1(配列番号3)及びプライマー3(配列番号5)を使用してPCRを行った。
確保した15種の菌株のそれぞれの変異型rpoD遺伝子断片の塩基配列分析を通じて、アメリカ国立衛生研究所の遺伝子銀行(NIH GenBank)を根拠に変異型rpoD遺伝子の塩基配列を確認し、変異型SigAのアミノ酸配列を確認した。選別した15種の菌株の変異型SigAアミノ酸配列の分析結果は下記表4の通りである。
その結果、少なくは1つのアミノ酸から多くは4つのアミノ酸が置換されたことを確認した。前記表4の表記において数字はSigAのアミノ酸番号を意味し、数字の前のアルファベットは置換前のアミノ酸を、数字の後のアルファベットは置換されたアミノ酸を意味する。
実施例6:高濃度L−リジン生産株のためのrpoD変異染色体導入用ベクター製作
前記実施例4で確認されたSigA変異を適用した効果を確認するために、これを染色体上に導入することができるベクターを作製した。
報告された塩基配列に基づいて、5’末端にEcoRI制限酵素部位を挿入したプライマー4(配列番号6)及び3’末端にSalI制限酵素部位を挿入したプライマー5(配列番号7)を合成した。このプライマー対を用いて、前記選別された15種の染色体をそれぞれ鋳型としてPCRを行い、15種の変異型rpoD(mt)遺伝子断片を増幅した。PCR条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、72℃で2分間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
PCRで増幅した15種の遺伝子断片を制限酵素EcoRI及びSalIで処理し、それぞれのDNA切片を獲得した後、これを制限酵素EcoRI及びSalI末端を有する染色体導入用pDZベクター(特許文献4)に連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。PCRを用いて目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した。その後、一般的に知られているプラスミド抽出法でプラスミドを獲得し、このプラスミドのSigAに挿入された変異に応じて、それぞれpDZ−SigA(D136G、T281S)、pDZ−SigA(L381R)、pDZ−SigA(M230T)、pDZ−SigA(M455V)、pDZ−SigA(S488T)、pDZ−SigA(R279L)、pDZ−SigA(I254N)、pDZ−SigA(A268S)、pDZ−SigA(L451I、Q491R)、pDZ−SigA(Q429R)、pDZ−SigA(K90E、K105Y、D250G、I254L)、pDZ−SigA(L447H)、pDZ−SigA(K483R)、pDZ−SigA(K479R)、pDZ−SigA(D238V、N263S、E358D)と命名した。また、前記変異体に対する他の対照群としてL−リジン生産性の増加に効果があると既に報告された(特許文献2)SigA変異A414Vを染色体上に挿入するためのベクターを作製するためにプライマー6〜9(配列番号8〜11)を作製した。コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のゲノムDNAを鋳型として、プライマー6とプライマー9対及びプライマー7とプライマー8対でそれぞれPCRを行った。PCR条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、72℃で1分間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
その結果、約500bpの遺伝子断片2つを獲得し、増幅された産物は、Infusion cloning kit(Invitrogen)を使用してpDZベクターに接合し、製作されたベクターをpDZ−SigA(A414V)と命名した。
実施例7:高濃度L−リジン生産株のためにSigA変異型ポリペプチドが導入されたKCCM11016P菌株の製作及びL−リジン生産能の比較
前記実施例6で製作した新規変異の導入ベクター15種及び既に報告された変異の導入ベクター1種を2段階の相同染色体組換えによりL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pに形質転換した。その後、染色体上のSigA変異が導入された菌株を塩基配列の分析により選別し、前記SigA変異が導入された菌株をKCCM11016P::SigA(D136G、T281S)、KCCM11016P::SigA(L381R)、KCCM11016P::SigA(M230T)、KCCM11016P::SigA(M455V)、KCCM11016P::SigA(S488T)、KCCM11016P::SigA(R279L)、KCCM11016P::SigA(I254N)、KCCM11016P::SigA(A268S)、KCCM11016P::SigA(L451I、Q491R)、KCCM11016P::SigA(Q429R)、KCCM11016P::SigA(K90E、K105Y、D250G、I254L)、KCCM11016P::SigA(L447H)、KCCM11016P::SigA(K483R)、KCCM11016P::SigA(K479R)、KCCM11016P::SigA(D238V、N263S、E358D)、KCCM11016P::SigA(A414V)と命名した。
前記実施例4と同様な方法で培養して、そこからL−リジンの濃度を分析し、その結果は下記表7の通りである。
