BR112019013521B1 - Polipeptídeo modificado, polinucleotídeo, micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-leucina e método para produzir l-leucina - Google Patents

Abstract

A presente revelação se refere a um polipeptídeo modificado inovador que tem uma atividade da sintase de isopropilmalato, um polinucleotídeo que codifica a mesma, um micro-organismo que compreende o polipeptídeo e um método para produzir L-leucina cultivando-se o micro-organismo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um polipeptídeo modificado inovador que tem uma atividade da sintase de isopropilmalato, um polinucleotídeo que codifica a mesma, um micro-organismo que compreende o polipeptídeo e um método para produzir L-leucina cultivando-se o micro-organismo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] L-Leucina é um aminoácido essencial, um que é dispendioso e amplamente usado em medicamentos, alimentos, aditivos alimentares, produtos químicos industriais, etc. Além disso, L-leucina é produzida principalmente com o uso de um micro-organismo. Fermentação de aminoácidos de cadeia ramificada que incluem L- leucina é realizada principalmente através de um micro-organismo do gênero Escherichia ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium, conhecido por biossintetizar 2-cetoisocaproato como um precursor a partir de ácido pirúvico através de diversas etapas (Patentes Coreanas nos 10-0220018 e 10-0438146).

[003] Sintase de isopropilmalato (doravante denominada como “IPMS”), a qual é uma enzima envolvida na biossíntese de leucina, é uma enzima da primeira etapa na biossíntese de leucina, que converte 2-cetoisovalerato, produzido durante a via biossintética valina, para isopropilmalato, que permite a biossíntese de leucina em vez de valina, e, desse modo, IPMS é uma enzima importante no processo de biossíntese de leucina. Entretanto, a IPMS é submetida a inibição de retroalimentação por L- leucina, que é um produto final, ou derivados da mesma. Consequentemente, embora haja uma variedade de técnica anterior relevante para variantes de IPMS que liberam inibição de retroalimentação para o propósito de produzir uma alta concentração de leucina (Pedido de Publicação de Patente no U.S. 2015-0079641 e Patente no U.S. 6403342), pesquisa ainda continua para descobrir variantes melhores.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[004] Os presentes inventores se empenharam para desenvolver uma variante IPMS que possa ser usada para a produção de L-leucina com uma alta concentração, e como um resultado, os presentes inventores desenvolveram uma variante de IPMS inovadora. Foi confirmado que a variante liberou inibição de retroalimentação por L- leucina, a qual é um produto final, e aumentou uma atividade da mesma de modo que a variante seja capaz de produzir L-leucina em um alto rendimento a partir de um micro-organismo que contém a mesma completando, desse modo, a presente revelação.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um polipeptídeo modificado inovador que tenha uma atividade da sintase de isopropilmalato.

[006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifique o polipeptídeo modificado.

[007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina, contendo o polipeptídeo.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir L-leucina cultivando-se o micro-organismo em um meio.

EFEITOS VANTAJOSOS

[009] O polipeptídeo modificado inovador que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato é um polipeptídeo no qual a atividade é aumentada comparado àquele do tipo selvagem e a inibição de retroalimentação por L-leucina é liberada e, desse modo, L-leucina pode ser produzida em um rendimento alto com o uso de tal polipeptídeo modificado.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[010] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um polipeptídeo modificado inovador que tem uma atividade da sintase de isopropilmalato. O polipeptídeo modificado inovador pode ser um polipeptídeo modificado que tem uma atividade da sintase de isopropilmalato, em que arginina na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituída por um resíduo de aminoácido diferente de arginina, ou glicinina na posição 561 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituída por um resíduo de aminoácido diferente de glicinina. O polipeptídeo modificado da presente revelação não apenas tem uma atividade superior àquela de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem uma atividade da sintase de isopropilmalato, mas também tem uma característica de que a inibição de retroalimentação por L-leucina é liberada.

[011] Como usado no presente documento, o termo “sintase de isopropilmalato” se refere a uma enzima que converte 2-cetoisovalerato para isopropilmalato, o qual é um precursor de L-leucina, por reação com acetil-CoA. A sintase de isopropilmalato da presente revelação pode ser incluída desde que a enzima tenha a atividade de conversão, independentemente de uma origem de um micro-organismo. Especificamente, a sintase de isopropilmalato pode ser uma enzima derivada a partir de um micro-organismo do gênero Corynebacterium. Mais especificamente, a sintase de isopropilmalato pode ser uma sintase de isopropilmalato derivada a partir de Corynebacterium glutamicum, e especificamente, a mesma pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, porém sem limitação à mesma. Além disso, a sintase de isopropilmalato pode incluir um polipeptídeo que tem homologia de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, é óbvio que uma sequência de aminoácidos que tem tal homologia e exibe um efeito que corresponde àquele da sintase de isopropilmalato pode ser incluída no escopo da presente revelação mesmo se a mesma tiver uma sequência de aminoácidos na qual algumas das sequências são deletadas, modificadas, substituídas ou adicionadas.

[012] Como usado no presente documento, o termo “aumento em atividade de sintase de isopropilmalato” se refere a um aumento na atividade de conversão para isopropilmalato. Portanto, o polipeptídeo modificado da presente revelação tem um nível superior da atividade de conversão de isopropilmalato comparado a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem a atividade de sintase de isopropilmalato. A atividade de conversão de isopropilmalato pode ser confirmada diretamente medindo- se o nível de isopropilmalato produzido, ou pode ser confirmada indiretamente medindo-se o nível de CoA produzido. Como usado no presente documento, o termo “aumento em atividade” pode ser usado em combinação com “atividade aumentada”. Ademais, isopropilmalato é um precursor de L-leucina e, portanto, o uso do polipeptídeo modificado da presente revelação resulta em produzir um nível superior de L-leucina comparado a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem a atividade de sintase de isopropilmalato.

