RU2668176C1 - Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668176C1 RU2668176C1 RU2017107246A RU2017107246A RU2668176C1 RU 2668176 C1 RU2668176 C1 RU 2668176C1 RU 2017107246 A RU2017107246 A RU 2017107246A RU 2017107246 A RU2017107246 A RU 2017107246A RU 2668176 C1 RU2668176 C1 RU 2668176C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- siga
- replacing
- lysine
- microorganism
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 134
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 101710198277 RNA polymerase sigma factor sigA Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 99
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 98
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 66
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 66
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 87
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 20
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 101150102864 rpoD gene Proteins 0.000 description 13
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 101100091878 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) rpoC2 gene Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- -1 glycerol and ethanol Chemical class 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 101150029016 rpo3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 102220085098 rs763184444 Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен модифицированный полипептид, обладающий активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, где по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в следующих положениях полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, заменена, и аминокислотная замена представляет собой по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: 136G, 254N, 268S, 281S, 381R, 429R, 447H, 451I, 455V, 479R, 483R, 488T и 491R. Предложен полинуклеотид, кодирующий указанный модифицированный полипептид. Предложен микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-лизин, содержащий указанный модифицированный полипептид. Предложен способ получения L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений позволяет повысить продукцию L-лизина. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 10 табл., 10 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому модифицированному полипептиду сигма-фактора А РНК-полимеразы (SigA), кодирующему его полинуклеотиду, микроорганизму, содержащему этот полипептид, и способу получения L-лизина с использованием этого микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
Штаммы микроорганизмов с повышенной продуктивностью могут быть созданы путем открытия и соответствующего использования генетических факторов, которые непосредственно/опосредованно вовлечены на ранних стадиях гликолиза, для получения штаммов, продуцирующих полезные продукты, такие как аминокислоты, в большом масштабе. Репрезентативные примеры технологий, которые можно применять для этого, могут включать глобальное репрограммирование транскриптома (gTME), которое представляет собой подход к регуляции экспрессии всех генов в клетке путем индуцирования случайного мутагенеза рекрутирующих белков РНК-полимеразы. Например, исследовательская группа из Массачусетского технологического института добилась успеха в значительном повышении способности Е.coli продуцировать тирозин с использованием технологии gTME (Патент США No. 8735132).
РНК-полимераза, применяемая на стадии транскрипции у микроорганизмов, представляет собой макромолекулу, состоящую из 5 небольших субъединиц, а именно двух факторов α, одного фактора β, одного фактора β' и одного фактора ω, и ее холофермент обозначают как α2ββ'ω. Сигма(σ)-факторы вместе с холоферментом представляют собой факторы, необходимые для стадии инициации транскрипции, которые обеспечивают специфичность связывания РНК-полимеразы с промотором. Штамм Corynebacterium имеет 7 типов сигма-факторов (SigA, SigB, SigC, SigD, SigE, SigH и SigM), которые регулируют транскрипцию определенных групп генов в соответствии с изменениями в окружающей среде (Journal of Biotechnology 154, 2011, 101-113). В частности, SigA представляет собой главный регулятор среди сигма-факторов, вовлеченных в регуляцию большинства генов "домашнего хозяйства" и "коровых" генов. Согласно сообщениям по результатам предыдущих исследований, были предприняты попытки улучшить способность продуцировать целевые вещества путем случайного мутагенеза SigA (Metabolic Engineering 9, 2007, 258-267), и также было сообщение, касающееся исследования повышения способности продуцировать L-лизин с использованием штамма Corynebacterium (Международная публикация No. WO 2003-054179).
Описание
Техническая задача
В этих обстоятельствах авторы настоящего изобретения приложили усилия для создания микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-лизин в повышенной концентрации без ингибирования роста клетки-хозяина. В результате они подтвердили, что микроорганизм рода Corynebacterium с повышенной способностью продуцировать L-лизин можно создать путем введения нового модифицированного типа полипептида SigA РНК-полимеразы в микроорганизм после разработки микроорганизма, в чем и заключается настоящее изобретение.
Техническое решение
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить модифицированный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, обладающей активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, в котором часть аминокислот полипептида заменена.
Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий этот модифицированный полипептид.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить трансформированный микроорганизм, кодирующий этот полипептид.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения L-лизина, включающий получение культуральной среды путем культивирования микроорганизма и выделения L-лизина из культуральной среды или из культивируемого микроорганизма.
Полезные эффекты изобретения
Настоящее изобретение позволяет подтвердить, может ли какой-либо модифицированный полипептид, имеющий модифицированный сигма-фактор А РНК-полимеразы, вызывать повышение способности продуцировать L-лизин. Кроме того, на основании вышеизложенного, микроорганизм, способный экспрессировать соответствующий модифицированный полипептид, обладает в высшей степени превосходной способностью продуцировать L-лизин. Соответственно, ожидается, что микроорганизм обеспечит эффекты по снижению производственных затрат, удобству в получении и так далее в промышленном аспекте.
Наилучшее воплощение изобретения
Для решения вышеизложенных задач в одном аспекте настоящего изобретения предложен модифицированный полипептид, обладающий активностью нового сигма-фактора А РНК-полимеразы.
Как его используют здесь, термин "сигма-фактор A (SigA) РНК-полимеразы" относится к фактору инициации транскрипции, который действует вместе с РНК-полимеразой, и он представляет собой белок (SigA), соответствующий одному из сигма-факторов. Сигма-факторы вовлечены в регуляцию транскрипции путем взаимодействия с ДНК выше по ходу транскрипции (UP-элемент), которая присутствует выше по ходу транскрипции от определенного промотора, и различными транскрипционными факторами. В частности, SigA известен как главный регулятор, контролирующий большинство "коровых" генов. Информацию по белку SigA можно получить из известных баз данных, таких как NCBI GenBank, например по белку с № доступа NP_601117. В частности, белок SigA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, но последовательность не ограничена этим, при условии что белок обладает такой же активностью как SigA по настоящему изобретению.
