WO2004081166A2 - Nukleotidsequenzen coryneformer bakterien codierend für am l-serinstoffwechsel beteiligte proteine sowie verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin - Google Patents

Nukleotidsequenzen coryneformer bakterien codierend für am l-serinstoffwechsel beteiligte proteine sowie verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-serin Download PDF

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corynebacterium
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Lothar Eggeling
Hermann Sahm
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Definitions

  • the invention relates to nucleotide sequences of coryneform bacteria coding for proteins involved in L-serine metabolism with reduced or switched-off L-serine dehydratase as well as microorganisms and methods for producing L-serine.
  • the amino acid L-serine is used in the food, feed and pharmaceutical industries, as well as in human medicine. In addition, it serves as a building block for the synthesis of other industrially usable products, such as. B. L-tryptophan from indole and L-serine.
  • L-serine can be produced by fermentation of strains of coryneform bacteria.
  • So z. B. a strain of Corynebacterium glycinophilum able to form L-serine from glycine and carbohydrates (Kubota K, Kageyama K, Shiro T and Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K and Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365).
  • L-serine hydroxymethyl transferase The enzyme L-serine hydroxymethyl transferase is involved in the conversion of glycine to L-serine (Kubota K and Yokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67 (6): 387-390).
  • These Corynebacterium glycinophylum strains have a defective serine dehydratase, which is caused by Mutagenesis was produced (Kubota K (1985) Improved production of L-serine by mutants of Corynebacterium glycinophylum with less serine dehydratase activity. Agricultural Biological Chemistry, 49: 7-12).
  • Hyphomicrobium strains (Izumi Y, Yoshida T, Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A and Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432).
  • the amino acid glycine must be used as a precursor for the formation of the amino acid L-serine.
  • coryneform bacteria which can produce L-serine directly from carbohydrates without the addition of further precursors. This is more advantageous for an economical production of L-serine on an industrial scale, since L-serine can be produced directly from carbohydrates without the complex addition of precursors.
  • These strains which belong to the genus Corynebacterium glutamicum, are characterized by the fact that they are e.g. B. resistant to the
  • L-serine analogs are serine hydroxamate and ⁇ -chloroalanine and have been obtained by undirected mutagenesis (Yoshida H and Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagakukishi 48: 201-208).
  • Brevibacterium flavum strains which have defects in L-serine degradation due to undirected mutagenesis, have an increased activity of the 3-phosphoglycerate dehydrogenase encoded by serA, and overexpress the genes serB and serC originating from Escherichia coli (EP0931833A2).
  • the object is achieved according to the invention with the features specified in the characterizing part of claim 1. Furthermore, the object is achieved based on the preamble of claim 7 according to the invention, with the features specified in the characterizing part of claim 7.
  • the Task is also achieved based on the preamble of claim 8 according to the invention, with the features specified in the characterizing part of claim 8.
  • the object is also achieved according to the invention on the basis of the preamble of claim 9, with the features specified in the characterizing part of claim 9.
  • the object is further achieved according to the invention on the basis of the preamble of claim 14, with the features specified in the characterizing part of claim 14.
  • the object is also achieved according to the invention by the features specified in the characterizing part of claim 20.
  • the object is achieved based on the preamble of claim 21 according to the invention, by the features specified in the characterizing part of claim 21.
  • nucleic acids and polypeptides according to the invention it is now possible to provide an L-serine dehydratase which causes less or no L-serine degradation. It is also possible to provide microorganisms and processes with which L-serine production is possible with higher yields than previously known microbial processes.
  • the invention relates to microorganisms of the genus Corynebacterium which are replicable, optionally recombinant nucleic acids, the nucleotide sequence coding for the L-serine dehydratase, hereinafter also referred to as SDA, in part or completely deleterious. is mutated or mutated or is expressed less or not at all compared to naturally occurring nucleotide sequences.
  • the invention furthermore relates to the provision of nucleic acids whose sdaA gene sequence has been partially or completely deleted or mutated or is expressed less or not at all compared to naturally occurring nucleotide sequences.
  • nucleic acid with a nucleotide sequence according to SEQ ID No 1 whose nucleotides from position 506 to 918 have been partially or completely deleted or mutated, or an allele, homologue or derivative of this nucleotide sequence or nucleotide sequences hybridizing with it has proven to be advantageous.
  • the deletion or mutation of the sequence motif containing the cysteine required for the formation of the iron-sulfur cluster can also be advantageous (Hofmeister et al., (1994) Iron-sulfur cluster-containing L-serine dehydratase from Peptostreptococcus asaccharolyticus: correlation of the cluster type with enzymatic activity. FEBS Letters 351: 416-418).
  • the wild type L-serine dehydratase (sdaA) gene sequence is generally known and can be known to those skilled in the art
  • NCBI Accession No. AP005279 or the attached sequence listing according to SEQ ID No. 1 can be removed.
  • L-serine dehydratase (sdaA) gene can be achieved, for example, by directed recombinant DNA techniques. Suitable methods for this are described in Shufer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Only parts of the gene can also be deleted, or mutated fragments of the L-serine dehydratase gene can also be exchanged. Deletion or exchange results in a loss or reduction in L-serine dehydratase activity. An example of such a mutant is the C. glutamicum strain ATCC13032 ⁇ sdaA, which carries a deletion in the sdaA gene.
  • the promoter and regulatory region which is located upstream of the structural gene can be mutated.
  • Expression regulation cassettes which are installed upstream of the structural gene act in the same way.
  • adjustable promoters it is additionally possible to reduce expression in the course of fermentative serine formation.
  • translation regulation is also possible, for example, by reducing the stability of the m-RNA.
  • genes can be used which code for the corresponding enzyme with low activity.
  • a reduced expression of the L-serine dehydratase gene can also be achieved by changing the media composition and culture management. The person skilled in the art can find instructions, inter alia, from Martin et al.
  • the nucleic acids according to the invention are distinguished in that they are isolated from coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably from Corynebacterium glutamicum.
  • Examples of wild types of coryneform bacteria deposited in stock cultures are, for example, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corynebacterium callunae ATCC 15991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; Brevibacterium divaricatum ATCC 14020; Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869; Corynebacterium lilium ATCC 15990; Brevibacterium flavum ATCC 14067; Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC
  • mutants or production strains suitable for the production of L-serine are organisms from the group Arthrobacter, Pseudomonas, Nocardia, Methylobacterium, Hyphomycrobium, Alcaligenes or Klebsiel-la.
  • the present invention is accomplished by specifying the characterized bacterial strains mentioned above, which, however, does not have a limiting effect.
  • a nucleic acid or a nucleic acid fragment is to be understood as a polymer made from RNA or DNA, which can be single or double-stranded and optionally contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
  • DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
  • alleles are functional equivalents, i. H. to understand essentially equivalent nucleotide sequences.
  • Functionally equivalent sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis and possibly adapted to the codon use of the host organism nucleotide sequences.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated sequence which continue to show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. So-called meaning mutations are also included here, which can lead to the exchange of conserved amino acids at the protein level, but which lead to do not lead to a fundamental change in the activity of the protein and are therefore function-neutral. This also includes changes in the nucleotide sequence that affect the N-terminus of a protein at the protein level, but without significantly impairing the function of the protein.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modifying the nucleotide sequence, resulting in corresponding derivatives.