[013] Além disso, diferente de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem a atividade de sintase de isopropilmalato, o polipeptídeo modificado da presente revelação pode ser caracterizado pelo fato de que inibição de retroalimentação por L- leucina, a qual é um produto final, ou um derivado da mesma é liberado. Como usado no presente documento, o termo “inibição de retroalimentação” se refere à inibição de uma reação no estado inicial de um sistema de enzima por um produto final no sistema de enzima. Para os objetivos da presente revelação, a inibição de retroalimentação pode ser inibição de retroalimentação na qual L-leucina ou um derivado da mesma inibe a atividade de sintase de isopropilmalato, a qual meios a primeira etapa da via biossintética, mas não é limitada a isso. Portanto, quando a inibição de retroalimentação de sintase de isopropilmalato é liberada, a produtividade de L-leucina pode ser aumentada comparada com o caso de não liberar a mesma.

[014] Como usado no presente documento, o termo “modificação”, “modificado” ou “variante” se refere a uma cultura ou um indivíduo que mostra uma alternância hereditária ou não hereditária em um fenótipo estabilizado. Especificamente, o termo “variante” pode destinar-se a significar uma variante na qual sua atividade é aumentada de forma eficiente devido à sequência de aminoácidos que corresponde a sintase de isopropilmalato derivada de Corynebacterium glutamicum ser modificada comparada ao tipo selvagem, uma variante na qual inibição de retroalimentação por L-leucina ou um derivado da mesma é liberada, ou uma variante na qual o aumento em atividade e inibição de retroalimentação são ambos liberados.

[015] Especificamente, o polipeptídeo modificado da presente revelação, o qual tem a atividade de sintase de isopropilmalato, pode ser um polipeptídeo modificado que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato, em que arginina, um aminoácido na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituído por um resíduo de aminoácido diferente de arginina, ou glicinina, um resíduo de aminoácido na posição 561 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituído por um resíduo de aminoácido diferente de glicinina. O aminoácido diferente de arginina pode incluir alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, glicinina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, ácido aspártico e ácido glutâmico; e o aminoácido diferente de glicinina pode incluir alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, arginina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, ácido aspártico e ácido glutâmico; mas os aminoácidos não são limitados a esses. Mais especificamente, o polipeptídeo modificado pode ser um polipeptídeo modificado, em que arginina, um resíduo de aminoácido na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituída por histidina, alanina, ou glutamina; ou glicinina, um resíduo de aminoácido na posição 561 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituído por ácido aspártico, arginina ou tirosina, mas não é limitado a esses. Além disso, o polipeptídeo modificado pode ser um no qual a arginina na posição 558 é substituída por histidina, alanina ou glutamina; e a glicinina na posição 561 é substituída por ácido aspártico, arginina ou tirosina, mas não é limitada a esses. Mais especificamente, o polipeptídeo modificado pode incluir uma sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 35.

[016] Além disso, o polipeptídeo modificado pode incluir um polipeptídeo que tem homologia de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO: 21 a SEQ ID NO: 35. Por exemplo, é óbvio que uma enzima variante que tem uma sequência de aminoácidos, na qual algumas das sequências são deletadas, modificadas, substituídas ou adicionadas enquanto a sequência de aminoácidos modificada que corresponde à sequência de aminoácidos nas posições 558 e/ou 561 é fixa, também deve pertencer ao escopo da presente revelação desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia acima e exiba um efeito que corresponde àquele de sintase de isopropilmalato. Por outro lado, as posições 558 e 561, as quais são posições de modificação específicas, se referem a posições que são determinadas com base no N-terminal na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e, portanto, o fato de que tais posições são determinadas considerando-se o número dos aminoácidos que são adicionados ou deletadas a partir do N-terminal de SEQ ID NO: 1 é óbvio para uma pessoa de habilidade comum na técnica, e, desse modo, também pertence ao escopo da presente revelação. Por exemplo, leuA, o qual é o gene que codifica sintase de isopropilmalato, foi representado por SEQ ID NO: 1 que consiste em 616 aminoácidos. Entretanto, em algumas referências, o código de iniciação de translação é indicado 35 aminoácidos a jusante da sequência do gene leuA, isto é, um gene que consiste em 581 aminoácidos. Nesse caso, o 558o aminoácido é interpretado como o 523o aminoácido e o 561o aminoácido como o 526o aminoácido e é, desse modo, incluído no escopo da presente revelação.

[017] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” se refere uma percentagem de identidade entre duas porções químicas de polinucleotídeo ou polipeptídeo. A homologia entre sequências de uma porção química para outra porção química pode ser determinada pela tecnologia conhecido na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada dispondo-se diretamente a informações de sequência, isto é, parâmetros tais como pontuação, identidade, similaridade, etc., de duas moléculas de polinucleotídeo ou duas moléculas de polipeptídeo com o uso de um programa de computador facilmente acessível (Exemplo: BLAST 2.0). Além disso, a homologia entre polinucleotídeos pode ser determinada por hibridização de polinucleotídeos sob a condição de formar um filamento duplo estável entre as regiões homólogas, desmontando-se com uma nuclease específica de filamento único, seguida por determinação de tamanho dos fragmentos desmontados.

[018] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificado.