Как его используют здесь, термин "модифицированный полипептид" относится к полипептиду, в котором аминокислотная последовательность полипептида дикого типа частично или полностью заменена. В настоящем описании модифицированный полипептид относится к полипептиду, обладающему активностью сигма-фактора A (SigA) РНК-полимеразы, в котором аминокислотная последовательность полипептида, имеющего сигма-фактор А (SigA) РНК-полимеразы, частично заменена, таким образом имеющему аминокислотную последовательность, отличную от таковой аминокислотной последовательности дикого типа. То есть, в настоящем изобретении предложен модифицированный полипептид SigA, который вносит вклад в способность продуцировать L-лизин, вместо полипептида SigA дикого типа.
В частности, модифицированный полипептид может представлять собой полипептид, обладающий активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в следующих положениях полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту:
136-ая аминокислота, 254-ая аминокислота, 268-ая аминокислота, 281-ая аминокислота, 381-ая аминокислота, 429-ая аминокислота и с 445-ой по 495-ую аминокислоты относительно инициирующего метионина, обозначенного как первая аминокислота.
То есть, модифицированный полипептид может представлять собой полипептид, в котором аминокислота по меньшей мере в одном положении из 57 аминокислотных положений для модификации (136-ая, 254-ая, 268-ая, 281-ая, 381-ая, 429-ая и от 445-ой до 495-ой) заменена на другую аминокислоту.
Более конкретно, среди аминокислот от 445-ой до 495-ой, по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 447-ой аминокислоты, 451-ой аминокислоты, 455-ой аминокислоты, 479-ой аминокислоты, 483-ей аминокислоты, 488-ой аминокислоты и 491-ой аминокислоты, может быть заменена на другую аминокислоту, но без ограничения этим.
В частности, аминокислотная замена может представлять собой комбинацию по меньшей мере одной из следующих аминокислотных замен:
замена 136-ой аминокислоты на глицин (D136G); замена 254-ой аминокислоты на аспарагин (I254N); замена 268-ой аминокислоты на серии (A268S); замена 281-ой аминокислоты на серии (T281S); замена 381-ой аминокислоты на аргинин (L381R); замена 429-ой аминокислоты на аргинин (Q429R); замена 447-ой аминокислоты на гистидин (L447H); замена 451-ой аминокислоты на изолейцин (L451I); замена 455-ой аминокислоты на валин (M455V); замена 479-ой аминокислоты на аргинин (K479R); замена 483-ей аминокислоты на аргинин (K483R); замена 488-ой аминокислоты на треонин (S488T) и замена 491-ой аминокислоты на аргинин (Q491R) относительно инициирующего метионина.
Более конкретно, полипептид может представлять собой модифицированный полипептид, в котором 136-ая аминокислота и 281-ая аминокислота заменены на глицин и серии, соответственно (D136G, T281S); 254-ая аминокислота на аспарагин (I254N); 268-ая аминокислота на серии (A268S); 381-ая аминокислота на аргинин (L381R); 429-ая аминокислота на аргинин (Q429R); 447-ая аминокислота на гистидин (L447H); 451-ая и 491-ая аминокислоты на изолейцин и аргинин, соответственно (L451I, Q491R); 455-ая аминокислота на валин (M455V); 479-ая аминокислота на аргинин (K479R); 483-ая аминокислота на аргинин (K483R) и 488-ая аминокислота на треонин (S488T) относительно инициирующего метионина полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет место комбинация по меньшей мере из одной из представленных выше 11 аминокислотных замен.
Согласно одному примеру воплощения настоящего изобретения, модифицированный полипептид может представлять собой полипептид, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-22.
Модифицированный полипептид по настоящему изобретению включает, без ограничения, не только аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 12-22, но также аминокислотные последовательности, имеющие гомологию с вышеизложенными аминокислотными последовательностями 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше или еще более конкретно 99%, где эти белки вносят вклад в улучшение способности продуцировать L-лизин по сравнению с таковой белка SigA дикого типа. Очевидно, что любая аминокислотная последовательность, обладающая биологической активностью по существу такой же или соответствующей таковой у белка, имеющего аминокислотную последовательность модифицированного белка SigA, дополнительно к вышеуказанной гомологии последовательности, также будет попадать в объем настоящего изобретения, хотя аминокислотная последовательность может иметь делецию, модификацию, замену или вставку в части последовательности.
Как его используют здесь, термин "гомология" относится к степени идентичности между двумя различными последовательностями нуклеотидов или аминокислотных остатков в определенном участке сравнения нуклеотидных или аминокислотных последовательностей гена, кодирующего белок, после выравнивания обеих последовательностей до максимального соответствия. Когда гомология является достаточно высокой, продукты экспрессии соответствующего гена могут иметь такую же или похожую активность. Гомологию можно определить с использованием программы для сравнения последовательностей, известной в области техники, например BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign™ (DNASTAR Inc.) и им подобных.
Другой аспект настоящего изобретения включает полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, или вектор, включающий этот полинуклеотид.
Как его используют здесь, термин "полинуклеотид" относится к полимеру из нуклеотидов, простирающемуся в длину в виде цепи посредством ковалентной связи между нуклеотидными единицами, то есть цепи ДНК или РНК, имеющей по меньшей мере определенную длину, и более конкретно он относится к полинуклеотидному фрагменту, кодирующему модифицированный полипептид.
В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность сигма-фактора A (SigA) РНК-полимеразы, представляет собой ген rpoD, и более конкретно, ген, имеющий происхождение из Corynebacterium glutamicum. На основании вырожденности генетического кода нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислоту и ее варианты, попадают в объем настоящего изобретения и, в частности, они могут быть представлены SEQ ID NO: 1, но не ограничиваться этим.
Дополнительно, в отношении модифицированного полипептида, нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислоту и ее варианты, попадают в объем настоящего изобретения на основании вырожденности генетического кода. Более конкретно, любая нуклеотидная последовательность, кодирующая любую из аминокислотных последовательностей 12-22 и их варианты, может быть включена, но без ограничения ими.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, включающая полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, и микроорганизм, трансформированный вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид. Более конкретно, введение может быть выполнено путем трансформации, но без ограничения этим.