  • the aim of such a modification can e.g. B. the further limitation of the coding sequence contained therein or z. B. also the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • artificial DNA sequences are the subject of the present invention as long as they impart the desired properties, as described above.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins created using computer-aided programs (molecular modeling) or by in-vitro selection. Coding DNA sequences obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host organism are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in molecular genetic methods by computer analysis of other, already known genes of the organism to be transformed.
  • homologous sequences are to be understood as those which are complementary to the nucleotide sequences according to the invention and / or hybrid with these Sieren.
  • hybridizing sequences includes, according to the invention, substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA, which enter into a specific interaction (binding) with the aforementioned nucleotide sequences under stringent conditions known per se. This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example, 10 to 30, preferably 12 to 15 nucleotides. According to the invention, this also includes so-called primers or probes.
  • sequence regions preceding the coding regions are also included.
  • sequence regions with a regulatory function are included here. You can use the transcription, the RNA -Stability or affect RNA processing and translation Examples of regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • the invention furthermore relates to a gene structure comprising at least one of the nucleotide sequences described above and regulatory sequences operatively linked to them which control the expression of the coding sequences in the host cell.
  • the present invention relates to a vector comprising a nucleotide sequence of the type described above, regulative nucleotide sequences operatively linked thereto and additional nucleotide sequences for the selection of transformed host cells, for replication within the host cell or for integration into the corresponding host cell genome.
  • the vector according to the invention can contain a gene structure of the aforementioned type.
  • Suitable vectors are those that are replicated in coryneform bacteria such as. B. pZl (Menkel E, Thierbach G, Eggeling L, Sahm H., 1989, Appl Environ Microbiol 55 (3): 684-688), pEKEx2 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991), or pXMJ19 (Jacoby M., Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebacterium glutamicum vectors. Biotechnol. Technique 13: 437-441).
  • Other plasmid vectors can be used in the same way. However, this list is not for the present invention limiting.
  • probes or primers can be synthesized and used to amplify and isolate, for example, genes from other microorganisms, preferably coryneform bacteria, using the PCR technique.
  • the present invention thus also relates to a probe for identifying and / or isolating genes coding for proteins involved in the biosynthesis of L-serine, this probe being produced on the basis of the nucleic acid sequences of the type described above and a suitable one for detection Contains marker.
  • the probe can be a partial section of the sequence according to the invention, for example from a conserved area which, for. B. has a length of 10 to 30 or preferably 12 to 15 nucleotides and under stringent conditions specifically with homologous nucleotide sequences can hybridize sequences. Suitable markings are well known from the literature.
  • the present invention furthermore relates to an L-serine dehydratase with reduced L-serine breakdown compared to the wild type L-serine dehydratase, coded by a nucleic acid sequence according to the invention or its variations of the type described above.
  • the present invention also relates to an L-serine Dehydratase, or an L-serine dehydratase mutein, with an amino acid sequence according to SEQ ID No 2 whose amino acids have been changed from positions 135 to 274, for example as a result of directed mutagenesis at the DNA level, or a modified form of this polypeptide - sequences or isoforms thereof or mixtures thereof.
  • “changed” means the complete or partial removal or replacement of the amino acids from positions 135 to 274.
  • Isoforms are to be understood as enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
  • modified forms are to be understood as enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N-terminus or C-terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made in the form of amino acid exchanges according to methods known per se.
  • the polypeptides according to the invention are distinguished by the fact that they originate from coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium, particularly preferably from Corynebacterium glutamicum.
  • coryneform bacteria preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium, particularly preferably from Corynebacterium glutamicum.
  • Examples of wild types of coryneform bacteria deposited in stock cultures are, for example, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
  • the present invention is characterized in more detail by the specification of the bacterial strains mentioned above, which, however, has no limiting effect.
  • the present invention further relates to a genetically modified microorganism, characterized in that the nucleotide sequence coding for L-serine dehydratase is partially or completely deleted or mutated or is expressed less or not at all compared to the naturally occurring nucleotide sequences.
  • the invention further relates to a microorganism which is characterized in that the sdaA gene is partially or completely deleted or mutated or is expressed less or not at all compared to the naturally occurring sdaA genes.
  • the present invention also includes a genetically modified microorganism containing, in replicable form, a gene structure or a vector of the type described above.
  • the present invention also relates to a genetically modified microorganism containing a polypeptide according to the invention of the type described above, which has reduced or no L-serine breakdown compared to the correspondingly non-genetically modified microorganism.
  • a genetically modified microorganism according to the invention is further characterized in that it is a coryne-shaped bacterium, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum.
  • genes can be amplified by methods known per se, such as, for example, the polymerase chain reaction (PCR) using short, synthetic nucleotide sequences (primers) and then isolated.
  • the primers used are generally produced using known gene sequences based on existing homologies in conserved areas of the genes and / or taking into account the GC content of the DNA of the microorganism to be examined.
  • a further procedure for isolating coding nucleotide sequences is the complementation of so-called defect mutants of the organism to be examined, which have at least a phenotypic loss of function in the activity of the gene to be examined or the corresponding protein. Complementation is to be understood as the elimination of the genetic defect of the mutant and extensive restoration of the original appearance before the mutagenesis, which is achieved by introducing functional genes or gene fragments from the microorganism to be examined.
  • a classic mutagenesis method for producing defect mutants or mutants with a reduced or deactivated L-serine dehydratase is for example the treatment of the bacterial cells with chemicals such as. B.
  • the present invention also relates to a method for the microbial production of L-serine, wherein the nucleic acid coding for L-serine dehydratase is partially or completely deleted or mutated in a microorganism or not at all or compared to naturally occurring nucleic acids is expressed less, this genetically modified microorganism is used for the microbial production of L-serine and the correspondingly formed L-serine is isolated from the culture medium.
  • the genetically modified microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing L-serine.
  • batch cultivation batch cultivation
  • feed process fed batch
  • repetitive feed process repetitive feed process
  • the culture medium to be used must meet the requirements of the respective strains in a suitable manner. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). As a carbon source, sugar and carbohydrates such as B.
  • Glucose sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as. B. glycerol and ethanol and organic acids such as. B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used as the nitrogen source.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • the culture medium must also contain salts of metals such.
  • the culture medium can Suitable precursors are also added.
  • the feedstocks mentioned can be added to the culture in the form of a single batch or can be added in a suitable manner during the cultivation.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner to control the pH of the culture.
  • anti-foaming agents such as B. fatty acid polyglycol esters.
  • suitable selectively acting substances e.g. B. Antibiotics can be added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as. B. air introduced into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of L-serine has formed. This goal is usually achieved within 10 hours to 160 hours.
  • L-serine formation can be carried out by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin derivatization, as in Spackman et al.
  • the microorganisms which are the subject of the present invention can L-serine from glucose, sucrose, lactose, mannose, fructose, maltose, molasses, starch, Produce cellulose or from glycerin and ethanol. It can be the representatives of coryneform bacteria already described in more detail above. A selection of results from the fermentation is shown in Table 1.