[019] O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado que tem a atividade de sintase de isopropilmalato, em que arginina, um aminoácido na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituída por outro resíduo de aminoácido diferente de arginina, ou glicinina, um resíduo de aminoácido na posição 561 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é substituído por outro resíduo de aminoácido diferente de glicinina. Especificamente, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nos: 21 a 35 e que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato; um polipeptídeo modificado que tem homologia de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com o polipeptídeo acima; ou que codifica um polipeptídeo modificado que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato, no qual algumas das sequências são deletadas, modificadas, substituídas ou adicionadas enquanto a sequência de aminoácidos modificada nas posições 558 e/ou 561, as quais são posições de modificação específicas no polipeptídeo acima, é fixa pode ser incluída sem limitação. Alternativamente, a sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida, por exemplo, uma sequência que codifica uma proteína que tem atividade de sintase de Isopropilmalato por hibridação de uma sequência complementar para toda ou parte da sequência de nucleotídeos acima sob condições rigorosas, pode ser incluída sem limitação.

[020] Como usado no presente documento, o termo “condições rigorosas” se refere a condições sob as quais um assim chamado híbrido é formado enquanto híbridos não específicos não são formados. Exemplos de tais condições incluem condições sob as quais genes que têm altos graus de homologia, tais como genes que têm uma homologia de 80% ou mais, especificamente, 90% ou mais, mais especificamente, 95% ou mais, de forma adicionalmente específica, 97% ou mais, e sendo o mais específico, 99% ou mais, hibridizam entre si enquanto genes que tem baixos graus de homologia do não hibridizam entre si, ou condições sob as quais genes são lavados 1 vez e, especificamente, 2 e 3 vezes, em uma temperatura e uma concentração de sal equivalente a 60 °C, 1*SSC, e 0,1% de SDS, especificamente, 60 °C, 0,1*SSC, e 0,1% de SDS e, mais especificamente, 68 °C, 0,1*SSC, e 0,1% SDS, as quais são as condições para lavagem de hibridação Southern comum (Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)).

[021] A sonda usada na hibridação pode ser uma parte da sequência complementar da sequência de nucleotídeos. Tal sonda pode ser construída por PCR com o uso de um oligonucleotídeo preparado com base em uma sequência conhecida como um iniciador e um fragmento de gene que contém tal sequência de nucleotídeos como um modelo. Por exemplo, um fragmento de gene que tem um comprimento de cerca de 300 bp pode ser usado como uma sonda. Mais especificamente, no caso do uso de uma sonda que tem um comprimento (cerca de 300 bp), 50 °C, 2*SSC, e 0,1 % de SDS pode ser sugerido para as condições de lavagem de hibridação.

[022] Por outro lado, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 50, e é óbvio que o polinucleotídeo também inclui um polinucleotídeo que pode ser transladado para o polipeptídeo modificado por degeneração de códon.

[023] Ainda outro aspecto da presente revelação é para fornecer um micro organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina contendo o polipeptídeo modificado.

[024] Na presente revelação, o micro-organismo pode incluir todos dentre um micro-organismo produzido artificialmente através de transformação ou um micro-organismo que ocorre naturalmente.

[025] Como usado no presente documento, o termo “transformação” se refere à introdução de um gene em uma célula hospedeira para expressão. Na presente revelação, o método de transformação inclui qualquer método que introduza um gene em uma célula e pode ser realizada selecionando-se uma técnica padrão adequada conhecida na técnica. Exemplos do método de transformação são eletroporação, coprecipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, microinjeção, DEAE-dextrano, lipossoma catiônico, método de choque térmico, etc., mas não são limitados a esses.

[026] O gene a ser transformado pode incluir tanto uma forma inserida no cromossoma de uma célula hospedeira quanto uma forma localizada fora do cromossoma, desde que a mesma possa ser expressa na célula hospedeira. Além disso, o gene inclui DNA e RNA como um polinucleotídeo capaz de codificar um polipeptídeo, e qualquer gene que possa ser introduzido e expresso na célula hospedeira pode ser usado sem limitação. Por exemplo, o gene pode ser introduzido em uma célula hospedeira em uma forma de um cassete de expressão, o qual é um construto de polinucleotídeo que contém todos os elementos exigidos para autoexpressão. O cassete de expressão usualmente inclui um promotor operacionalmente ligado ao gene, um sinal de terminação de transcrição, sítios de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de translação. O cassete de expressão pode estar em uma forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o gene pode ser um introduzido em uma célula hospedeira ele próprio ou em uma forma de um construto de polinucleotídeo, isto é, uma forma de um vetor, e operacionalmente ligado às sequências exigidas para expressão na célula hospedeira.

[027] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a qualquer carreador para clonar e/ou transferir nucleotídeos para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicão para permitir a replicação dos fragmentos combinados com outros fragmentos de DNA. “Replicão” se refere a qualquer unidade genética que atua como um autorreplicante até para replicação de DNA in vivo, isto é, replicável por autorregulação (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossoma e vírus). O termo “vetor” pode incluir carreadores virais e não virais para introduzir nucleotídeos em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo, e pode também incluir um DNA miniesférico. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo sem uma sequência de DNA bacteriana. A remoção de sequências DNA bacteriano que são ricas em área de CpG tem sido conduzida para reduzir silenciamento da expressão transgênica e para promover expressão mais contínua a partir de um vetor de DNA plasmidial (por exemplo, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10:215 a 225; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5:731 a 738; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11:856 a 64). O termo “vetor” também pode incluir um transposon tal como Sleeping Beauty (Izsvak et al. J. Mol. Biol. 302:93 a 102 (2000)), ou um cromossoma artificial. Exemplos do vetor usado tipicamente podem ser plasmídeo, cosmídeo, vírus e bacteriófago naturais ou recombinantes. Por exemplo, como o vetor de fago ou o vetor de cosmídeo, pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, ÀIXII, ÀASHII, ÀAPII, Àt10, Àt11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados. Além disso, como o vetor de plasmídeo, tipo pDZ, tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET, etc. podem ser usados. Especificamente, o vetor pECCG117 pode ser usado. O vetor que pode ser usado na presente revelação não é particularmente limitado, e o vetor de expressão/substituição conhecido pode ser usado.