Более конкретно, микроорганизм, включающий модифицированный полипептид SigA может улучшать способность продуцировать L-лизин без ингибирования роста клетки-хозяина и, таким образом, может получать L-лизин с высоким выходом по сравнению с микроорганизмом, включающим полипептид SigA дикого типа.
Как его используют здесь, термин "вектор" относится к любому носителю для клонирования и/или переноса нуклеотидов в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон для обеспечения возможности репликации фрагмента, комбинированного с другим фрагментом ДНК. Термин "репликон" относится к любой генетической единице, действующей как самореплицирующаяся единица для репликации ДНК in vivo, то есть произвольные генетические единицы, способные к репликации путем саморегуляции (например плазмиды, фаги, космиды, хромосомы и вирусы). Как его используют здесь, термин "вектор" может включать вирусные и невирусные носители для введения нуклеотидов в клетку-хозяина in vitro, ex vivo или in vivo, и также может включать мини-сферическую ДНК. Например, вектор может представлять собой плазмиду без последовательности бактериальной ДНК. Дополнительно вектор может включать транспозоны (Annu Rev Genet. 2003; 37: 3-29) или искусственные хромосомы. Более конкретно, вектор может включать векторы pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, pDZ и pMW118, но без ограничения ими.
Как его используют здесь, термин "трансформация" относится к процессу введения гена в клетку-хозяина, тем самым давая возможность экспрессии гена в клетке-хозяине. Трансформированный ген может включать, без ограничения, как ген, вставленный в хромосому клетки-хозяина, так и ген, локализованный за пределами хромосомы, при условии, что они могут экспрессироваться в клетке-хозяине.
Дополнительно ген может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой полинуклеотидную конструкцию, включающую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может включать промотор, функционально связанный с геном, сигнал терминации транскрипции, домен связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме вектора экспрессии, способного к саморепликации. Дополнительно полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как есть или в форме полинуклеотидной конструкции, и может быть функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничения этим.
Клетка-хозяин или микроорганизм могут представлять собой любую клетку-хозяин или микроорганизм, которые включают полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, или которые трансформированы вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, таким образом обладая способностью экспрессировать модифицированный полипептид, и для задач настоящего изобретения клетка-хозяин или микроорганизм могут представлять собой любую клетку-хозяин или микроорганизм, которые могут продуцировать L-лизин посредством включения SigA-модифицированного полипептида. Конкретные примеры микроорганизма могут включать микробные штаммы, принадлежащие роду Escherichia, роду Serratia, роду Erwinia, роду Enterobacteria, роду Salmonella, роду Streptomyces, роду Pseudomonas, роду Brevibacterium, роду Corynebacterium и так далее, и конкретно микроорганизм, принадлежащий роду Corynebacterium, и более конкретно Corynebacterium glutamicum, но без ограничения ими.
В примере воплощения по настоящему изобретению в различные штаммы Corynebacterium glutamicum, обладающие способностью продуцировать L-лизин (KCCM11016P, KFCC10750, KCCM10770P и CJ3P), вводили модифицированный полипептид, который включает одну любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-22, и сравнивали их продуктивности по L-лизину. В результате было подтверждено, что все штаммы, в которые вводили модифицированный полипептид, демонстрировали повышенный уровень продукции L-лизина по сравнению со штаммом, включающим полипептид SigA дикого типа (Примеры 7-10 и Таблицы 8-11). Эти результаты позволяют предположить, что микроорганизм, включающий модифицированный полипептид по настоящему изобретению, представляет собой штамм с усиленной способностью продуцировать L-лизин, и этот микроорганизм обеспечивает экономическое преимущество при получении L-лизина с высоким выходом при культивировании этого микроорганизма.
Авторы настоящего изобретения обозначили штамм с усиленной способностью продуцировать L-лизин как таковой "KCCM11016P::SigA(L447H)", как "Corynebacterium glutamicum СА01-2277" и депонировали его в Корейском центре культур микроорганизмов, признанном международным органом депонирования согласно Будапештскому договору, 22 ноября 2013 года с номером доступа KCCM11479P.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-лизина, включающий культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, описанного выше, и выделение L-лизина из культивируемого микроорганизма или культуральной среды.
Как его используют здесь, термин "культивирование" относится к выращиванию микроорганизма в подходящих и искусственно контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть выполнен на основе подходящих культуральной среды и условий культивирования, известных в области техники. Конкретные условия, такие как температура культивирования, время культивирования, рН культуральной среды и так далее, обычный специалист в данной области техники может определить на основании общих знаний или путем традиционного способа, известного в данной области техники, и соответственно отрегулировать подходящим образом. Более конкретно, эти известные способы культивирования подробно описаны в источниках [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) и Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Дополнительно, способы культивирования могут включать периодическое культивирование, непрерывное культивирование и культивирование с подпиткой, и в особенности, культивирование можно осуществлять непрерывно в процессе культивирования с подпиткой или периодического культивирования с подпиткой, но без ограничения этим.
Среда, используемая при культивировании, должна соответствующим образом удовлетворять требованиям конкретных штаммов. Примеры источников углерода для использования в этой среде могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота, но без ограничения ими. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации, но без ограничения этим. Примеры источников азота для использования в среде могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота также можно использовать по отдельности или в комбинации, но без ограничения этим. Примеры источников фосфора для использования в среде могут включать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия, соответствующие натрий-содержащие соли и так далее, но без ограничения ими. Дополнительно среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, необходимые для роста. Наконец, вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины, также могут содержаться в дополнение к веществам, описанным выше. Дополнительно можно использовать предшественники, подходящие для культуральной среды. Эти источники можно добавлять в культуру подходящим способом во время культивирования путем периодического культивирования или непрерывного культивирования, но способы не ограничены этим.
