DK200900060U3 - Nukleotidsekvenser fra coryneforme bakterier som koder for proteiner der deltager i L-serinstofskiftet - Google Patents

Description

1DK 2009 00060 U3

Beskrivelse

Nukleotidsekvenser fra coryneforme bakterier som koder for proteiner der deltager i L-serinstofskiflet

Opfindelsen angår nukleotidsekvenser fra coryneforme bakterier som koder for proteiner der deltager i L-serinstofskiflet, hvilke proteiner har reduceret eller inaktiveret L-serin-dehydratase, samt mikroorganismer.

Aminosyren L-serin anvendes i fødevare-, foderstof- og farmaindustrien samt inden for humanmedicin. L-serin tjener også som en komponent til syntese af yderligere industrielt anvendelige produkter, fx L-tryptophan ud fra indol og L-serin.

Det er kendt at L-serin kan fremstilles ved fermentering af coryneforme bakteriestammer. Således er eksempelvis en Corynebacterium glycinophilum-stamme i stand til at danne L-serin ud fra glycin og kulhydrater (Kubota K, Kageyama K, Shiro T og Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K og Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365). Enzymet L-serin-hydroxymethyl-transferase deltager her i omsætningen af glycin til L-serin (Kubota K og Yokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67(6):387-390). Disse Corynebacterium glycinophylum-stammer udviser en defekt serindehydratase som blev frembragt ved ikke-målrettet mutagenese (Kubota K (1985) Improved production of L-serin by mutants of Corynebacterium glycinophylum with less serine dehydratase activity.

Agricultura! Biological Chemistry, 49:7-12). Denne enzymaktivitet er pyridoxa! 5'-phosphat-afhængig og ikke karakteriseret molekylært (Kubota K., Yokozeki K, Ozaki H. (1989) Effects of L-serine dehydratse activity on L-serine production by Corynebacterium glycinophylum and an examination of the properties of the enzyme. Agric. Biol. Chem 49:7-12) Fra US-patent 4.528.273 2 2DK 2009 00060 U3 kendes ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af L-serin af glycin, hvor mikroorganismen er serin-dehydratase-negativ.

Endvidere fremstilles L-serin fermentativt ud fra methanol og glycin ved hjælp af methylotrofe bakterier, fx Hyphomicrobium-stammer (Izumi Y, Yoshida T, 5 Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A og Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432). I begge tilfælde skal aminosyren glycin anvendes som udgangsmateriale for dannelsen af aminosyren L-serin,

Derudover er coryneforme bakterier kendt som direkte kan frembringe L-serin ud 10 fra kulhydrater uden supplerende tilføjelse af yderligere udgangsmaterialer. Med hensyn til en rentabel produktion af L-serin i industriel målestok er dette mere fordelagtigt da L-serin kan fremstilles direkte ud fra kulhydrater uden en bekostelig tilsætning af udgangsmaterialer. Disse stammer som tilhører Corynebacterium glutamicum-slægten, er kendetegnet ved at de fx er resistente 15 over for L-serinanalogerne serin-hydroxamat og β-chloralanin og blev opnået ved ikke-målrettet mutagenese (Yoshida H og Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagaku-kaishi 48: 201-208).

Endvidere er Brevibacterium /Lm/m-stammer kendt som ved ikke-målrettet 20 mutagenese udviser defekter i L-serinopbygningen, besidder en øget 3- phosphoglycerat-dehydrogenase-aktivitet der kodes af serA, og overudtrykker de fra Escherichia coli stammende serB- og serC-gener (EP0931833A2).

Opfindelsen har som opgave at tilvejebringe foranstaltninger som fører til en 25 forbedret produktion af L-serin eller stofskifteprodukter der kan afledes deraf, fx tryptophan. Opfindelsen har således til opgave at tilvejebringe nukleinsyrer som koder for proteiner der deltager i L-serinstofskiftet, hvor disse proteiner sammenlignet med proteiner der forekommer i vildtypeorganismer, i ringere grad eller overhovedet ikke nedbryder L-serin til pyruvat. 1 denne sammenhæng er det 3 0 endvidere opfindelsens opgave at tilvejebringe en L-serin-dehydratase og mikroorganismer der i forhold til naturligt forekommende 3 3DK 2009 00060 U3 L-serin-dehydrataser eller mikroorganismer med en L-serin-dehydratase udviser en reduceret nedbrydning af L-serin.

Med udgangspunkt i den indledende del af krav 1 løses opgaven ifølge opfindelsen ved hjælp af de træk der er angivet i krav 1 ’s kendetegnende del. Med udgangspunkt i den indledende del af krav 5 løses opgaven ifølge opfindelsen ved hjælp af de i krav 5’s kendetegnende del angivne træk. Med udgangspunkt i den indledende del af krav 6 løses opgaven ifølge opfindelsen desuden ved hjælp af de i krav 6’s kendetegnende del angivne træk. Med udgangspunkt i den indledende del af krav 7 løses opgaven ifølge opfindelsen tillige ved hjælp af de i krav 7’s kendetegnende del angivne træk. Med udgangspunkt i den indledende del af krav 11 løses opgaven ifølge opfindelsen endvidere ved hjælp af de i krav 1 l’s kendetegnende del angivne træk. Med udgangspunkt i den indledende del af krav 15 løses opgaven ifølge opfindelsen tillige ved hjælp af de i krav 15’s kendetegnende del angivne træk,

Med nukleinsyreme og polypeptiderne ifølge opfindelsen er det nu muligt at tilvejebringe en L-serin-dehydratase som ikke længere forårsager en reduceret eller ingen L-serinnedbrydning. Det er endvidere muligt at tilvejebringe mikroorganismer, ved hjælp af hvilke der kan opnås en L-serinproduktion der i forhold til de hidtil kendte mikrobielle fremgangsmåder har et højere udbytte.

Fordelagtige videreudviklinger er angivet i underkravene.

Opfindelsen angår i mikroorganismer af Corynebacterium-slægten replikerbare, eventuelt rekombinante nukleinsyrer, hvis for L-serin-dehydratase, i det følgende også betegnet SDA, kodende nukleotidsekvenser er delvist eller fuldstændigt deleterede eller muterede eller, i forhold til naturligt forekommende nukleotidsekvenser, udtrykkes i ringere grad eller overhovedet ikke.