その結果、2種の新規変異導入株(KCCM11016P::SigA(M230T)、KCCM11016P::SigA(R279L))は、親菌株に比べ同等のL−リジン生産能を示し、他の2種の新規変異導入株(KCCM11016P::SigA(K90E、K105Y、D250G、I254L)、KCCM11016P::SigA(D238V、N263S、E358D))は成長速度が著しく遅くなり、L−リジン生産量が大幅に減少した。しかし、残りの新規変異株11種は親菌株に比べL−リジン生産能が最大19%増加し、既に報告した変異(SigA(A414V))導入株KCCM11016P::SigA(A414V)に比べてもL−リジン生産能が16%増加したことを確認した。これに対し、本発明者らは、前記L−リジン生産能が向上した菌株であるKCCM11016P::SigA(L447H)をコリネバクテリウム・グルタミクム「CA01−2277」と命名し、2013年11月22日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託し、受託番号KCCM11479Pが与えられた。
このような結果は、新規な11種のSigA変異型ポリペプチドがL−リジン生産能に優れることを示唆する。
実施例8:高濃度L−リジン生産株のためにSigA変異型ポリペプチドが導入されたKFCC10750菌株製作及びL−リジン生産能の比較
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する他の菌株において、前記実施例7で選別したSigA変異11種の導入効果を確認するために、前記実施例7と同様の方法でL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10750(KCCM11347P、特許文献5)に11種のSigA変異がそれぞれ導入された菌株を製作して、KFCC10750::SigA(D136G、T281S)、KFCC10750::SigA(L381R)、KFCC10750::SigA(M455V)、KFCC10750::SigA(S488T)、KFCC10750::SigA(I254N)、KFCC10750::SigA(A268S)、KFCC10750::SigA(L451I、Q491R)、KFCC10750::SigA(Q429R)、KFCC10750::SigA(L447H)、KFCC10750::SigA(K483R)、KFCC10750::SigA(K479R)と命名した。また、既に報告した変異SigA(A414V)を導入した菌株も製作し、これをKFCC10750::SigA(A414V)と命名した。
前記実施例4と同様な方法で培養して、そこからL−リジンの濃度を分析し、その結果は下記表8の通りである。
その結果、新規変異導入株11種は、親菌株に比べてL−リジン生産能が最大17%増加し、既に報告された変異SigA(A414V)導入株KFCC10750::SigA(A414V)に比べてもL−リジン生産能が約14%増加したことを確認した。
実施例9:高濃度L−リジン生産株のためにSigA変異型ポリペプチドが導入されたKCCM10770P菌株製作及びL−リジン生産能の比較
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する他の菌株において、前記実施例7で選別したSigA変異11種の効果を確認するために、前記実施例7と同様の方法でL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10770P(特許文献4)にSigA変異が導入された菌株を製作し、KCCM10770P::SigA(D136G、T281S)、KCCM10770P::SigA(L381R)、KCCM10770P::SigA(M455V)、KCCM10770P::SigA(S488T)、KCCM10770P::SigA(I254N)、KCCM10770P::SigA(A268S)、KCCM10770P::SigA(L451I、Q491R)、KCCM10770P::SigA(Q429R)、KCCM10770P::SigA(L447H)、KCCM10770P::SigA(K483R)、KCCM10770P::SigA(K479R)と命名した。また、既に報告した変異SigA(A414V)を導入した菌株も製作し、KCCM10770P::SigA(A414V)と命名した。
前記実施例4と同様な方法で培養して、そこからL−リジンの濃度を分析し、その結果は下記表9の通りである。
その結果、新規変異導入株11種は親菌株に比べL−リジン生産能が最大20%増加し、既に報告した変異SigA(A414V)導入株KCCM10770P::SigA(A414V)に比べてもL−リジン生産能は約16%増加したことを確認した。
実施例10:高濃度L−リジン生産株のために、SigA変異型ポリペプチドが導入されたCJ3P菌株製作及びL−リジン生産能の比較
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する他の菌株における効果も確認するために、前記実施例7と同様の方法でL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムCJ3P(非特許文献7)にSigA変異が導入された菌株を製作し、CJ3P::SigA(D136G、T281S)、CJ3P::SigA(L381R)、CJ3P::SigA(M455V)、CJ3P::SigA(S488T)、CJ3P::SigA(I254N)、CJ3P::SigA(A268S)、CJ3P::SigA(L451I、Q491R)、CJ3P::SigA(Q429R)、CJ3P::SigA(L447H)、CJ3P::SigA(K483R)、CJ3P::SigA(K479R)と命名した。また、既に報告した変異SigA(A414V)を導入した菌株も製作し、CJ3P::SigA(A414V)と命名した。CJ3P菌株は、公知となった技術に基づいて野生株に3種の変異を導入してL−リジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクム菌株である。
前記実施例4と同様な方法で培養し、そこからL−リジンの濃度を分析し、その結果は下記表10の通りである。
その結果、新規変異導入株11種は親菌株に比べてL−リジン生産能が最大20%増加し、既に報告した変異SigA(A414V)導入株CJ3P::SigA(A414V)に比べてもL−リジン生産能は約15%増加したことを確認した。