Дополнительно, значение рН культуры может быть скорректировано во время культивирования путем добавления в культуру такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, подходящим образом. Во время культивирования можно добавлять пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для предупреждения образования пены. Дополнительно для поддержания аэробного состояния культуры в культуру может быть введен кислород или газ, содержащий кислород; или азот, водород или углекислый газ могут быть введены без введения газа для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния культуры. Температура в культуре обычно может находиться в диапазоне от 27°С до 37°С, и более конкретно, от 30°С до 35°С. Культивирование можно продолжать до тех пор, пока не будет получено желаемое количество полезных веществ, и в особенности от 10 часов до 100 часов. L-лизин может выделяться в культуральную среду, в которой проводится культивирование, или может содержаться в клетках микроорганизма.
Дополнительно, в отношении способа получения L-лизина по настоящему изобретению, способ выделения L-лизина из культивируемого микроорганизма или из культуры широко известен в данной области техники. Способы выделения L-лизина могут включать фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, HPLC (высокоэффективную жидкостную хроматографию) и так далее, но не ограничиваются ими.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры приведены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение модифицированного полипептида SigA путем искусственного мутагенеза
В этом примере библиотеку векторов для первичной вставки в хромосому путем кроссинговера для получения модифицированного SigA получали следующим способом. Выполняли ПЦР (полимеразная цепная реакция) пониженной точности (error-prone PCR) для гена rpoD (SEQ ID NO: 1), кодирующего SigA Corynebacterium (SEQ ID NO: 2), и таким образом были получены фрагменты (1497 п.н.) вариантов гена rpoD с введенной случайным образом модификацией - нуклеотидной заменой. ПЦР пониженной точности проводили с помощью набора Genemorphll Random Mutagenesis Kit (Stratagene) с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы наряду с праймером 1 (SEQ ID NO: 3) и праймером 2 (SEQ ID NO: 4). ПЦР пониженной точности проводили таким образом, что модификации могли быть введены в амплифицированный фрагмент гена в соотношении от 0 до 4,5 мутаций на 1 т.п.н. амплифицированного фрагмента. ПЦР выполняли в течение 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 96°С в течение 30 сек, отжиг при 53°С в течение 30 сек и полимеризация при 72°С в течение 2 мин.
Амплифицированные фрагменты гена соединяли с вектором pCR2.1-ТОРО (здесь и далее 'pCR2.1') с использованием набора для клонирования pCR2.1-TOPO ТА Cloning Kit (Invitrogen), трансформировали в Е.coli DH5a и высевали на твердую среду LB. Из трансформированных таким образом колоний выбрали двадцать, и их нуклеотидные последовательности анализировали после выделения из них плазмид. В результате было подтверждено, что мутации были введены в различные положения с частотой 1,5 мутаций/т.п.н. Плазмиды экстрагировали примерно из 20000 трансформированных колоний Е. Coli, и они получили название "библиотека pCR2.1-rpoD(mt)". Затем была получена плазмида, включающая ген rpoD дикого типа, для применения в качестве контроля. ПЦР проводили с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы наряду с праймером 1 (SEQ ID NO: 3) и праймером 2 (SEQ ID NO: 4) в таких же условиях как описано выше. В качестве полимеразы использовали высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene), и плазмиды, полученные таким образом получили название "pCR2.1-rpoD (WT)".
Пример 2: Получение библиотеки штаммов с модифицированным SigA с повышенной способностью продуцировать L-лизин
Библиотеку pCR2.1-rpoD(mt), полученную с использованием штамма KCCM11016P (патент Кореи No. 10-0159812) в качестве родительского штамма, трансформировали путем гомологичной хромосомной рекомбинации, высевали на комплексную среду, содержащую канамицин (25 мг/л) и компоненты, описанные ниже, и из нее было получено примерно 25000 колоний. Колонии получили названия от "KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1" до "KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-25000". Дополнительно, полученным таким образом вектором pCR2.1-rpoD(WT) трансформировали штамм KCCM11016P для получения контрольного штамма, и он получил название "KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT)".
Полученные таким образом трансформанты будут иметь две копии гена rpoD в хромосоме. Однако, в библиотеку pCR2.1-rpoD(mt) и вектор pCR2.1-rpoD(WT) вставлены фрагменты гена rpoD без какого-либо промотора, и следовательно, когда они вставлены в хромосому штамма путем гомологичной рекомбинации, только одна копия из двух копий гена rpoD экспрессируется, таким образом давая возможность экспрессии модифицированного белка SigA или белка SigA дикого типа.
Комплексная среда (рН 7,0)
Глюкоза (10 г), пептон (10 г), экстракт говядины (5 г), дрожжевой экстракт (5 г), сердечно-мозговая вытяжка (18,5 г), NaCl (2,5 г), мочевина (2 г), сорбит (91 г), агар (20 г) (на основе 1 л дистиллированной воды)
Пример 3: Скрининг библиотеки штаммов с модифицированным SigA с улучшенной способностью продуцировать L-лизин
Примерно 25000 колоний, полученных в Примере 2, были соответственно инокулированы в селективную среду (300 мкл), содержащую компоненты, описанные ниже, и их культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками при 32°С на скорости 1000 об/мин в течение 24 часов. Количество L-лизина, продуцируемого во время культивирования, анализировали нингидриновым методом (J. Biol. Слет. 1948. 176: 367-388). После завершения культивирования 10 мкл культурального супернатанта и 190 мкл раствора для нингидриновой реакции ((63% глицерин, 27% нингидриновый реактив (7,1 г/л в 0,5 М цитратном буфере, рН 5,5)) взаимодействовали при 65°С в течение 30 минут. Поглощение при длине волны 570 нм измеряли с помощью спектрофотометра и сравнивали с таковым контроля, то есть KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT), и было выбрано примерно 935 модифицированных штаммов, демонстрирующих поглощение, увеличенное по меньшей мере на 10%. Другие колонии демонстрировали похожее или уменьшенное поглощение по сравнению с контролем.
Селективная среда (рН 8,0)
Глюкоза (10 г), сульфат аммония (5,5 г), MgSO4⋅7H2O (1,2 г), KH2PO4 (0,8 г), K2HPO4 (16,4 г), биотин (100 мкг), тиамин HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг) и никотинамид (2000 мкг) (на основе 1 л дистиллированной воды).