Opfindelsen angår endvidere tilvejebringelsen af nukleinsyrer, hvis sdaA-gensekvens er delvist eller fuldstændigt deleteret eller muteret eller i forhold til naturligt forekommende nukleotidsekvenser udtrykkes i ringere grad eller 4 4DK 2009 00060 U3 overhovedet ikke. Det viste sig fx at være fordelagtigt med en nukleinsyre med en nukleotidsekvens ifølge SEQ ID No 1, hvis nukleotider er delvist eller fuldstændigt deleterede eller muterede fra position 506 til 918, eller en allel, en homolog eller et derivat af denne nukleotidsekvens eller en nukleotidsekvens der hybridiserer med disse. Derudover kan eksempelvis deletionen eller mutationen af det til dannelse af jem-svovlclusteret nødvendige cysteinholdige sekvensmotiv være fordelagtig (Hofmeister et al., (1994) Iron-sulfur cluster-containing L-serine dehydratase from Peptostreptococcus asaccharolyticus: correlation of the cluster type with enzymatic acticvity. FEBS Letters 351: 416-418).

Vildtype-L-serin-dehydratase (sdaAj-gensekvensen er almindelig kendt og kan tilvejebringes fra de af fagmanden kendte databaser (NCBI-deponeringsnr. AP005279) eller den vedlagte sekvensprotokol ifølge SEQ ID No. 1.

Den fuldstændige deletion af L-serin-dehydratase(sdaA)-genet kan eksempelvis opnås ved hjælp af målrettede rekombinante DNA-teknikker. Egnede fremgangsmåder hertil er beskrevet af Schåfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) eller af Link et al, (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Det er også muligt kun at deletere dele af genet eller udskifte muterede fragmenter af L-serin-dehydratase-genet. Ved deletion eller udskiftning opnås således et tab eller en reduktion af L-serin-dehydratase-aktiviteten. Et eksempel på en sådan mutant er C. glutamicum-slammtn ATCC13032AsdaA som bærer en deletion i sdctA-genet.

For at forhindre ekspressionen af sdaA-genet eller opnå en ringere ekspression er det fx muligt at mutere promotor- og reguleringsregionen som befinder sig opstrøms for strukturgenet. Ekspressionsreguleringskassetter som indsættes opstrøms for strukturgenet, har en lignende funktion. Ved hjælp af regulerbare promotorer er det endvidere muligt at reducere ekspressionen under den fermentative L-serin-dannelse. Derudover er det imidlertid også muligt at regulere translationen, idet eksempelvis stabiliteten af m-RNA’et reduceres. Der kan endvidere anvendes gener som koder for det pågældende enzym med-ringere 5 5DK 2009 00060 U3 aktivitet. Alternativt kan der desuden opnås en reduceret ekspression af L-serin-dehydratase-genet ved at ændre mediesammensætningen og dyrkningsbetingelserne. Vejledninger finder fagmanden bi.a. hos Martin et al. (Bio/Technology 5,137-146 (1987)), hos Guerrero et al. (Gene 138,35-41 (1994)), Tsuchiya og Morinaga (Bio/Technology 6,428-430 (1988)), hos Eikmanns et al. (Gene 102,93-98 (1991)), i europæisk patentskrift EP 0 472 869, i US-patent 4601893, hos Schwarzer og Piihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), hos Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)), hos LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175,1001-1007 (1993)) og i WO 96/15246.

Nukleinsyreme ifølge opfindelsen er kendetegnet ved at de isoleres fra coryneforme bakterier, fortrinsvis af Corynebacterium- eller Brevibacterium-slægten og særligt foretrukket fra Corynebacterium glutamicum. Eksempler på coryneforme vildtypebakterier der er deponeret i stamkulturer, er fx Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;

Corynebacterium callunae ATCC 15991;

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020;

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869;

Corynebacterium lilium ATCC 15990;

Brevibacterium flavum ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Eksempler på mutanter eller produktionsstammer der er egnet til fremstilling af L-serin, er organismer fra gruppen bestående af Arthrobacter, Pseudomonas, 6 DK 2009 00060 U3

Nocardia, Methylobacterium, Hyphomycrobium, Alcaligenes eller Klebsiella.

Den foreliggende opfindelse karakteriseres nærmere ved angivelse af de ovenfor nævnte bakteriestammer, hvilken angivelse imidlertid ikke er begrænsende.

Ved en nukleinsyre eller et nukleinsyrefragment forstås ifølge opfindelsen en polymer af RNA eller DNA, som kan være enkelt- eller dobbeltstrenget og eventuelt indeholde naturlige, kemisk syntetiserede, modificerede eller kunstige nukleotider. Betegnelsen DNA-polymer omfatter her også genomisk DNA, cDNA eller blandinger deraf.

Ved alleiler forstås ifølge opfindelsen funktionelle ækvivalenter, dvs. nukleotidsekvenser som i det væsentlige har samme funktion. Funktionel ækvivalente er sådanne sekvenser der på trods af afvigende nukleotidsekvens, fx som følge af degenereringen af den genetiske kode, fortsat besidder de ønskede funktioner. Funktionelle ækvivalenter omfatter således naturligt forekommende varianter af de heri beskrevne sekvenser samt kunstige nukleotidsekvenser der opnås ved kemisk syntese og eventuelt er tilpasset værtsorganismens codonanvendelse.

Navnlig forstås ved en funktionel ækvivalent også naturlige eller kunstige mutationer af en oprindeligt isoleret sekvens, hvilke mutationer fortsat har den ønskede funktion. Mutationer indbefatter substitutioner, additioner, deletioner, udskiftninger eller insertioner af én eller flere nukleotider. Indbefattet heri er også såkaldte "betydningsmutationer” der på proteinniveau fx kan føre til udskiftning af konserverede aminosyrer, men som imidlertid ikke fører til nogen principiel ændring af proteinets aktivitet og dermed er funktionsneutrale. Dette indebærer også ændringer af den nukleotidsekvens der på proteiniveau vedrører den N-terminale del af et protein uden dog i væsentlig grad at indskrænke proteinets funktion.

Nukleotidsekvenser der opnås ved modifikation af nukleotidsekvensen, hvilket resulterer i tilsvarende derivater, er også omfattet af den foreliggende opfindelse.

Formålet med en sådan modifikation kan fx være yderligere begrænsning af den 7 7DK 2009 00060 U3 deri indeholdte kodende sekvens eller fx også være indføring af yderligere restriktionsenzymspaltningssteder.

Endvidere angår den foreliggende opfindelse kunstige DNA-sekvenser så længe de, som beskrevet ovenfor, tilvejebringer de ønskede egenskaber. Sådanne kunstige DNA-sekvenser kan fx fremskaffes ved tilbageoversættelse af proteiner som konstrueres ved hjælp af computerbaserede programmer (molecular modelling), eller ved in-vitro-selektion. Kodende DNA-sekvenser der blev opnået ved tilbageoversættelse af en polypeptidsekvens i overensstemmelse med den for værtsorganismen specifikke codonanvendelse, er særligt egnede. En fagmand der er bekendt med molekylærgenetiske metoder, kan med lethed bestemme den specifikke codonavendelse ved computeranalyse af andre allerede kendte gener i den organisme der skal transformeres.