前記結果を総合すると、本発明において新規に確保した11種のSigA活性を有する変異型ポリペプチド(SigA(D136G、T281S)、SigA(L381R)、SigA(M455V)、SigA(S488T)、SigA(I254N)、SigA(A268S)、SigA(L451I、Q491R)、SigA(Q429R)、SigA(L447H)、SigA(K483R)、SigA(K479R))が、多様なコリネバクテリウム属微生物においてそれぞれL−リジン生産能の増加に優れた効果があり、これは既に報告した変異SigA(A414V)よりL−リジン生産能の増大効果が優れることを示唆する。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (11)

  1. 配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて下記位置のアミノ酸のうち、一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、RNAポリメラーゼシグマ因子A活性を有する変異型ポリペプチド:
    開始メチオニンを1番目のアミノ酸にして、そこから136番目のアミノ酸;254番目のアミノ酸;268番目のアミノ酸;281番目のアミノ酸;381番目のアミノ酸;429番目のアミノ酸;及び445番目〜495番目のアミノ酸。
  2. 前記アミノ酸の置換が、136番目のアミノ酸;254番目のアミノ酸;268番目のアミノ酸;281番目のアミノ酸;381番目のアミノ酸;429番目のアミノ酸;447番目のアミノ酸;451番目のアミノ酸;455番目のアミノ酸;479番目のアミノ酸;483番目のアミノ酸;488番目のアミノ酸;及び491番目のアミノ酸からなるアミノ酸のうち、1種以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
  3. 下記アミノ酸の置換のうち、1種以上が組み合わされた、請求項1に記載の変異型ポリペプチド:
    136番目のアミノ酸がグリシンで置換;254番目のアミノ酸がアスパラギンで置換;268番目のアミノ酸がセリンで置換;281番目のアミノ酸がセリンで置換;381番目のアミノ酸がアルギニンで置換;429番目のアミノ酸がアルギニンで置換;447番目のアミノ酸がヒスチジンで置換;451番目のアミノ酸がイソロイシンで置換;455番目のアミノ酸がバリンで置換;479番目のアミノ酸がアルギニンで置換;483番目のアミノ酸がアルギニンで置換;488番目のアミノ酸がトレオニンで置換;及び491番目のアミノ酸がアルギニンで置換。
  4. 前記変異型ポリペプチドが、配列番号12〜22のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列を有するものである、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
  5. 請求項1に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  7. 配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて下記位置のアミノ酸のうち、一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、RNAポリメラーゼシグマ因子A活性を有する変異型ポリペプチドを含むように形質転換されたL−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物:
    開始メチオニンを1番目のアミノ酸にして、そこから136番目のアミノ酸;254番目のアミノ酸;268番目のアミノ酸;281番目のアミノ酸;381番目のアミノ酸;429番目のアミノ酸;及び445番目〜495番目のアミノ酸。
  8. 前記アミノ酸の置換が、136番目のアミノ酸;254番目のアミノ酸;268番目のアミノ酸;281番目のアミノ酸;381番目のアミノ酸;429番目のアミノ酸;447番目のアミノ酸;451番目のアミノ酸;455番目のアミノ酸;479番目のアミノ酸;483番目のアミノ酸;488番目のアミノ酸;及び491番目のアミノ酸からなるアミノ酸のうち、1種以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、請求項7に記載のL−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
  9. 下記アミノ酸の置換のうち、1種以上が組み合わされた、請求項7に記載のL−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物:
    136番目のアミノ酸がグリシンで置換;254番目のアミノ酸がアスパラギンで置換;268番目のアミノ酸がセリンで置換;281番目のアミノ酸がセリンで置換;381番目のアミノ酸がアルギニンで置換;429番目のアミノ酸がアルギニンで置換;447番目のアミノ酸がヒスチジンで置換;451番目のアミノ酸がイソロイシンで置換;455番目のアミノ酸がバリンで置換;479番目のアミノ酸がアルギニンで置換;483番目のアミノ酸がアルギニンで置換;488番目のアミノ酸がトレオニンで置換;及び491番目のアミノ酸がアルギニンで置換。
  10. 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項7に記載のL−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
  11. 請求項7〜10のいずれか一項による微生物を培養する段階;及び前記培養された微生物または培養培地からL−リジンを回収する段階を含む、L−リジンを生産する方法。
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