Вышеописанный способ неоднократно повторяли для выбранных 935 штаммов, и были выбраны лучшие 231 тип штаммов со способностью продуцировать L-лизин, улучшенной на 15% или больше по сравнению с таковой штамма KCCM11016P /pCR2.1-rpoD(WT).
Пример 4: Анализ способности продуцировать L-лизин KCCM11016P/dCR2.1-moD(mt)
231 тип штаммов, выбранных в Примере 3, анализировали в отношении их способности продуцировать L-лизин после их культивирования следующим способом.
Каждый из штаммов инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 25 мл среды для посевной культуры, соответственно, и культивировали во встряхиваемом инкубаторе (200 об/мин) при 30°С в течение 20 часов. Затем в каждую из колб на 250 мл с угловыми перегородками, содержащих 24 мл культуры, которая содержала компоненты, описанные ниже, инокулировали 1 мл посевной культуральной жидкости и культивировали во встряхиваемом инкубаторе (200 об/мин) при 30°С в течение 72 часов. Концентрацию L-лизина в каждой культуре анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Посевная культуральная среда (рН 7,0)
Глюкоза (20 г), пептон (10 г), дрожжевой экстракт (5 г), мочевина (1,5 г), KH2PO4 (4 г), K2HPO4 (8 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг) и никотинамид (2000 мкг) (на основе 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
Глюкоза (100 г), (NH4)2SO4 (40 г), соевый белок (2,5 г), твердая фракция кукурузного экстракта (5 г), мочевина (3 г), KH2PO4 (1 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг), никотинамид (3000 мкг) и CaCO3 (30 г) (на основе 1 л дистиллированной воды).
Из выбранных 231 типа штаммов было выбрано 17 типов штаммов, воспроизводимо демонстрирующих повышенную концентрацию L-лизина по сравнению с контролем, и культивирование и анализ были выполнены в повторах. Результаты анализа концентрации L-лизина показаны в Таблице 2 ниже.
В результате анализа концентрации L-лизина 17 выбранных штаммов было подтверждено, что способность продуцировать L-лизин 15 штаммов, исключая два штамма, то есть KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-6589 и KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-18904, была повышена максимум на 20% по сравнению с таковой в контроле, штамме KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT).
Пример 5: Подтверждение мутаций в гене rpoD у штаммов, выбранных из библиотеки с искусственным мутагенезом SigA
Для подтверждения мутаций, введенных в SigA в 15 штаммах, демонстрирующих улучшенную способность продуцировать L-лизин из 17 выбранных штаммов из Примера 4, были проанализированы нуклеотидные последовательности мутантов rpoD. Для определения нуклеотидных последовательностей проводили ПЦР с использованием праймера 1 (SEQ ID NO: 3) и праймера 3 (SEQ ID NO: 5).
Нуклеотидная последовательность модифицированного гена rpoD была подтверждена на основании Генного банка Национального института здоровья (NIH Genbank) путем анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов модифицированного гена rpoD для каждого из полученных таким образом 15 штаммов, и нуклеотидная последовательность модифицированного SigA была подтверждена. Результаты анализа модифицированной аминокислотной последовательности SigA полученных таким образом 15 штаммов показаны в Таблице 4 ниже.
В результате было подтверждено, что были заменены аминокислоты в диапазоне минимум от одной максимум до четырех. В Таблице 4 выше цифры представляют номер аминокислоты SigA, буква напротив цифры представляет аминокислоту до замены, и буква после цифры представляет аминокислоту, на которую произведена замена.
Пример 6: Получение вектора для введения в хромосому модифицированного rpoD для получения штамма, способного продуцировать L-лизин в высокой концентрации
Для подтверждения эффекта применения модификации SigA, которая была подтверждена в Примере 4, был получен вектор, подходящий для введения модификации SigA в хромосому.
Праймер 4 (SEQ ID NO: 6), в который был вставлен сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце, и праймер 5 (SEQ ID NO: 7), в который был вставлен сайт рестрикции Sa/I на 3'-конце, синтезировали на основании описанных нуклеотидных последовательностей. Затем проводили ПЦР с использованием каждой из хромосом 15 выбранных типов в качестве матрицы с использованием пары праймеров, и таким образом амплифицировали 15 типов модифицированных фрагментов гена rpoD(mt). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 2 мин; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
15 типов фрагментов гена, амплифицированных путем ПЦР, обрабатывали EcoRI и Sa/I для получения соответствующих фрагментов ДНК и соединяли фрагменты с вектором pDZ (патент Кореи No. 10-0924065) для введения в хромосому, который включает в себя сайты рестрикции EcoRI и Sa/I, трансформировали им Е.coli DH5a и высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором с вставленным методом ПЦР геном-мишенью, отбирали и плазмиды получали путем традиционного способа выделения плазмид. Плазмиды получили названия pDZ-SigA(D136G, T281S), pDZ-SigA(L381R), pDZ-SigA(M230T), pDZ-SigA(M455V), pDZ-SigA(S488T), pDZ-SigA(R279L), pDZ-SigA(I254N), pDZ-SigA(A268S), pDZ-SigA(L451I, Q491R), pDZ-SigA(Q429R), pDZ-SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L), pDZ-SigA(L447H), pDZ-SigA(K483R), pDZ-SigA(K479R) и pDZ-SigA(D238V, N263S, E358D), соответственно, в соответствии с модификацией вставки в SigA каждой плазмиды. Дополнительно в качестве другого контроля для вышеизложенных вариантов праймеры 6-9 (SEQ ID NO: 8-11) получали для конструирования векторов для вставки SigA, модифицированного A414V, о котором сообщалось, что он обладает действием по повышению способности продуцировать L-лизин (Международная публикация WO 2003-054179), в хромосому. Затем проводили ПЦР с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 наряду с парой праймера 6 и праймера 9 и парой праймеров из праймера 7 и праймера 8, соответственно. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 1 мин; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
В результате были получены фрагменты гена размером примерно 500 п.н. и продукты амплификации были связаны с вектором pDZ с помощью набора для клонирования Infusion (Invitrogen). Полученный таким образом вектор получил название pDZ-SigA(A414V).