  • the genetically modified microorganisms according to the invention are distinguished here by a significantly improved L-serine production compared to the correspondingly non-transformed microorganisms (wild types) or the microorganisms which only contain the vector without a gene insert. In a special embodiment variant of the present invention, it is shown that C.
  • glutamicum ATCC 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA leads to an at least 4-fold increase in L-serine accumulation in the medium in comparison to the control strains (Table 1).
  • Table 1 glutamicum ATCC 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA
  • amino acid production strains are to be understood as Corynebacterium glutamicum strains or homologous microorganisms which have been modified by classic and / or molecular genetic methods in such a way that their metabolic flow increases in the direction of the biosynthesis of amino acids or their derivatives (metabolic engineering).
  • these amino acid production strains one or more genes and / or the corresponding enzymes which are at crucial and correspondingly complexly regulated key positions in the metabolic pathway (bottleneck) are changed or even deregulated.
  • the present invention already includes all of them known amino acid production strains, preferably of the genus Corynebacterium or homologous organisms.
  • those production strains are also included which the person skilled in the art can produce by analogy with knowledge from other microorganisms, for example enterobacteria, bacillaceae or yeast species, by customary methods.
  • Fig. 1 Integration plasmid pK19mobsacB-Deltasda ⁇
  • the markings indicated on the outer edge of the plasmid identify the respective restriction sites.
  • the sections within the circle indicate the following genes: kanamycin resistance sacB sucrase
  • Fig. 2 Growth behavior (square symbols) and L-serine degradation (circular symbols) of C. glutamicum 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA, clone 1 (D, O) and C. glutamicum 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA, clone 2
  • the abscissa X indicates the fermentation time in hours [h].
  • the ordinate Yi indicates the growth of the microorganisms measured as optical density (OD) at 600 nm.
  • the ordinate Y 2 indicates the L-serine concentration in mM.
  • Fig. 3 Expression plasmid pEC-T18mob2-serA fbr CB.
  • the markings indicated on the outer edge of the plasmid identify the respective restriction interfaces.
  • Corynebacterium glutamicum has a nucleotide sequence (Genbank accession number BAB99038; SEQ-ID-No. 1) whose derived polypeptide sequence has 40% identity to the described L-serine dehydratase from E. coli (NCBI accession number P16095) , By directed mutagenesis according to a method by Link et al. (Link AJ, Phillips D, Church GM. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wildtype Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J Bacteriol. 1997
  • SdaA-2 5 -CCCATCCACTAAACTTAAACACGTCATAATGAACCCACC-3 (AP005279 complementary to nucleotide 74121-74139);
  • SdaA 3 5 ⁇ -TGTTTA ⁇ GTTT ⁇ GTGGATGGGCCGACTAATGGTGCTGCG 3-x (AP005279 complementary to nucleotides 74553-74571);
  • sdaA 4 5 -CGGGAAGCCCAAGGTGGT 3-x (AP005279 nucleotide 75044 -75062)
  • Primers sdaA-1 and sdaA-2 flank the beginning and end of the sdaA gene, respectively.
  • the primers sdaA-2 and sdaA-3 each have complementary linker regions (highlighted text) which make it possible to generate a deletion in the sdaA gene in vitro in a two-stage PCR approach (cross-over PCR).
  • cross-over PCR In a first PCR reaction with chromosomal DNA from C. glutamicum, the primer combinations sdaA-1 and sdaA-2 as well as sdaA-3 and sdaA-4 were used.
  • the PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 600 nM each of the corresponding oligonucleotides sdaA-1 and sdaA-4 and 60 nM of the oligonucleotides sdaA-2 and sdaA-3, 100 ng of chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 volume of 10-fold reaction buffer and 2.6 units of a heat-stable Taq / Pwo DNA polymerase mixture (Expand High Fidelity PCR System from Röche Diagnostics, Mannheim, Germany) in a thermal cycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) carried out under the following conditions: 94 ° C.
  • deoxynucleotide triphosphates dATP, dCTP, dGTP, dT
  • the DNA fragments obtained, each having a length of 500 bp, were isolated from a 0.8% agarose gel using the QIAExII gel extraction kit (Qiagen) according to the manufacturer, and both
  • Fragments were used as templates in the second PCR.
  • the primers sdaA-1 and sdaA-4 were now used as primers. This time the reaction took place in 35 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates, 600 nM each of the corresponding oligonucleotide, 20 ng each of the isolated template DNA from the first PCR, 1/10 volume of 10-fold reaction buffer and 2.6 Units of the Taq / Pwo DNA polymerase mixture under the following conditions: 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 80 seconds. Again, the elongation step was extended by 5 seconds after 10 cycles.
  • the 1000 bp DNA fragment obtained which now contains the inactivated sdaA gene with a 420 bp central deletion, was isolated from a 0.8% agarose gel and blunt-ended using the Sure clone kits (Amersham Pharmacia Biotech) into the S al interface of the inactivation vector pK19mobsacB (Schäfer et al. Gene 145: 69-73 (1994), which can replicate only in E. coli but not in C. glutamicum.
  • the plasmid pK19mobsacB_ ⁇ sdaA obtained was checked for correctness by restriction mapping.
  • the cloning was carried out in the Escherichia coli strain DH5o; mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649).
  • the plasmid was then electroporated into C. glutamicum 13032 ⁇ panBC (Radmacher E, Vaitsikova A,
  • This strain is pantotenate-auxotrophic due to the deletion of the pantothenate biosynthesis genes panB and panC, and is characterized by the fact that it secretes approx. 50 mM alanine and 8 mM valine under pantothenate limitation due to an increased accumulation of pyruvate.
  • the strain forms approximately 100 ⁇ M L-serine and is therefore suitable as a starting strain for the construction of an L-serine producer.
  • Kanamycin-resistant clones of C. glutamicum 13032 ⁇ panBC were obtained in which the inactivation vector was integrated in the genome.
  • kanamycin-resistant clones were placed on LB medium containing sucrose ((Sa brook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) with 15 g / l agar , 2% glucose / 10% sucrose) and colonies are obtained which have lost the vector through a second recombination event (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465).
  • FIG. 2 shows that the deletion of the sdaA gene leads to an approximately 40% reduced degradation of L-serine.
  • strains 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA (clone 1, clone 2) and 13032 ⁇ panBC (Kon 1, clone 2) were used with the plasmid pEC- T18mob2 - serA tx serCserB transformed.
  • the plasmid (FIG. 3) is composed of the vector pEC-T18mob2 (Tauch, A., Kirchner, 0., Loffler, B., Gotker, S., Puhler, A. and Kalinowski, J.
  • strains 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaApserA fbr CB and 13032 ⁇ panBCpser ⁇ fbr CB were obtained.
  • the two strains 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaAps ⁇ r ⁇ fbr CB and 13032 ⁇ panBCpserA fbr CB were grown in complex medium (CgIII with 2% glucose and 5 ⁇ g / 1 tetracycline), and the fermentation medium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) inoculated from the previous cultures.
  • the medium additionally contained 50 ⁇ g / 1 kanamycin and 1 ⁇ M pantothenate.