[028] Além disso, o vetor pode ser um vetor recombinante que pode incluir adicionalmente vários genes de resistência a antibióticos.

[029] Como usado no presente documento, o termo “gene de resistência a antibióticos” se refere a um gene que tem resistência a antibióticos, e as células que compreendem esse gene sobrevivem mesmo no ambiente tratado com o antibiótico correspondente. Portanto, o gene de resistência a antibióticos pode ser usado de modo eficaz como um marcador de seleção para uma em produção larga escala de plasmídeos em micro-organismos, tais como E. coli, etc. Na presente invenção, como o gene de resistência a antibióticos não é um fator que afeta significativamente a eficiência de expressão que é obtida por uma combinação ótima de componentes do vetor que é a característica chave da presente invenção, qualquer gene de resistência a antibióticos comum pode ser usado como um marcador de seleção sem limitação. Especificamente, os genes de resistência contra ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, estreptomicina ou neomicina podem ser usados.

[030] Como usado no presente documento, o termo “operacionalmente ligado” se refere à ligação operável de uma sequência regulatória para expressão de nucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína-alvo para realizar sua função geral afetando, desse modo, a expressão de uma sequência de nucleotídeos codificação. Ligação operável com um vetor pode ser feita com o uso de uma técnica de recombinação de gene conhecida na técnica, e clivagem e ligação de DNA específica de sítio podem ser realizadas com o uso de uma enzima de restrição e ligase conhecidas na técnica.

[031] Como usado no presente documento, o termo “célula hospedeira em que um vetor é introduzido (transformado)” se refere a uma célula transformada com um vetor que tem um gene que codifica uma ou mais proteínas-alvo. A célula hospedeira pode incluir qualquer um dentre um micro-organismo procariótico e um microorganismo eucariótico desde que o micro-organismo inclua um polipeptídeo modificado capaz de produzir sintase de isopropilmalato introduzindo-se o vetor acima. Por exemplo, a cepa de micro-organismo que pertence aos gêneros de Escherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Corynebacterium e Brevibacterium pode ser incluída. Um exemplo do micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum, mas não é limitado a esse.

[032] O micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina, a qual é capaz de expressar o polipeptídeo modificado que tem a atividade de sintase de isopropilmalato, inclui todos os micro-organismos capazes de expressar o polipeptídeo modificado por vários métodos conhecidos além da introdução de um vetor.

[033] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir L-leucina, que compreende:(a) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina; e (b) recuperar L-leucina a partir do micro-organismo cultivado ou o meio cultivado.

[034] Como usado no presente documento, o termo “cultura” se refere ao cultivo do micro-organismo sob condições ambientais controladas apropriadamente. O processo de cultivo da presente revelação pode ser realizado dependendo de um meio e condição de cultura adequados conhecidos na técnica. Tal processo de cultivo pode ser facilmente ajustado e usado por uma pessoa de habilidade comum na técnica dependendo da cepa a ser selecionada. Especificamente, a cultura pode ser uma tipo lote, uma tipo contínua e uma tipo lote alimentado, mas não é limitada a essas.

[035] As fontes de carbono contidas no meio podem incluir açúcares e carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, óleo de coco, etc.; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético. Esses materiais podem ser usados isoladamente ou em combinações dos mesmos, mas não são limitados a isso. As fontes de nitrogênio contidas no meio podem incluir fontes de nitrogênio orgânico, tal como peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, milhocina e soja; e fontes de nitrogênio inorgânico, tais como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou em combinação, mas não são limitadas a isso. As fontes de fósforo contidas no meio podem incluir di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, sais contendo sódio correspondentes, mas não são limitadas a isso. Além disso, sais de metal tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro podem estar contidos. Além disso, aminoácidos, vitaminas, precursores adequados, etc. podem estar contidos. Esses meios ou precursores podem ser adicionados em um processo de cultura em lote ou um processo de cultura contínua para uma cultura, mas não são limitados a isso.

[036] O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo adicionando-se um composto apropriado tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, e a geração de espumas pode ser inibida durante o cultivo com o uso de um agente antiespumante tal como éster poliglicólico de ácido graxo. A fim de manter condições aeróbicas da cultura, oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado na cultura. A fim de manter condições anaeróbicas e microaeróbicas, nenhum gás pode ser injetado ou nitrogênio, hidrogênio, ou dióxido carbono pode ser injetado. A temperatura da cultura pode ser 27 °C a 37 °C, e, especificamente, 30 °C a 35 °C, mas não é limitada a isso. O período de cultivo pode ser contínuo desde que a quantidade desejada de material útil seja recuperada e, preferencialmente, por 10 a 100 horas, mas o período de cultivo não é limitado a isso.

[037] A etapa de recuperar L-leucina produzida na etapa de cultura da presente revelação pode coletar a L-leucina desejada a partir do micro-organismo ou do meio com o uso de um método adequado conhecido na técnica dependendo de métodos de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados, e um método adequado conhecido na técnica pode ser usado para recuperar a L-leucina desejada a partir do meio ou o micro-organismo. Além disso, a etapa recuperação acima pode incluir um processo de purificação.

MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[038] Abaixo no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes com modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: CONFIRMAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS LEUA DE LEUCINA QUE PRODUZ MICRO-ORGANISMO KCCM11661P

[039] Corynebacterium glutamicum ATCC14067 foi inoculado em um meio de semeadura que tem os ingredientes descritos abaixo a 121 °C por 15 minutos, cultivado por 13 horas e, então, 25 ml do meio de cultura foram recuperados. O meio de cultura recuperado foi lavado com um tampão de citrato 100 mM e tratado com N- metil- N '-nitro-N -nitrosoguanidina (NTG) por 30 minutos para uma concentração final de 400 μg/ml. Depois disso, o resultante foi lavado com um tampão de fosfato 100 mM. A taxa de mortalidade das cepas tratadas com NTG foi determinada como 99,6% como um resultado de manchar as cepas em um meio mínimo que tem os ingredientes descritos abaixo. A fim de obter variantes resistentes à norleucina (NL), as tratadas com NTG cepas foram manchados nos meios mínimos com concentrações finais de 20 mM, 40 mM e 50 mM, cultivados a 30 °C por 5 dias e, então, variantes resistentes a NL foram obtidas.

MEIO DE SEMEADURA

[040] Glicose (20 g), peptona (10 g), extrato de levedura (5 g), ureia (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (100 μg), hidrocloreto de tiamina (1. 000 μg), cálcio-ácido pantotênico (2. 000 μg), e nicotinamida (2. 000 μg; com base em 1 l de água destilada), pH 7,0

MEIO DE PRODUÇÃO

[041] Glicose (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), concentrados de água de lavagem de milho (5 g), ureia (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO47H2O (0,5 g), biotina (100 μg), hidrocloreto de tiamina (1. 000 μg), cálcio-ácido pantotênico (2. 000 μg), nicotinamida (3. 000 μg), e CaCO3 (30 g; com base em 1 l de água destilada), pH 7,0

[042] As variantes obtidas pelo método acima foram designadas como Corynebacterium glutamicum KCJ-24 e Corynebacterium glutamicum KCJ-28 e depositadas para o Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos, uma autoridade depositária internacional, em 22 de janeiro de 2015, sob o Tratado de Budapeste, e como um resultado, Corynebacterium glutamicum KCJ-24 e Corynebacterium glutamicum KCJ-28 foram depositados sob nos de Acesso KCCM11661P e KCCM11662P, respectivamente. Corynebacterium glutamicum KCJ-24 e Corynebacterium glutamicum KCJ-28 produziram L-leucina em uma concentração de 2,7 g/l e 3,1 g/l, respectivamente. Portanto, foi confirmado que a produtividade de L- leucina produzida a partir das variantes foi 10-vezes superior àquela do tipo selvagem.

[043] Além disso, foi feita uma tentativa para confirmar se a variação de leuA que codifica sintase de isopropilmalato (IPMS) ocorreu na variante KCCM11661P. A sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de tipo selvagem leuA foi confirmada por referência a WP_003863358,1 de Genebank. O DNA cromossômico da variante foi amplificado com o uso de um método de reação em cadeia de polimerase (doravante denominado como ‘PCR’). Embora seja conhecido que o gene leuA consiste em 616 aminoácidos, em algumas referências, é publicado que o código de iniciação de translação é indicado 35 aminoácidos a jusante da sequência do gene leuA, e, desse modo, o gene leuA consiste em 581 aminoácidos. Nesse caso, o número da posição que indica a variação do aminoácido correspondente pode variar. Portanto, em casos em que o gene leuA é considerado consistir em 581 aminoácidos, a posição de variação é além disso indicada em parêntesis.

[044] Especificamente, PCR foi realizada com o uso do DNA cromossômico da variante como um modelo e com o uso de iniciadores de SEQ ID Nos: 3 e 4 sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 1 minuto; recozimento a 58 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 2 minutos com o uso de polimerase de DNA Taq. Tal PCR foi repetida um total de 28 vezes para amplificar um fragmento de cerca de 2. 700 pares de base. A sequência de nucleotídeos do fragmento foi analisada com o uso do mesmo iniciador, e como um resultado, foi confirmado que G, que é o 1673o nucleotídeo de leuA em KCCM11661P, foi substituído por A. Esse resultado implica que arginina, que é o 558o (ou 523o; doravante indicado apenas como 558o) aminoácido, é substituída por histidina. Além disso, também foi confirmado que GC, que são os 1682o e 1683o nucleotídeos, foram substituídos por AT. Esse resultado também implica que glicinina, que é o 561o (ou 526o, doravante indicado apenas como 561o) aminoácido, é substituída por ácido aspártico.

EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE VETOR DE SUBSTITUIÇÃO DE VARIANTE DE IPMS

[045] A fim de produzir um vetor contendo a sequência de nucleotídeos modificada confirmada no Exemplo 1, PCR foi realizada com o uso do DNA cromossômico da variante acima como um modelo e com o uso de iniciadores de SEQ ID Nos: 5 e 6 sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 1 minuto; recozimento a 58 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto com o uso de polimerase de DNA Pfu. Tal PCR foi repetida um total de 25 vezes para amplificar um fragmento de cerca de 1. 460 pares de base com sítios de enzima de restrição SalI e XbaI. O fragmento amplificado foi tratado com enzimas de restrição, SalI e XbaI e, então, pDZ-leuA (R558H, G561D) foi preparado por ligação com o vetor pDZ (Patente Coreana no:10-0924065 e Publicação de Patente Internacional no 2008033001) tratado com as mesmas enzimas. Além disso, a fim de preparar um vetor com cada variação, ATCC14067 foi usado como um modelo e, então, 2 fragmentos foram amplificados com o uso de iniciadores 5 e 7, e iniciadores 8 e 6, respectivamente. PCR foi realizada com o uso dos dois fragmentos preparados como modelos sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 1 minuto; recozimento a 58 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto com o uso de polimerase de DNA Pfu. Tal PCR foi repetida um total de 25 vezes para amplificar um fragmento de cerca de 1. 460 pares de base com sítios de enzima de restrição SalI e XbaI. O fragmento amplificado foi tratado com enzimas de restrição SalI e XbaI e, então, pDZ-leuA (R558H) foi preparado por ligação com pDZ tratado com as mesmas enzimas. pDZ-leuA (G561D) foi preparado com o uso de iniciadores 5 e 9, e iniciadores 10 e 6 pelo mesmo método acima.

EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE CEPA DE SUBSTITUIÇÃO DE VARIANTE DE IPMS

[046] Corynebacterium glutamicum ATCC14067 foi usado como uma cepa parente a fim de preparar uma cepa que contenha a sequência de nucleotídeos modificada leuA a qual foi encontrada na cepa modificada acima.

[047] Corynebacterium glutamicum ATCC14067 foi transformado com os vetores pDZ-leuA (R558H), pDZ-leuA (G561D) e pDZ-leuA (R558H, G561D), os quais foram preparados no Exemplo 2 por eletroporação. Cada uma das cepas preparada através do cruzamento secundário foi designada como 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) e 14067::leuA (R558H, G561D). A fim de confirmar se o nucleotídeo de leuA foi substituído, PCR foi realizada com o uso de iniciadores de SEQ ID Nos: 3 e 4 sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 1 minuto; recozimento a 58 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 2 minutos com o uso de polimerase de DNA Taq. Tal PCR foi repetida um total de 28 vezes para amplificar um fragmento de cerca de 2. 700 pares de base. Depois disso, a substituição do nucleotídeo de leuA foi confirmado analisando-se a sequência de nucleotídeos com o mesmo iniciador.

[048] A cepa, 14067::leuA (R558H, G561D) que foi transformada com o vetor pDZ-leuA (R558H, G561D), foi designada como KCJ-0148, e depositada para o Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos em 25 de janeiro de 2016, e como um resultado, a cepa foi depositada sob Adesão no KCCM11811P.

EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM SUBSTITUIÇÃO À CEPA DE VARIANTE DE IPMS

[049] A fim de produzir L-leucina a partir de Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) e 14067::leuA (R558H, G561D), os quais foram preparados no Exemplo 3, foi realizado cultivo da seguinte maneira.

[050] Um ciclo de platina de cada uma dentre a cepa parente, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, e as cepas Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D), e 14067::leuA (R558H, G561D) preparadas foi inoculado em um balão de Erlenmeyer com reentrâncias de canto (250 ml) contendo um meio de produção (25 ml). Depois disso, L-leucina foi produzida por incubação em um banho maria com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 60 horas.

[051] Após conclusão da incubação, a quantidade de L-leucina produzida foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho. A concentração de L-leucina no meio de cultura para cada cepa experimental é mostrada na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM CEPA DE SUBSTITUIÇÃO DE VARIANTE DE IPMS

[052] Como mostrado na Tabela 1 acima, foi confirmado que a produtividade de L-leucina das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D), e 14067::leuA (R558H, G561D), as quais têm a variação R558H, G561D, ou R558H/G561D no gene leuA, foi aumentada cerca de 12 a 25-vezes comparada àquela da cepa parente, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE VARIANTE DE IPMS

[053] A fim de produzir um vetor de expressão contendo a sequência de nucleotídeos modificada confirmado no Exemplo 1, PCR foi realizada com o uso de ATCC14067 e o DNA cromossômico das 3 variantes preparadas no Exemplo 3 como modelos e com o uso de iniciadores de SEQ ID Nos: 11 e 12 sob as seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 1 minuto; recozimento a 58 °C por 30 segundos; e polimerização a 72 °C por 1 minuto com o uso de polimerase de DNA Pfu. Tal PCR foi repetida um total de 25 vezes para amplificar um fragmento de cerca de 2. 050 pares de base com sítios de enzima de restrição NdeI e XbaI. O fragmento amplificado foi tratado com enzimas de restrição, NdeI e XbaI e, então, vetores de expressão p117_PCJ7-leuA (WT), p117_PCJ7-leuA (R558H), p117_PCJ7-leuA (G561D), e p117_ PCJ7-leuA (R558H, G561D) foram preparados por ligação com o uso de p117_PCJ7 em que um promotor PCJ7 foi inserido no vetor pECCG117 (Biotechnology letters Vol. 13, no 10, p. 721 a 726 (1991)) tratado com as mesmas enzimas. O promotor PCJ7 é um promotor que aumenta expressão de gene, e é publicamente conhecido na Patente Coreana no 10-0620092 e Publicação de Patente Internacional no 2006-065095.

EXEMPLO 6: PRODUÇÃO DE CEPA TRANSFORMADA COM VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE VARIANTE DE IPMS

[054] A fim de produzir uma cepa transformada com um vetor de superexpressão contendo a sequência de nucleotídeos modificada leuA preparada no Exemplo 5, a cepa parente, a qual é tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC14067, e as cepas que produzem leucina KCCM11661P e KCCM11662P foram usadas.

[055] Cada um dos vetores p117_PCJ7-leuA (WT), p117_PCJ7-leuA (R558H), p117_PCJ7-leuA (G561D), e p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), preparados no Exemplo 5, foi transformado com Corynebacterium glutamicum ATCC14067, KCCM11661P e KCCM11662P por eletroporação. Como um resultado, 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H,G561D); KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D); e KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7- leuA (R558H, G561D) foram produzidos.