Пример 7: Получение штамма KCCM11016P с введенным модифицированным полипептидом SigA для штаммов, способных продуцировать L-лизин в высокой концентрации, и сравнение их способностей продуцировать L-лизин
15 типами векторов с введенными новыми мутациями, полученными в Примере 6, и одним типом вектора с введенной мутацией, о которой сообщалось ранее, трансфицировали Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, который представляет собой штамм, продуцирующий L-лизин, путем двухэтапной рекомбинации гомологичных хромосом. Затем штаммы с введенными модификациями SigA отбирали путем анализа нуклеотидных последовательностей. Штаммы с введенными модификациями SigA получили названия KCCM11016P::SigA(D136G, T281S), KCCM11016P::SigA(L381R), KCCM11016P::SigA(M230T), KCCM11016P::SigA(M455V), KCCM11016P::SigA(S488T), KCCM11016P::SigA(R279L), KCCM11016P::SigA(I254N), KCCM11016P::SigA(A268S), KCCM11016P::SigA(L451I, Q491R), KCCM11016P::SigA(Q429R), KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L), KCCM11016P::SigA(L447H), KCCM11016P::SigA(K483R), KCCM11016P::SigA(K479R), KCCM11016P::SigA(D238V, N263S, E358D) и KCCM11016P::SigA(A414V), соответственно.
Штаммы культивировали таким же способом, как в Примере 4, и анализировали их концентрации L-лизина. Результаты показаны в Таблице 7 ниже.
В результате два новых штамма с введенными модификациями (KCCM11016P::SigA(M230T) и KCCM11016P::SigA(R279L)) показали способность продуцировать L-лизин, эквивалентную таковой у родительского штамма, в то время как два других новых штамма с введенными мутациями (KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L) и KCCM11016P::SigA(D238V, N263S, E358D)) продемонстрировали значительно более низкую скорость роста и значительно сниженный уровень продукции L-лизина. Однако остальные 11 новых мутантных штаммов продемонстрировали максимальное увеличение продукции L-лизина на 19% по сравнению с таковым родительского штамма, и также продемонстрировали повышение продукции L-лизина на 16% по сравнению с таковой KCCM11016P::SigA(A414V), который представляет собой мутантный штамм с введенной мутацией SigA(A414V), о котором сообщалось ранее. Авторы настоящего изобретения обозначили штамм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин как таковой "KCCM11016P::SigA(L447H)" "Corynebacterium glutamicum СА01-2277" и депонировали его в Корейском центре культур микроорганизмов, признанном как международный орган депонирования в соответствии с Будапештским соглашением, 22 ноября 2013 года с номером доступа KCCM11479P.
Эти результаты позволяют предположить, что 11 новых модифицированных полипептидов SigA обладают превосходной способностью продуцировать L-лизин.
Пример 8: Получение штамма KFCC10750 с введенным модифицированным полипептидом SigA для штаммов, способных продуцировать L-лизин в высоких концентрациях, и сравнение их способностей продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффекта введения 11 типов вариантов SigA, выбранных в Примере 7, в другие штаммы рода Corynebacterium glutamicum, штаммы с введенной, соответственно, каждой из 11 типов мутаций SigA Corynebacterium glutamicum KFCC10750 (KCCM11347P, патент Кореи No. 10-0073610), обладающие способностью продуцировать L-лизин, были получены таким же способом как в Примере 7. Эти штаммы получили названия KFCC10750::SigA(D136G, T281S), KFCC10750::SigA(L381R), KFCC10750::SigA(M455V), KFCC10750::SigA(S488T), KFCC10750::SigA(I254N), KFCC10750::SigA(A268S), KFCC10750::SigA(L451I, Q491R), KFCC10750::SigA(Q429R), KFCC10750::SigA(L447H), KFCC10750::SigA(K483R) и KFCC10750::SigA(K479R), соответственно. Дополнительно, штамм с введенной мутацией SigA(A414V), о котором сообщалось ранее, был получен и получил название "KFCC10750::SigA(A414V)".
Штаммы культивировали таким же образом как в Примере 4 и анализировали их концентрации L-лизина. Результаты показаны в Таблице 8 ниже.
В результате 11 типов штаммов с введенными новыми мутациями демонстрировали максимальное увеличение продукции L-лизина на 17% по сравнению с таковой родительского штамма и также демонстрировали увеличение продукции L-лизина примерно на 14% по сравнению с таковой KFCC10750::SigA(A414V), который представляет собой штамм с введенной мутацией SigAA414V, о котором сообщалось ранее.
Пример 9: Получение штамма KCCM10770P с введенным модифицированным полипептидом SigA для штаммов, способных продуцировать L-лизин в высокой концентрации, и сравнение их способностей продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффекта введения 11 типов вариантов SigA, выбранных в Примере 7, в другие штаммы рода Corynebacterium glutamicum, штаммы с введенными, соответственно, модификациями SigA Corynebacterium glutamicum KFCC10770 (KCCM11347P, патент Кореи No. 10-0924065), обладающие способностью продуцировать L-лизин, были получены таким же способом как в Примере 7. Эти штаммы получили названия KCCM10770P::SigA(D136G, T281S), KCCM10770P::SigA(L381R), KCCM10770P::SigA(M455V), KCCM10770P::SigA(S488T), KCCM10770P::SigA(I254N), KCCM10770P::SigA(A268S), KCCM10770P::SigA(L451I, Q491R), KCCM10770P::SigA(Q429R), KCCM10770P::SigA(L447H) и KCCM10770P::SigA(K483R), KCCM10770P::SigA(K479R), соответственно. Дополнительно штамм с введенной мутацией SigA(A414V), о котором сообщалось ранее, был получен и получил название "KFCC10770::SigA(A414V)".
Эти штаммы культивировали таким же образом, как в Примере 4, и анализировали их концентрации L-лизина. Результаты показаны в Таблице 9 ниже.