  • the two starting strains 13032 ⁇ panBC and 13032 ⁇ panBC ⁇ sdaA were cultivated in the same way, but the media contained no tetracycline b. At least two were independent
  • the wild-type strain WT pXMJ19 (Jacoby M., Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebacterium glutamicum vectors. Biotechnol. Technique 13: 437-441), the overexpression strain WT pXMJl 9_sdaA and the Deletion strain AsdaA pXMJ19 in CgXII minimal medium as in Keilhauer et al. , (1993).
  • the medium contained 30 mg / 1 protocatechic acid, 100 mM glu kose and 100 mM L-serine.
  • the cells were cultivated in the presence of 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside and harvested in the exponential growth phase at an optical density of 6-8, measured on the spectrophotomer Pharmacia Biotech ultrospec 3000. They were then centrifuged at 4500 rpm and 4 ° C. for 10 min, in 50 mM N-2-
  • Hydroxyethylpiperazin-N '-2-ethanesulfonic acid buffer respired, and centrifuged again. The cells were then taken up in 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N '-2-ethanesulfonic acid buffer (pH 8.0), 1 M FeS0 4 and 10 mM dithiothreitol. The cells were disrupted using ultrasound treatment (Branson sonifier 250; duty cycle 25%, output control 2.5, 10 minutes) on ice.
  • the reaction mixture contained 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N '-2-ethanesulfonic acid buffer (pH 8.0), 10 mM dithiothreitol and 10-100 ⁇ l crude extract.
  • the detection of the pyruvate formed from the serine was carried out as described (Ohmori et al., 1991).
  • the reaction was started by adding 50 mM L-serine and stopped after 10 minutes by adding 1, 2-diamino-4, 5-dimethoxybenzene reagent in a ratio of 1: 1.
  • the reagent was as described in Ohmori et al.
  • Table 2 Specific activity of L-serine dehydrate in strains 13032 WT pXMJ19_sdaA (overexpressor), 13032 WT pXMJ19 (wild type with empty vector) and 13032 AsdaA pXMJ19 (deletion mutant with empty vector) under inducing conditions.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine mit reduzierter bzw. Ausgeschalteter L-Serin-Dehydratase sowie Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von L-Serin.

Description

B e s c h r e i b u n g
Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine sowie
Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin
Die Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine mit reduzierter bzw. ausgeschalteter L-Serin-Dehydratase sowie Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von L-Serin.
Die Aminosäure L-Serin findet in der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und Pharmaindustrie, sowie in der Humanmedizin Anwendung. Darüber hinaus dient sie als Bau- stein für die Synthese weiterer industriell verwertbarer Produkte, wie z. B. L-Tryptophan aus Indol und L-Serin.
Es ist bekannt, dass L-Serin durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien hergestellt werden kann. So ist z. B. ein Stamm von Corynebacterium glycinophi - lum in der Lage, L-Serin aus Glycin und Kohlenhydraten zu bilden (Kubota K, Kageyama K, Shiro T und Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K und Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365) . An der Umsetzung von Glycin zu L-Serin ist hier das Enzym L-Serin-Hydroxymethyl- transferase beteiligt (Kubota K und Yokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67(6) :387- 390) . Diese Corynebacterium glycinophylum Stämme weisen eine defekte Serindehydratase auf, die durch ungerich- tete Mutagenese erzeugt wurde (Kubota K (1985) Improved production of L-serin by mutants of Corynebacterium glycinophylum with less serine dehydratase activity. Agricultural Biological Chemistry, 49:7-12). Diese En- zymaktivität ist Pyridoxal 5""-Phosphat abhängig und nicht molekular charakterisiert (Kubota K. , Yokozeki K, Ozaki H. (1989) Effects of L-serine dehydratse activity on L-serine production by Corynebacterium glycinophylum and an examination of the properties of the enzyme . Agric. Biol. Chem 49:7-12) Aus dem US Patent 4,528,273 ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin aus Glycin bekannt, bei dem der Mikroorganismus Serin- Dehydratase negativ ist. Weiterhin wird L-Serin fermentativ aus Methanol und Glycin unter Zuhilfenahme methylotropher Bakterien, wie z. B. Hyphomicrobium Stämmen, produziert (Izumi Y, Yos- hida T, Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A und Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432) . In beiden Fällen muss die Aminosäure Glycin als Vorstufe für die Bildung der Aminosäure L-Serin eingesetzt werden.
Ferner sind coryneforme Bakterien bekannt, die L-Serin direkt aus Kohlenhydraten, ohne zusätzliche Beigabe weiterer Vorstufen produzieren können. Dies ist für ei- ne wirtschaftliche Produktion von L-Serin in industriellem Maßstab vorteilhafter, da L-Serin direkt aus Kohlenhydraten ohne aufwendige Zugabe von Vorstufen hergestellt werden kann. Diese Stämme, die zu der Gattung Corynebacterium glutamicum gehören, weisen sich dadurch aus, dass sie z. B. resistent gegen die
L-Serin-Analoga Serin-Hydroxamat und ß-Chloroalanin sind und durch ungerichtete Mutagenese erhalten wurden (Yoshida H und Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagaku- kaishi 48: 201-208) .
Darüber hinaus sind Brevibacterium flavum Stämme bekannt, die durch ungerichtete Mutagenese Defekte im L-Serin-Abbau aufweisen, eine erhöhte Aktivität der durch serA kodierten 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase besitzen, und die aus Escherichia coli stammenden Gene serB und serC überexprimieren (EP0931833A2) .
Es ist Aufgabe der Erfindung, Maßnahmen zur Verfügung zu stellen, die zu einer verbesserten Produktion von L-Serin oder davon ableitbaren StoffWechselprodukten wie z. B. Tryptophan führen. Es ist somit Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuren bereitzustellen, die für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine codieren, die gegenüber in Wild Typ Organismen vorkommenden Proteinen einen verringerten bzw. keinen Abbau von L-Serin zu Py- ruvat aufweisen. In diesem Zusammenhang ist es weiter- hin Aufgabe der Erfindung eine L-Serin-Dehydratase sowie Mikroorganismen bereitzustellen, die gegenüber natürlich vorkommenden L-Serin-Dehydratasen bzw. Mikroorganismen mit einer L-Serin-Dehydratase, einen verringerten Abbau von L-Serin aufweisen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin bereitzustellen.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 7 erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 7 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird außerdem ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 8 erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 8 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird ebenso ausgehend vom Oberbegriff des An- Spruchs 9 erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 9 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 14 erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 14 angegebenen Merkma- len. Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 20 wird die Aufgabe ebenfalls erfindungsgemäß gelöst, durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 20 angegebenen Merkmale. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 21 erfindungsgemäß gelöst, durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 21 angegebenen Merkmale .
Mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sowie Polypep- tiden ist es nunmehr möglich, eine L-Serin-Dehydratase bereitzustellen, die einen verringerten bzw. keinen L-Serin Abbau mehr verursacht. Weiterhin ist es möglich, Mikroorganismen und Verfahren bereitzustellen, mit denen eine L-Serinproduktion mit gegenüber bisher bekannten mikrobiellen Verfahren höheren Ausbeuten möglich ist.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben .
Gegenstand der Erfindung sind in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante Nukleinsäuren, deren für die L-Serin- Dehydratase, im folgenden auch als SDA bezeichnet, codierende Nukleotidsequenz in Teilen oder komplett dele- tiert oder mutiert ist oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Bereitstellung von Nukleinsäuren, deren sdaA Gensequenz in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird. Es erwies sich beispielswei- se eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 1 deren Nukleotide von Position 506 bis 918 teilweise oder komplett deletiert oder mutiert sind oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder mit diesen hybridisierende Nukleotidse- quenzen als vorteilhaft. Weiterhin vorteilhaft kann beispielsweise die Deletion oder Mutation des zur Bildung des Eisen-Schwefelclusters erforderliche Cystein enthaltende Sequenzmotivs sein (Hofmeister et al . , (1994) Iron-sulfur cluster-containing L-serine dehydra- tase from Peptostreptococcus asaccharolyticus: correla- tion of the cluster type with enzymatic acticvity. FEBS Letters 351: 416-418).
Die Wild Typ L-Serin-Dehydratase { sdaA) Gensequenz ist allgemein bekannt und kann den dem Fachmann bekannten
Datenbanken (NCBI Accession Nr. AP005279) oder dem beigefügten Sequenzprotokoll gemäß SEQ ID No. 1 entnommen werden.
Die vollständige Deletion des L-Serin-Dehydra- tase (sdaA) -Gens kann beispielsweise durch gerichtete rekombinante DNA-Techniken erreicht werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al . (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al . (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch können nur Teile des Gens deletiert werden, oder auch mutierte Fragmente des L-Serin-Dehydratase-Gens ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der L-Serin-Dehydratase- Aktivität erreicht. Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der C. glutamicum Stamm ATCC13032ΔsdaA, der eine Deletion im sdaA-Gen trägt.
Um die Expression des sdaA-Gens zu verhindern oder eine geringere Expression zu erreichen, kann beispielsweise die Promoter- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionsregulationskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen -Serin- bildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regu- lation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Des weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität kodieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression des L-Serin- Dehydratase-Gens durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium besonders bevorzugt aus Corynebacterium glutamicum isoliert werden. Beispiele für in Stammkulturen hinterlegte Wild Typen coryneformer Bakterien sind beispielsweise, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corynebacterium callunae ATCC 15991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; Brevibacterium divaricatum ATCC 14020; Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869; Corynebacterium lilium ATCC 15990; Brevibacterium flavum ATCC 14067; Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Beispiele für zur Herstellung von L-Serin geeignete Mutanten oder Produktionsstämme sind, Organismen aus der Gruppe Arthrobacter, Pseudomonas, Nocardia, Methy- lobacterium, Hyphomycrobium, Alcaligenes oder Klebsiel- la. Die vorliegende Erfindung wird durch die Angabe der zuvor genannten Bakterienstämme näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend wirkt.
Unter einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurefrag- ment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomi- sehe DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktioneil Äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktioneil äquivalente Sequen- zen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degenerierung des genetischen Codes bedingt noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin be- schriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodongebrauch des Wirtsorganismus angepasste Nukleotidsequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen, die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N-Terminus eines Proteins betref- fen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch solche Nukleotidsequenzen umfasst, welche man durch Modifika- tion der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertung anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridi- sieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfasst erfindungsgemäß u.a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den codierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5 "-oder upstream) und/oder nachfolgenden (3 '-oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Se- quenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder die RNA Prozessierung sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u.a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Genstruktur, enthaltend wenigstens eine der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der codierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz der zuvor be- schriebenen Art, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur In- tegration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.
Als Vektoren eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden wie z. B. pZl (Menkel E, Thierbach G, Eggeling L, Sahm H., 1989, Appl Environ Microbiol 55(3): 684-688), pEKEx2 (Eikmanns et al . , Gene 102: 93-98 (1991), oder pXMJ19 (Jacoby M. , Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebac- terium glutamicum vectors . Biotechnol . Technique 13: 437-441) . Andere Plasmidvektoren können in gleicher Weise verwendet werden. Diese Aufzählung ist für die vorliegende Erfindung jedoch nicht limitierend.
Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenzen können entsprechende Sonden oder auch Primer synthetisiert und dazu verwendet werden, beispielsweise mit Hilfe der PCR-Technik analoge Gene aus anderen Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien zu amplifizieren und isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen codierend für an der Biosynthese von L-Serin be- teiligte Proteine, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält . Bei der Sonde kann es sich um einen Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Se- quenz, beispielsweise aus einem konservierten Bereich handeln, der z. B. eine Länge von 10 bis 30 oder bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden aufweist und unter stringen- ten Bedingungen spezifisch mit homologen Nukleotidse- quenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind aus der Literatur zahlreich bekann . Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im Handbuch von Galt: Oligonukleotide synthesis : a practi- cal approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) oder beispielsweise im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybri- dization" der Firma Röche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) und bei Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine L-Serin-Dehydratase mit gegenüber der Wild Typ L-Serin- Dehydratase verringertem L-Serinabbau, codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder deren Variationen der zuvor beschriebenen Art. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine L-Serin-Dehydratase, bzw. ein L-Serin-Dehydratase Mutein, mit einer Amino- säuresequenz gemäß der SEQ ID No 2 deren Aminosäuren von Position 135 bis 274, beispielsweise als Folge einer gerichteten Mutagenese auf DNA-Ebene, verändert wurden oder einer modifizierten Form dieser Polypeptid- sequenzen oder Isoformen davon oder Mischungen daraus. Unter „verändert" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das komplette oder teilweise Entfernen oder Austauschen der Aminosäuren von Position 135 bis 274 verstanden.
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N-Terminus oder C-Terminus des Polypep- tids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder Bre- vibacterium besonders bevorzugt aus Corynebacterium glutamicum stammen. Beispiele für in Stammkulturen hinterlegte Wild Typen coryneformer Bakterien sind beispielsweise Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; Brevibacterium divaricatum ATCC 14020; Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869; Corynebacterium lilium ATCC 15990; Brevibacterium flavum ATCC 14067; Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354; Beispiele für zur Herstellung von L-Serin geeignete Mutanten oder Produktionsstämme sind Organismen aus der Gruppe Arthrobacter, Pseudomonas, Nocardia, Methylobac- terium, Hyphomycrobium, Alcaligenes oder Klebsieila. Die vorliegende Erfindung wird durch die Angabe der zuvor genannten Bakterienstämme näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend wirkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen gene- tisch veränderten Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass die für die L-Serin-Dehydratase codierende Nukleotidsequenz in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleotidsquenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der dadurch gekennzeichnet ist, dass das sdaA-Gen in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber den natürlich vorkommenden sdaA-Genen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in repli- zierbarer Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus auch ein genetisch veränderter Mikroorganismus ent- haltend ein erfindungsgemäßes Polypeptid der zuvor beschriebenen Art, welches im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus einen verringerten bzw. keinen L-Serin Abbau aufweist. Ein erfindungsgemäß genetisch veränderter Mikroorganismus zeichnet sich ferner dadurch aus, dass er ein cory- neformes Bakterium, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Spe- zies Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum- ist .
Prinzipiell können Gene durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen Nukleotidsequenzen (Primern) amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien in konservierten Berei- chen der Gene und/oder unter Berücksichtigung des GC- Gehalts der DNA des zu untersuchenden Mikroorganismus.