EXEMPLO 7: PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM CEPA TRANSFORMADA COM VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE VARIANTE DE IPMS

[056] A fim de produzir L-leucina a partir das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067::p117_PCJ7- leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D); KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11661P::117PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7- leuA (R558H, G561D); e KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), as quais foram produzidas no Exemplo 6, cultivo foi realizado da seguinte maneira.

[057] Um ciclo de platina de cada uma das cepas parentes, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, KCCM11661P e KCCM11662P, e as cepas produzidas no Exemplo 6 foi inoculada em um balão de Erlenmeyer com reentrâncias de canto (250 ml) contendo um meio de produção (25 ml). Depois disso, L-leucina foi produzida por incubação em um banho maria com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 60 horas.

[058] Após conclusão da incubação, a quantidade de L-leucina produzida foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho. A concentração de L-leucina no meio de cultura para cada cepa experimental é mostrada na Tabela 2 abaixo. TABELA 2 PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM CEPA DE SUPEREXPRESSÃO DE VARIANTE DE IPMS

[059] Como mostrado na Tabela 2 acima, foi confirmado que a produção de L- leucina das cepas que produzem L-leucina, 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) e 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), as quais foram transformadas com o vetor de superexpressão contendo variação do gene leuA na cepa ATCC14067, foi aumentada 45- a 98-vezes comparado àquele da cepa parente ATCC14067; a produção de L-leucina das cepas que produzem L-leucina, KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D) e KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), as quais foram transformadas com o vetor de superexpressão contendo variação do gene leuA na cepa KCCM11661P, foi aumentada 2,3- a 4,5-vezes comparada àquela da cepa parente KCCM11661P; e que a produção de L-leucina das cepas que produzem L-leucina, KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D) e KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H,G561D), as quais foram transformadas com o vetor de superexpressão contendo variação do gene leuA na cepa KCKCM11662P, foi aumentada 2- a 4,2-vezes comparada àquela da cepa parente KCCM11662P.

EXEMPLO 8: MEDIÇÃO DE ATIVIDADE DA SINTASE DE ISOPROPILMALATO EM CEPA TRANSFORMADA COM VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE LEUA

[060] A fim de medir uma atividade da sintase de isopropilmalato nas cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) e 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), produzida no Exemplo 6, experimentos foram realizados da seguinte maneira.

[061] Um ciclo de platina de cada uma das 4 cepas acima foi inoculado em um balão de Erlenmeyer com reentrâncias de canto (250 ml) contendo o meio de semeadura (25 ml). Depois disso, os resultantes foram incubados em um banho maria com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 16 horas. Após a conclusão da incubação, o meio de cultura foi centrifugado para descartar o sobrenadante, o pélete foi lavado e misturado com um tampão de lise, e as células foram pulverizadas com um homogeneizador de gotas. As proteínas presentes no lisado foram quantificadas de acordo com o ensaio de Bradford, e a atividade de sintase de isopropilmalato foi medida medindo-se o CoA produzido quando o lisado contendo proteínas (100 μg/ml) foi usado. Os resultados de medição da atividade da sintase de isopropilmalato em cada cepa são mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3

[062] A fim de confirmar o grau de liberação de inibição de retroalimentação por leucina na enzima, a atividade da sintase de isopropilmalato foi medida medindo-se o CoA produzido quando o lisado contendo proteínas (100 μg/ml) foi usado sob a condição em que leucina (3 g/l) foi adicionada. Os resultados de medição da atividade da sintase de isopropilmalato em cada cepa são mostrados na Tabela 4 abaixo. TABELA 4

[063] Como mostrado nas Tabelas 3 e 4 acima, foi confirmado que a atividade da sintase de isopropilmalato das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) e 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), as quais foram transformadas com o vetor que expressa a variante de IPMS, foi aumentada 1,05-vezes, 1,3-vezes e 3,2-vezes, respectivamente, comparada àquela do controle, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT). Além disso, as cepas que produzem L-leucina mantiveram sua atividade de IPMS em 61%, 70% e 89%, respectivamente, mesmo quando leucina (2 g/l) foi adicionada, confirmando que a inibição de retroalimentação por leucina foi liberada.

EXEMPLO 9: PRODUÇÃO DE VETOR PARA MELHORAR VARIANTE DE SINTASE DE ISOPROPILMALATO (IPMS)

[064] Nos Exemplos 4, 7 e 8, uma vez que foi confirmado que o 558o e o 561o aminoácidos na sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de sintase de isopropilmalato foram sítios importantes para a atividade da enzima variante de IPMS, foi feita a tentativa de confirmar se a atividade de enzima foi aumentada ou se inibição de retroalimentação foi adicionalmente liberada quando substituída por um aminoácido diferente dos aminoácidos na variante. Portanto, foi feita uma tentativa de preparar uma variante substituída por um aminoácido de outros grupos de aminoácido capazes de provocar variações estruturais.

[065] Uma variante na qual o 558o aminoácido, arginina, foi substituída por alanina (Ala) ou glutamina (Gln) foi preparada. O vetor p117_PCJ7-leuA (R558A), no qual o 558o aminoácido é substituído por alanina (Ala), e o vetor p117_PCJ7-leuA (R558Q), no qual o 558o aminoácido é substituído por glutamina (Gln), foram preparados com o uso de um método de mutagênese dirigida a sítio e com o uso do vetor p117_PCJ7-leuA (R558H) como um modelo, os iniciadores de SEQ ID Nos: 13 e 14, e o p ar de iniciadores de SEQ ID Nos: 15 e 16.