В результате 11 типов штаммов с введенными новыми мутациями демонстрировали максимальное увеличение продукции L-лизина на 20% по сравнению с таковой родительского штамма, и также демонстрировали увеличение продукции L-лизина примерно на 16% по сравнению с таковой KFCC10770::SigA(A414V), который представляет собой штамм с введенной мутацией SigAA414V, о котором сообщалось ранее.
Пример 10: Получение штамма CJ3P с введенным модифицированным полипептидом SigA для штаммов, способных продуцировать L-лизин в высокой концентрации, и сравнение их способностей продуцировать L-лизин
Для подтверждения эффекта на других штаммах рода Corynebacterium glutamicum, штаммы, в которые были введены модификации SigA, были соответственно введены в Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), обладающие способностью продуцировать L-лизин, были получены таким же образом как в Примере 7. Эти штаммы получили названия CJ3P::SigA(D136G, T281S), CJ3P::SigA(L381R), CJ3P::SigA(M455V), CJ3P::SigA(S488T), CJ3P::SigA(I254N), CJ3P::SigA(A268S), CJ3P::SigA(L451I, Q491R), CJ3P::SigA(Q429R), CJ3P::SigA(L447H), CJ3P::SigA(K483R) и CJ3P::SigA(K479R), соответственно. Дополнительно, штамм с введенной мутацией SigA(A414V), о котором сообщалось ранее, был получен и получил название "CJ3P::SigA(A414V)". CJ3P представляет собой штамм Corynebacterium glutamicum, который обладает способностью продуцировать L-лизин благодаря введению 3 типов мутаций в микроорганизм дикого типа на основе известной технологии.
Штаммы культивировали таким же образом как в Примере 4 и анализировали их концентрации L-лизина. Результаты показаны в Таблице 10 ниже.
В результате 11 типов штаммов с введенными новыми мутациями демонстрировали максимальное увеличение продукции L-лизина на 20% по сравнению в таковой родительского штамма, и также демонстрировали увеличение продукции L-лизина примерно на 15% по сравнению с таковой CJ3P::SigA(A414V), который представляет собой штамм с введенной мутацией SigAA414V, о котором сообщалось ранее.
Суммируя вышеизложенные результаты, было показано, что 11 новых модифицированных полипептидов, обладающих активностью SigA, полученных в настоящем изобретении (то есть, SigA(D136G, T281S), SigA(L381R), SigA(M455V), SigA(S488T), SigA(I254N), SigA(A268S), SigA(L451I, Q491R), SigA(Q429R), SigA(L447H), SigA(K483R) и SigA(K479R)), обладают превосходным действием по улучшению продукции L-лизина, соответственно, у различных микроорганизмов рода Corynebacterium, и эти результаты позволяют предположить, что модифицированные полипептиды обладают превосходным действием по улучшению продукции L-лизина по сравнению с модифицированным SigA(A414V), о котором сообщалось ранее.
На основании вышеизложенного специалист в области техники, к которой принадлежит данное изобретение, понимает, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технической идеи или существенных признаков настоящего изобретения. В этом отношении примеры воплощений, раскрытые здесь, служат исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения. Наоборот, настоящее изобретение предназначено охватывать не только воплощения, представленные в примерах, но также различные альтернативные, модифицированные, эквивалентные и другие воплощения, которые могут быть включены в пределах сущности и объема настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (9)
1. Модифицированный полипептид, обладающий активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, где по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в следующих положениях полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, заменена, и аминокислотная замена представляет собой по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: замена 136-ой аминокислоты на глицин, замена 254-ой аминокислоты на аспарагин, замена 268-ой аминокислоты на серин, замена 281-ой аминокислоты на серин, замена 381-ой аминокислоты на аргинин, замена 429-ой аминокислоты на аргинин, замена 447-ой аминокислоты на гистидин, замена 451-ой аминокислоты на изолейцин, замена 455-ой аминокислоты на валин, замена 479-ой аминокислоты на аргинин, замена 483-ей аминокислоты на аргинин, замена 488-ой аминокислоты на треонин и замена 491-ой аминокислоты на аргинин.
2. Модифицированный полипептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, изложенных в SEQ ID NO: 12-22.
3. Полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид по п.1.
4. Микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-лизин, содержащий модифицированный полипептид, обладающий активностью сигма-фактора А РНК-полимеразы, где по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в следующих положениях полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, заменена, и аминокислотная замена представляет собой по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен: замена 136-ой аминокислоты на глицин, замена 254-ой аминокислоты на аспарагин, замена 268-ой аминокислоты на серин, замена 281-ой аминокислоты на серин, замена 381-ой аминокислоты на аргинин, замена 429-ой аминокислоты на аргинин, замена 447-ой аминокислоты на гистидин, замена 451-ой аминокислоты на изолейцин, замена 455-ой аминокислоты на валин, замена 479-ой аминокислоты на аргинин, замена 483-ей аминокислоты на аргинин, замена 488-ой аминокислоты на треонин и замена 491-ой аминокислоты на аргинин.
5. Микроорганизм по п.4, принадлежащий роду Corynebacterium.
6. Микроорганизм по п.4, представляющий собой Corynebacterium glutamicum.