Eine weitere Vorgehensweise zur Isolierung von codierenden Nukleotidsequenzen ist die Komplementation von sogenannten Defekt-Mutanten des zu untersuchenden Orga- nismusses, die zumindest phänotypisch einen Funktionsverlust in der Aktivität des zu untersuchenden Gens oder entsprechenden Proteins aufweisen. Unter einer Komplementation ist die Aufhebung des Gendefektes der Mutante und weitgehende Wiederherstellung des ursprünglichen Erscheinungsbildes vor der Mutagenese zu verstehen, die durch die Einbringung funktioneller Gene oder Genfragmente aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus erreicht wird.
Ein klassisches Mutagenese-Verfahren zur Herstellung von Defektmutanten bzw. von Mutanten mit einer reduzierten oder ausgeschalteten L-Serin-Dehydratase, ist beispielsweise die Behandlung der Bakterienzellen mit Chemikalien wie z. B.
N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder UV-Bestrahlung. Derartige Verfahren zur Mutationsauslösung sind all- gemein bekannt und können unter anderem bei Miller
(A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bac- teria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriolo- gy" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) nachgelesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin, wo- bei die für die L-Serin-Dehydratase codierende Nuklein- säure in einem Mikroorganismus in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert wird oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleinsäuren gar nicht oder geringer exprimiert wird, dieser genetisch veränderte Mikroorga- nismus zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin eingesetzt wird und das entsprechend gebildete L-Serin aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Serin kultiviert werden. Eine Zusam- menfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im
Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Wei- se den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlen- stoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B.
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Soja- Öl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleisch- extrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoni- umcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung ver- wendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisen- sulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaum- mittel wie z. B. Fettsaurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plas- miden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45 °C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Serin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse der L-Serin-Bildung kann durch Anionen- austauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al .
(Analytical Chemistry, 30, (1958) , 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen so wie bei Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Serin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um die zuvor bereits näher beschriebenen Vertreter coryneformer Bakterien handeln. Eine Auswahl an Ergebnissen der Fermentation ist in Tabelle 1 darge- stellt. Hierbei zeichnen sich die erfindungsgemäß genetisch veränderten Mikroorganismen durch eine wesentlich verbesserte L-Serin-Produktion gegenüber den entsprechend nicht transformierten Mikroorganismen (Wild Typen) oder den Mikroorganismen aus, die lediglich den Vektor ohne Gen-Insert enthalten. In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung ist gezeigt, daß C. glutamicum ATCC 13032ΔpanBCΔsdaA zu einer wenigstens 4-fachen Steigerung der L-Serin Akkumulation im Medium im Vergleich zu den Kontrollstammen führt (Tab. 1) . Durch die gemeinsame Überexpression weiterer Gene, die positiv auf den L-Serinbiosyn- theseweg wirken, konnte eine 16-fache Steigerung der L-Serin-Produktion erreicht werden.
Unter Aminosäure-Produktionsstämmen, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Corynebacterium glutamicum- Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, dass ihr Stoffwechselfluss ver- stärkt in die Richtung der Biosynthese von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft (metabolic enginee- ring) . Beispielsweise sind bei diesen Aminosäure- Produktionsstammen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfasst hierbei sämtliche bereits bekannte Aminosäure-Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder homologer Organismen. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfaßt, die der Fachmann in Analogie zu Erkennt- nissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise En- terobacterien, Bacillaceen oder Hefe-Arten nach gängigen Methoden herstellen kann.
Die Figuren zeigen beispielhaft verwendete Plasmide so- wie experimentelle Ergebnisse nach Einsatz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. Mikroorganismen
Es zeigt:
Fig. 1: Intergrationsplasmid pK19mobsacB-DeltasdaÄ
Die am äußeren Rand des Plasmids angegebenen Markierungen kennzeichnen die jeweiligen Restriktionsschnittstellen. Die im Inneren des Kreises angegebenen Abschnitte kennzeichnen folgende Gene : kan Kanamycinresistenz sacB Sucrase
OriT Transfer-Origin sdA 5 "-Ende des sdaA Gens sda" 3 '-Ende des sdaA Gens
Fig. 2: Wachstumsverhalten (quadratische Symbole) und L-Serin-Abbau (kreisförmige Symbole) von C. glutamicum 13032ΔpanBCΔsdaA, Klon 1 (D, O) und C. glutamicum 13032ΔpanBCΔsdaA, Klon 2
(■, •) im Vergleich zu C. glutamicum 13032ΔpanBC, Klon 1 (D, O) und C. glutamicum 13032ΔpanBC, Klon 2 (■, •) . Die Abszisse X gibt die Fermentationszeit in Stunden [h] an. Die Ordinate Yi gibt das Wachstum der Mikroorganismen gemessen als optische Dichte (OD) bei 600 nm an. Die Ordinate Y2 gibt die L- Serinkonzentration in mM an.
Fig. 3: Expressionsplasmid pEC-T18mob2-serAfbrCB .
Die am äußeren Rand des Plasmids angegebenen Markierungen kennzeichnen die jeweiligen Re- striktionsschnittstellen. Die im Inneren des
Kreises angegebenen Abschnitte kennzeichnen folgende Gene :
SerC Phosphoserin Transaminase SerB Phosphoserin Phosphatase Rep Replikationsursprung
Per Partition Zeilverteilungsgen Tet Tetracyclinresistenzgen RP4-mob Mobilisationsursprung OriV Ursprung der DNA Replikation SerA-fbr 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase
Ausfü rungsbeispiele ;
1. Konstruktion einer sdaA-Deletionsmutante von C. glu- tamicum ATCC13032 ΔpanBC
Corynebacterium glutamicum verfügt über eine Nukleotidsequenz (Genbank-Accession-Nummer BAB99038; SEQ-ID-No. 1) dessen abgeleitete Polypeptid-Sequenz 40 % Identität zur beschriebenen L-Serin-Dehydratase von E. coli aufweist (NCBI-Accession-Nummer P16095) . Durch gengerichtete Mutagenese nach einer Methode von Link et al . (Link AJ, Phillips D, Church GM. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wildtype Escherichia coli: application to open reading fra- me characterization. J Bacteriol . 1997
Oct;179(20) :6228-37) und Schäfer et al . (Gene 145: 69 - 73 (1994) ) wurde das sdaÄ-Gen von C. glutamicum deletiert. Hierzu wurden folgende Primer von der corynebac- teriellen sdaA-Sequenz (NCBI Accession-Nummer AP005279) abgeleitet :
sdaA-1: 5λ-TCGTGCAACTTCAGACTC-3
(AP005279 Nukleotid 73635 - 73653) ;
SdaA-2 : 5 -CCCATCCACTAAACTTAAACACGTCATAATGAACCCACC-3 (AP005279 komplementär zu Nukleotid 74121-74139) ;
SdaA-3 : 5 λ -TGTTTAÄGTTTÄGTGGATGGGCCGACTAATGGTGCTGCG-3 x (AP005279 komplementär zu Nukleotid 74553 - 74571) ;
sdaA-4 : 5 -CGGGAAGCCCAAGGTGGT-3 x (AP005279 Nukleotid 75044 -75062)