Ved homologe sekvenser forstås ifølge opfindelsen sådanne der er komplementære til nukleotidsekvenseme ifølge opfindelsen, og/eller hybridiserer dermed. Udtrykket hybridiserende sekvenser omfatter ifølge opfindelsen i det væsentlige tilsvarende nukleotidsekvenser fra DNA- eller RNA-gruppen, hvilke nukleotidsekvenser under i og for sig kendte stringente betingelser indgår en specifik interaktion (binding) med de ovennævnte nukleotidsekvenser. Hertil hører også korte nukleotidsekvenser med en længde på eksempelvis 10-30, fortrinsvis 12-15 nukleotider. Ifølge opfindelsen er bl.a, også såkaldte primere eller probér omfattet heraf.

Ifølge opfindelsen er de sekvensområder som går forud for (5-eller opstrøms) og/eller følger efter (3'- eller nedstrøms) de kodende områder, omfattet deraf. Heri er navnlig sekvensområder med regulatorisk funktion indbefattet. De kan påvirke transskriptionen, RNA-stabiliteten eller RNA-processeringen samt translationen. Eksempler på regulatoriske sekvenser er bl.a. promotorer, enhancere, operatorer, terminatorer eller translationsforstærkere,

Opfindelsen angår endvidere en genstruktur som indeholder mindst én af de ovenfor beskrevne nukleotidsekvenser, samt regulatoriske sekvenser der er 8 DK 2009 00060 U3 operativt forbundet dermed, hvilke regulatoriske sekvenser regulerer ekspressionen af de kodende sekvenser i værtscellen.

Den foreliggende opfindelse angår tillige en vektor som indeholder en nukleotidsekvens af den ovenfor beskrevne type, regulatoriske nukleotidsekvenser der er operativt forbundet dermed, samt yderligere nukleotidsekvenser til selektion af tranformerede værtsceller, til replikation i værtscellen eller til integrering i det tilsvarende værtscellegenom. Derudover kan vektoren ifølge opfindelsen indeholde en genstruktur af den ovennævnte type.

Egnede vektorer er sådanne der replikerer i coryneforme bakterier, fx pZl (Menkel E, Thierbach G, Eggeling L, Sahm H.} 1989, Appl Environ Microbiol 55(3): 684-688), pEKEx2 (Eikmanns et al. Gene 102: 93-98 (1991) eller pXMJ19 (Jacoby M, Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebacterium glutamicum vectors. Biotechnol. Technique 13: 437-441).

Andre plasmidvektorer kan anvendes på tilsvarende måde. Denne opremsning indskrænker imidlertid ikke den foreliggende opfindelse.

Ved at udnytte nukleinsyresekvenseme ifølge opfindelsen kan tilsvarende probér eller primere syntetiseres og anvendes til, fx ved hjælp af PCR-teknikken, at amplificere og isolere analoge gener fra andre mikroorganismer, fortrinsvis coryneforme bakterier.

Den foreliggende opfindelse angår således også en probe til identificering og/eller isolering af gener som koder for proteiner der deltager i biosyntesen af L-serin, idet denne probe fremstilles ud fra nukleinsyresekvenseme ifølge opfindelsen af den ovenfor beskrevne type og indeholder en til detektion egnet markør. Med hensyn til proben kan der være tale om et deludsnit af sekvensen ifølge opfindelsen, fx et deludsnit fra et konserveret område, der fx har en længde på 10-30 eller fortrinsvis 12-15 nukleotider, og som under stringente betingelser specifikt kan hybridisere med homologe nukleotidsekvenser. I litteraturen findes talrige eksempler på egnede markører. Eksempelvis kan fagmanden bl.a. finde vejledninger hertil i håndbogen fra Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) samt hos Newton og Graham: PCR

9 9DK 2009 00060 U3 (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Tyskland, 1994) eller fx i håndbogen "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) samt hos Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en L-serin-dehydratase der i forhold til vildtype-L-serin-dehydratasen har reduceret L-serinnedbrydning, og som kodes af en nukleinsyresekvens ifølge opfindelsen eller variationer deraf af den ovenfor beskrevne type. Den foreliggende opfindelse angår tillige en L-serin-dehydratase eller et L-serin-dehydratasemutein med en aminosyresekvens ifølge SEQ ID No 2, hvis aminosyrer fra position 135 til 274 er ændret som følge af eksempelvis en målrettet mutagenese på DNA-niveau eller en modificeret form af disse polypeptidsekvenser eller isoformer deraf eller blandinger deraf. Ved „ændret“ menes ifølge den foreliggende opfindelse komplet eller delvis fjernelse eller udskiftning af aminosyreme fra position 135 til 274.

Ved isoformer menes enzymer med samme eller lignende substrat- og virkningsspecificitet, men med forskellig primærstruktur.

Ved modificerede former menes ifølge opfindelsen enzymer med sekvensændringer, fx i polypeptidets N-terminale del eller C-terminale del eller i området med konserverede aminosyrer, uden at enzymets funktion imidlertid begrænses. Disse ændringer kan udføres gennem aminosyreudskiftninger i overensstemmelse med i og for sig kendte fremgangsmåder.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen er kendetegnet ved at de er afledt af coryneforme bakterier, fortrinsvis af Corynebacterium- eller Brevibacteriumslægten, særligt foretrukket af Corynebacterium glutamicum- eller Brevibacteriumslægten, særligt foretrukket af Corynebacterium glutamicumslægten. Eksempler på vildtyper af coryneforme bakterier der er deponeret i stamkulturer, er fx Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; 10 10DK 2009 00060 U3

Corynebacterium callunae ATCC 15991;

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020;

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869;

Corynebacterium lilium ATCC 15990;

Brevibacterium flavum ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Eksempler på mutanter eller produktionsstammer der er egnet til fremstilling af L-serin, er organismer fra gruppen bestående afArthrobacter, Pseudomonas, Nocardia, Methylobacterium, Hyphomycrobium, Alcaligenes eller Klebsiella.

Den foreliggende opfindelse karakteriseres nærmere gennem angivelse af de ovennævnte bakteriestammer, hvilken angivelse imidlertid ikke virker begrænsende,

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en genetisk modificeret mikroorganisme som er kendetegnet ved at nukleotidsekvensen som koder for L-serin-dehydratase, er delvist eller fuldstændigt deleteret eller muteret eller som i forhold til naturligt forekommende nukleotidsekvenser udtrykkes i ringere grad eller overhovedet ikke udtrykkes.

Opfindelsen angår desuden en mikroorganisme der er kendetegnet ved at sda A-genet er delvist eller fuldstændigt deleret eller muteret eller som i forhold til de naturligt forekommende sda A-gener udtrykkes i ringere grad eller overhovedet ikke udtrykkes.