7. Способ получения L-лизина, включающий:
(а) культивирование микроорганизма по любому из пп.4-6 в среде и
(б) выделение L-лизина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140119137A KR101755767B1 (ko) | 2014-09-05 | 2014-09-05 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
| KR10-2014-0119137 | 2014-09-05 | ||
| PCT/KR2015/009353 WO2016036191A1 (ko) | 2014-09-05 | 2015-09-04 | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2668176C1 true RU2668176C1 (ru) | 2018-09-26 |
Family
ID=55440139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017107246A RU2668176C1 (ru) | 2014-09-05 | 2015-09-04 | Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10676512B2 (ru) |
| EP (1) | EP3196300B1 (ru) |
| JP (1) | JP6464260B2 (ru) |
| KR (1) | KR101755767B1 (ru) |
| CN (2) | CN111676205B (ru) |
| BR (1) | BR112017004368A2 (ru) |
| DK (1) | DK3196300T3 (ru) |
| ES (1) | ES2917498T3 (ru) |
| MY (1) | MY180044A (ru) |
| PL (1) | PL3196300T3 (ru) |
| RU (1) | RU2668176C1 (ru) |
| WO (1) | WO2016036191A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102291553B1 (ko) * | 2021-01-29 | 2021-08-18 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 프리모솜 조립 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003054179A1 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Degussa Ag | Alleles of the siga gene from coryneform bacteria |
| RU2316588C1 (ru) * | 2004-01-30 | 2008-02-10 | Адзиномото Ко., Инк. | Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты) |
| US20090170154A1 (en) * | 2004-03-05 | 2009-07-02 | Kao Corporation | Mutant bacterium belonging to the genus bacillus |
| US20110300588A1 (en) * | 2010-05-07 | 2011-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutations and genetic targets for enhanced l-tyrosine production |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE408621T1 (de) * | 1995-05-30 | 2008-10-15 | Astrazeneca Ab | Dna moleküle |
| BR122021015693B1 (pt) * | 2011-12-21 | 2022-05-03 | Cj Cheiljedang Corporation | Microrganismo produtor de lisina e método para a produção de l-lisina |
| DK2803722T3 (en) * | 2012-01-10 | 2018-01-08 | Cj Cheiljedang Corp | Corynebacterium microorganisms capable of utilizing xylose, and method for producing L-lysine using the same |
-
2014
- 2014-09-05 KR KR1020140119137A patent/KR101755767B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-04 US US15/508,662 patent/US10676512B2/en active Active
- 2015-09-04 PL PL15837358.9T patent/PL3196300T3/pl unknown
- 2015-09-04 CN CN202010624521.XA patent/CN111676205B/zh active Active
- 2015-09-04 RU RU2017107246A patent/RU2668176C1/ru active
- 2015-09-04 CN CN201580047334.7A patent/CN106715688A/zh active Pending
- 2015-09-04 DK DK15837358.9T patent/DK3196300T3/da active
- 2015-09-04 JP JP2017512724A patent/JP6464260B2/ja active Active
- 2015-09-04 MY MYPI2017700608A patent/MY180044A/en unknown
- 2015-09-04 BR BR112017004368-8A patent/BR112017004368A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-09-04 WO PCT/KR2015/009353 patent/WO2016036191A1/ko active Application Filing
- 2015-09-04 EP EP15837358.9A patent/EP3196300B1/en active Active
- 2015-09-04 ES ES15837358T patent/ES2917498T3/es active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003054179A1 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Degussa Ag | Alleles of the siga gene from coryneform bacteria |
| RU2316588C1 (ru) * | 2004-01-30 | 2008-02-10 | Адзиномото Ко., Инк. | Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты) |
| US20090170154A1 (en) * | 2004-03-05 | 2009-07-02 | Kao Corporation | Mutant bacterium belonging to the genus bacillus |
| US20110300588A1 (en) * | 2010-05-07 | 2011-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutations and genetic targets for enhanced l-tyrosine production |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| OGUIZA J. A. et al., Multiple sigma factor genes in brevibacterium lactofermentum: characterization of sigA and sigB, Journal of Bacteriology Vol. 178, No. 2, pp. 550-553, 1996. * |
| UniProtKB - Q8NPA3 (Q8NPA3_CORGL), 01.10.2002; Найдено в Интернет по адресу: www.uniprot.org/uniprot/Q8NPA3. * |
| UniProtKB - Q8NPA3 (Q8NPA3_CORGL), 01.10.2002; Найдено в Интернет по адресу: www.uniprot.org/uniprot/Q8NPA3. OGUIZA J. A. et al., Multiple sigma factor genes in brevibacterium lactofermentum: characterization of sigA and sigB, Journal of Bacteriology Vol. 178, No. 2, pp. 550-553, 1996. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3196300B1 (en) | 2022-05-11 |
| JP6464260B2 (ja) | 2019-02-06 |
| MY180044A (en) | 2020-11-20 |
| PL3196300T3 (pl) | 2022-08-01 |
| DK3196300T3 (da) | 2022-07-25 |
| CN106715688A (zh) | 2017-05-24 |
| EP3196300A1 (en) | 2017-07-26 |
| US10676512B2 (en) | 2020-06-09 |
| JP2017525381A (ja) | 2017-09-07 |
| EP3196300A4 (en) | 2018-01-31 |
| WO2016036191A1 (ko) | 2016-03-10 |
| KR20160029964A (ko) | 2016-03-16 |
| CN111676205B (zh) | 2023-11-07 |
| BR112017004368A2 (pt) | 2018-02-27 |
| ES2917498T3 (es) | 2022-07-08 |
| US20180037615A1 (en) | 2018-02-08 |
| CN111676205A (zh) | 2020-09-18 |
| KR101755767B1 (ko) | 2017-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2588665C2 (ru) | Способ получения l-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать l-лизин | |
| JP6359037B2 (ja) | Ｌ−バリン産生能が向上した菌株及びこれを用いたｌ−バリンの産生方法 | |
| CN106029879B (zh) | 具有提高的l-苏氨酸生产能力的微生物以及使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
| EP3272860B1 (en) | Pyruvate dehydrogenase mutant, microorganism comprising mutant, and method for producing l-amino acid by using microorganism | |
| RU2614253C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий о-ацетилгомосерин, и способ получения о-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2676137C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования О-ацетилгомосерина и способ получения О-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2681475C1 (ru) | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| JP2018529354A (ja) | Ｌ−トレオニンを生産する組み換え微生物及びそれを用いてｌ−トレオニンを生産する方法 | |
| RU2668176C1 (ru) | Микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| US11312982B2 (en) | Microorganism with improved L-threonine producing capability, and method for producing L-threonine by using the same | |
| KR101768391B1 (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 | |
| KR101768390B1 (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 | |
| KR101760219B1 (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 | |
| KR102673796B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
| JP2018504914A (ja) | キノリン酸生産能を有する微生物及びそれを用いてキノリン酸を生産する方法 | |
| JP2024515389A (ja) | Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法 |