Primer sdaA-1 und sdaA-2 flankieren jeweils den Beginn und das Ende des sdaA-Gens . Die Primer sdaA-2 und sdaA- 3 verfügen über jeweils komplementäre Linker-Regionen (hervorgehobener Text) , die es ermöglichen in einem zweistufigen PCR-Ansatz (Cross-over PCR) eine Deletion in dem sdaA-Gen in vitro zu erzeugen. In einer ersten PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum wurden jeweils die Primer-Kombinationen sdaA-1 und sdaA-2 sowie sdaA-3 und sdaA-4 eingesetzt. Die PCR- Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 μM De- oxynukleotidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , je 600 nM der entsprechenden Oligonukleotide sdaA-1 und sdaA-4 sowie 60 nM der Oligonukleotide sdaA-2 und sdaA- 3, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA- Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Röche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Water- town, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 40 Sekunden. Der Elongationsschritt bei 72°C wurde nach 10 Zyklen um 5 Sekunden pro Zyklus verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA-Fragmente, die jeweils eine Länge von 500 bp aufwiesen mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aus einem 0,8 %igen Agarose-Gel isoliert, und beide
Fragmente wurden als Template in die zweite PCR eingesetzt. Als Primer wurden nun die Primer sdaA-1 und sdaA-4 eingesetzt. Diesmal erfolgte die Reaktion in 35 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtri- phosphaten, je 600 nM des entsprechenden Oligonukleo- tids, jeweils 20 ng der isolierten Template-DNA aus der ersten PCR, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten der Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung unter folgenden Bedingungen: 94 °C für 30 Sekunden, 50 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 80 Sekunden. Wiederum wurde der Elongationsschritt nach 10 Zyklen um jeweils 5 Sekunden verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1000 bp lange DNA-Fragment, dass nun das inaktivierte sdaA-Gen mit einer 420 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8 %igen Agarose-Gel isoliert, und blunt-end mit Hilfe des Sure Clone-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) in die S al -Schnittstelle des Inaktivierungsvektors pK19mobsacB (Schäfer et al . Gene 145: 69-73 (1994), der nur in E. coli , nicht aber in C. glutamicum replizieren kann, kloniert . Das erhaltene Plasmid pK19mobsacB_ΔsdaA (Fig. 1) wurde durch Re- striktionskartierung auf Richtigkeit überprüft. Die Klonierung erfolgte in dem Escherichia coli Stamm DH5o;mcr (Grant et al . , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) . Anschließend wurde das Plasmid durch Elektroporation in C. glutamicum 13032ΔpanBC (Radmacher E, Vaitsikova A,
Burger U, Krumbach K, Sahm H, Eggeling L. Linking cent- ral metabolism with increased pathway flux: L-valine accumulation by Corynebacterium glutamicum. Appl Envi- ron Microbiol . 2002 68(5) : 2246-50) eingebracht und auf Integration des Vektors selektioniert. Dieser Stamm ist durch die Deletion der Pantothenat-Biosynthese Gene panB und panC Pantothenat-auxotroph, und zeichnet sich dadurch aus, dass er unter Pantothenat-Limitation aufgrund einer verstärkten Akkumulation von Pyruvat ca. 50 mM Alanin und 8 mM Valin ausscheidet. Darüber hinaus bildet der Stamm ca. 100 μM L-Serin und eignet sich somit als Ausgangsstamm für die Konstruktion eines L-Serinproduzenten. Es wurden Kanamycin-resistente Klone von C. glutamicum 13032ΔpanBC erhalten, bei denen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag. Um auf die Excision des Vektors zu selektionieren, wurden Kanamycin-resistente Klone auf Saccharose-haltigem LB- Medium ( (Sa brook et al . , Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) mit 15 g/1 Agar, 2% Glucose/ 10% Saccharose) ausplattiert und Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al . 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Zwei dieser Klone, deren Nukleotide des sdaA-Gens von Position 506 bis 918 deletiert waren und fortan mit 13032ΔpanBCΔsdaA, Klon 1 und 13032ΔpanBCΔsdaA, Klon 2 bezeichnet werden, wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet .
2. Einfluss der sdaA-Deletion auf den L-Serin-Abbau
Im Folgenden wurde getestet, ob das deletierte sdaA-Gen tatsächlich am L-Serin-Abbau beteiligt ist. Hierzu wurde ein Wachstumsexperiment mit jeweils zwei Klonen des Stamms C. glutamicum 13032ΔpanBCΔsdaA im Vergleich zum Stamm C. glutamicum 13032ΔpanBC auf Minimalmedium (Keilhauer et al . , Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603) das zusätzlich 2 % Glucose, 1 μM Pantothenat und 100 mM L-Serin enthielt durchgeführt. Es wurde das Wachstum und der Verbrauch von L-Serin verfolgt. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
Das Ergebnis in Fig. 2 zeigt, dass die Deletion des sdaA-Gens zu einem ca. 40 % verringerten Abbau von L-Serin führt.
3. Einfluss der Deletion des sdaA-Gens auf die L-Serin- Bildung
Um zu testen, welchen Einfluss die Deletion des L-Serin-Dehydratase-Gens auf die L-Serin-Bildung hat, wurden die Stämme 13032ΔpanBCΔsdaA (Klon 1, Klon 2) und 13032ΔpanBC (Kon 1, Klon 2) mit dem Plasmid pEC-T18mob2 - serAt x serCserB transformiert. Das Plasmid (Fig. 3) setzt sich zusammen aus dem Vektor pEC-T18mob2 (Tauch, A. , Kirchner, 0., Loffler, B., Gotker, S., Puh- ler, A. and Kalinowski, J. Efficient Electrotransforma- tion of Corynebacterium diphtheriae with a Mini- Replicon Derived from the Corynebacterium glutamicum Plasmid pGAl. Curr. Microbiol . 45 (5), 362-367 (2002)), den corynebacteriellen Genen serAfhx (Peters-Wendisch P, Netzer R, Eggeling L, Sahm H. 3-Phosphoglycerate de- hydrogenase from Corynebacterium glutamicum: the C-terminal domain is not essential for activity but is required for inhibition by L-serine. Appl Microbiol Bi- otechnol. 2002 Dec; 60 (4) :437-41) , sowie serC und serB (deutsche Patentanmeldung 100 44 831.3, 11.09.2000). Nach erfolgter Elektroporation wurden die Stämme 13032ΔpanBCΔsdaApserAfbrCB und 13032ΔpanBCpserÄfbrCB er- halten. Zur Untersuchung der L-Serinausscheidung wurden die zwei Stämme 13032ΔpanBCΔsdaApsβrÄfbrCB und 13032ΔpanBCpserAfbrCB in Komplexmedium (CgIII mit 2% Glukose und 5 μg/1 Tetracyclin) gezüchtet, und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595- 5603) jeweils aus den Vorkulturen beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich 50 μg/1 Kanamycin und 1 μM Pantothenat. Als Kontrolle wurden die beiden Ausgangsstämme 13032ΔpanBC und 13032ΔpanBCΔsdaA in gleicher Weise kultiviert, allerdings enthielten die Medien kein Tetracyclin b. Es wurden je mindestens zwei unabhängige
Fermentationen durchgeführt. Nach Kultivierung für 30 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration er- folgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (J
Chromat (1983) 266: 471-482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 1 dargestellt, und es zeigt sich, daß das Ausschalten der L-Serin-Dehydratase zu einer 4- fachen Steigerung der L-Serin-Akkumulation im Medium führt, unabhängig davon, ob die L-Serin-Biosynthesegene serA£br , serC und serB überexrimiert werden. Die Überexpression der L-Serin-Biosynthesegene serAfhr , serC und serB führt jedoch generell zu einer 16-fachen Steigerung der L-Serin-Akkumulation im Kulturüberstand. Somit stellt die Nutzung der konstruierten und beschriebenen Deletionsmutante ΔsdaA ein Verfahren dar, um die L-Serinbildung entscheidend zu verbessern.