11 DK 2009 00060 U3

Den foreliggende opfindelse angår tillige en genetisk modificeret mikroorganisme der i replikerbar form indeholder en genstruktur eller en vektor af den ovenfor beskrevne type.

Derudover angår den foreliggende opfindelse også en genetisk modificeret mikroorganisme som indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen af den ovennævnte type, hvilket polypeptid har en reduceret eller ingen L-serinnedbrydning i forhold til den tilsvarende ikke-genetisk modificerede mikroorganisme.

En genetisk modificeret mikroorganisme ifølge opfindelsen er endvidere kendetegnet ved at den er en coryneform bakterie, fortrinsvis af Corynebacterium- eller Brevibacteriumslægten, særligt foretrukket af Corynebacterium glutamicum- eller Brevibacterium flavum-arten.

Principielt kan gener amplificeres og efterfølgende isoleres ved i og for sig kendte fremgangsmåder, fx polymerase-kædereaktionen (PCR), ved hjælp afkorte syntetiske nukleotidsekvenser (primere). Fremstillingen af de anvendte primere foregår generelt ved hjælp af kendte gensekvenser på basis af bestående homologier i konserverede genområder og/eller under hensyntagen til GC-indholdet af DNA i den mikroorganisme der skal undersøges.

En yderligere fremgangsmåde til isolering af kodende nukleotidsekvenser er komplementeringen af såkaldte defektmutanter i den organisme der skal undersøges, hvilke defektmutanter i det mindste fænotypisk har et funktionstab i aktiviteten af det gen eller tilsvarende protein der skal undersøges. Ved en komplementering menes ophævelse af mutanternes gendefekt og vidtgående gendannelse af den oprindelige fænotype før mutagenesen, hvilken fænotype opnås ved indføring af funktionelle gener eller genfragmenter fra den mikroorganisme der skal undersøges.

En klassisk mutagenesefremgangsmåde til fremstilling af defektmutanter eller mutanter med reduceret eller inaktiveret L-serin-dehydratase er fx behandlingen af bakterieceller med kemiske midler, fx N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin eller 12 12DK 2009 00060 U3 UV-bestråling. Sådanne fremgangsmåder til mutationsudløsning er alment kendte og kan bl.a. læses i Milier (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) eller i håndbogen "Manual of Methods for General Bacteriology" fra American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Med den foreliggende opfindelse kan L-serin fremstilles mikrobielt, hvorved nukleinsyren der koder for L-serin-dehydratasen, deleteres eller muteres delvist eller fuldstændigt eller i forhold til naturligt forekommende nukleotidsekvenser udtrykkes i ringere grad eller overhovedet ikke i en mikroorganisme, idet denne genetisk modificerede mikroorganisme anvendes til mikrobiel fremstilling af L-serin, og det tilsvarende dannede L-serin isoleres fra dyrkningsmediet.

De ifølge opfindelsen fremstillede genetisk modificerede mikroorganismer kan dyrkes kontinuerligt eller diskontinuerligt ved batch-fremgangsmåden (statisk dyrkning) eller i fed-batch- (tilførselsfremgangsmåde) eller repeated fed-batch-fremgangsmåden (gentagen tilførselsfremgangsmåde) med henblik på fremstilling af L-serin. En sammenfatning af kendte dyrkningsfremgangsmåder er beskrevet i lærebogen ifølge Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) eller i lærebogen ifølge Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Det dyrkningsmedium der skal anvendes, skal på passende måde opfylde kravene for de pågældende stammer. Der findes beskrivelser af dyrkningsmedier til forskellige mikroorganismer i håndbogen "Manual of Methods for General Bacteriology" fra American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Som carbonkilde kan anvendes sukker og kulhydrater, som fx glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, melasse, stivelse og cellulose, olier og fedtstoffer, som fx soyaolie, solsikkeolieJordnøddeolie og kokosfedt, fedtsyrer, som fx palmitinsyre, stearinsyre og linolsyre, alkoholer, som fx glycerin og ethanol, samt organiske syrer, som fx eddikesyre. Disse stoffer kan anvendes 13 13DK 2009 00060 U3 enkeltvis eller som blanding. Som nitrogenkilde kan anvendes organiske nitrogenholdige forbindelser, såsom peptoner, gærekstrakt, kødekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevæske, soyabønnemel og urinstof, eller uorganiske forbindelser, såsom ammoniumsulfat, ammoniumchlorid, ammoniumphosphat, ammoniumcarbonat og ammoniumnitrat, Nitrogenkildeme kan anvendes enkeltvis eller som blanding. Som phosphorkilde kan anvendes phosphorsyre, kaliumdihydrogenphosphat eller dikaliumhydrogenphosphat eller de tilsvarende natriumholdige salte. Dyrkningsmediet skal endvidere indeholde salte af metaller, som fx magnesiumsulfat eller jemsulfat, som er nødvendige for væksten. Endelig kan anvendes essentielle vækststoffer, såsom aminosyrer og vitaminer, i tilgift til de ovenfor nævnte stoffer. Til dyrkningsmediet kan der endvidere tilsættes passende udgangsmaterialer. De nævnte stoffer kan tilsættes til kulturen i form af en engangstilsætning eller på passende måde tilsættes under dyrkningen.

Til pH-regulering af kulturen anvendes basiske forbindelser, såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, ammoniak eller ammoniakvand, eller sure forbindelser, såsom phosphorsyre eller svovlsyre, på passende måde. Til regulering af skumudviklingen kan der anvendes antiskummiddel, som fx fedtsyrepolyglycolester. Til opretholdelse af plasmiders stabilitet kan mediet tilsættes passende selektivt virkende stoffer, fx antibiotika. Til opretholdelse af aerobe betingelser indføres oxygen eller oxygenholdige gasblandinger, fx luft, i kulturen. Kulturens temperatur ligger normalt på 20°C til 45°C og fortrinsvis på 25°C til 40°C. Dyrkningen fortsættes indtil der er dannet et maksimum af L-serin. Dette mål nås normalt inden for 10 til 160 timer.

Analysen af L-serin-dannelsen kan foregå ved anionbytningskromatografi med efterfølgende ninhydrinderivatisering, fx som beskrevet af Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), eller analysen kan foregå ved omvendtfase-HPLC, fx som beskrevet af Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979)51: 1167-1174).