[066] Uma variante na qual o 561o aminoácido, glicinina, foi substituído por arginina (Arg) ou tirosina (Tyr) foi preparada. O vetor p117_PCJ7-leuA (G561R), no qual o 561o aminoácido é substituído por arginina (Arg), e o vetor p117_PCJ7-leuA (G561Y), no qual o 561o aminoácido é substituído por tirosina (Tyr), foram obtidos com o uso de um método de mutagênese dirigida a sítio e com o uso de p117_PCJ7-leuA (G561D) como um modelo, os iniciadores de SEQ ID Nos: 17 e 18, e o p ar de iniciadores de SEQ ID Nos:19 e 20.

EXEMPLO 10: PRODUÇÃO DE CEPA NA QUAL VARIANTE MODIFICADA DE ISOPROPILMALATO É INTRODUZIDA

[067] A fim de preparar uma cepa transformada com um vetor de expressão contendo a sequência de nucleotídeos modificada leuA preparada no Exemplo 9, Corynebacterium glutamicum ATCC14067 tipo selvagem foi usado como uma cepa parente.

[068] Cada um dos vetores, p117_PCJ7-leuA (R558A), p117_PCJ7-leuA (R558Q), p117_PCJ7-leuA (G561R) e p117_PCJ7-leuA (G561Y), os quais foram preparados no Exemplo 9, foi transformado em Corynebacterium glutamicum ATCC14067 por eletroporação para preparar 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R), e 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y).

EXEMPLO 11: PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM CEPA NA QUAL VARIANTE MODIFICADA POR SINTASE DE ISOPROPILMALATO É INTRODUZIDA

[069] A fim de produzir L-leucina a partir das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A), 14067::p117_PCJ7- leuA (R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R) e 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y), as quais foram preparadas no Exemplo 10, cultivo foi realizado da seguinte maneira.

[070] Um ciclo de platina de cada uma dentre a cepa parente, Corynebacterium glutamicum ATCC14067 e as 4 cepas acima foi inoculada em um balão de Erlenmeyer com reentrâncias de canto (250 ml) contendo um meio de produção (25 ml). Depois disso, L-leucina foi produzida por incubação em um banho maria com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 60 horas.

[071] Após conclusão da incubação, a quantidade de L-leucina produzida foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho. A concentração de L-leucina no meio de cultura para cada cepa experimental é mostrada na Tabela 5 abaixo. TABELA 5 PRODUÇÃO DE L-LEUCINA EM CEPA DE SUPEREXPRESSÃO DE VARIANTE DE IPMS

[072] Como mostrado na Tabela 5 acima, foi confirmado que a produtividade de L-leucina das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A) e 14067::p117_PCJ7-leuA (R558Q), foi aumentada 32- a 38-vezes comparada à cepa parente, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.

[073] Além disso, foi confirmado que a produtividade de L-leucina das cepas que produzem L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R) e 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y), foi aumentada cerca de 36- a 40-vezes comparada àquela da cepa parente, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.

[074] Com base nos resultados acima, foi confirmado que o 558o e o 561o aminoácidos na sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de sintase de isopropilmalato foram sítios importantes para a atividade da enzima variante de IPMS, e que mesmo quando cada um dentre o 558o e o 561o aminoácidos da proteína IPMS tipo selvagem foi substituído por histidina e ácido aspártico, respectivamente, a produtividade de L-leucina foi notavelmente aumentada na cepa que tem tal modificação.

[075] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será entendido por aqueles versados na técnica a quem a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito técnico ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas e não pela descrição detalhada, e deve-se entender que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes dos mesmos são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (9)

1. Polipeptídeo modificado que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato caracterizado por a arginina na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser substituída por histidina, alanina ou glutamina, ou por a glicina na posição 561 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser substituída por arginina ou tirosina.

2. Polipeptídeo modificado que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato caracterizado por a arginina na posição 558 a partir de um N-terminal de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser substituída por histidina, alanina ou glutamina, e por a glicina na posição 561 a partir de um N-terminal do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ser substituída por ácido aspártico, arginina ou tirosina.

3. Polipeptídeo modificado que tem uma atividade de sintase de isopropilmalato caracterizado por consistir na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 21 a 23, e 25 a 35.

4. Polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o polinucleotídeo consistir na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou sequência degenerada da mesma, em que (i) o códon que consiste em 1672° a 1674° nucleotídeos é substituído por um códon que codifica um aminoácido selecionado do grupo que consiste em histidina (CAU or CAC), alanina (GCU, GCC, GCA or GCG) ou glutamina (CAA or CAG); (ii) o códon que consiste nos 1681° a 1683° nucleotídeos é substituído por um códon que codifica um aminoácido selecionado do grupo que consiste em arginina (AGA or AGG) ou tirosina (UAU or UAC); ou (iii) o códon que consiste no 1672° ao 1674° nucleotídeos é substituído por um códon que codifica um aminoácido selecionado do grupo que consiste em histidina (CAU or CAC), alanina (GCU, GCC, GCA or GCG) ou glutamina (CAA or CAG), e o códon que consiste nos 1681° ao 1683° nucleotídeos é substituído por um códon que codifica um amino ácido selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico (GAG or GAC), arginina (AGA or AGG) ou tirosina (UAU or UAC).

5. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o polinucleotídeo consistir numa sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 36 a 38 e SEQ ID NO: 40 a 50.

6. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina caracterizado por compreender o polipeptídeo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

7. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L-leucina caracterizado por ser transformado com um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica o poliptídeo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

8. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.

9. Método para produzir L-leucina caracterizado por compreender: (a) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz L- leucina, conforme definido na reivindicação 6, em um meio para produzir L-leucina; e (b) recuperar L-leucina a partir do micro-organismo cultivado ou do meio cultivado.