Tabelle 1: Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von CoryneJac eriujn glutamicum 13032ΔpanBC und
13032ΔpanBCΔsdaA nach Expression der Gene serA r, serC und serB .
Figure imgf000028_0001
4. Bestimmung der L-Serin-Dehydratase-Aktivität
Zur Bestimmung der L-Serin Dehydratase-Aktivität wurde der Wildtypstamm WT pXMJ19 (Jacoby M. , Burkovski A (1999) Construction ans application of new Corynebacterium glutamicum vectors . Biotechnol . Technique 13: 437- 441) , der Überexpressionsstamm WT pXMJl 9_sdaA und der Deletionsstamm AsdaA pXMJ19 in CgXII-Minimalmedium wie bei Keilhauer et al . , (1993) beschrieben angezogen. Das Medium enthielt 30 mg/1 Protokatechusäure, 100 mM Glu- kose und 100 mM L-Serin. Die Zellen wurden in Anwesenheit von 1 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase bei einer optischen Dichte von 6-8, gemessen am Spektralphotomer Pharmacia Biotech ultrospec 3000, geerntet. Anschließend wurden sie 10 min bei 4500 rpm und 4°C abzentrifugiert, in 50 mM N-2-
Hydroxyethylpiperazin-N' -2-ethansulfonsäure-Puffer (pH 8,0) respundiert, und erneut zentrifugiert . Danach wurden die Zellen in 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N' -2- ethansulfonsäure-Puffer (pH 8,0), 1 M FeS04 und 10 mM Dithiothreitol aufgenommen. Der Zellaufschluss erfolgte mittels Ultraschallbehandlung (Branson sonifier 250; duty cycle 25%, Output control 2,5, 10 Minuten) auf Eis. Zur Bestimmung der L-Serin Dehydratase-Aktivität enthielt der Reaktionsansatz 50 mM N-2-Hydroxyethyl- piperazin-N' -2 -ethansulfonsäure-Puffer (pH 8,0), 10 mM Dithiothreitol und 10-100 μl Rohextrakt. Der Nachweis des aus dem Serin gebildeten Pyruvats erfolgte wie beschrieben (Ohmori et al . , 1991) . Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 mM L-Serin gestartet und nach 10 Minuten durch Zugabe von 1, 2-Diamino-4 , 5-dimethoxy- benzol Reagenz im Verhältnis 1:1 gestoppt. Das Reagenz bestand, wie bei Ohmori et al . , 1991 beschrieben, aus 4 mg 1 , 2-Diamino-4 , 5-dimethoxybenzol in 42,4 ml H20, 3,5 ml ß-Mercaptoethanol und 4 , 1 ml HCl (37%ig) gelöst. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 2 h bei 102 °C trockener Hitze. Der Nachweis und die Quantifizierung des aus dem Pyruvat entstandenen 2-Hydroxy-6, 7- dimethoxy-3-methylquinoxalin-Derivats erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie, ebenfalls wie beschrieben (Ohmori et al . , 1991). Die Proteinbestimmung im Rohextrakt erfolgte mittels eines auf der Bradford- Methode (Bradford, 1976) beruhenden Protein Assays (Fa. Bio-Rad) . Die ermittelten spezifischen L-Serin Dehydra- tase-Aktivitäten der drei Stämme sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 : Spezifische Aktivität der L-Serin Dehydrata- se in den Stämmen 13032 WT pXMJ19_sdaA (Überexprimie- rer) , 13032 WT pXMJ19 (Wildtyp mit Leervektor) und 13032 AsdaA pXMJ19 (Deletionsmutante mit Leervektor) unter induzierenden Bedingungen.
Figure imgf000030_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. In Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die für die L-Serin-Dehydratase codierende
Nukleotidsequenz in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
2. Nukleinsäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sdaA-Gensequenz in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
3. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, gekennzeichnet durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 1, deren Nukleotide von Position 506 bis 918 komplett oder teilweise deletiert oder mutiert sind oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder mit diesen hybridisierende Nukleotidsequenzen.
4. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus coryneformen Bakterien isoliert werden.
5. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Corynebacterium oder Brevibacterium isoliert werden.
6. Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum isoliert werden.
7. Genstruktur enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen.
8. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 6 oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 7 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszelle oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.
9. L-Serin-Dehydratase mit reduzierter L-Serin-
Dehydrataseaktivität , codiert durch eine Nuklein- säure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
10. L-Serin-Dehydratase nach Anspruch 9, mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 2 deren Aminosäuren von Position 135 bis 274 verändert sind, oder eine modifizierte Form dieser Polypep- tidsequenz oder Isoform davon.
11. L-Serin-Dehydratase gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus coryneformen Bakterien stammt .
12. L-Serin-Dehydratase gemäß einem der Ansprüche 9 bis
Figure imgf000032_0001
dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Corynebacterium oder Brevibacterium stammt .
13. L-Serin-Dehydratase gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum stammt .
14. Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass die für eine L-Serin-Dehydratase codierende
Nukleotidsequenz, in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
15. Mikroorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das sdaA-Gen in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert ist oder gegenüber den natürlich vorkommenden sdaA-Genen geringer oder gar nicht expri- miert wird.
16. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 14 bis
15, enthaltend in replizierbarer Form eine Nuklein- säure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eine Genstruktur gemäß Anspruch 7 , einen Vektor gemäß Anspruch 8 oder ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13.
17. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 14 bis
16, dadurch gekennzeichnet, dass er ein coryneformes Bakterium ist .
18. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass er zur Gattung Corynebacterium oder Brevibac- terium gehört .
19. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass er zu Corynebacterium glutamicum oder Brevi- bacterium flavum gehört.
20. Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen codierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgehend von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält.
21. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die für die L-Serin-Dehydratase codierende Nuk- leinsäure in einem Mikroorganismus in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert wird oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleinsäuren gar nicht oder geringer exprimiert wird,
b) dieser genetisch veränderte Mikroorganismus aus Schritt a) zur mikrobiellen Herstellung eingesetzt wird und
c) das gebildete L-Serin aus dem Kulturmedium isoliert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die sdaA-Gensequenz in Teilen oder komplett deletiert oder mutiert wird oder gegenüber natür- lieh vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotide gemäß SEQ ID No 1 von Position 506 bis 918 komplett oder in Teilen deletiert oder mutiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer oder gar nicht exprimiert werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gruppe Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Pseudomonas, No- cardia, Methylobacterium, Hyphomicrobium, Alcalige- nes oder Klebsiella eingesetzt werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, eine Genstruktur gemäß Anspruch 7 oder ein Vektor gemäß Anspruch 8 eingesetzt wird.
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