De mikroorganismer der er genstand for den foreliggende opfindelse, kan producere L-serin ud fra glucose, saccharose, lactose, mannose, fructose, maltose, melasse, stivelse, cellulose eller ud fra glycerin og ethanol. Der kan være tale om 14 14DK 2009 00060 U3 de repræsentanter for coryneforme bakterier der allerede er blevet nærmere beskrevet ovenfor. Et udvalg af resultater af fermenteringen er angivet i tabel 1. Her udmærker de genetisk modificerede mikroorganismer ifølge opfindelsen sig ved en væsentligt forbedret L-serinproduktion i forhold til de tilsvarende ikke-transformerede mikroorganismer (vildtyper) eller de mikroorganismer som blot indeholder vektoren uden gen-insert. I en særlig udførelsesvariant af den foreliggende opfindelse vises det at C. glutamicum ATCC 13032ApanBCAsdaA fører til mindst en 4*dobbelt forøgelse af L-serinakkumuleringen i mediet sammenlignet med kontrolstammeme (tabel 1). Ved den fælles overekspression af yderligere gener som indvirker positivt på L-serinbiosyntesevejen, kunne opnås en 16-dobbelt forøgelse af L-serinproduktionen.

Ved aminosyreproduktionsstammer menes ifølge den foreliggende opfindelse Corynebacterium glutamicum-stammer eller homologe mikroorganismer der ved klassiske og/eller molekylærgenetiske fremgangsmåder er modificeret på en sådan måde at stofskiftestrømmen deri i forstærket omfang forløber i retning af biosyntesen af aminosyrer eller derivaterne deraf (metabolic engineering). For disse aminosyreproduktionsstammers vedkommende er eksempelvis ét eller flere gener og/eller de tilsvarende enzymer som befinder sig i afgørende og tilsvarende kompleks regulerede nøglepositioner i stofskiftevejen (flaskehals), modificeret eller sågar dereguleret i deres regulering. Den foreliggende opfindelse omfatter her samtlige allerede kendte aminosyreprodukionsstammer, fortrinsvis af Corynebacteriumslægten eller homologe organismer. Ifølge opfindelsen er endvidere også de produktionsstammer omfattet som fagmanden i analogi med erfaringer fra andre mikroorganismer, fx Enterobacterier, Bacillacede eller gærarter, kan fremstille i overensstemmelse med sædvanlige fremgangsmåder.

Figurerne viser som eksempel anvendte plasmider samt eksperimentelle resultater efter anvendelse af nukleinsyrerne eller mikroorganismerne ifølge opfindelsen.

Her viser:

Fig. 1: Integrationsplasmid pK19mobsacB-DeltaWm4 15 DK 2009 00060 U3

De markeringer der er angivet på plasmidets ydre kant, angiver de pågældende restriktionsspaltningssteder. De segmenter der er angivet inde i cirklen, betegner følgende gener: kan Kanamycinresistens sacB Sucrase

OriT T ransfer-replikationsstartområde sdA' 5' -enden af sdaA-genet sda“ 3'-enden af sdaA-genet

Fig. 2: Vækstforhold (kvadratiske symboler) og L-serin-nedbrydning (cirkelformede symboler) for C. glutamicum 13032ApanBCAsdaA, klon 1 (□, O) og C, glutamicum 13032ApanBCAsdaA, klon 2 (1, ·) sammenlignet med C. glutamicum 13032ApanBC, klon 1 (□, O) og C. glutamicum 13032ApanBC, klon 2 (, ·). Abscissen X angiver fermenteringstiden i timer [h], Ordinaten Y| angiver mikroorganismernes vækst målt som optisk tæthed (OD) ved 600 nm. Ordinaten Y2 angiver L-serinkoncentrationen i mM.

Fig, 3: Ekspressionsplasmid pEC-T18mob2-serAfbrCB.

De markeringer der er angivet på plasmidets ydre kant, angiver de pågældende restriktionsspaltningssteder. De segmenter der er angivet inde i cirklen, betegner følgende gener:

SerC Phosphoserin-transaminase

SerB Phosphoserin-phosphatase

Rep Replikationsstartområde

Per Partition-cel ledelingsgen

Tet Tetracyclinresistensgen RP4-mob Mobiliseringsoprindelse

OriV DNA-replikationsstartområde

SerA-fbr 3-phosphogIycerat-dehydrogenase

Udførelseseksempler: 16 16DK 2009 00060 U3

1. Konstruktion af en sdaA-deletionsmutant af C. glutamicum ATCC13032 ApanBC

Corynebacterium glutamicum har en nukleotidsekvens (genbank-deponeringsnummer BAB99038; SEQ-ID-No. 1) hvis afledte polypeptidsekvens er 40% identisk med den beskrevne L-serin-dehydratase fra E. coli (NCBI-deponeringsnummer P16095). Ved gen-rettet mutagenese i overensstemmelse med en fremgangsmåde ifølge Link et al. (Link AJ, Phillips D, Church GM. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J Bacteriol. 1997 Oct; 179(20):6228-37) og Schåfer et al. (Gene 145: 69-73 (1994)) blev sdaA~gemt i C. glutamicum deleteret. Til dette formål blev følgende primere afledt af den corynebakterielle sdaA-sekvens (NCBI-deponeringsnummer AP005279): sdaA-1: 5!-TCGTGCAACTTCAGACTC-3‘ (AP005279 nukleotid 73635 - 73653); sdaA-2: 5 ‘-CCCATCCACTAAACTTAAACACGTCATAATGAACCCACC-3 ‘ (AP005279 komplementærtil nukleotid 74121-74139); sdaA-3: 5‘-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCGACTAATGGTGCTGCG- 3‘ (AP005279 komplementær til nukleotid 74553 74571); sdaA-4: 5‘-CGGGAAGCCCAAGGTGGT-3t (AP005279 nukleotid 75044-75062)

Primer sdaA-1 og sdaA-2 flankerer hver især begyndelsen og slutningen af sdaA-genet. Primerne sdaA-2 og sdaA-3 har hver især komplementære linkerregioner (fed skrift) som gør det muligt i en totrins-PCR-protokol (Cross-over-PCR) at generere en deletion i sdaA-genet in vitro. I en første PCR-reaktion 17 17DK 2009 00060 U3 med kromosomalt DNA fra C. glutamicum blev såvel primerkombinationen sdaA-1 og sdaA-2 som sdaA-3 og sdaA-4 anvendt. PCR-reaktionen blev udført i 30 cykler i nærværelse af 200μΜ deoxynukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), henholdsvis 600nM af de tilsvarende oligonukleotider sdaA-1 og sdaA-4 samt 60nM af oligonukleotideme sdaA-2 og sdaA-3, 100 ng kromosomalt DNA fra Corynebacterium glutamicum ATCC13032,1/10 volumen 10-dobbelt reaktionsbuffer og 2,6 enheder af en varmestabil Taq-/Pwo-DNA-polymerase-blanding (Expand High Fidelity PCR System fra Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i en thermocykler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) under følgende betingelser: 94°C i 30 sekunder, 50°C i 30 sekunder og 72°C i 40 sekunder. Forlængelsestrinnet ved 72°C blev efter 10 cykler forlænget med 5 sekunder pr. cyklus. Efter PCR-reaktionen blev de opnåede DNA-fragmenter som hver især havde en længde på 500 bp, ifølge producentens anvisninger isoleret fra en 0,8% agarosegel ved hjælp af QIAExlI-gelekstraktionskittet (Qiagen), og begge fragmenter blev anvendt som template i den anden PCR. Som primer anvendtes efterfølgende primeren sdaA-1 og sdaA-4. Denne gang foregik reaktionen i 35 cykler i nærværelse af 200μΜ deoxynukleotidtriphosphater, hver 600nM af det tilsvarende oligonukleotid, henholdsvis 20 ng af det isolerede template-DNA fra den første PCR, 1/10 volumen 10-dobbelt reaktionsbuffer og 2,6 enheder af Taq-/Pwo-DNA-polymerase-blandingen under følgende betingelser: 94°C i 30 sekunder, 50°C i 30 sekunder og 72°C i 80 sekunder. Efter 10 cykler blev forlængelsestrinnet igen forlænget med hver især 5 sekunder. Efter PCR-reaktionen blev det opnåede DNA-fragment med en længde på 1000 bp som nu omfatter det inaktiverede sdaA-gen med en 420 bp lang central deletion, isoleret fra en 0,8% agarose-gel og gjort stumpendet ved hjælp af Sure Clone-kittet (Amersham Pharmacia Biotech) klonet i Shrøl-spaltningsstedet i inaktiveringsvektoren pKl9mobsacB (Schåfer et al. Gene 145: 69-73 (1994) som kun kan replikere i E. coli, men ikke i C. glutamicum. Det opnåede plasmid pK19mobsacB_DsdaA (fig. 1) blev kontrolleret for korrekthed ved restriktionskortlægning. Kloningen foregik i Escherichia co/i-stammen DFI5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649).

18 18DK 2009 00060 U3

Derefter blev plasmidet indført i C. glutamicum 13032DpanBC (Radmacher E, Vaitsikova A, Burger U, Krumbach K, Sahm H, Eggeling L. Linking central metabolism with increased pathway flux: L-valine accumulation by Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol. 2002 68(5):2246-50) ved elektroporering og selekteret for integrering af vektoren. Som følge af deletionen af pantothenat-biosyntesegeneme panB- og panC er denne stamme gen-pantothenat-auxotrof og udmærker sig ved at den under pantothenat-begrænsning som følge af en forstærket akkumulering af pyruvat udskiller ca. 50mM alanin og 8mM valin. Derudover danner stammen ca. 100μΜ L-serin og er dermed egnet som udgangsstamme for konstruktion af en l-serinproducent. Der blev opnået kanamycin-resistente kloner af C. glutamicum l3032ApanBC i hvilke inaktiveringsvektoren var integreret i genomet. For at selektere for excidering af vektoren blev kanamycin-resistente kloner udpladet på saccharose-holdigt LB-medium (Sambrook et al.; Moleeular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) med 15 g/1 agar, 2% glucose/10% saccharose), og der blev opnået kolonier der havde mistet vektoren igen ved en anden rekombinationsbegivenhed (Jager et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). To af disse kloner, hvis nukleotider i sdaA-genet var deleteret fra position 506 til 918 og i det følgende betegnes ved 13032ApanBCAsdaA, klon 1 og 13032ApanBCAsdaA, klon 2, blev anvendt til de efterfølgende undersøgelser.

2. sdaA-deletionens indvirkning på L-serin-nedbrydningen 1 det følgende blev det undersøgt om det deleterede sdaA-gen reelt deltager i nedbrydningen af L-serin. Til dette formål blev der udført et væksteksperiment med henholdsvis to kloner af stammen C. glutamicum 13032ApanBCAsdaA sammenlignet med stammen C. glutamicum 13032ApanBC på minimalmedium (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603) som yderligere indeholdt 2% glucose, ΙμΜ pantothenat og lOOmM L-serin. Væksten og forbruget af L-serin blev fulgt. Resultatet er vist i fig. 2.

19 19DK 2009 00060 U3

Resultatet i fig. 2 viser at deletionen af sdaA-genet reducerer nedbrydningen af L-serin med ca. 40%.

3. Indvirkningen af deletionen af sdaA-genet på dannelsen af L-serin

Med henblik på at teste, hvilken indvirkning deletionen af L-serin-dehydratase-genet har på dannelsen af L-serin, blev stammerne 13032ApanBCAsdaA (klon 1, klon 2) og 13032ApanBC (klon 1, klon 2) transformeret med plasmidet pEC-T18mob2-serA^serCserB. Plasmidet (fig. 3) består af vektoren pEC-T18mob2 (Tauch, A., Kirchner, O., Loffler, B., Gotker, S., Puhler, A. and Kalinowski,J. Efficient Electrotransformation of Corynebacterium diphtheriae with a Mini-Replicon Derived from the Corynebacterium glutamicum Plasmid pGAl. Curr. Microbiol. 45 (5), 362-367 (2002)), de corynebakterielle gener serA^1 (Peters-Wendisch P, Netzer R, Eggeling L, Sahm H. 3-Phosphoglycerate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum: the C-terminal domain is not essential for activity but is required for inhibition by L-serine. Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Dec;60(4);437-41) samt serC ogserB (tysk patentansøgning 100 44 831.3, 11.09.2000). Efter fuldendt elektroporering blev stammerne 13032ApanBCAsdaApA'i?Av4fbrCB og 13032panBCp5er^tbrCB opnået. Til undersøgelse af udskillelsen af L-serin blev de to stammer 13032ApanBCAsdaAp5e/vlfbrCB og 13032ApanBCpserrifbrCB dyrket i komplekst medium (Cglll med 2% glukose og 5 pg/l tetracyclin), og fermenteringsmediet CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) blev i hvert enkelt tilfælde podet med forkultureme. Mediet indeholdt yderligere 50 pg/l kanamycin og lpM pantothenat. Som kontrol blev de to udgangsstammer 13032panBC og 13032ApanBCAsdaA dyrket på samme måde, men medierne indeholdt imidlertid ikke tetracyclin b. For hver udgangsstamme blev der udført mindst to uafhængige fermenteringer. Efter dyrkning i 30 sekunder ved 30°C på rotationsrysteren ved 120 rpm blev den i mediet akkumulerede L-serinmængde bestemt. Aminosyrekoncentrationen blev bestemt ved høj tryks væskekromatografi (J Chromat (1983) 266:471-482). Resultatet af fermenteringen er angivet i tabel 1, og det fandtes at udelukkelsen af L-serin-dehydratasen fører til en 4 dobbelt stigning i L-serin-akkumuleringen i mediet uafhængigt deraf, om L-serin- 20 DK 2009 00060 U3 fhi* bionsyntesegeneme serA , serC og serB overudtrykkes. Overekspressionen af L-serin-biosyntesen serA^, serC og serB fører imidlertid generelt til en 16-dobbelt stigning i L-serin-akkumuleringen i kultursupematanten. Anvendelsen af de konstruerede og beskrevne deletionsmutanter DsdaA udgør således en 5 fremgangsmåde til betydelig forbedring af L-serindannelsen.

Tabel 1: Akkumulering af L-serin i kultursupematanten fra Corynebacterium glutamicum 13032ApanBC og 13032panBCAsdaA efter ekspression af 10 generne serAlhl serC og serB.

Stamme ODgoo L-serin [mM] 13032ApanBC 40 0,1 13032ApanBCAsdaA 42 0,4 13032ApanBCpserAlbrCB 30 1,6 13032ApanBCAsdaApserAtbrCB 30 6,6 4. Bestemmelse af L-serin-dehydratase-aktiviteten

Til bestemmelse af L-serin-dehydratase-aktiviteten blev vildtypestammen WT pXMJ19 (Jacoby M., Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebacterium glutamicum vectors. Biotechnol. Technique 13: 437-441) i overekspressionsstammen WT pXMJ19_:«aM og deletionsstammen ΔsdaA pXMJ19 udsået i CgXII-minimalmedium som beskrevet hos Keilhauer et al, (1993). Mediet indeholdt 30 mg/1 protokatechusyre, lOOmM glukose og lOOmM L-serin. Cellerne blev dyrket i nærværelse af ImM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid og høstet i den eksponentielle vækstfase ved en optisk tæthed på 6-8, målt på Spektralphotomer Pharmacia Biotech ultrospec 3000. Derefter blev de fracentrifugeret i 10 min. ved 4500 omdrejninger i minuttet og ved 4°C, resuspenderet i 50mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethan-sulfonsyrebuffer (pH 8,0) og centrifugeret på ny. Derpå blev cellerne optaget i 50mM N-2-hydroxyethylpiperazin-M'-2-ethansulfonsyrebuffer (pH 8,0), ImM

21 21DK 2009 00060 U3

FeS04 og lOmM dithiothreitol. Cellesprængningen blev udført ved ultralydsbehandling (Branson sonifier 250; duty cycle 25%, output control 2,5,10 minutter) på is. Til bestemmelse af L-serin-dehydratase-aktiviteten indeholdt reaktionsblandingen tilsat 50mM N-2-hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonsyrebuffer (pH 8,0), lOmM dithiothreitol og 10-100 μΐ råekstrakt. Påvisningen af det fra serinet dannede pyruvat blev udført som beskrevet (Ohmori et al, 1991). Reaktionen blev påbegyndt under tilsætning af 50mM L-serin og standset efter 10 minutter ved tilsætning af l,2-diamino-4,5-dimethoxy-benzolreagens i forholdet 1:1. Reagenset bestod, som beskrevet hos Ohmori et al, 1991, af 4 mg l,2-diamino-4,5-dimethoxybenzol opløst i 42,4 ml H20, 3,5 ml Δ-mercaptoethanol og 4,1 ml HC1 (37%). Derefter blev der udført en inkubation i 2 timer ved 102°C tør varme. Påvisningen og kvantificeringen af det ud fra pyruvatet dannede 2-hydroxy-6,7-dimethoxy-3-methylquinoxalin-derivat blev udført ved højtryksvæskekromatografi, ligeledes som beskrevet (Ohmori et al, 1991). Proteinbestemmelsen i råekstrakt blev udført ved hjælp af et proteinassay (Fa. Bio-Rad), som var baseret på Bradford-fremgangsmåden (Bradford, 1976). De beregnede specifikke L-serin-dehydratase-aktiviteter i de tre stammer er angivet i tabel 2.

Tabel 2: Specifik aktivitet af L-serin-dehydratase i stammerne 13032 WT pXMJ19_sdaA (overudtrykker), 13032 WT pXMJ19 (vildtype med tom vektor) og 13032 AsdaA pXMJ 19 (deletionsmutant med tom vektor) under inducerende betingelser.

C. glutamicum-stamme spec. aktivitet [nmol/min*mg| 13032 WT pXMJ19_sdaA 0,221 13032 WTpXMJ 19 0,003 13032 åsdaA pXMJ19 0 DK 2009 00060 U3

SEQUENCE LISTING

<110> Forschungszentritm Diilich GmbH

<120> Nukleotidsekvenser fra coryneforme bakterier som koder for proteiner der deltager i L seri nstofskiftet <130> U45386DK01 <160> 2 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 1449

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 tcgtgcaact tcagactctt acggaggcga tggaccaaaa acaactacaa tcaagcagat 60 caccttgtac accaccatag aaaaggccca ccctcagcca tggctatcag tgttgttgat 120 ctatttagca tcggtatcgg accatcatcc tcacataccg tcggccccat gagagccgcc 180 ctcacgtata tctctgaatt tcccagctcg catgtcgata tcacgttgca cggatccctt 240 gccgccaccg gtaaaggoca ctgcactgac cgggcggtat tactgggtct ggtgggatgg 300 gaaccaacga tagttcccat tgatgctgca ccctcacccg gcgcgccgat tcctgcgaaa 360 ggttctgtga acgggccaaa gggaacggtg tcgtattccc tgacgtttga tcctcatcct 420 cttccagaac accccaatgc cgttaccttt aaaggatcaa ccacaaggac ttatttgtcg 480 gtgggtggtg ggttcattat gacgttggag gatttccgga agctggacga tatcggatca 540 ggtgtgtcaa ccattcatcc agaggcagag gtgccttgtc cttttcagaa gagttcccaa 600 ttactcgcat atggtcgcga ttttgcggag gtcatgaagg ataatgagcg cttaatccac 660 ggggatcttg gcacagtgga tgcccatttg gatcgagtgt ggcagattat gcaggagtgc 720 gtggcacaag gcatcgcaac gccggggatt ttaccgggtg ggttgaatgt gcaacgtcgg 780 gcgccgcagg tacacgcgct gattagcaac ggggatacgt gtgagctggg tgctgatctt 840 gatgctgtgg agtgggtgaa tctgtacgcc ttggcggtga atgaagaaaa cgccgctggt 900 ggtcgtgtgg ttactgctcc gactaatggt gctgcgggga ttattccggc ggtgatgcac 960 tatgcgcggg attttttgac aggttttggg gcggagcagg cgcggacgtt tttgtatacc 1020 gcgggtgcgg tgggcatcat cattaaggaa aatgcctcga tctctggcgc ggaggtgggg 1080 tgtcagggtg aggttggttc agcgtccgcg atggcggctg ccgggttgtg tgcagtctta 1140 ggtggttctc cgcaacaggt ggaaaacgcc gcggagattg cgttggagca caatttggga 1200 ttgacgtgcg atccggtggg cgggttagtg cagattccgt gtattgaacg caacgctatt 1260 gctgccatga agtccatcaa tgcggcaagg cttgcccgga ttggtgatgg caacaatcgc 1320 gtgagtttgg atgatgtggt ggtcacgatg gctgccaccg gccgggacat gctgaccaaa 1380 tataaggaaa cgtcccttgg tggtttggca accaccttgg gcttcccggt gtcgatgacg 1440 gagtgttag 1449

Page 1 DK 2009 00060 U3 <210> , 2 <211> 449 <212> l PRT <213> i Corynebacterium glutamicum <400> ; 2 Met Ala Ile Ser val val Asp Leu Phe ser Ile Gly Ile Gly pro ser 1 5 10 15 ser ser His Thr val Gly Pro Met Arg Ala Ala Leu Thr Tyr Ile ser 20 25 30 Glu Phe Pro Ser Ser His val Asp Ile Thr Leu His Gly Ser Leu Ala 35 40 45 Ala Thr 50 Gly Lys Gly His Cys 55 Thr ASp Arg Ala Val 60 Leu Leu Gly Leu val Gly Trp Glu Pro Thr ile val Pro ile Asp Ala Ala Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Ala Pro Ile Pro Ala Lys Gly Ser val Asn Gly Pro Lys Gly Thr 85 90 95 val Ser Tyr Ser Leu Thr phe Asp pro His Pro Leu Pro Glu His Pro 100 105 110 Asn Ala Val Thr Phe Lys Gly ser Thr Thr Arg Thr Tyr Leu Ser val 115 120 125 Gly Gly Gly Phe ile Met Thr Leu Glu Asp Phe Ara Lys Leu Asp Asp 130 135 140 ile Gly ser Gly val ser Thr Ile Hi s pro Glu Ala Glu Val Pro Cys 145 150 155 160 pro Phe Gin Lys Ser ser Gin Leu Leu Ala Tyr Gly Arg Asp Phe Ala 165 170 175 Glu val Met Lys ASP Asn Glu Arg Leu Ile His Gly Asp Leu Gly Thr 180 185 190 val ASp Ala 195 His Leu Asp Arg Val 200 Trp Gin ile Met Gin 205 Glu Cys val Ala Gin Gly Ile Ala Thr Pro Gly ile Leu pro Gly Gly Leu Asn val 210 215 220 Gin Arg Arg Ala Pro Gin val Hi S Ala Leu ile Ser Asn Gly Asp Thr 225 230 235 240 page 2 DK 2009 00060 U3 cys Glu Leu Gly Ala Asp Leu Asp Ala val Glu Trp Val Asn Leu Tyr 245 250 255 Ala Leu Ala val Asn Glu Glu Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val val Thr 260 265 270 Ala Pro Thr Asn Gly Ala Ala Gly ile ile Pro Ala Val Met His Tyr 275 280 285 Ala Arg ASp Phe Leu Thr Gly Phe Gly Ala Glu Gin Ala Arg Thr Phe 290 295 300 Leu Tyr Thr Ala Gly Ala val Gly Ile Ile Ile Lys Glu Asn Ala Ser 305 310 315 320 Ile ser Gly Ala Glu val Gly Cys Gin Gly Glu Val Gly Ser Ala Ser 325 330 335 Ala Met Ala Ala Ala Gly Leu Cys Ala Val Leu Gly Gly Ser Pro Gin 340 345 350 Gin val Glu Asn Ala Ala Glu Ile Ala Leu Glu His Asn Leu Gly Leu 355 360 365 Thr cys ASp pro Val Gly Gly Leu Val Gin Ile Pro Cys ile Glu Arg 370 375 380 Asn Ala Ile Ala Ala Met Lys Ser ile Asn Ala Ala Arg Leu Ala Arg 385 390 395 400 ile Gly Asp Gly Asn Asn Arg val Ser Leu Asp Asp Val Val Val Thr 405 410 415 Met Ala Ala Thr Gly Arg Asp Met Leu Thr Lys Tyr Lys Glu Thr Ser 420 425 430 Leu Gly Gly Leu Ala Thr Thr Leu Gi y Phe Pro Val Ser Met Thr Glu 435 440 445 cys

Page 3

Claims (15)

22 22DK 2009 00060 U3

1. Nukleinsyre der er replikerbar i mikroorganismer af corynebacterium-slægten, og som er kendetegnet ved en nukleotidsekvens ifølge sekvens nr. 1, hvis nukleotider er fuldstændigt deleterede fra position 506 til 918.

2. Nukleinsyrer ifølge krav 1, kendetegnet ved at de er isoleret fra coryneforme bakterier.

3. Nukleinsyrer ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at de er isoleret fra Corynebacterium eller Brevibacterium.

4. Nukleinsyrer ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, 10 kendetegnet ved at de er isoleret fra Corynebacterium glutamicurn eller Brevibacterium flavum.

5. Genstruktur som indeholder mindst én nukleotidsekvens ifølge krav 1 til 4 samt regulatoriske sekvenser der er operabelt forbundet dermed.

6. Vektor som indeholder mindst én nukleotidsekvens ifølge krav 1 til 4 eller 15 en genstruktur ifølge krav 5 samt yderligere nukleotidsekvenser til selektion, til replikation i værtscellen eller til integration i værtscellegenomet.

7. L-serin-dehydratase med en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO 2, hvis aminosyrer er fuldstændigt deleterede fra position 135 til 274.

8. L-serin-dehydratase ifølge krav 7, 2. kendetegnet ved at den er afledt af coryneforme bakterier.

9. L-serin-dehydratase ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved at den er afledt af Corynebacterium eller Brevibacterium. 23 DK 2009 00060 U3

10. L-serin-dehydratase ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 9, kendetegnet ved at den er afledt af Corynebacterium glutamicum eller Brevibacterium flavum.

11. Mikroorganisme der i replikerbar form indeholder en nukleinsyre ifølge et 5 hvilket som helst af kravene 1 til 4, en genstruktur ifølge krav 5, en vektor ifølge krav 6 eller et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10.

12. Mikroorganisme ifølge krav 11, kendetegnet ved at den er en coryneform bakterie.

13. Mikroorganisme ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved at den tilhører Corynebacterium- eller Brevibacteriumslægten.

14. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst af kravene 11 til 13, kendetegnet ved at den tilhører Corynebacterium glutamicum eller Brevibacterium flavum.

15. Probe til identificering og/etler isolering af gener som koder for proteiner der deltager i biosyntesen af L-serin, hvilken probe er kendetegnet ved at den er fremstillet ud fra nukleinsyrer ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4 og har en markør der er egnet til detektion.